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CN1603342A - 与半胱天冬蛋白酶－8相互作用的蛋白 - Google Patents

与半胱天冬蛋白酶－8相互作用的蛋白 Download PDF

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CN1603342A
CN1603342A CNA2004100563830A CN200410056383A CN1603342A CN 1603342 A CN1603342 A CN 1603342A CN A2004100563830 A CNA2004100563830 A CN A2004100563830A CN 200410056383 A CN200410056383 A CN 200410056383A CN 1603342 A CN1603342 A CN 1603342A
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D·沃勒克
M·舒赫曼
T·冈察洛夫
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Yeda Research and Development Co Ltd
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Abstract

提供了与半胱天冬蛋白酶－8相互作用的蛋白质。还提供了这些蛋白质的生产和用途。

Description

与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白
本申请是申请日为1999年12月23日、申请号为CN 99805362.7、发明名称为“与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本发明总地涉及半胱氨酸蛋白酶领域。更具体地说，本发明涉及与半胱天冬蛋白酶-8(MACH)相互作用和/或调节其在CD95(Fas/Apo-1)或CD120a(p55-TNF受体)介导的细胞死亡(或凋亡)通道中的功能的蛋白。
具体地说，本发明涉及与半胱天冬蛋白酶-8/MACH直接或间接相互作用的蛋白。本发明还涉及与半胱天冬蛋白酶-8/MACH相互作用的蛋白的制备和应用。
发明背景
肿瘤坏死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)(在下文中TNF指TNF-α和TNF-β)是多功能促炎细胞因子，它们主要由单核吞噬细胞形成，对细胞有多种作用(Wallach，D.(1986)，Interferon 7(Ion Gresser编辑)，83-122页，Academic Press，London；和Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通过结合特异性细胞表面受体来启动其作用。其中一些作用可能对生物体有利：它们可能会破坏(例如)肿瘤细胞或感染了病毒的细胞，并增强粒细胞的抗菌活性。通过这种方式，TNF对于保护生物体抵御肿瘤和感染性因子以及从损伤中恢复有贡献。因此，TNF可用作抗肿瘤剂，在该应用中，它结合肿瘤细胞表面上的受体，从而启动了导致肿瘤细胞死亡的行为。TNF还可用作抗感染剂。
然而，TNF-α和TNF-β均有有害的作用。有证据表明，过度产生TNF-α会在几种疾病中起主要致病作用。例如，已经知道，TNF-α主要作用于脉管结构，这是脓毒休克症状的主要病因(Tracey等，1986)。在一些疾病中，TNF可能会通过抑制脂肪细胞的活性和引起缺乏食欲而导致体重过度减轻(恶液质)，因此TNF-α称为恶液质素。另外，它还被描述成是风湿性疾病中组织损伤的一种中介体(mediator)(Beutler和Cerami，1987)，以及移植物抗宿主反应中所见破坏的主要中介体(Piquet等，1987)。此外，已知TNF参与发炎过程和其它许多疾病。
两种不同的、独立表达的受体p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF-Rs(它们与TNF-α和TNF-β特异性结合)启动和/或介导了TNF的上述生物学效应。这两种受体在结构上有不相似的胞内结构域，这暗示它们的信号传导方式不同(参见Hohmann等，1989；Engelmann等1990；Brockhaus等，1990；Leotscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990；和Heller等，1990)。然而，例如涉及CD120a和CD120b胞内信号传导的各种蛋白和可能存在的其它因子的细胞机制还没有得到阐明。正是该胞内信号的传导(通常在配体(即TNFα或β)结合受体后发生)致使级联反应开始并最终导致所见的细胞对TNF的反应。
关于上述TNF的杀细胞作用，就目前研究的大多数细胞而言，该作用主要由CD120a引发。抗CD120a胞外结构域(配体结合域)的抗体本身能引发杀细胞效应(见EP 412486)，该效应与受体交联抗体的效率相关，认为这是胞内信号传导过程产生的第一步。而且，诱变研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)已经表明，CD120a的生物功能取决于其胞内结构域的完整性，因此，已提出导致TNF杀细胞效应的胞内信号传导启动的发生是CD120a的两个或多个胞内结构域缔合的结果。而且，TNF(α和β)形成均三聚体，因此，已提出通过CD120a靠其结合和交联受体分子(即引起受体聚集)的能力来诱导胞内信号传导。
TNF/NGF受体超家族的另一个成员是FAS/APO1受体(CD95)(也称为FAS抗原)，它是在各种组织中表达的一种细胞表面蛋白，它与许多细胞表面受体(包括TNF-Rs和NGF-R)同源。CD95以凋亡方式介导细胞死亡(Itoh等，1991)，并且好象是自身反应T细胞的阴性选择物，即，在T细胞成熟期间，CD95介导了识别自身抗原的T细胞的凋亡性死亡。也已发现，CD95基因(lpr)中的突变在小鼠中引起了与人自身免疫疾病—系统性红斑狼疮(SLE)—相似的淋巴细胞增生疾病(Watanabe-Fukunaga等，1992)。CD95的配体看来是其它细胞中杀伤T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞-CTL)中携带的细胞表面相关分子，因此，当该CTL接触携带CD95的细胞时，它们能诱导携带CD95的细胞编程性细胞死亡。另外，已经制得对CD95有特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体能诱导携带CD95的细胞(包括被编码人CD95的eDNA转化的小鼠细胞)凋亡性细胞死亡(Itoh等，1991)。
尽管淋巴细胞的一些细胞毒性效应是通过淋巴细胞产生的配体与广泛存在的细胞表面受体CD95(它能引发细胞死亡)的相互作用而介导的，但是也已发现，除T淋巴细胞外的其它各种正常细胞也在其表面表达CD95，并且能通过触发该受体而被杀死。怀疑是由于对该杀死过程的失控性诱导而导致了某些疾病中组织破坏(例如急性肝炎中的肝细胞破坏)。因此，寻找方法来抑制CD95的细胞毒性活性可能会有治疗潜力。
相反，由于已经发现某些恶性细胞和HIV感染的细胞在其表面携带了CD95，因此可利用抗CD95的抗体或CD95配体来引发这些细胞中的CD95介导的胞毒作用，从而提供一种抵抗这些恶性细胞或HIV-感染的细胞的方法(见Itoh等，1991)。因此，寻求其它方法来增强CD95胞毒活性可能也会有治疗潜力。
提供一种调节对TNF(α或β)和CD95配体的细胞反应的方法是人们长期以来的需求。例如，在上述病理场合下，当TNF或CD95配体过度表达时，就需要抑制TNF或CD95配体诱导的杀细胞效应，而在其它场合，例如伤口愈合的应用中，则希望增强TNF的效应，或在CD95的情况下，在肿瘤细胞或HIV感染的细胞中，希望增强CD95介导的效应。
申请人已经用了各种方法(例如参见欧洲专利申请No.EP 186833，EP 308378，EP398327和EP 412486)来调节TNF的有害作用，方法是用抗TNF抗体或可溶性TNF受体(基本上是此受体的可溶性胞外结构域)与TNF竞争和细胞表面结合的TNF-Rs结合，从而抑制TNF与其受体结合。另外，由于TNF与其受体的结合是TNF诱导细胞效应所需的，因此申请人已经设法通过调节TNF-Rs的活性来调节TNF的作用(例如参见EP 568925)。
例如，EP 568925涉及一种调节信号转导和/或TNF-Rs中断裂的方法，从而肽或其它分子可与受体本身或与该受体相互作用的效应蛋白相互作用，从而调节了TNF-Rs的正常功能。在EP 568925中，描述了在CD120a的胞外、跨膜和胞内结构域中有突变的各种CD120a突变体的构建和性质分析。这样，CD120a的上述结构域内的区域被确定为受体发挥功能(即与配体(TNF)结合以及随后的信号转导和胞内信号传导，最终导致所见的TNF对细胞的效应)所必需的。而且，该文还描述了许多分离和鉴定蛋白、肽或其它因子的方法，这些蛋白、肽或其它因子能结合CD120a上述结构域内的不同区域，可能参与了TNF-Rs活性的调节或调控。在EPO 368925中还描述了分离和克隆编码这些蛋白和肽的DNA序列的方法；构建表达载体来产生这些蛋白和肽的方法；以及与CD120a或与结合CD120a不同区域的上述蛋白和肽相互作用的抗体或其片段的制备方法。然而，EP 568925没有指明结合TNF-Rs(如CD95)胞内结构域的实际蛋白和肽，也没有描述用来分离和鉴定结合TNF-Rs胞内结构域的这些蛋白和肽的酵母双杂交方法。同样，EP 568925也没有公开能结合CD95胞内结构域的蛋白或多肽。
因此，当希望抑制TNF或CD95配体的作用时，需要减少细胞表面的TNF-Rs或CD95的数量或活性，而当需要增强TNF或CD95配体的作用时，希望增加TNF-Rs或CD95的数量或活性。出于这一目的，已经对CD120a和CD120b的启动子进行了测序和分析，并且已经发现了许多对不同转录调节因子有特异性的一些关键序列基序，因此可以在其启动子水平来控制这些TNF-Rs的表达，即通过抑制启动子的转录来减少受体数量，增强启动子转录来增加受体数量(EP 606869和WO 9531206)。
尽管已经知道肿瘤坏死因子(TNF)受体以及结构上相关的受体CD95，在受白细胞产生的配体刺激时，在细胞内引发了导致细胞自身死亡的破坏性活性，但是对该引发的机制仍知之甚少。突变研究表明，在CD95和CD120a中，细胞毒性的信号传导涉及其胞内结构域的不同区域(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)。这些区域(“死亡结构域”)的序列相似。CD95和CD120a的“死亡域”均有自身缔合(self-associate)的趋势。它们的自身缔合明显促进了信号传导作用启动所需的受体聚集(见Song等，1994；Wallach等，1994；Boldin等，1995)，且在高水平受体表达下会导致引发不依赖于配体的信号传导(Boldin等，1995)。
一些淋巴细胞的细胞毒性效应受淋巴细胞产生的配体和CD95相互作用所介导，CD95是一种广泛存在的细胞表面受体，它能引发细胞死亡(另见Nagata和Golstein，1995)；而单核吞噬细胞杀死细胞作用涉及配体-受体配对—TNF及其受体CD120a，它们在结构上与CD95及其配体相关(另见Vandenabeele等，1995)。和其它受体诱导的效应一样，TNF受体和CD95通过一系列蛋白-蛋白相互作用(从配体-受体结合到最终激活酶促效应功能)诱导细胞死亡，在研究中已经描述启动细胞死亡信号传导作用的非酶促蛋白-蛋白相互作用：TNF或CD95配体三聚体分子与受体结合，其胞内结构域相互作用(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)由于死亡域基序自身缔合的趋势而增强(Boldin等，1995a)，以及两种细胞质蛋白(这两种蛋白也能相互结合)与受体胞内结构域受诱导结合—MORT-1(或FADD)与CD95结合(Boldin等，1995b；Chinnaiyan等，1995；Kischkel等，1995)，TRADD与CD120a结合(Hsu等，1995；Hsu等，1996)。用酵母双杂交筛选程序鉴定出三种蛋白，这些蛋白与CD95和CD120a胞内结构域的“死亡结构域”结合，而“死亡结构域”通过同源区域的异质性缔合来参与受体诱导细胞死亡，这些蛋白还能独立地引发细胞死亡。它们中的一种蛋白是MORT-1(Boldin等，1995b)，也称为FADD(Chinnaiyan等，1995)，它能特异性地结合CD95。第二种是TRADD(另见Hsu等，1995，1996)，它与CD120a结合，第三种是RIP(另见Stanger等，1995)，它与CD95和CD120a结合。这些蛋白除了能结合CD95和CD120a外，还能相互结合，从而在CD95和CD120a之间提供了功能性“串话(cross-talk)”。这些结合发生在受体及其缔合蛋白中共有的保守序列基序—“死亡结构域组件”中。另外，尽管在酵母双杂交测试中，MORT-1显示出自发结合CD95，但是在哺乳动物细胞中，这一结合只有在受体受刺激后才会发生，这暗示MORT-1参与了CD95信号传导的启动行为。MORT-1不含酶活性特征的序列基序，因此，它引发细胞死亡的能力看来似乎并不是MORT-1本身固有的活性，而是激活了结合MORT-1的其它一些蛋白，并进一步作用于信号级联反应的下游。分子缺少N端部分的MORT-1突变体的细胞表达已经显示出阻断CD95或CD120a诱导的细胞毒性(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，这说明此N端区域通过蛋白-蛋白的相互作用传递了两种受体杀细胞效应的信号。
最近的研究已经暗示了一组胞质硫醇蛋白酶，它们在各种生理性细胞死亡过程开始时与Caenorhabditis elegans蛋白酶CED3以及哺乳动物白介素-1β转化酶(ICE)在结构上相关(综述见Kumar，1995和Kenkart，1996)。也有一些迹象表明，该家族的蛋白酶可能参与了CD95和TNF-Rs诱导的细胞毒性。发现这些蛋白酶的特异性肽抑制剂以及封闭其功能的两种病毒编码的蛋白(牛痘蛋白crmA和杆状病毒p35蛋白)为细胞提供了抗此细胞毒性的保护力(Enari等，1995；Los等，1995；Tewari等，1995；Xue等，1995；Beidler等，1995)。某些特异性细胞蛋白的迅速断裂明显是由CED3/ICE家族蛋白酶介导的，这可在CD95或TNF-Rs刺激后不久在细胞内得到证实。
最近，已经分离、克隆并鉴定出这样一种蛋白酶及其各种同种型(包括抑制性的同种型)，命名为MACH(也称为半胱天冬蛋白酶(caspase)-8)，它是一种MORT-1结合蛋白，作用是调节MORT-1活性进而调节CD95和CD120a的活性，可能还独立地作用于MORT-1，关于其可能的用途在共同拥有的待批以色列专利申请No.IL 114615，114986，115319，116588和117932及其对应的PCT申请No.PCT/US96/10521和本发明者最近的出版文献(Boldin等，1996)中有详细描述，它们全部纳入本文作参考。本发明者(未发表)和其它人(Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)最近还分离并鉴定出另一种此类蛋白酶及其各种同种型(包括抑制性同种型)，其命名为Mch4(也称为半胱天冬蛋白酶-10)。半胱天冬蛋白酶-10也是一种MORT-1结合蛋白，其作用是调节MORT-1的活性，因此可能也能调节CD95和CD120a的活性，可能还独立作用于MORT-1。因此，上述文献中还描述了关于半胱天冬蛋白酶-10的所有方面、特征、性质和用途，所有这些文献均全部纳入本文作参考。
还应注意，半胱天冬蛋白酶、半胱天冬蛋白酶-8和半胱天冬蛋白酶-10具有相似的前域(prodomain)(见Boldin等，1996；Muzio等，1996；Fernandes-Alnemri等，1996；Vincent和Dixit，1997)，它们通过其前域与MORT-1相互作用，该相互作用是通过MORT-1N端部分中的、以及半胱天冬蛋白酶-8和半胱天冬蛋白酶-10中重复存在的“死亡域基序”或“死亡效应域”DED而发生的(见Boldin等，1995b；Chinnalyan等，1995)。
这些蛋白酶(现在称为半胱天冬蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶))是一个数量渐增的具有几个共同特征的半胱氨酸蛋白酶家族。已经发现大多数半胱天冬蛋白酶参与了编程性细胞死亡或凋亡的启动和执行，而其他的看来参与了促炎细胞因子的产生(Nicholson DW等人，1997，Salvesen GS等人，1997，Cohen GM 1997)。它们被合成作为无催化活性的前体，通常靠结构域间接头中存在的特异性内部天冬氨酸残基断裂来激活。半胱天冬蛋白酶的断裂位点用四肽序列(X-X-X-D)来确定，而断裂总发生在天冬氨酸的下游。结果，某些成熟的活性半胱天冬蛋白酶就能加工并激活其自身以及其他无活性的前体(Femandes-Alnemri T等人，1996，Srinivasula SM等人，1996)。
编程性细胞死亡过程的激活通常是特异性的，涉及上游的半胱天冬蛋白酶(称为“启动”半胱天冬蛋白酶)对下游的半胱天冬蛋白酶(称为“执行半胱天冬蛋白酶”)的连续加工。这两类半胱天冬蛋白酶的结构也反映了它们的功能特征。实际上，“启动型半胱天冬蛋白酶”与“执行型半胱天冬蛋白酶”相比具有更长的前域区域(SalvesenGS等人，1997，Cohen GM 1997)。长的区域允许“启动物”或“顶端半胱天冬蛋白酶”能被TNF受体家族的死亡受体触发激活。在配体诱导死亡受体发生三聚后，启动半胱天冬蛋白酶通过其长的N-端前域被募集，与特异性衔接分子相互作用，形成了诱导死亡的信号传导复合物(Cohen GM 1997，Kischkel FC等人，1995)。例如，半胱天冬蛋白酶-8/MACH以及可能的半胱天冬蛋白酶-10(它含有两个死亡效应域(DED)或FADD结构域)被衔接分子FADD/MORT-1募集到受体复合物处，而半胱天冬蛋白酶-2通过CRADD/RAIDD以及RIP被募集(Nagata S等人，1997，Mac Farlane等人，1997，Ahmad M等人，1997，Duan H等人，1997)。由于激活的受体复合物的三聚特征，认为至少两个半胱天冬蛋白酶分子相互毗邻，从而使它们通过自身催化加工被激活(Yang等人，1998，Muzio等人，1998)。
半胱天冬蛋白酶被合成作为由三个主要亚基组成的酶原，这三个亚基是N-端前域以及两个亚基，两个亚基有时被一个接头肽隔开。两个亚基称为“长的”亚基或亚基1(含有活性酶促位点)和“短的”亚基或亚基2。为了完全激活酶，应使前域和两个亚结构域断裂。两个断裂的亚基形成了一个异二聚体，长的区域从N-端衍生获得，短的亚基是半胱天冬蛋白酶前体的C-端区域衍生获得。根据半胱天冬蛋白酶-3的推定的三维结构，看来长结构域的C-端和短亚基结构域的N-端必须被释放，且短亚基的C-端必须与长亚基的N-端紧密毗邻，以便产生一个正确折叠的有活性的酶(Rotonda等人，1996，Mittl等人，1997，Srinivasula等人，1998)。
N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶是一种已知参与葡糖胺胞内代谢的胞内酶。已经从产生壳多糖酶的细菌霍乱弧菌(Vibrio cholerae)中克隆了含有N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的基因组DNA片段(Yamano等人，Biosci Biotechnol Biochem.61，p.1349-53，1997)。
编码大肠杆菌N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的nagA基因也是已知的[例如参见Peri等人，1990年1月68(1)，123-137页]。目前还未报道对人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶作了克隆和测序。
发明概述
本发明提供了一种与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白(简称半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白)，或其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，它能与半胱天冬蛋白酶-8的亚基1和/或亚基2相互作用。
本发明还提供了人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶，或其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物。
本发明还提供了包含图2、3、5B或6的氨基酸序列的蛋白质。
本发明还提供了包含Tip-60蛋白的氨基酸序列但不包括氨基酸94至145的蛋白质。
还包括在本发明范围内的蛋白质含有下文所述的克隆P27、P70、P79、L7、L12、M26、B4、B17、J40、B13、B37、B33或P74及其剪接变体P16和P43编码的氨基酸序列。
本发明还提供了如上所述的蛋白质，它被半胱天冬蛋白酶-8体外或体内切割。
本发明还提供了编码本发明蛋白质的分离的DNA序列。包含在该范围内的是图2和图3所示的DNA序列。另外还包括在本发明范围内的是能在中等严谨条件下与所述DNA序列杂交的分离的DNA。
本发明还提供了一个载体，该载体包含如上所述的DNA序列。
本发明还提供了含有本发明载体的真核或原核宿主细胞。
本发明还提供了一种产生本发明与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物的方法，该方法包括使本发明的宿主细胞在允许所述蛋白质产生的条件下生长，如所需的那样影响翻译后修饰，获得所述蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，以及分离所述蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物。
本发明还提供所述方法，其中细胞是原核细胞。
本发明还提供所述方法，其中细胞是真核细胞。
本发明还提供所述方法，其中细胞是哺乳动物、昆虫、或酵母细胞。
本发明还提供所述方法，其中细胞是HeLa或293 T HEK细胞。
本发明还提供所述方法，其中用人CMV启动子作为启动子。
另外，本发明还提供与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的肽，该肽含有本发明蛋白质的至少4个串联的氨基酸。
所述肽的衍生物也包括在本发明范围内。另外包括在本发明范围内的是能在接触所述半胱天冬蛋白酶-8时与半胱天冬蛋白酶-8形成共价键的所述肽的衍生物。
本发明还提供了对本发明DNA序列对应的核苷酸序列有特异性的核酶。
本发明还提供了一种反义寡核苷酸，它包含对应于本发明DNA序列的至少9个核苷酸序列。
本发明还提供了针对本发明蛋白质表位的抗体。
本发明还提供了一种用来检测与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白质的免疫试验，该试验包括本发明的抗体。
本发明还提供了一种用来检测半胱天冬蛋白酶-8的免疫试验，该试验包括本发明的肽。
本发明还提供了一种用来检测半胱天冬蛋白酶-8的免疫试验，该试验包括本发明的蛋白质。
本发明还提供了鉴定与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤：
a)提供含有与启动子相连的含DNA序列基序的报道基因的酵母细胞；
a)在所述酵母细胞中表达所述半胱天冬蛋白酶-8的p20亚基；
b)在所述酵母细胞内表达DNA结合域与所述半胱天冬蛋白酶-8的p10和/或p20亚基的融合蛋白，其中所述DNA结合域能结合所述DNA序列基序；
c)任选地，在所述酵母细胞内表达出未融合的所述半胱天冬蛋白酶-8的p10或p20亚基；
d)用由驱动融合蛋白表达的表达载体所组成的文库转化所述酵母细胞培养物，该融合蛋白由cDNA文库和转录激活子组成；
e)从转化的酵母细胞中筛选出报道基因激活的酵母细胞，和
f)分离步骤e)的酵母细胞，并进一步分离出在其诱饵载体内表达的与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白质。
本发明还提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体、或衍生物，所述核酶、反义寡核苷酸或抗体调节半胱天冬蛋白酶-8活性的用途。
本发明还提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体、或衍生物，所述核酶、反义寡核苷酸或抗体调节TNF-受体或Fas介导的效应的用途。
本发明还提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体、或衍生物，所述核酶、反义寡核苷酸或抗体调节凋亡的用途。
本发明还提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体、或衍生物，所述核酶、反义寡核苷酸或抗体用作药剂的用途。
本发明还提供所述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体、或衍生物，所述核酶、反义寡核苷酸或抗体用作药剂来治疗有原发性少突神经胶质病(primary oligodendrogliopathy)的多发性硬化、自身免疫眼色素层视网膜炎(uveoretinitis)、糖尿病、狼疮、自身免疫心肌炎I、HCV介导的慢性肝炎、慢性胃炎如甲型胃炎、混合结缔组织疾病(MCTD)、Crohn疾病或溃疡性结肠炎的用途。
本发明还提供了能结合半胱天冬蛋白酶-8相互作用基因启动子区域中富含嘌呤的序列的形成三联体的寡核苷酸。形成三联体的寡核苷酸可含有化学修饰，如用阳离子N，N-二乙基-乙二胺、尿苷、苯并[g]-喹唑啉-2，4-二酮-(1H，3H)-二酮修饰核苷酸之间的磷酸键或用苯并[f]喹唑啉-2，4-二酮-(1H，3H)二酮残基代替胸苷残基。形成三联体的寡核苷酸还可与对DNA有亲和力的化学物质共价连接，较佳的是可嵌入DNA的那些试剂，如吖啶和补骨脂素。
本文描述内容中的术语“相互作用”与本发明蛋白和半胱天冬蛋白酶-8之间的相互作用有关，其意味着包括直接相互作用的形式，如结合、切割和间接的相互作用，如通过衔接蛋白。相互作用可能任选地导致调节半胱天冬蛋白酶-8介导的信号。
本文描述内容中的术语“结合”，当指半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的结合时，是指半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白与半胱天冬蛋白酶-8的物理结合。该物理结合可在半胱天冬蛋白酶-8或其亚基和本发明蛋白的混合物进行免疫试验(如ELISA或RIA试验)、双杂交试验、免疫沉淀试验、体积分离为基础的试验(如非变性丙烯酰胺凝胶电泳或体积排阻凝胶层析)中测得。在采用双杂交试验时，认为半胱天冬蛋白酶-8或其亚基被表达成DNA激活结构域融合物，半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白表达成DNA结合域融合物，或反过来。
术语“双杂交测试”指双杂交试验，其中通过在酵母细胞中导入编码第一蛋白与DNA结合域的融合物的第一表达载体以及编码第二蛋白与DNA激活结构域的融合物的第二表达载体，可以测定蛋白-蛋白的相互作用。酵母细胞必须含有至少一个被含有所述DNA结合域识别的DNA序列基序的启动子所推动的报道基因。通常，采用两个报道基因，如组氨酸合成酶和β-半乳糖苷酶。这使得研究者能避免由突变引起的假阳性。本申请人已经对该技术作了改进，用来筛选、分离和测试介导TNF-Rs和Fas信号的蛋白质，例如参见WO 97/03998及其中的参考文献。双杂交测试依靠两种融合蛋白定位于细胞核。
本文所用的术语“双杂交测试”还包括一种双杂交技术的改进方法，其中采用了细胞生长信号传导蛋白，如ras和sos(Broder等人，Curr Biol 1998，8，1121-4页，Aronheim等人，Nucl.Acids Res.1997 25，3373-4页及其参考文献)。为了起作用，这些蛋白质需要重新定位于细胞膜。这是通过将细胞生长信号传导蛋白和第一蛋白表达成融合物，将细胞膜定位信号(如十四烷基化信号序列)和第二蛋白表达成融合物来实现的。第一和第二蛋白之间的相互作用会使细胞生长信号传导蛋白重新定位于细胞膜，从而触发细胞生长。然后选出攻击性生长的细胞作进一步研究。该系统与上述的双杂交系统不同，因为它不依靠两种杂交物定位于细胞核。
术语“诱饵”指上述双杂交测试中的蛋白质，它和DNA结合域表达成融合蛋白。
术语“捕获物”指上述双杂交测试中与DNA激活域一起表达成融合物的蛋白质。
附图简述：
图1显示了用作实施例1B描述的双杂交筛选中的诱饵的半胱天冬蛋白酶-8单链构建物的示意图。
图2是从cDNA克隆获得的编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的克隆32的初步部分核苷酸(SEQ ID NO：1)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3显示了由克隆J2的5′延伸区、EST克隆AA460869和外显子诱捕克隆L48741组成的N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶的推定人核苷酸全长序列(SEQ ID NO：3)和推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图4A显示了在单用p55 TNF受体(标为p55 TNFR)、p55 TNF受体与p35、半胱天冬蛋白酶的杆状病毒抑制剂(p55+p35)或克隆J2(p55+J2)、或p55 TNF受体与不能切割的J2突变体(标为J*，图3的346位Asp置换成Glu)转染HEK-293T细胞后克隆J2的功能活性，该活性用凋亡细胞百分数表示。这些突变体在体内和体外都不能被切割。
图4B显示了单独的、或用p35或J2或J2*转染后经TNF和环己酰亚胺处理的凋亡的HeLa细胞的百分数。
图5A显示了克隆P74 5′端的1725个编码碱基对(SEQ ID NO：5)。
图5B显示了从图5A的克隆P74的序列推导出的574个氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图6显示了从登录号RPC15-1057I20的PAC克隆的推导氨基酸序列衍生的开放读框的1428个氨基酸(SEQ ID NO：7)。
图7显示了从克隆p74的推导氨基酸序列(称为“克隆的”)衍生的开放读框的574个氨基酸与从PAC克隆RPCI5-1057I20的推导氨基酸序列(称为“推导的”)衍生的开放读框的1428个氨基酸的序列对比。
图8显示了PAC克隆RPCI5-1057I20的推导氨基酸序列(顶部序列)(SEQ ID NO：8)的开放读框与组蛋白脱乙酰酶A序列(底部序列，Genebank登录号NP-006028.1)(SEQID NO：9)的序列对比。
图9A显示了Bid蛋白以及cDNA克隆J2、P16、P43、P70、P74或P79编码的蛋白在35S甲硫氨酸存在时在网织红细胞裂解物中产生并在SDS PAGE凝胶上分离的放射自显影。
图9B显示了Bid蛋白以及cDNA克隆J2、P16、P43、P70、P74或P79编码的蛋白如图9A产生的放射自显影，它们用来分析与在细菌中表达成其两个亚基与GST融合的融合蛋白形式的半胱天冬蛋白酶-8的结合。分子量标记的位置显示在凝胶左侧。
图10显示了部分P43 cDNA克隆编码的蛋白质被半胱天冬蛋白酶-8、半胱天冬蛋白酶-10、半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-9或半胱天冬蛋白酶-3、半胱天冬蛋白酶-9、半胱天冬蛋白酶-10的突变体切割的结果。在所用大肠杆菌中所表达的重组半胱天冬蛋白酶的总细菌裂解物体积用相对单位(RU)表示。分子量标记的位置显示在凝胶左侧。感兴趣的蛋白质用星号作标记：实心箭头显示了大小完整的P43蛋白，空心箭头显示了切割产物。
图11显示了，在用p55 TNF受体和绿色荧光蛋白(称为“PC”)有或没有克隆J2、P16、P27、P43、P79、P74或P70的cDNA插入物下共转染HEK-293T细胞后，双杂交筛选鉴定出的cDNA克隆所编码的蛋白质的功能活性，该活性表示成经历凋亡的细胞百分数。
图12显示了野生型Tip60和不可切割的突变型Tip60在经p55 TNF受体和绿色荧光蛋白共转染的HEK-293T细胞中的细胞死亡抑制活性，以及缺少N端头32个氨基酸的Δ32-Tip60的作用。对照细胞单用pCGN载体转染。
发明详述
本文没有详细描述分子生物学领域的许多方法，因为这些方法是本领域技术人员众所周知的。这些方法包括定点诱变、PCR克隆、用寡核苷酸或cDNA探针的噬菌体文库筛选、cDNA的表达、重组蛋白的分析、细菌和酵母细胞的转化、哺乳动物的转染等。描述这些方法的课本例如是Sambrook等人的《分子克隆实验手册》Cold SpringHarbor Laboratory；ISBN：0879693096，1989，《分子生物学当代方法》，F.M.Ausubel，ISBN：047150338X，1988和《分子生物学简短方法》，F.M.Ausubel等人编辑，第3版，John Wiley和Sons；ISBN：0471137812，1995。这些出版物均全部纳入本文作参考。
为了用双杂交筛选方法鉴定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白和潜在的底物，可以采用双杂交或三杂交系统。
用于本发明方法的双杂交系统基本上如Fields和Song，Nature 340，245页，1989所述。较佳的，个别载体、酵母株和文库可以作为配对双杂交系统(Matchmaker two-hybrid system)(#PT1265-1)的组件购自Clontech(Palo Alto，USA)。
用于本发明方法的酵母双杂交系统的较佳实例在Boldin等人，Cell，85，803-15页，1996中已有所描述。酵母双杂交系统在Brent等人的美国专利5,580,736中有进一步的描述。因此，这些出版物均全部纳入本文作参考。
所用的三杂交系统基本上如Tirode等人，J.Biol.Chem，272，22995-9页，1997中所述的那样。为了监测本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，需要半胱天冬蛋白酶-8的两个亚基独立表达。出于那些目的，半胱天冬蛋白酶-8的两个亚基宜在不同启动子控制下分开表达。在一个较佳的实施方案中，在可在酵母中操作的弱启动子控制下表达半胱天冬蛋白酶-8 p10亚基(丝氨酸375至天冬氨酸479)，其与DNA结合域的读框符合。较佳的，该弱启动子是酵母ADH启动子，DNA结合蛋白是酵母转录激活物Gal-4或细菌LexA蛋白的DNA结合域。ADH启动子和Gal4 DNA结合域例如存在于Clontech，Palo alto，USA出售的pGBD中。然而，本领域技术人员显然可以采用其它启动子，只要该启动子在酵母细胞中有效即可。利用相同的标记可以采用其它DNA结合域，只要这些DNA结合域没有转录激活功能。
长的有活性的半胱天冬蛋白酶-8 p20亚基(丝氨酸217至天冬氨酸374)在酵母细胞中可操作的可诱导启动子的控制下表达成不融合的蛋白质。较佳的，可以采用在上文Tirode等人文章中描述的Met 25甲硫氨酸可阻遏的启动子。可诱导启动子的使用简化了用免疫沉淀和聚丙烯酰胺凝胶电泳对p10-p20复合物的检测。可诱导的启动子还具有其它优点，它使得对酵母细胞可能有毒性的蛋白质在酵母中得以表达，因为有可能限制表达潜在毒性蛋白的期间。
用本发明方法筛选的蛋白宜以cDNA文库的形式提供。然而，也可采用基因组文库或组合文库。将文库克隆在酵母中可操作的转录激活结构域的C端。较佳的，采用酵母Gal-4蛋白的转录激活结构域，然而，也可采用其它许多转录激活子。较佳的，用购自Clontech的pGAD GH载体来克隆文库。
用于筛选的酵母株必须含有选择标记如组氨酸合成酶，其在一启动子的控制下，该启动子含有上述DNA结合域特异性结合的DNA序列。较佳的，酵母细胞还含有在一启动子控制下的报道基因，该启动子含有上述DNA结合域特异性结合的DNA序列。购自Clontech的酵母株HF7c可用来筛选Gal-4结合域杂交物；当用lexA作为DNA结合域时，可以采用株L40。
转化后，将酵母细胞置于选择有活性细胞的条件下，接种到缺少某些氨基酸的培养基中，而这些氨基酸是其中导入质粒稳定性所需的。
培养基对于上述选择标记的基因被激活的酵母细胞是有选择性的。较佳的，选择标记是组氨酸合成酶基因。通过在缺少组氨酸的培养基中培养，可选出表达该基因的酵母细胞。该系统的一个优点是可以在生长培养基中加入组氨酸合成酶抑制剂3-氨基三唑。因此，可以抑制其中表达少量组氨酸合成酶的酵母细胞，该表达由含有上述DNA结合域特异性结合的序列的启动子泄漏而引起。在一些克隆中，半胱天冬蛋白酶-8 p10和/或p20亚基与所述克隆之间的弱的、非特异性相互作用可能使所述启动子假激活。因此，通过增加所述抑制剂在用来选择相互作用克隆的培养基中的浓度，可以选出只与某些极小长度相互作用的克隆。3-氨基三唑的浓度宜为7.5毫摩尔。
通过定量测定其报道基因活性，对能在缺少组氨酸的培养基中生长的克隆作进一步分析。较佳的，用lacZ基因作为报道基因。lacZ活性的定量测定宜在液体培养物中进行，如Boldin等人，J.Biol.Chem.270，7795-8，1995中所述的那样。
上述筛选方法可以类似地用双杂交试验来进行。本质的差别在于半胱天冬蛋白酶-8的两个亚基被表达成单个肽链，它是与上述DNA结合域的融合蛋白。如下所述，p20亚基在其活性位点突变(半胱氨酸360-丝氨酸360)。
较佳的，p10亚基与p20亚基通过一个接头隔开，该接头的长度宜在10至50个氨基酸之间。所述接头宜包含小的不带电荷的氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸和缬氨酸。更佳的，接头由丝氨酸和甘氨酸残基组成。最佳的，甘氨酸残基和丝氨酸残基在所述接头中的比例约为3∶1至4∶1。
用上述半胱天冬蛋白酶-8诱饵的双杂交系统来获得克隆与上述使用三杂交系统相似，只是结合仅仅一个亚基的克隆不易与结合两个亚基的克隆或结合需要两个亚基的复合物的克隆区分开来。然而，通过评价双转化子(即转化了新鉴定的克隆和p10或p20半胱天冬蛋白酶-8亚基的酵母细胞，其中所述亚基与DNA结合域融合)的lacZ活性，在双杂交方法中发现的任何克隆均易测试其与两个亚基的结合。与p10和p20亚基的复合物的结合也很容易评价，方法是测定三联转化子的lacZ活性，其中半胱天冬蛋白酶-8的一个亚基表达成与DNA结合域的融合蛋白，另一个被表达成不融合的蛋白。因此，显然上述三杂交系统也可用来测定在双杂交系统中发现的克隆的结合特征，因为其中使用的可诱导启动子能快速地鉴定出仅与p10亚基或p10-p20亚基复合物相互作用的克隆。
然后，选出能在缺少组氨酸的培养基中生长并表达lacZ活性的克隆作进一步研究。首先，测试克隆所编码的蛋白结合不相关蛋白(如核纤层蛋白)的能力。通常，弃去结合核纤层蛋白的克隆。
然后，对发现与半胱天冬蛋白酶-8特异性相互作用的克隆作进一步分析。这用从上述筛选方法直接获得的部分克隆以及根据所述部分克隆的序列获得的全长克隆来进行。为了获得全长克隆，获得部分克隆的序列，用本领域技术人员已知的方法从酵母细胞中抽提出所述克隆的DNA。然后，将DNA转化入细菌内，以获得大量纯化的可用于测序的DNA。或者，可用限制性酶切下载体内的插入物(宜为上述pGBD载体)，克隆到另一载体(如购自Stratagene的pBluescript)中，以便于测序。测序用链终止方法进行，较佳的是采用United States Biochemicals的测序试剂盒获得的Sequenase2酶。
然后可将如此获得的序列输入数据库搜寻程序，通过计算机搜寻鉴定出重叠的序列。所用的程序是本领域技术人员熟知的，例如包括GCG(genetics computer group″遗传计算机组″)软件包。较佳的是，采用搜寻工具，如从EMBL主机(例如http://dove.embl-heidelberg.de/Blast2/)获得的Basic Local Aligment SearchTool(BLAST)。Blastn命令可用来搜寻在鉴定的克隆中重叠或相似的核苷酸序列。
用本发明方法鉴定的蛋白质与DNA结合域的融合蛋白形式提供。因此，核酸序列应被翻译的读框是已知的，因为它必须与DNA结合域编码序列的读框符合。因此，用本发明鉴定的克隆的DNA序列能被非歧义地翻译成氨基酸序列。然后，可用从上述EMBL主机获得的Blastp程序来鉴定重叠的蛋白序列或相似蛋白。
另外，除了上述搜寻数据库的方法外，可以筛选文库如基因组文库或cDNA文库，以便鉴定完整的克隆。这些筛选方法在上述Sambrook等人以及Ausubel等人的课本中有所描述。另外，可以采用以PCR为基础的克隆技术，如迅速扩增cDNA末端(5′和3′RACE，Graham等人，Biochem Biophys Res Commun 177，8-16页，1991及其参考文献)。
然后，进一步研究在本发明的筛选试验中鉴定的部分克隆，或用任一上述方法获得的全长克隆。这是这样实现的，例如测试这些克隆对于活性半胱天冬蛋白酶-8蛋白水解性消化的敏感性。该试验可在体内进行。为此，用产生待测试克隆编码的蛋白的表达载体以及编码第二蛋白(其表达将诱导半胱天冬蛋白酶-8活性)的表达载体转染哺乳动物细胞系。表达载体宜包含用于表达克隆和第二蛋白的强启动子，如Rous肉瘤病毒(RSV，Yamamoto等人，Cell 22，787-97页，1980)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV，Artelt P等人，Gene 68 213-9页，1988)、巨细胞病毒(CMV，Thomsen，等人，PNAS 81659-63页，1984)，或病毒或细胞来源的类似启动子。
其表达诱导半胱天冬蛋白酶-8活性的第二蛋白选自Fas-胞内结构域、CD120a胞内结构域、Mort-1、半胱天冬蛋白酶-8、或能诱导半胱天冬蛋白酶-8活性的等价蛋白。或者，可通过TNF或CD95-配体的处理将半胱天冬蛋白酶-8活性导入细胞内。详细描述可能的机制以及此类实验其它技术细节的实验在上述Boldin等人，Cell 1996中能够找到。
在将编码第二蛋白和待测蛋白的上述表达载体导入哺乳动物细胞内后，培养细胞培养物足够长的时间，以使蛋白表达、半胱天冬蛋白酶-8激活或表达、以及待测试蛋白发生断裂。所述时期通常为4至72小时，较佳的为16至30小时，最佳的为20至24小时。为了确定断裂程度，制备全细胞裂解物。或者，可用抗标记抗体或镍-氮川三乙酸层析来纯化标记的蛋白，其试剂和详细方法可从Qiagen GmbH，Hilden，Germany获得。免疫沉淀技术在上述Boldin等人Cell，1996中有所描述。免疫沉淀的试剂和说明能以试剂盒形式从Boehringer Mannheim，Mannheim，Germany获得。
现在用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳对纯化蛋白的全细胞裂解物进行大小分辨。
现在，待测试蛋白或其标记的片段可通过Western印迹技术用抗标记的抗体来显示。较佳的标记是组氨酸标记与抗多组氨酸抗体的组合。然而，可采用其它的标记序列与对其有特异性的抗体的组合，只要抗体保留对标记序列有特异性，即不识别全细胞裂解物中的其它蛋白。断裂的特异性可通过运行对照反应来确认，其中在上述时间内将特异性的半胱天冬蛋白酶抑制剂加入到哺乳动物细胞培养物中。较佳的抑制剂是选自zVAD-fmk，zDEVD-fmk，zIETD-fmk(见Keppler-Hafkemeyer等人，Biochemistry37，16934-42页，1998)。更佳的抑制剂是zVAD-fmk。可采用的其它抑制剂是起半胱天冬蛋白酶细胞抑制剂作用的Bclx或p35蛋白。当这些蛋白质在试验中共同表达时的切割抑制表明切割是半胱天冬蛋白酶特异性的。
测试待测试蛋白是否能被半胱天冬蛋白酶-8切割的第二种试验是体外试验，在酶促反应中将重组产生的半胱天冬蛋白酶-8与待测试的标记的蛋白一起使用。待测试蛋白质可以如上所述生产，方法是将其编码序列克隆到含有强启动子的表达载体中，并转染到哺乳动物细胞内。有利的是，如上所述对待测试蛋白质作标记，从而能通过抗标记抗体或能特异性结合标记序列的其它试剂将其从哺乳动物细胞抽提物中纯化出来。另外，待测试的蛋白质可用体外翻译系统来体外产生。体外翻译技术是本领域技术人员所熟知的，其试剂和详细方法可从例如Stratagene，La Jolla，USA获得。
另外，待测试蛋白质可用例如放射性同位素来标记。有利的是，在采用同位素标记时，体外表达待测试的蛋白质，在体外翻译反应期间加入同位素标记的氨基酸以及未标记的氨基酸。较佳的同位素是S35。更佳的，标记的氨基酸是S35-甲硫氨酸，标记的和未标记的氨基酸之间的比例为1∶1至大约1∶1000。
然后，将重组产生的待测试蛋白和重组产生的半胱天冬蛋白酶-8活性酶合并在合适的缓冲液内，放置足够长的时间以产生切割。较佳的缓冲液和试验的其它较佳参数在上文Boldin等人，Cell 1996中有所描述。较佳的时间通常为10分钟至数小时，较佳的在30分钟和1小时之间。
在使切割发生后，用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使反应物按大小分离。如果采用了同位素标记，则可以干燥凝胶，用照相胶片或磷光显影(phosphoimaging，Fuji)来检测同位素。对待测试蛋白质作标记，并可在Western印迹中用标记特异性抗体来检测。
与没有半胱天冬蛋白酶-8的对照反应相比，在加入了半胱天冬蛋白酶-8蛋白的反应物中出现其它低分子量条带表明受测试蛋白质被半胱天冬蛋白酶-8切割。低分子量条带的大小还表明了切割位点的大概位置。
本发明涉及编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA序列。
另外，本发明还涉及编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的生物活性同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物的DNA序列，以及该序列编码的蛋白质、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物。这些类似物、片段、突变体和衍生物的制备是用标准程序(例如参见Sambrook等人，1989)，其中在编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA序列中，可以缺失、增加一个或多个密码子或被其它密码子取代，从而产生针对天然蛋白质有至少一个氨基酸残基变化的类似物。
在编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物的上述本发明DNA序列中，本发明的一个实施方案还包括能与从天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的编码区衍生的eDNA序列杂交的DNA序列，其中这种杂交在中等严谨条件下进行，且可杂交的DNA序列编码了具有生物活性的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。这些可杂交的DNA序列包括与天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白cDNA序列有相当高度同源性的DNA序列，以及代表了半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白样序列的DNA序列，这些序列例如是编码各种半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白同种型的天然衍生的序列，或编码属于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白样序列组的蛋白、且编码的蛋白具有半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白活性的天然存在的序列。另外，这些序列还可以包括，例如，非天然存在的合成产生的序列，这些序列与天然的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白cDNA序列相似，但是掺入了许多需要的修饰。因此，这些合成的序列包括编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白类似物、片段和衍生物的所有可能的序列，所有这些均具有半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的活性。
如本文所用的，严谨条件是杂交试验中所用的温度、单价阳离子的摩尔浓度以及杂交溶液中甲酰胺百分数的函数。为了确定涉及任何给定系列条件的严谨程度，首先采用了Meinkoth等人(1984)的方程式来测定100％相同性的杂交物的稳定性，该稳定性表示成DNA-DNA杂交物的解链温度Tm：
Tm＝81.5℃+16.6(LogM)+0.41(％GC)-0.61％(form)-500/L，其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中G和C核苷酸的百分数，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，L是杂交物的碱基对长度。Tm从100％相同的杂交物计算值每减少1℃，允许错配的数量就增加约1％。因此，如果在指定盐浓度和甲酰胺浓度下的任何给定杂交实验的Tm比100％杂交物根据Meinkoth方程式计算出的Tm低10℃，则即使有高达约10％的错配，也会发生杂交。
“中等严谨条件”是提供的Tm比含靶序列的理想双链体的Tm(用上式计算出或实际测得)低不超过20℃的那些条件。没有限制，中等严谨条件(比计算出的或测得的杂交物的Tm低15-20℃)是在低于计算出的杂交物的Tm的合适温度下采用2×SSC(标准柠檬酸盐溶液)和0.5％SDS(十二烷基硫酸钠)的洗涤条件。条件的最终严谨度主要取决于洗涤条件，特别是如果所用的杂交条件是允许稳定性较差的杂交物能和稳定的杂交物一起形成的那些条件。然后，较高严谨度的洗涤条件除去了稳定性较低的杂交物。可以和上述中等严谨洗涤条件一起使用的常见的杂交条件是在比Tm低约20-25℃的温度下，在6×SSC(或6×SSPE(标准磷酸盐溶液-EDTA))、5×Denhardt′s试剂、0.5％SDS、100微克/毫升变性的、片段化鲑精DNA的溶液中杂交。如果采用混合的探针，则宜用四甲基氯化铵(TMAC)来代替SSC(Ausubel，1987，1999)。
为了获得上述各种天然存在的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白样序列，可以用天然的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白cDNA或其部分作为探针，采用从各种组织中筛选和分离天然衍生的DNA或RNA样品的标准程序(例如参见Sambrook等人1989中提出的标准程序)。
本发明涉及可用上述筛选试验鉴定的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。本发明还涉及基本对应于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的多肽或蛋白质。术语“基本对应于”不仅包括半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，也包括其类似物的多肽或蛋白。
基本对应于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的类似物，是半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被另一氨基酸取代、或被删除和/或插入而形成的多肽，只要所得的蛋白质基本上呈现出与其所对应的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白同样或更高的生物活性。
为了基本对应于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，在半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白序列中的变化(如同种型)通常较小。虽然变化的数目可以多于10个，但较佳的不多于10个，更佳地不多于5个，最佳地不多于3个这样的变化。尽管任何技术都可运用于发现基本对应于半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的有潜在生物学活性的蛋白质，但是一种这样的方法是对编码该蛋白质的DNA运用常规的诱变方法，产生一些修饰形式。然后，根据它们与各种半胱天冬蛋白酶-8结合和在上述胞内通道的调剂/介导中调节半胱天冬蛋白酶-8活性的能力，对这些克隆表达的蛋白加以筛选。
“保守的”变化是预计不会改变蛋白质活性的那些变化，这些变化通常是首先要筛选的，因为这些变化预计不会明显改变蛋白大小、电荷或构型，因而预计不改变蛋白质的生物特性。
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的保守取代形式包括一种类似物，其中多肽中至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸保守地取代。较佳地，这种取代是根据表1A中下列清单进行，这些取代可用常规实验方法来确定，从而使合成的多肽分子在保持半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白生物活性的同时又具有变化的结构和功能性质。
                         表 IA
            原来的残基             代表性的取代残基
            Ala                    Gly；Ser
            Arg                    Lys
            Asn                    Gln；His
            Asp                    Glu
            Cys                    Ser
            Gln                    Asn
            Glu                    Asp
            Gly                    Ala；Pro
            His                    Asn；Gln
            Ile                    Leu；Val
            Leu                    Ile；Val
            Lys                    Arg；Gln；Glu
            Met                    Leu；Tyr；Ile
            Phe                    Met；Leu；Tyr
            Ser                    Thr
            Thr                    Ser
            Trp                    Tyr
            Tyr                    Trp；Phe
            Val                    Ile；Leu
或者，另一类半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的取代形式是在多肽中删去至少一个氨基酸残基，然后再根据下表IB在其位置插入不同的残基。多肽中可进行的取代类型可依据对不同种类中同源蛋白之间氨基酸变化频率的分析结果，例如Schulz等，G.E.，“蛋白质结构原理”，Springer-Verlag，New York，NY，1978中的表1-2，以及Creighton，T.E.，“蛋白质：结构和分子性能”，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA1983中的图3-9中给出的分析结果。根据这一分析，本文另外定义了保守性取代，该取代能在下列5组之一组中进行互换。
                      表 IB
l.小的脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；
2.极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；
3.极性带正电荷的残基：His、Arg，Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和
5.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。
上述括号中的3个氨基酸残基在蛋白质结构中有特殊作用。Gly是唯一没有侧链的残基，因而它赋予链柔韧性。然而，这会倾向于促进形成除α-螺旋外的二级结构。Pro，因其不同寻常的几何结构，会紧密地约束肽链，并且通常会促进类似于β-转角的结构，而在一些例子中，Cys能够参与二硫键的形成(二硫键的形成在蛋白质折叠中很重要)。应注意，Schulz等(同上)将上面的第1和第2组合二为一。还应注意，Tyr，因其有形成氢键的趋势，因此与Ser和Thr等有显著的亲近关系。
根据本发明进行的保守性氨基酸取代，例如上面所陈述的，都是本领域中已知的，并且预期在氨基酸取代之后可以维持多肽的生物学和结构特性。本发明的大多数缺失和取代是那些不导致蛋白质或多肽分子特性发生根本变化的类型。“特性”以遍举方式(non-inclusive)定义为二级结构(如α-螺旋或β-折叠)的变化和生物活性(结合半胱天冬蛋白酶-8和/或介导半胱天冬蛋白酶-8对细胞死亡的效应)的变化。
可用于本发明来获得半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白类似物的在蛋白质中产生氨基酸替换的例子包括：任何已知的方法步骤，例如在授予Mark等的美国专利RE33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的美国专利5,116,943；授予Namen等的美国专利4,965,195；授予Chong等的美国专利4,879,111；授予Lee等的美国专利5,017,691中给出的方法；以及在美国专利No.4,904,584(Shaw等)中给出的用赖氨酸取代的蛋白质。
除了上述不会明显改变半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白活性的保守性取代外，那些会增加半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白类似物生物活性的保守性取代或保守性稍低而随机性较高的改变，也在本发明范围之内。
当需要证实取代或缺失的确切效果时，本领域技术人员知道，可以通过常规的结合和细胞死亡试验来评估取代、缺失等的效果。用该标准测试方法进行筛选并不需要过多的实验。
可接受的半胱天冬蛋白酶-8类似物是至少保留和半胱天冬蛋白酶-8相互作用的能力从而介导半胱天冬蛋白酶-8在胞内通道中的活性、或调节半胱天冬蛋白酶-8本身活性的那些类似物。通过这种方式，可以产生具有所谓显性阴性效应的类似物，即该类似物在结合半胱天冬蛋白酶-8方面或随后的信号传导或该结合后的其它活性方面有缺陷。例如，这些类似物可用来抑制半胱天冬蛋白酶-8的细胞毒性作用，或增强该作用，这取决于是希望增加细胞死亡还是细胞存活，并取决于这些活性中哪一个是受半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白与半胱天冬蛋白酶-8的相互作用所调节的主要活性(见上文)，这是通过这些类似物与天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白竞争与半胱天冬蛋白酶-8结合或相互作用而产生的。
在遗传水平上，这些类似物通常可以这样制得：对编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变，从而产生编码类似物的DNA，随后合成DNA并在重组细胞培养中表达多肽。类似物通常表现出与天然存在的蛋白相同或更高的定性生物活性，Ausubel等，《当代分子生物学方法》，Greene Publications and WileyInterscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，《分子克隆实验手册》，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
制备本文所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或者制备能编码相同多肽但与天然序列不同的其他核苷酸序列(因为遗传密码已知的简并性允许这些变化)，都可以通过定点特异性诱变编码早先制得的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白类似物或天然半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的DNA来实现。定点特异性诱变可利用特异性的寡核苷酸序列来产生类似物，其中该特异性寡核苷酸序列编码具有所需突变的DNA序列以及足够数目的毗邻核苷酸，以提供具有足够大小和序列复杂度(complexity)的引物序列，从而在被横跨的缺失相接处两侧形成稳定的双链体。通常，较佳的是长度约20-25个核苷酸的引物，在被改变序列的每一侧有约5-10个互补核苷酸。一般，定点特异性诱变技术是本领域中众所周知的，代表性的出版物例如是Adelman等，DNA，2：183(1983)，该文献的公开内容纳入本文作参考。
正如人们所懂得的那样，定点特异性诱变技术通常采用单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括：载体如M13噬菌体，例如公开在Messing等，《大分子和重组DNA的第三届Cleveland研讨会″Third Cleveland Symposium onMacromolecules and Recombinant DNA″》，编者A.Walton，Elsevier，Amsterdam(1981)中，该文献纳入本文作参考。这些噬菌体易从商业上购得，它们的用法通常是本领域技术人员所熟知的。或者，可用含有单链噬菌体复制起点的质粒载体来获得单链DNA(Veira等，Meth.Enzymol.153：3，1987)。
通常，本文所述的定点诱变这样来进行：先获得一单链载体，该载体序列中含有编码有关多肽的DNA序列。用自动化DNA/寡核苷酸合成法制得携带所需突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与含有蛋白质编码序列的单链载体退火，然后用有DNA聚合作用的酶(如大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段)作用，完成携带突变的链的合成。这样，突变序列和第二条链就带有所需的突变。然后用该异源双链载体转化合适的细胞(如大肠杆菌JM101细胞)，并选出含有携带突变序列重排的重组载体的克隆。
在选出了这样的克隆后，可以取出有突变的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白序列，并置于合适的载体中，该载体通常是可用于转染合适宿主的转移载体或表达载体。
因此，利用已知的DNA或RNA扩增技术(如PCR和化学寡核苷酸合成技术)，也可在体外、原位和/或体内检测、获得和/或修饰编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的基因或核酸。PCR可以通过重复的DNA聚合酶反应来扩增(增加数目)特异性DNA序列。该反应可用作克隆的替代手段；而所需的只是有关核酸序列的知识。为了进行PCR，可设计与感兴趣的序列互补的引物。然后通过自动化DNA合成法制得这些引物。因为引物可被设计成与基因的任何部分杂交，因此可创造一些能够容忍互补碱基对存在错配的条件。扩增这些错配区域能导致合成出诱变的产物，从而产生具有新特性的肽(即定点诱变)。另见例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通过联合互补DNA(cDNA)合成技术，并使用反转录酶和PCR反应，可将RNA用作原料来合成催乳素受体的胞外结构域，而不经过克隆。
此外，PCR引物可设计成结合新的限制性位点或具有其他特征，如在待扩增的基因片段末端有终止密码子。在扩增的基因序列的5′和3′端安置限制性位点，可以使编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其片段的基因片段按需进行设计，以便连接载体中的其他序列和/或克隆位点。
PCR及扩增RNA和/或DNA的其它方法是本领域众所周知的，并且根据此处所讲述和给予的指导，无需过多试验就可根据本发明进行使用。已知的DNA或RNA扩增方法包括(但并不限于)：聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增方法(例如参见授予Mullis等的美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等的美国专利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美国专利5,142,033；授予Wilson等的美国专利5,122,464；授予Innis的美国专利5,091,310；授予Gyllensten等的美国专利5,066,584；授予Gelfand等的美国专利4,889,818；授予Silver等的美国专利4,994,370；授予Biswas的美国专利4,766,067；授予Ringold的美国专利4,656,134；和Innis等编辑的《PCR方法：方法和应用指南》)，以及RNA介导的扩增方法，其中使用对靶序列反义的RNA作为模板来合成双链DNA(授予Malek等的美国专利No.5,130,238，其商品名为NASBA)；以及结合了DNA扩增和抗体标记技术的免疫-PCR(Ruzicka等，Science 260：487(1993)；Sano等，Science 258：120(1992)；Sano等，Biotechniques 9：1378(1991))。这些专利和参考文献的全部内容纳入本文作参考。
按类似的方式，半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的生物活性片段(例如任何半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其同种型的片段)，可参考上述半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白类似物所述的方式进行制备。合适的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白片段是那些保留半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的能力，并能介导半胱天冬蛋白酶-8或其它蛋白质与半胱天冬蛋白酶-8直接或间接结合的生物活性的片段。因此，可以制得相对于类似物而言具有上述显性阴性或显性阳性效应的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白片段。应注意，这些片段代表了本发明的一类特殊的类似物，即，它们是衍生自全长半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白序列的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的确定部分(例如任何一种半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其同种型获得的片段)，每个片段或这样的部分具有上述任一所需活性。例如，这样的片段可以是肽。
类似地，衍生物还可通过对半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白及其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基侧链基团进行标准修饰，或者通过将半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白及其类似物或片段偶联于其他分子(如抗体、酶、受体等)来制得，这些技术都是本领域中熟知的。因此，本文所用的术语“衍生物”覆盖了用本领域已知手段对位于残基侧链的官能团或N-端或C-端基团进行修饰而制得的衍生物，这些衍生物均包括在本发明内。衍生物可以具有化学分子部分，例如碳水化合物或磷酸残基，只要这样的组份具有与半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包括：羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得)、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基(alkanoyl)或碳环类的芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离的羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
术语“衍生物”只包括那些没有一个氨基酸变成20种常见的天然氨基酸中的某一种氨基酸的衍生物。
如上所述，可用切割试验来确定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白是否被半胱天冬蛋白酶-8切割。对切割片段进行大小分离，近似地指示出切割位置。
还可进一步确定切割位点，方法是制备待测试蛋白质的缺失突变型，并如上所述测试每个缺失突变型对于半胱天冬蛋白酶-8切割的敏感性。缺失突变体可通过PCR克隆待测蛋白的所需片段来构建，用编码所述待测试蛋白质的克隆的DNA序列作为模板。然后将PCR扩增的片段克隆到表达载体中，因而必须提供ATG起始密码子，较佳的是Kozak序列(Kozak，M，Nucleic Acids Res.12 857-72页，1984)。关于表达蛋白质的进一步详细情况可在上述Qiagen有关组氨酸标记的蛋白质中找到，也可在蛋白质表达概述中找到。蛋白质表达的另一参考文献是上述的《当代方法》，具体是其中第16章。
因此，待测试蛋白质的切割位点可以这样确定：从其制备各种缺失突变体，测定被半胱天冬蛋白酶-8切割的最小的此类缺失突变体。
鉴定切割位点的另一种方法是采用根据待测试克隆的预计蛋白质序列产生的肽。该肽可用化学方法合成，例如Bodanszky和Bodanszky，《肽合成实践》，Springer，NewYork，ISBN 0-387-13471-9和Bodanszky，《肽合成实践》，Springer，New York，ISBN 0-387-12359-4。常规肽合成还可从几家商业公司(例如SynPep Corp.，Dublin，CA USA和California Peptide Research，Inc.，Napa，CA，USA)获得。肽还能以与其它蛋白的融合物形式或非融合形式通过表达编码它的重组DNA来产生，详述见上文《当代方法》的第16章。
为了用肽对待测试蛋白质的切割位点作图谱，将所述蛋白质的预计氨基酸序列分成区域，合成对应于每个区域的肽。另外，合成一多肽，它含有一个区域约一半氨基酸，毗邻还含有直接相邻区域的约一半氨基酸，从而重叠了两个区域之间的边界。该区域含有5-100个氨基酸，较佳的9-40个氨基酸，最佳的20-30个氨基酸。现在如上所述测试整个一组肽被半胱天冬蛋白酶-8切割的敏感性。可提供大量纯的制得的肽。切割反应后，可通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳以及UV检测或染色显色(例如用考马斯蓝)来直接分析。另外，为了更容易检测，可用同位素末端标记来标记肽(例如参见，Shevchnko A，等人，Rapid Commun Mass Spectrom，11，1015-24页，1997)。
在完成上述肽筛选后，进一步研究现在已知包含半胱天冬蛋白酶-8切割位点的肽，可以重复相同的方法，但是从鉴定的肽序列中选出较小的区域。
肽的实际切割位点应符合半胱天冬蛋白酶切割序列XXXD(见Boldin等人，Cell1996和Nicholson等人，《杀伤型半胱天冬蛋白酶》，Trends in Biochem Sci.22，299-306，1997)。通过制备一个氨基酸突变的肽并测试这些突变肽对半胱天冬蛋白酶-8切割的敏感性，可以评价肽中每个氨基酸的构型。待突变的氨基酸宜被选自带电荷非极性氨基酸组的氨基酸(见Lehninger，Biochemistry，Worth，NY，1979，第4章)、最佳的是选自甘氨酸或丙氨酸的氨基酸代替。
通过使关键的氨基酸发生突变，就可产生结合半胱天冬蛋白酶-8、但不对其切割敏感的肽。结合可在非变性条件下用丙烯酰胺凝胶电泳通过肽-半胱天冬蛋白酶-8复合物的大小分离来测试。
还可以构建能与半胱天冬蛋白酶-8的活性半胱氨酸反应从而共价结合所述半胱氨酸的修饰的肽。化学领域技术人员已知的与巯基反应的试剂可用于此目的。这些试剂能可逆地结合。例如，含有巯基的试剂可以和半胱天冬蛋白酶-8活性半胱氨酸的SH基团反应。形成的共价S-S键可通过还原来切割，例如在胞质溶胶中生理条件下，或用使S-S基团还原的试剂(如二硫苏糖醇)。与巯基基团反应的试剂也能不可逆地结合半胱天冬蛋白酶-8。这些试剂也容易在本领域已知的能与巯基反应的交联剂(如PIERCE Life Sciences目录(PIERCE，Rockford，IL，USA)pO-90以及下页)中找到。
与巯基反应的合适基团例如是吡啶二硫基、碘乙酰氨基或马来酰亚氨基。这些基团可通过接头与肽连接，这些接头包含任选的不饱和的脂肪烃链、-O-、-S-、-NH-或芳族基团。接头可被任选地取代。
与巯基反应的基团可通过本领域已知的化学合成方法与肽连接；肽的官能团可以和与巯基反应的基团接头分子的官能团反应。例如，肽序列中存在的或为了产生合适官能团而加入(在赖氨酸情况下是ε-氨基)的赖氨酸残基可以异双官能交联物(例如N-γ-马来酰亚氨丁酰氧-琥珀酰亚胺酯)反应，以产生一个肽，其中所述赖氨酸ε-氨基与交联剂的N-羟基琥珀酰亚胺基团反应，而交联剂的马来酰亚氨基保持不反应，在所述肽特异性结合所述半胱天冬蛋白酶-8时发生的与半胱天冬蛋白酶-8半胱氨酸接触时它与所述半胱氨酸的巯基反应，从而灭活了所述半胱天冬蛋白酶-8。
肽中用来和巯基反应性试剂反应的位置可以选择，以靠近发生半胱天冬蛋白酶-8切割的氨基酸(通常是天冬氨酸)。巯基反应性基团与肽结合所依靠的接头在长度、极性基团(如羟基)、带电荷基团(如硝基和磺基基团)、芳族基团(如苯撑或苯基残基)的存在方面可以不同。接头结构中的这些差异将导致产生含有肽并与巯基反应性试剂共价结合的试剂，该试剂将特异性地结合半胱天冬蛋白酶-8并与其活性半胱氨酸的巯基有效地反应。
通过将所述蛋白质或肽导入哺乳动物细胞中并测定诱导凋亡的试剂在所述细胞中的效果，还可对待测试蛋白质或其肽片段作进一步特性分析。
通过将编码待测试蛋白质的DNA插入载体中，可实现蛋白质或肽在哺乳动物细胞中的表达，其中该载体含有启动子、任选的内含予序列以及剪接供体/受体信号、还任选地包含终止序列。这些技术在上述《当代方法》16章中有综述。
上述启动子、内含子和终止序列可在哺乳动物细胞中操作。启动子宜为强启动子，如上述的RSV、CMV或MPSV启动子。启动子也可以是SV40早期启动子(Everett等人，Nucl.Acids Res.11 2447-64页，1983及其参考文献)或细胞启动子，如β-肌动蛋白启动子或ELF-1启动子(Tokushige等人，J Virol Methods.64 73-80页，1997)。另外，还可采用杂交启动子，如Edamatsu等人(Gene 187，289-94页，1997)描述的lac操纵子和人ELF-1α启动子之间的杂交物、Akagi等人(Kidney Int.51，1265-9页，1997)描述的CMV-β肌动蛋白杂交启动子、或tet操纵序列与CMV启动子的杂交物(Furth等人，PNAS 91，9302-6页，1994及其参考文献)。
在需要表达的蛋白质的编码序列中可以插入内含子序列，该序列可以完整的序列形式(即包括剪接供体和受体位点)插入。这些内含子序列的插入能增强RNA稳定性，从而增强了所需蛋白质的产生。尽管理论上，合适的内含子序列可以选自任何含有内含子的基因，但是较佳的内含子序列是β-肌动蛋白内含子、SV 40内含子以及p55 TNF受体内含子。
内含子序列可含有增强上述启动子转录的增强子元件。
通常，内含子序列还含有赋予组织特异型表达的转录或翻译控制序列。因此，当希望以组织特异性方式表达本发明的蛋白质，可以有利地采用这些内含子序列。含有组织特异性增强子元件的内含子例子是位于人5-氨基乙酰丙酸合成酶2基因内含子8中的红细胞样特异性增强子(Surinya等人，J.Biol.Chem.273 16798-809页，1998)，Huang等人，Nucl.Acids Res.18，937-47页，1990中提供了关于用内含子序列增强蛋白质产生的理论的讨论以及内含子序列的例子。
转录终止序列和聚腺苷酸化信号可以加在编码希望表达的蛋白质的DNA的3′端。这些序列可以在许多或甚至大多数基因中发现。有利的是，采用SV 40聚腺苷酸化信号(Schek等人，Mol Cell Biol.，5386-93页，1992及其参考文献)。
用来在哺乳动物细胞中表达蛋白质的较佳载体是pcDNAHis载体(Invitrogen)，它含有用来驱动编码所需蛋白质的基因表达的CMV启动子。可采用的其它载体包括pCDNA3或pMPSVEH载体。这些载体分别含有CMV和MPSV启动子。
利用待测试的蛋白质的重组表达，现在可以评价所述蛋白质对于半胱天冬蛋白酶-8介导的凋亡信号的作用。为此，凋亡可通过诱导凋亡蛋白(如CD120a胞内结构域、CD95胞内结构域、Mort-l蛋白、半胱天冬蛋白酶-8或其等价物)的过度表达来诱导；或通过触发CD120a、CD95、TRAMP/DR3或其等价受体来激活凋亡信号。受体激活可通过使受体与配体接触或使受体与抗体(较佳的是多克隆抗体)交联来实现(见Engelmann等人，J.Biol.Chem.265，14497-504页，1990)。
尽管受体样CD120a的触发通常需要加入蛋白质合成抑制剂如环己酰亚胺以便得到强的凋亡信号，但是受体胞内结构域或涉及凋亡信号转导的蛋白质的过度表达却不是这样(见Boldin等人，Cell 85，803页，1996)。关于凋亡的检测、培育时间以及其它细节和该试验的参数在上文Boldin等人的文献中已有描述。
表达待测试蛋白质的细胞相对于不表达的细胞死亡可以用多种方法来评价，例如基于DNA片段化或检测凋亡特异性抗原和表位的方法。用来检测凋亡的试剂盒形式的试剂和方法可从上述Boehringer Mannheim和其它公司购得。
还可通过评价细胞的形态学外观来确定细胞死亡。凋亡性细胞死亡的特征是有波状细胞膜，且在没有细胞裂解下细胞收缩。
有利的是，在哺乳动物细胞中表达报道基因，以便提供成功转染的标记。由于转染程序本身产生一些细胞死亡(包括未被转染细胞的死亡)，因此有利的是只评价被转染的细胞。用于此目的的较佳的报道基因是lacZ基因，它很容易通过用Xgal或表现为活性β-半乳糖苷酶的类似试剂培育转染的细胞来检测。然而，还可采用任何其它已知的报道基因，较佳的是产物容易用简单的颜色反应(其结果可用显微镜来评价)来检测的基因。例如，绿色荧光蛋白可用来直接检测而不需要颜色反应。该报道基因需要使用荧光显微镜。
因此，通过只考虑已被转染的细胞(即表达报道基因的细胞)、计数表现出凋亡形态的细胞百分数，就可以评价特定的转染克隆以及从中表达的蛋白质对凋亡的影响。
哺乳动物细胞宜为HeLa细胞或人胚肾(HEK)293-T细胞。转染宜用上述《当代方法》中描述的磷酸钙方法进行。细胞形态在转染后1-150小时评价，较佳的在4-35小时内评价，最佳的在转染后20小时评价。
抗体的产生
多克隆抗体宜在家兔、鸡、小鼠、大鼠、绵羊或类似的哺乳动物中产生。为了产生针对本发明蛋白或肽的抗体，如上所述通过重组DNA技术在哺乳动物细胞中产生蛋白质或肽。还可如上述《当代方法》16章中所述在细菌或昆虫细胞中产生蛋白质。
将蛋白质或肽从产生它们的细胞中纯化出来。蛋白质纯化方法是本领域技术人员已知的，在上述《当代分子生物学方法》16章以及《蛋白质科学当代方法》(Wiley andSons Inc.)第5和6章中有详细描述。有利的是，蛋白质可以与第二蛋白(如谷胱苷肽-S-转移酶等)或序列标记(如组氨酸标记序列)的融合物形式产生。融合或标记蛋白质的使用简化了纯化程序(如上述《当代分子生物学方法》16章以及上述Qiagen组氨酸标记蛋白表达和纯化试剂盒说明书中所述)。
如果蛋白质或肽已经被表达成融合蛋白的形式，则希望在用蛋白质产生抗体前切割融合伙伴，以避免产生针对融合伙伴的抗体。切割融合伙伴以及分离所需蛋白质在上述《当代分子生物学方法》16章中有所描述。用来表达并纯化麦芽糖结合蛋白融合的重组蛋白质的载体、方法和试剂也可从商业途径获得。
在生产本发明的肽时，可能希望不除去融合伙伴，因为融合蛋白可能会刺激针对该肽的抗体产生。通常当从肽产生长度少于50个氨基酸的抗体时，这种考虑是恰当的。
如上所述，肽还可用化学领域已知的化学方法合成。
针对蛋白质的多克隆抗体的产生在《当代免疫学方法》Wiley and Sons Inc.的第2章中有所描述。针对肽的抗体的产生可能需要在方法中作些改变，因为肽与蛋白质相比抗原性通常较低。针对肽的多克隆抗体的产生在上述《当代免疫学方法》第9章中有所描述。
单克隆抗体可以从受免疫动物(尤其是大鼠或小鼠)的脾或淋巴结的B细胞制得，方法是在有利于杂交细胞生长的条件下与无限增殖的B细胞融合。对于鼠B细胞的融合，细胞系Ag-8是较佳的。
产生单克隆抗体的技术在许多文章和课本中有所描述，例如上述的《当代免疫学方法》第2章。该书的第9章中描述了用肽免疫动物。这些动物的脾细胞或淋巴结细胞能以经蛋白质免疫的动物的脾或淋巴结细胞那样使用，来产生书中第2章描述的单克隆抗体。
用来产生单克隆抗体的技术在Kohler和Milstein，Nature 256，495-497以及USP4,376,110中有进一步的描述。
从抗体超变区被几乎随机的序列取代的人抗体基因库中制备抗体的方法在USP5,840,479中有所描述。如果很难用给定的肽或蛋白质对动物免疫的话，则这些抗体是较佳的。一些结构的免疫原性很弱，即使加入佐剂和与其它蛋白质连接成融合构建物，免疫原性也很弱。如果希望使用结构与人抗体相似的抗体(例如当希望抗体在人体内具有低的免疫原性时)，则USP 5,840,479中描述的抗体是更佳的。
一旦鉴定出合适的抗体，就可能需要改变其特性。例如，嵌合抗体可在生产中获得较高的得率。当希望抗体在人体内免疫原性低时，恒定区被人抗体恒定区取代的嵌合抗体是较为需要的。嵌合抗体的产生在许多出版物中有所描述，例如Cabilly等人，PNAS 81，3273页，1984；Morrison等，PNAS 81，6851，1984，Boulianne等人，Nature 312，643页，1984，EP 125023，EP 171496，EP 173494，EP184187，WO86/01533，WO 87/02671以及Harlow和Lane，《抗体实验指南》，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。
另一类抗体是抗独特型抗体。抗独特型(抗-Id)抗体是这样一种抗体，它识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇。Id抗体可这样制得，免疫与单克隆抗体来源动物相同的物种和基因型的动物(例如小鼠品种)，其中该单克隆抗体就是制备的抗-Id所针对的。受免疫动物会识别免疫用抗体的独特型决定簇，并通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-Id抗体)而进行应答。例如参见美国专利No.4,699,880，该专利全部纳入本文作参考。
抗-Id抗体还可用作“免疫原”，在另一动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。该抗-抗-Id与最初诱导抗-Id的单克隆抗体在表位上相同。因此，通过使用针对mAb独特型决定簇的抗体，就可鉴别出表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。
因此，针对本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其类似物、片段或衍生物而产生的单克隆抗体可用于在合适的动物(如BALB/c小鼠)中诱导抗-Id抗体。可用该被免疫小鼠的脾细胞产生分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。此外，抗-Id单克隆抗体还可与载体(如匙孔血蓝蛋白(KLH))偶联，并用于免疫其他的BALB/c小鼠。这些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗体，该抗体具有最初单克隆抗体的结合特性，对上述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、或其类似物、片段或衍生物的表位有特异性。
这样，抗-Id单克隆抗体具有它们自己的独特型表位，或有结构上与被评价表位相似的“独特位”。
术语“抗体”还包括完整的分子及其片段，例如能够结合抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，能够更迅速地从循环系统中清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合性(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。
应理解，根据本文公开的用于完整抗体分子的方法，本发明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他抗体片段也可用于检测和定量测定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。这些片段通常可用木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)通过蛋白酶水解切割产生。
如果抗体能特异性地与某分子反应从而使该分子与抗体结合，那么就称该抗体“能够结合”该分子。术语“表位”指任何分子中能被抗体识别且还能被抗体结合的部分。表位或“抗原决定簇”通常由分子表面化学活性基团(如氨基酸或糖侧链)构成，而且具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。
“抗原”是能被抗体结合、并且还能诱导动物产生能与该抗原表位结合的抗体的分子或分子的一部分。抗原可具有一个或多个表位。上述特异反应指抗原会以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不会与大量由其他抗原引起的其他抗体反应。
本发明中有用的抗体(包括抗体片段)可用于定量或定性检测样品中的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或检测表达本发明半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的细胞存在与否。这可以用免疫荧光技术，利用荧光标记的抗体(见下文)并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测而实现。
用于本发明的抗体(或其片段)可在组织学上被采用，例如在免疫荧光或免疫电子显微术中，用来原位检测本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。原位检测可这样来实现：从患者体内取一份组织样品，然后将经标记的本发明抗体供给该样品。抗体(或其片段)的提供最好是通过将经标记的抗体(及其片段)施加或覆盖在生物样品上。通过采用这种步骤，不仅可以确定是否存在半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，而且能确定其在受检组织中的分布。采用了本发明，一般技术人员容易知道，可对各种组织学方法(例如染色步骤)加以改动来实现这种原位检测。
对于本发明半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的这些试验方法通常包括：使生物样品(如生物液体、组织抽提物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或已在组织培养基中培育过的细胞)在能够鉴别半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的可检测标记抗体存在下进行培育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种方法检测抗体。
生物样品可以用固相支持物或载体(如硝酸纤维素)、或能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体来处理。然后用合适的缓冲液洗涤支持物或载体，再根据本发明上述那样用可检测的标记的抗体处理。再用缓冲液第二次洗涤固相支持物或载体，除去未结合的抗体。然后可用常规方法检测所述固相支持物或载体上所结合的标记的量。
“固相支持物”、“固相载体”、“固体支持物”、“固体载体”、“支持物”或“载体”指能结合抗原或抗体的任何支持物或载体。熟知的支持物或载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。出于本发明的目的，载体的特性可以是不溶的，或在某种程度上可溶。载体材料可以有实际上所有可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持物或载体的结构可以是球形(如在玻珠内)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、测试条带等。较佳的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员可知道用于结合抗体或抗原的其他许多合适的载体，或者能够通过常规实验来确定这些载体。
如上所述的本发明给定量抗体的结合活性可以用众所周知的方法来测定。本领域技术人员能够通过常规实验来确定每次测定的操作条件和最佳试验条件。
其他的步骤，诸如洗涤、搅拌、振荡、过滤等，可增加到试验方法中，这些步骤都是常规的或是具体情况下所需的。
本发明的抗体能够被可检测地标记的一种方法是将该抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，当该酶与合适的底物接触时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学物。可用于可检测地标记抗体的酶包括(但不局限于)：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较来实现。
检测可用其他各种免疫试验实现。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，就可以通过采用放射免疫分析(RIA)来检测R-PTP酶。关于RIA的清楚描述可在《分子生物学中的实验技术和生物化学》(Laboratory Techniques and Biochemistry in MolecularBiology)，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其参见Chard，T.所写的标题为“An Introduction to Radioimmune Assay and RelatedTechniques(放射免疫分析和相关技术的介绍)”的章节，该文献纳入本文作参考。放射性同位素可用g计数器或闪烁计数器等设备或通过放射性自显影来进行检测。
还可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体被暴露于适当波长的光时，就能因荧光而检测出它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白(pycocyanin)、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
抗体还可用发出荧光的金属(如152E或其他镧系金属)进行可检测地标记。这些金属可通过这些金属的螯合基团(如二乙三胺五乙酸(ETPA))与抗体连接。
还可以将抗体偶联化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，检测在化学反应过程中发光的存在来检测带有化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、热吖啶鎓酯(theromatic acridiniumester)、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可通过检测发光来确定。用于标记目的的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
本发明的抗体分子可用于免疫计量试验，也称为“双位点”或“夹心”试验。在典型的免疫计量试验中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固相支持物或载体上，加入一定量的带可检测标记的可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。
典型的且较佳的免疫测量试验包括“正向”试验，在该试验中与固相结合的抗体先与待测试样品接触，通过形成二元固相抗体-抗原复合物从而将抗原从样品中抽提出。在培育合适的时间后，洗涤固相支持物或载体以去除液体样品残余物(包括未反应的抗原，如果有的话)，然后再与含有未知量的标记抗体(其功能为“报道分子”)的溶液接触。在第二次培育使标记抗体通过未标记抗体与结合于固相支持物或载体上的抗原复合之后，第二次洗涤固相支持物或载体，除去未反应的标记抗体。
在另一种“夹心”试验(该试验可与本发明的抗原一起使用)中，使用所谓的“同时”和“反向”试验。同时试验涉及一次培育步骤，因为和固相支持物或载体结合的抗体以及标记抗体被同时加入到测试样品中。在培育结束后，洗涤固体支持物或载体以除去液体样品残余物和未复合的标记抗体。然后象常规的“正向”夹心试验那样，测定与固相支持物或载体结合的标记抗体的存在。
在“反向”试验中，分步先将标记抗体溶液加至液体样品中，然后在培育适当时间后，再加入结合在固相支持物或载体上的未标记抗体。在第二次培育后，以常规方式洗涤固相载体，使其不含被测试样品的残余物和未反应的标记抗体溶液。然后再象“同时”和“正向”试验那样，测定与固相支持物或载体结合的标记抗体的存在。
免疫试验
免疫试验(如RIA或ELISA)的建立在许多文章、课本和其它出版物中已有描述。参见WO 97/03998，48页第4行至52页第27行。本发明的免疫试验有两种通用形式，第一，采用固定化半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或等价肽的免疫试验可用于定量测定半胱天冬蛋白酶-8。第二，采用针对半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白表位的固定化抗体可用来定量测定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。
这些试验可用于诊断，因为在可能涉及这些途径的许多疾病或综合征中需要评价参与凋亡通道的半胱天冬蛋白酶-8以及其它蛋白质的水平。
核酸
预计在本发明筛选中获得的克隆是部分克隆。如果需要，在上文已经描述了完整克隆的获得。完整克隆以及本发明筛选中最初找到的部分克隆的DNA序列可能有各种用途。
例如，为了控制半胱天冬蛋白酶-8相互作用的表达，可能需要在细胞内产生反义RNA。为了这个目的，将编码半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的完整或部分cDNA插入上述含有启动子的表达载体中。插入cDNA的3′端与启动子的3′端毗邻，cDNA的5′端与启动子的3′端被所述cDNA隔开。当cDNA在细胞中表达时，产生了不能编码蛋白的反义RNA。反义RNA存在于细胞中减少了半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白基因的细胞(基因组)拷贝数。
为了生产反义RNA，可采用完整的cDNA。或者，可采用它的片段，其长度宜在9和2000核苷酸之间，更佳的在15和500个核苷酸之间，最佳的在30和150个核苷酸之间。
片段宜对应于cDNA 5′半侧内的区域，更佳的对应于含有5′非翻译区和/或第一外显子区域的5′区域，最佳的含有ATG翻译起始位点。另外，片段可以仅仅对应于5′非翻译区的DNA序列。
合成的寡核苷酸可用作反义寡核苷酸。寡核苷酸宜为DNA寡核苷酸。反义寡核苷酸的长度宜为9至150核苷酸，更佳的为12至60个核苷酸，最佳的为15至50个核苷酸。反义寡核苷酸覆盖的区域宜包括cDNA的3′非翻译区，更佳的含有聚腺苷酸化信号或翻译终止密码子或两者。
Kumar等人在Microbiol Mol Biol Rev.62，1415-1434页中评述了反义RNA的作用机理和反义工具使用的目前状况。Yeh等人在J Bone Miner Res.13，.1870-9，1998中描述了反义寡核苷酸在抑制BMP受体合成中的用途。Meiri等人已经在PNAS 95，15037-15402页，1998中描述了反义寡核苷酸抑制压敏钾通道基因Kvl.4合成的用途。Kondo等人在Oncogene 17，2585-91页，1988中描述了反义寡核苷酸抑制Bcl-x合成的用途。
反义药物的治疗用途在Stix，Sci Am.279，46页，50页，1998，Flanagan在CancerMetastasis Rev 17，169-76页，1998；Guinot和Temsamani在Pathol Biol(Parais)46，347-54页，1998及其参考文献中有所讨论。
在设计反义寡核苷酸时，通常采用增强所需性能的寡核苷酸修饰。例如，用硫代磷酸键代替天然存在于DNA中的磷酸酯键，这主要是因为这些硫代磷酸酯寡核苷酸较不易被细胞酶分解。Peng等人指出，当采用磷酸二酯-硫代磷酸酯混合骨架时，可能会减少硫代磷酸酯寡核苷酸的不希望的体内副作用。较佳的，在60％的寡核苷酸中采用2′-甲氧基核糖核苷酸修饰。这些修饰的寡核苷酸能引起与硫代磷酸酯寡核苷酸所见可比的反义效果。Peng等人还指出，不能支持核糖核酸酶H活性的寡核苷酸类似物没有活性。
因此，本发明的较佳的反义寡核苷酸具有磷酸二酯-硫代磷酸酯混合骨架。较佳的是，在约30-80％、最佳的约60％的寡核苷酸中采用2′-甲氧基核糖核苷酸修饰。
反义寡核苷酸还可引入其它修饰。例如，寡核苷酸分子可以与一基团相连，该基团任选地含有部分不饱和的脂肪族烃链以及一个或多个极性或带电荷基团如羧酸基团、酯基团和醇基团。另外，寡核苷酸可以和肽结构连接，该肽结构宜为膜亲性(membranotropic)肽。这些经修饰的寡核苷酸更容易穿透膜，而这对于它们的功能是关键的，因此可能会显著增强它们的活性。希望到达大脑的反义药物尤其需要膜渗透率。Gerster等人已经在Anal Biochem.262，177-84页，1998中描述了棕榈基连接的寡核苷酸。Shoji等人已经在J Drug Target 5，261-73页，1998中描述了香叶醇连接的寡核苷酸。Soukchareun等人已经在Bioconjug Chem 9，466-75页，1998中描述了与肽(例如膜亲性肽)相连的寡核苷酸及其制备。Wang在J Controlled Release 53，39-48页，1998中描述了反义分子或将分子靶向某些细胞并增强所述细胞摄取寡核苷酸作用的其它药物的修饰。
核酶
给出基因的已知mRNA序列，就可设计核酶，它是特异性结合并切割所述mRNA序列的RNA分子(例如参见Chen等人，Ann.NY Acad.Sci.660，271-3，1992，Zhao和Pick，Nature 365，448页，1993，Shore等人，Oncogene 8，3183，1993，Joseph和Burke，J.Biol.Chem.268，24515，1993，Shimayama等人，Nucleic Acids Symp Ser 29，177页，1993，Cantor等人，PNAS 90，10932页，1993)。
因此，可以设计出切割本发明半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白mRNA的编码核酶的RNA序列。切割位点宜位于编码区内或5′非翻译区内，更佳的在靠近AUG翻译起始密码子的编码区5′部分。
编码本发明核酶的DNA可通过DNA吸收、吸收修饰的DNA(见下文所述的导致膜通透性增强的寡核苷酸修饰和蛋白质修饰)或下文所述的病毒载体介导基因转移来导入细胞。
将半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、肽和DNA导入细胞
本发明提供了半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、从其衍生的肽、反义DNA分子和寡核苷酸。这些工具与治疗或研究有关的用途必需将它们导入活生物的细胞内。出于这个目的，希望改善肽、蛋白质和寡核苷酸的膜通透性。改善寡核苷酸的膜通透性的方法在上文已有讨论。相同的原理，即用亲脂性结构衍生，也可用来产生膜通透性增强的肽和蛋白质。例如，上述的已知的膜亲性肽的序列可以加到肽或蛋白质的序列中。另外，可以用部分亲脂性的结构如上述的烃链(被至少一种极性或带电荷基团取代)来衍生肽或蛋白质。例如，Muranishi等人在Pharm.Research 8，649，1991已经描述了肽的月桂酰衍生物。肽和蛋白质的其它修饰包括氧化甲硫氨酸残基，从而产生亚砜基团，如Zacharia等人，Eur.J.Pharmacol.203，353页，1991所述。Zacharia及其同事还描述了相对疏水性的肽键被其酮亚甲基异酯(COCH2)代替的肽或衍生物。蛋白质和肽化学领域技术人员已知的这些和其它修饰增强了膜的通透性。
增强膜通透性的另一种方式是在细胞表面采用受体，例如病毒受体，以诱导肽或蛋白质的细胞吸收。特异性结合某些细胞表面分子的病毒常采用这种机制。结合后，细胞将病毒带入其内部。细胞表面分子称为病毒受体。例如，整联蛋白分子CAR和AdV已被描述成腺病毒的病毒受体，见Hemmi等人，Hum Gene Ther 9，2363-73页，1998及其参考文献。CD4、GPRl、GPR15和STRL33分子已被鉴定为HIV的受体/共受体，见Edinger等人，Virology，249，367-78页，1998及其参考文献。
因此，将已知结合细胞表面受体的分子和肽、蛋白质或寡核苷酸偶联将增强所述肽、蛋白质或寡核苷酸的膜通透性。形成偶联物的合适基团例子是糖、维生素、激素、细胞因子、运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白等分子。Low等人美国专利5,108,921描述了用这些分子来增强肽、蛋白质和寡核苷酸的膜通透性以及所述偶联物的制备。
Low及其同事还进一步指出，可用诸如叶酸或生物素之类的分子来将偶联物靶向生物体内的多个细胞，因为这些分子的受体表达是丰富的、非特异性的。
在将本发明的肽、蛋白质或寡核苷酸靶向某些种类的细胞或组织时，也可采用上述的细胞表面蛋白来增强本发明所述肽、蛋白质或寡核苷酸的膜通透性。例如，如果希望靶向癌细胞，则宜采用在那些细胞表面上更丰富表达的细胞表面蛋白。例子有叶酸受体、粘蛋白抗原MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、MUC5B和MUC7、糖蛋白抗原KSA、癌胚抗原、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、HER-2/neu、以及人慢性β-促性腺激素。Wang等人(同上，1998)指出采用叶酸来靶向癌细胞，Zhang等人ClinCancer Res 4，2669-76页，1998指出上述其它抗原的每一种均相对丰富存在于各种癌细胞和正常细胞中。
因此，利用上述偶联技术，本发明的蛋白质、肽或寡核苷酸可以如需要的那样靶向某一类型的细胞。例如，如果需要增强淋巴细胞谱系细胞的凋亡性，则例如可利用在这些细胞上表达的MHC II类分子，使本发明的半胱天冬蛋白酶-8阳性调节蛋白或肽靶向这些细胞。这可通过将针对所述MHC II类分子恒定区的抗体或其抗原结合位点与本发明的蛋白质或肽偶联来实现。另外，还描述了各种细胞因子的众多细胞表面受体以及其它细胞通讯分子，这些分子中有许多或多或少地以局限于组织或细胞类型的方式表达。因此，当希望靶向T细胞亚组时，可用CD4 T细胞表面分子来制备本发明的偶联物。CD4-结合分子由HIV病毒提供，其表面抗原gp42能特异性结合CD4分子。在治疗患有基于T细胞的自身免疫反应的患者(如红斑狼疮患者)中，本发明的增强凋亡作用的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或肽能有利地靶向T细胞。
病毒介导的细胞靶向
本发明的蛋白质、肽和反义序列可利用病毒载体来导入细胞。在上述的《当代分子生物学方法》第16章中详细描述了为此目的而采用牛痘载体。腺病毒载体的应用在例如Teoh等人，Blood 92，4591-4601页，1998；Narumi等人，Am J Respir Cell MolBiol 19，936-941页，1998；Pederson等人，J Gastrointest Surg 2，283-91，1998；Guang-Lin等人，Transplant Proc 30，2923-4页，1998及其参考文献；Nishida等人，Spine 23，2437-42，1998；Schwarzenberger等人，J Immunol 161，6383-9页，1998和Cao等人，JImmunol 161，6238-44，1998中有所描述。用逆转录病毒转移反义序列在Daniel等人，JBiomed Sci.5，383-94页，1998中有所描述。
当采用病毒作为载体时，通常用病毒表面蛋白来靶向病毒。由于许多病毒(如上述的腺病毒)在其细胞向性方面是相当非特异性的，因此可能希望通过使用细胞类型或组织特异性启动子来进一步赋予特异性。Griscelli等人，Hum Gene Ther.9 1919-28页，1998指出用心室特异性心肌球蛋白轻链2启动子将由腺病毒介导转移的基因特异性地靶向心脏。
或者，对病毒载体进行工程改造，使其表面上表达其它蛋白质，或将病毒载体的表面蛋白改成插入所需的肽序列。这样可将病毒载体加工成能表达一种或多种附加的表位用来靶向所述病毒载体。例如，根据本发明的指导，可用细胞因子表位、MHC II类结合肽或衍生自归巢分子的表位来靶向病毒载体。
上述工具的应用
本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白与涉及半胱天冬蛋白酶-8蛋白水解活性的半胱天冬蛋白酶-8亚基特异性地相互作用。尽管不希望受理论的束缚，本发明者认为，本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白是半胱天冬蛋白酶-8所涉及的信号传导通道的“下游”元件。上游因子看来通过半胱天冬蛋白酶-8前域(介导蛋白-蛋白相互作用的结构域)结合。看来与众多因子广泛通讯共同形成凋亡反应可能是通过涉及死亡效应结构域(DED)和相关结构域(如位于半胱天冬蛋白酶-8前域内的结构域)的蛋白-蛋白相互作用而介导的。与这些蛋白质相反，本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白可能是细胞死亡过程的直接执行者之一。例如，Tip-60，一种本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，是组蛋白脱乙酰酶。因此，该蛋白质可能直接参与染色质结构的变化。
本发明蛋白质与半胱天冬蛋白酶-8的相互作用可能有几种后果：第一，调节半胱天冬蛋白酶-8的活性。这显示在本文一体内试验中，其中本发明的J2克隆抑制了半胱天冬蛋白酶-8介导的凋亡。
第二，半胱天冬蛋白酶-8相互作用可能通过阻止半胱天冬蛋白酶-8分解而增加其活性，或是通过起抑制剂作用而减少其活性。
第三，半胱天冬蛋白酶-8相互作用的活性可以调节。在本文中通过半胱天冬蛋白酶-8切割半胱天冬蛋白酶-8相互作用的能力而证明了这一点。这些蛋白中的一些可能通过切割而失活。然而，也有可能是蛋白质的活性发生改变，诱导出了新的活性，或是半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白通过切割被激活，正如半胱天冬蛋白酶本身那样。
因此，本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、肽、寡核苷酸和抗体可用来调节半胱天冬蛋白酶-8的活性。在凋亡导致过度的细胞死亡的情况下，希望下调半胱天冬蛋白酶-8。例如，在原发性少突神经胶质疾病引发的多发性硬化、自身免疫眼色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、I型自身免疫心肌炎、急性肝功能衰竭(不管病因)、HCV-介导的慢性肝炎、慢性胃炎如A型胃炎、混合结缔组织病(MCTD)、Crohn疾病、和溃疡性结肠炎中，已提出凋亡信号会引起体组织的破坏。因此，对于患有这些疾病的患者，下调被凋亡性细胞死亡破坏的那些细胞中的半胱天冬蛋白酶-8活性是有益处的。
例如，在上述少突神经胶质疾病中，希望抑制少突神经胶质细胞中的半胱天冬蛋白酶-8活性。细胞表面G蛋白偶联的磷脂溶血磷脂酸受体在少突神经胶质细胞和其它各种脑细胞中表达，但是不在体内其它组织中表达。因此，将本发明的肽或蛋白质靶向这些细胞。可以这样实现：将所述肽或蛋白质与磷脂溶血磷脂酸偶联，或是将特异性识别所述磷脂溶血磷脂酸受体的抗体序列导入病毒载体，从而时使所述病毒载体特异性地结合所述磷脂溶血磷脂酸受体。
类似地，可将本发明的肽或蛋白质靶向参与上述其它疾病以及凋亡性细胞死亡显示介导体内所见组织损伤的其它疾病的其它细胞类型。
同样，本发明的反义RNA、反义寡核苷酸以及核酶可以类似方式靶向上述少突神经胶质细胞或其它疾病中的相应细胞。这样，半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的表达被抑制，而不是半胱天冬蛋白酶-8本身的表达被抑制。许多半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白表达的抑制可能减少了半胱天冬蛋白酶-8的凋亡效应。然而，减少某些半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的表达实际上可能会增加半胱天冬蛋白酶-8的效应，因为某些半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白能起半胱天冬蛋白酶-8活性的负调节剂作用。因此，在考虑用反义寡核苷酸和反义RNA以及核酶进行治疗前，必须首先测试这些试剂在例如上述体内试验中的效应。
另一方面，某些情况可能需要增加半胱天冬蛋白酶-8活性。这可能是上述同一疾病的情况，例如在全身性红斑狼疮场合。然而，待靶向的细胞类型是不同的。例如，在狼疮中，T细胞群可能在胸腺内含有未被破坏的自身反应性细胞。因此，应将本发明的半胱天冬蛋白酶-8上调剂靶向T细胞。最好是将半胱天冬蛋白酶-8上调剂靶向自身反应性细胞。在某些疾病中，例如多发性硬化，估计某些T细胞克隆在疾病发展中起关键作用。因此，可通过使用特异性针对自身反应性T细胞克隆的T细胞受体可变区的一个或多个抗体，用来靶向本发明的半胱天冬蛋白酶-8上调剂(可以是本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或肽)，将本发明的半胱天冬蛋白酶-8上调剂靶向这些细胞。
综上所述，本发明包括含有活性物质的药物制剂，该活性物质含有本发明的一种或多种半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、肽、抗体、核酶、反义RNA或反义寡核苷酸。
本发明还包括一种药物组合物，它含有能感染哺乳动物细胞的病毒载体，其中所述载体含有操作性相连的启动子以及编码本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或肽、核酶、反义RNA、反义寡核苷酸或抗体的DNA序列。病毒载体任选地含有与启动子操作性相连的编码序列，该序列编码位于病毒表面并能结合哺乳动物细胞表面蛋白的肽或蛋白质。表面蛋白宜为能使病毒载体被吸收的蛋白质，最好能以组织或细胞类型特异性方式表达，这样就使病毒载体的靶向得以实现。
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其类似物、片段或衍生物还可用来分离、鉴定和克隆同类的其它蛋白质，即参与胞内信号传导过程、结合半胱天冬蛋白酶-8或功能上相关的蛋白酶或蛋白质的那些蛋白质。在本申请中，可采用上述酵母双杂交系统，或可采用最近开发的利用非严谨性Southern杂交然后PCR克隆的系统(Wilks等人，1989)。在Wilks等人的出版物，描述了两种推定蛋白质-费氨酸激酶的鉴定和克隆，方法是采用非严谨性southern杂交，然后根据激酶基序的已知序列(一种假想的激酶序列)进行PCR克隆。可采用该方法，根据本发明使用半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的序列来鉴定并克隆有关的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的那些序列。
利用本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、或其类似物、片段或衍生物的另一种方法是在亲和层析方法中用它们来分离并鉴定它们能结合的其它蛋白或因子，例如参与胞内信号传导过程的其它蛋白质或因子。在本申请中，可将本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其类似物、片段或衍生物与亲和层析基质个别连接，然后与细胞抽提物或怀疑参与细胞内信号传导过程的分离的蛋白质或因子接触。亲和层析步骤后，就可洗脱、分离并鉴定出与本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其类似物、片段或衍生物结合的其它蛋白质或因子。
如上所述，本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、或其类似物、片段或衍生物还可用作免疫原(抗原)来产生它的特异性抗体。这些抗体也可用于从细胞抽提物或产生半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白或其类似物或片段的转化细胞系中纯化半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白(例如人N-乙酰-葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶或其任一种同种型)。另外，这些抗体可用于诊断目的，用来鉴定与半胱天冬蛋白酶-8介导的FAS-R配体或TNF系统功能异常相关的疾病。因此，如果这些疾病与涉及半胱天冬蛋白酶-8蛋白或半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的功能异常胞内信号传导系统有关，则这些抗体可用作重要的诊断工具。
应注意，本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的分离、鉴定和特性分析可用任一熟知的标准筛选程序来进行。例如，用这些筛选程序中的一种(下文所述的酵母双杂交程序)来鉴定半胱天冬蛋白酶-8蛋白(见Stanger等人1995)，随后是本发明的各种半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白(除了上述的以及下述共有待批专利申请中的其它各种新蛋白)。同样，如上下文所述，可采用其它程序如亲和层析、DNA杂交程序等本领域熟知的技术，来分离、鉴定和特性分析本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或来分离、鉴定和特性分析能与本发明的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白结合的其它蛋白质、因子、受体等。
实施例IA
用来鉴定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的双杂交筛选
用描述成“酵母-三杂交系统”(Tirode F.等人，1997)的改进的酵母双杂交系统筛选半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白及其潜在的底物。采用的个别载体、酵母株和文库是从Clontech(Palo Alto，USA)购得的Matchmaker双杂交系统(#PT1265-1)的组件。
使两个半胱天冬蛋白酶-8亚基在不同启动子控制下分别表达。将短的p10亚基(丝氨酸375至天冬氨酸479)克隆到载体pGBT9(Clontech)中，与酵母Gal4蛋白的DNA结合域(氨基酸1-147，序列编号按Laughon等人，分子和细胞生物学，4，260-267，1984)读框相符。长的有活性的p20亚基(丝氨酸217至天冬氨酸374)在360位突变，即将该位置的半胱氨酸变成丝氨酸(C360S)，使酶的蛋白酶活性失去。使突变从C360Sp20亚基在正调节的Met25启动子控制下在缺少甲硫氨酸的培养基中表达成不融合的蛋白(Sangsoda，Mol Gen Genet.200，407-14页，1985)。可以通过调节酵母细胞生长培养基中的甲硫氨酸浓度来控制启动子推动p20亚基表达的活性，这样就能(1)用毒性蛋白亚基作为诱饵，和(2)控制蛋白-蛋白相互作用对于第三方(即p20亚基)的依赖性。p10和p20表达单元可以位于不同载体内。它们也能在同一载体内。在现在描述的实施例中，采用改进的pGBT9载体pGBT9-3H(见上述Tirode等人)。p20亚基宜和核定位信号一起表达成融合物。
在表达时，在不存在甲硫氨酸时，两个亚基在酵母细胞中相互结合。两个亚基的结合用共免疫沉淀和Western印迹实验证实。
克隆到pGAD GH载体(Durfee等人，Genes Dev 7，555-569)中的B细胞cDNA文库由S.Elledge博士赠与。该载体含有Gal4激活结构域(氨基酸768-881)。该GAL4激活结构域在与GAL4 DNA结合域融合后足以诱导大量的GAL4基因转录活性，见Ma和Ptashne，Cell，48，847-853(1987)。
Keegan等人(1986，同上)描述的GAL上游激活位点(UAS.sub.G)在报道基因(lacZ)以及允许在酵母株HF7c中选择(His)的基因(购自Clontech)的上游区域内。
用上述含有半胱天冬蛋白酶-8的质粒转化HF7c培养物，并如Clontech酵母程序所述的，在缺少色氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸的选择培养基中生长来选择转化子酵母细胞。任选地加入高丝氨酸至80毫克/升。
然后用含有载体的B细胞文库进一步转化所述转化子培养物，然后接种到缺少组氨酸的上述培养基(选择培养基)中。
在选择培养基中任选地添加3-氨基三唑(组胺合成酶抑制剂)。加入抑制剂的作用是控制驱动该基因的启动子在不含半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的酵母细胞中的泄漏。在一些情况下，弱的非特异性的相互作用可能会产生乱真的Gal4-UAG-his启动子转录，从而导致酵母克隆在选择培养基中生长。
选出在选择培养基中生长的转化子，抽提中其中的DNA质粒。然后将DNA转化到能在缺少亮氨酸的培养基中选择的HB101细菌内。
在细菌生长并从中抽提纯化出质粒DNA后，将质粒DNA转化到SFY526酵母细胞内。然后，将SFY526转化子接种到包括组氨酸并含有Xgal的选择培养基上，测试其lacZ活性。然后用Whatman 3MM No.50滤纸提升(lift)酵母菌落(关于菌落提升的描述参见上述Sambrook等人的课本)，然后在铝箔上放置约20秒，转移到液氮中约25秒以冷冻酵母细胞，置于室温下约1分钟以使酵母细胞融化，置于培养皿中Whatmann 3MM No.1滤纸上，该滤纸预先浸泡在含有Xgal和β-巯基乙醇的Z缓冲液(β-半乳糖苷酶反应缓冲液，例如参见Clontech程序、上述Sambrook等人的课本或上述的《当代分子生物学方法》)中。菌落出现蓝色表明有活性的β-半乳糖苷酶。使半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白在该试验中放置数分钟至过夜，较佳的5分钟至3小时，最佳的5分钟至1小时，它通常会显示出蓝色。另外，β-半乳糖苷酶活性可以这样定量测定，即在含有Xgal的培养基中液体培养，离心除去细胞，并用分光光度计测定培养基的吸收值。
然后进一步测试上述筛选过程中鉴定的cDNA克隆与其它蛋白的相互作用。测试这样进行：将待测试克隆与不相关的蛋白(该蛋白与DNA激活结构域表达成融合物)一起转化到pGAD GH载体中。
能在缺少组氨酸的培养基中生长或显示lacZ活性的双转化子表明文库克隆是非特异性结合的。
至于不相关的蛋白，可以采用已知有“粘性”的蛋白(即与其它蛋白非特异性相互作用的蛋白)以及其它不相关的蛋白。例如，测试蛋白质与核纤层蛋白、RIP、RAIDD、TRAF2和MORTl的结合。通常，弃去与核纤层蛋白结合的蛋白质。
还用与lexA DNA结合域融合的半胱天冬蛋白酶-8亚基p10来进行上述三杂交测试。较佳的载体是购自Clontech的pLexA载体。当采用lexA作为DNA结合域时，应采用酵母L40菌株或其等价物。
在上述筛选方法中鉴定出半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，然后用下述的体内或体外切割试验和信号转导试验作进一步分析。
实施例1B：
用来鉴定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的改进的双杂交筛选诱饵
用改进的半胱天冬蛋白酶-8诱饵通过酵母双杂交系统(Fields和Song，1989)来进一步筛选半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。诱饵载体pGBT9(Clontech)表达出单链蛋白质形式的半胱天冬蛋白酶-8。为了产生与活性半胱天冬蛋白酶构型类似的诱饵蛋白，除去前域，使小的亚基2(从丝氨酸375开始到天冬氨酸479为止)与Gal4 DNA结合域融合。小亚基的C端与大亚基1(从丝氨酸217开始到天冬氨酸374为止)的N端间隔有一个16氨基酸的甘氨酸-丝氨酸-接头(GGGGSGGGGSGGGGSG)。这样，通过一个分子的自发折叠，衍生得到活性半胱天冬蛋白酶的两个亚基。将亚基1中活性位点的半胱氨酸突变成丝氨酸(sub 1C360S)。当象半胱天冬蛋白酶-8一样从pcDNAHis载体中过度表达时，通过测定其诱导HEK 293-T细胞凋亡的能力，显示出该单链半胱天冬蛋白酶-8的过度表达在功能上与野生型半胱天冬蛋白酶-8的过度表达相似。单链半胱天冬蛋白酶-8的活性可通过半胱天冬蛋白酶抑制剂p35的共表达来封闭。
如上进行双杂交筛选，只是pGBT9载体(Clontech)表达出上述的单链半胱天冬蛋白酶-8。
实施例2：
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的鉴定
用实施例1A所述的改进的双杂交筛选鉴定出数个编码特异性半胱天冬蛋白酶-8结合蛋白的克隆。酵母中的双杂交测试确证了克隆的结合特异性，但没有检测到与对照蛋白结合。如下所述，分离选出的cDNA克隆，测序，将其核苷酸序列与Genbank中发现的序列比较。
实施例2.1
发现克隆L1含有部分cDNA序列与Stat 1的氨基酸690-750相同。Stat 1被鉴定为结合干扰素-刺激应答元件(ISRE)和γ激活序列(GAS)元件的转录因子(综述见IfficSN，1998)。最近，Stat 1已显示参与组成型半胱天冬蛋白酶水平的调节(Kuiner等人，1997)并起半胱天冬蛋白酶-3体外底物的作用(King P.等人，1998)。提示切割Stat 1可能在调节凋亡反应本身中起作用。
实施例2.2
发现克隆L7编码的部分cDNA与Genbank中发现的EST克隆(登录号AA608733，未给予功能)C端部分几乎完全匹配。
实施例2.3
发现克隆L20与NEFA(登录号462693)的氨基酸104-420相同。NEFA是一种新的蛋白质，它含有碱性氨基酸推定的DNA结合域和潜在的核靶向信号、两个螺旋-环-螺旋(HLH)基序区域，并行的EF-手型基序、EF-手之间富含酸性氨基酸的区域以及亮氨酸拉链基序(Barnikol-Watanabe等人，1994)。还发现NEFA是一种钙结合蛋白，发现它定位于细胞质内和细胞表面上，还可在培养基中检测到。NEFA属于核结合蛋白(nucleobindin)亚家族。然而，还未明确NEFA的生物学作用。克隆L20在体外和体内均被半胱天冬蛋白酶-8所切割。
实施例2.4
发现克隆L12编码的部分cDNA与数据库中发现的人EST克隆(登录号M62097)几乎完全匹配。体外蛋白酶试验显示，克隆L12被半胱天冬蛋白酶-8体外切割。简言之，使体外合成的35S标记蛋白在细菌产生的半胱天冬蛋白酶-8的存在下在蛋白酶缓冲液中培育30-60分钟。在SDS-PAGE上分离蛋白质及其片段，结果用放射自显影或磷显影显示。蛋白酶活性可以用特异性全半胱天冬蛋白酶(pancaspase)抑制剂z-VAD-氟甲基酮封闭。
实施例2.5
发现克隆L5编码的cDNA与Tip60蛋白(登录号3024755)相同。Tip60(Tat相互作用蛋白60kDa)开始时被描述成细胞HIV-Tat反式激活相互作用蛋白(Kamine等人，Virology 216，357-366，1996)，后来显示其具有组蛋白乙酰转移酶活性(Yamamoto和Horikoshi，1997)。除了增强Tat介导HIV启动子激活的作用外，Tip60的生物学作用还有待确定。
在酵母中的双杂交测试中，发现克隆L5与单独的半胱天冬蛋白酶-8亚基2以及p10-p20复合物结合。在实施例2.4所述的体外蛋白酶试验中，克隆L5被半胱天冬蛋白酶-8体外切割。Tip60在与p55 TNF-受体在HeLa和HEK293-T细胞内共同过度表达后，Tip60也以半胱天冬蛋白酶依赖型方式被切割。即使没有蛋白合成抑制剂的存在，在用TNF处理后，它也在HeLa细胞中被切割。简言之，将蛋白质克隆到pcDNAHis载体(Invitrogen)中并和凋亡诱导蛋白(例如p55 TNF-R或半胱天冬蛋白酶-8)一起在HEK 293-T细胞或HeLa细胞中表达。24小时后，收获转染细胞，将0.5-1×106细胞的全细胞裂解液施加到SDS-PAGE上，随后用抗poly-His抗体(Sigma)进行Western印迹。结果用ECL显色。分离出编码与Tip60蛋白匹配的插入物的数个cDNA克隆。发现所有克隆(包括Tip60的“野生型全长”克隆)均缺少从氨基酸94(脯氨酸)延伸至145(苏氨酸)的片段。该部分蛋白质不是乙酰转移酶活性位点部分，认为不是蛋白功能所必需的。发现位置200和203的天冬氨酸残基被丙氨酸残基替换的Tip-60突变体不能被切割。
实施例2.6
发现克隆M26编码的部分cDNA与Genbank中发现的人EST克隆(登录号C18037)几乎完全匹配。在酵母中的双杂交测试中，发现克隆M26单与半胱天冬蛋白酶-8亚基2结合。
实施例3
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的分离
用实施例1B描述的双杂交筛选鉴定出其它几个编码特异性半胱天冬蛋白酶-8结合蛋白的克隆。如下所述，分离选出的cDNA克隆，测序并将其核苷酸序列与Genbank中找到的序列比较。
筛选B细胞文库(Durfee T等人，1993)和Jurkat T-细胞文库。表2显示了第一组克隆的初始特性分析。
表2
    克隆   部分/同源   来源   lacZ(SFY)     插入物长度     切割
    数个   NEFA   所有细胞   +     650-1100     体内/体外
    B33   核结合蛋白   1pr-细胞   +     2000     体内/体外
    B4.2   KIAA0615   雄性脑   +++     3000     体外
    B8.1   EST00156   +++     1500     体内/体外
    B11   磷酸乙醇胺胞苷基转移酶   +++     体外
    B17.1   H23509   婴儿脑   ++     1200
    B13.1   核糖核苷二磷酸还原酶   EBV   +++     700     体外
    B22   亲环蛋白A   +     700
    B27   gbAA936350   +     2700     体内/体外
    B37.1   EBV   EBV   ++++     1400
    J2   AA746639   人   ++++     600     体外/体内
    J40   KIAA0419   雄性脑   ++     2300     体外
体内：293-T细胞和/或HeLa细胞
用实施例1A描述的酵母双杂交方法来分离出编码部分NEFA的部分克隆和克隆B8.1。
实施例3.1
克隆B4(登录号3327044)、B17(登录号H23509)、B27(登录号AA936350)和J40(登录号2887413)编码的cDNA插入物与各自EST的末端同源。
实施例3.2
克隆B11编码的cDNA插入物与CTP-磷酸乙醇胺胞苷基转移酶(ET，登录号D84307)的C端同源。ET是参与磷脂代谢的酶，它催化磷酸乙醇胺转变成CDP-乙醇胺(Nakashima等人，1997)。经上述实施例2.4所述试验证实，克隆B11被半胱天冬蛋白酶-8体外切割。
实施例3.3
克隆B13和B37编码的cDNA插入物与编码EBV基因组一部分的克隆(登录号V01555)的C端同源。
实施例3.4
克隆B22编码的cDNA插入物与T细胞亲环蛋白(登录号Y00052)的C端同源。T-细胞亲环蛋白被鉴定为是环孢菌素A和FK506的胞内受体，并且具有内在的肽基脯氨酸顺反异构酶活性(Haendler B.等人，1987)。
实施例3.5
克隆B33编码的cDNA插入物与核结合蛋白(登录号2506255)的C端同源。核结合蛋白是一种分泌型蛋白，具有与DNA和CA2+结合的性质，它与实施例3.3所述的NEFA蛋白非常相似。核结合蛋白最初被描述成是增强自身免疫lpr小鼠脾细胞中抗DNA抗体产生的55kDa蛋白(Mirua K.等人，1992)。通过上述实施例2.4和2.5的试验证实，B33能在体外和体内被半胱天冬蛋白酶-8切割。
实施例3.6
克隆J2含有的600bp插入物所编码的部分蛋白质序列在体外无细胞系统中以及细胞内表达时产生了约20kDa的多肽。在上述实施例2.4和2.5的试验中，当其与p55TNF-Rs或半胱天冬蛋白酶-8共同表达时，克隆J2编码的多肽在体外以及在体内HEK 293-T细胞和HeLa细胞中被半胱天冬蛋白酶-8切割。
图2提供了克隆J2的核苷酸序列和推定的氨基酸序列。
图3提供了PCR获得的克隆J2的5′延伸序列与公开在数据库中的序列的比较和序列对比，结果揭示克隆J2与人EST(登录号)AA460869同源，对应于推定的人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶和另一个克隆(L48741)，并能组成推定的全长人N-乙酰葡糖胺-6-磷酸脱乙酰酶。
实施例4
克隆J2的功能特性分析
克隆J2最初的功能特性分析揭示它对半胱天冬蛋白酶-8和人p55TNF-Rs诱导的HEK293-T和HeLa细胞凋亡有抑制活性。J2的表达使共转染p55 TNF受体的HEK293-T细胞或经TNF和环己酰亚胺处理的HeLa细胞的凋亡阻遏/延迟25-50％，如图3所示。凋亡性细胞死亡的定量测定这样来进行，方法是在所示构建物转染后20小时表现出凋亡形态的表达β-半乳糖苷酶的细胞部分。数据表示成显示凋亡特征的蓝色细胞占蓝色细胞总计数(每份样品约500个细胞)的平均百分数。或者，用绿色荧光蛋白作为标记，用荧光共焦显微镜检测。
实施例5
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的克隆
用上述实施例1B中描述的诱饵，通过双杂交筛选方法，筛选出pACT2载体(购自Clontech，Palo Alto，USA)表达出的人胎盘cDNA文库。利用该筛选程序鉴定出编码特异性半胱天冬蛋白酶-8结合蛋白的数个克隆。进一步研究克隆P16、P27、P43、P70、P74和P79。
cDNA克隆P43、P16和P74的cDNA插入物测序表明，它们共享某些同源序列。克隆P74具有最长的cDNA插入物，约3000bp，看来它编码的蛋白质具有574个氨基酸的推定开放读框，预计分子量约为68-70kDa。将上述三个cDNA插入物的序列与公众数据库中找到的序列比较。发现克隆P43、P16和P74的cDNA克隆与Genbank中找到的两个EST克隆(W04418和N64095)的序列有一些同源性。所有三个cDNA插入物的序列看来构成了同一蛋白的不同剪接同种型的3′端。对三个cDNA插入物的序列进行序列对比，确认了P74序列中574氨基酸的开放读框(如图5所示)。在另一公众数据库(RPCI5-1057I20；Roswell Park Cancer Institute Human PAC文库)中鉴定的定位于人染色体12q31的基因组克隆中也找到了相似的序列。该PAC克隆的序列推导出的开放读框有1428个氨基酸(如图6所示)，它含有上述具有574氨基酸的开放读框。图7显示了克隆P74(称为“克隆的”)的cDNA插入物推定氨基酸序列的开放读框与PAC克隆(称为“推导的”)序列推导的开放读框的序列对比。
通过克隆P74的推导氨基酸序列与全长PAC克隆的推导序列的比较，看来对应于P74的全长蛋白的5′端较长，可能从图6所示PAC序列的第一个甲硫氨酸和开头的甲硫氨酸中的一个开始。
还发现克隆P74的序列显示出与小鼠和人组蛋白脱乙酰酶的高度同源区(该区域可能是含有组蛋白脱乙酰酶酶促活性位点的结构域)有显著的同源性，提示P74编码的蛋白质可能共享了这些蛋白质的功能。克隆P74部分cDNA的163-1716bp之间的序列显示出与组蛋白脱乙酰酶A(登录号NP_006028)有大约80％的同源性。克隆P74部分cDNA的385-1707bp之间的序列显示出与组蛋白脱乙酰酶5(登录号NP_005465)的序列同源。克隆P74部分cDNA的418-1629bp之间的序列显示出与组蛋白脱乙酰酶mHDA1(登录号AAD09834)的序列同源，而克隆P74部分cDNA的424-1551bp之间的序列显示出与组蛋白脱乙酰酶6(登录号NP_006035)的序列同源。图8中显示了从PAC序列推导的全长蛋白的氨基酸序列与组蛋白脱乙酰酶A(Genebank登录号NP-006028.1)氨基酸序列的序列对比。
实施例6
半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的功能特性分析
A)双杂交筛选中鉴定出的cDNA克隆J2、P16、P43、P70、P74或P79编码的蛋白质，在35S甲硫氨酸存在下、在TnT T7连接的网状细胞裂解液系统CoupledRetyculocyte Lysate System(购自Promega，目录号#L4610)中，表达在网状细胞裂解液中，并在SDS-PAGE凝胶上分离(见图9A)。分析相同量的网状细胞裂解液表达的蛋白质，分析其与上述实施例1B中半胱天冬蛋白酶-8的两个亚基与GST融合并在细菌中表达的融合蛋白GST-S1-S2(C360S)的结合。在单用GST珠粒4℃培育1小时来预先清除后，通过与GST珠粒4℃培育1小时后，使TnT产生的蛋白质与连接了GST珠粒的半胱天冬蛋白酶-8 GST-S2-S1融合蛋白一起沉淀，洗涤GST沉淀物，通过在含有SDS的样品缓冲液中沸腾并用SDS-PAGE分离，从珠粒分离出与半胱天冬蛋白酶-8结合的蛋白质。这样，就可通过放射自显影使能结合半胱天冬蛋白酶-8构建物的蛋白质显色。与GST-S1-S2(C360S)和Bid(Fas凋亡信号通道中的一种已知的邻近的半胱天冬蛋白酶-8底物)的结合相比，克隆P74编码的蛋白质看来在体外特异性地结合半胱天冬蛋白酶-8(见图9B)。在图中，网状细胞裂解液产生的全长蛋白质用星号作标记。
在上述实施例1A中描述的双杂交测试中，发现P74编码的蛋白质与半胱天冬蛋白酶8的两个亚基编码的融合蛋白结合，但是不与单独表达的半胱天冬蛋白酶-8小亚基结合。相比而言，上述实施例中提到的其它蛋白质，如Tip60，却与单独表达的半胱天冬蛋白酶-8的S2小亚基结合(数据未显示)。
B)用TnT T7连接的网状细胞裂解液系统，在35S甲硫氨酸存在下，在体外在网状细胞裂解液中表达P43 cDNA编码的蛋白质，使其受在大肠杆菌中表达成组氨酸标记的亚基2-亚基1(S2-S1)融合蛋白的重组野生型或突变型半胱天冬蛋白酶3、半胱天冬蛋白酶9或半胱天冬蛋白酶10切割。半胱天冬蛋白酶-8表达成亚基1-亚基2(S1-S2)-组氨酸标记的融合蛋白。在蛋白酶试验中采用1体积和4体积的总细菌裂解液，定义为1或4个相对单位(RU)(图10)。简言之，在细菌产生的半胱天冬蛋白酶-8存在下，在蛋白酶缓冲液中37C培育体外合成的35S标记蛋白30分钟。在SDS-PAGE上分离蛋白质及其片段，结果用放射自显影或磷光显影来显示。结果表明，用作底物的P43cDNA编码的蛋白质被半胱天冬蛋白酶-8有效切割，受半胱天冬蛋白酶-10的切割较弱，而且不被半胱天冬蛋白酶-3或半胱天冬蛋白酶-9切割(图10)。因此，看来该蛋白质是半胱天冬蛋白酶-8的特异性底物。
C)为了分析新克隆的蛋白质对TNF受体信号传导途径诱导的凋亡性细胞死亡的作用，将所选cDNA克隆到pcDNA 3.1/His C表达载体(购自Invitrogen)中，与pcDNA3载体(Invitrogen)中表达的p55 TNFR受体以及pEGFPC1表达载体(Clontech)表达的绿色荧光蛋白(GFP)瞬时共转染到HEK-293-T细胞中。将Tip60 cDNA和缺少N端开头32个氨基酸的Δ32-Tip60克隆到pCGN载体(M.Tanaka和W.Herr在Cell 60，375-386，1990中有所描述)中，其中血凝素(HA)标记与cDNA的N端融合并用于相同的实验设定。
24小时后，在荧光显微镜下检查转染的细胞，通过测定荧光细胞总数中显示出凋亡形态的细胞数，来对细胞死亡评分。发现克隆到pcDNA-His载体中的部分cDNA所过度表达的P74蛋白保护了HEK-293-T细胞和HeLa细胞不会因p55TNF受体(图11)过度表达或半胱天冬蛋白酶-8的两个融合的亚基(未显示)过度表达诱导而死亡。发现野生型Tip60和不能被切割的Tip60突变型(其中位置200和203的天冬氨酸残基被丙氨酸残基置换)保护HEK-293-T细胞不会因p55 TNF受体(图12)过度表达诱导而死亡，而缺少N-端开头32个氨基酸的Δ32-Tip60没有显示出此保护作用。
在完全描述了本发明后，本领域技术人员将会理解，在不脱离本发明的精神和范围下无需过多实验就能在范围很广的等价参数、浓度和条件内进行同样的发明。
尽管本发明已经联系其具体实例作了描述，但是应当知道它还能作进一步的改进。本申请应当覆盖：大致上根据本发明原理、本文公开的内容、利用本发明所属领域已知或常规技术以及如下文所附权利要求范围内提出的必要特征所作的任何变化、用途或改进。
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应当理解，本文的措词或术语均只是为了便于描述，而非限制性，因此本说明书的措词或术语可由本领域技术人员根据本文的理论和指导结合本领域普通技术人员的知识来作解释。
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                               序列表
<110>依达研究发展有限公司(YEDA RESEARCH AND DEVEL OPMENT CO.，LTD.)
<120>与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的蛋白质
<130>
<140>
<141>
<150>132105
<151>1999-09-28
<150>127721
<151>1998-12-24
<160>9
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>447
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
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<210>2
<211>148
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Arg His Glu Gly Leu Gly Asn Gly Arg His Thr Leu Gly Gln Gln Glu
  1               5                  10                  15
Val Glu Val Asp Gly Leu Thr Ala Tyr Val Ala Gly Glu Arg Pro Asp
             20                  25                  30
Pro Leu Gly Pro Arg Ser Gln Pro Ala Cys Gln Val Ala His Asp Pro
         35                  40                  45
Pro Arg Ala Cys Pro Leu Cys Ser Gln Gly Thr Lys Thr Leu Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Ile Ala Pro Met Asn Val Cys Val Arg Ala Leu Pro Ala Gly His
 65                  70                  75                  80
Arg Phe Ser Met Lys Ser Ala Leu Lys Ala Ala Ser Leu His Pro Ala
                 85                  90                  95
Gln Leu Leu Gly Leu Glu Lys Ser Lys Gly Thr Leu Thr Leu Val Leu
            100                 105                 110
Thr Gln Thr Ser Trp Cys Ser Thr Thr Pro Phe Thr Ser Arg Pro Pro
        115                 120                 125
Thr Ser Arg Val Ser Trp Cys Gly Arg Arg Thr Gln Leu Gly Ser Asp
    130                 135                 140
Lys Asp Leu Gly
145
<210>3
<211>1513
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
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ctccggagcc gctcgctccc gacacggctc acgatgcgcg gcgacagggc cggcgggggc 120
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<210>4
<211>502
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
Gly Ala Ala Pro Leu Ser Ala Gly Val Arg His Trp Ala Arg Asp Leu
  1               5                  10                  15
Ala Ala Ala Gly Leu Arg Ser Arg Ser Leu Pro Thr Arg Leu Thr Met
             20                  25                  30
Arg Gly Asp Arg Ala Gly Gly Gly Pro Val Leu Gln Phe Thr Asn Cys
         35                  40                  45
Arg Ile Leu Arg Gly Gly Lys Leu Leu Arg Glu Asp Leu Trp Val Arg
     50                  55                  60
Gly Gly Arg Ile Leu Asp Pro Glu Lys Leu Phe Phe Glu Glu Arg Arg
 65                  70                  75                  80
Val Ala Asp Glu Arg Arg Asp Cys Gly Gly Arg Ile Leu Ala Pro Gly
                 85              90                      95
Phe Ile Asp Val Gln Ile Asn Arg Gly Phe Gly Val Asp Phe Ser Gln
            100                 105                 110
Ala Thr Glu Asp Val Gly Ser Gly Val Ala Leu Val Ala Arg Arg Ile
        115                 120                 125
Leu Ser His Gly Val Thr Ser Phe Cys Pro Thr Leu Val Thr Ser Pro
    130                 135                 140
Pro Glu Ala Tyr His Lys Val Val Pro Gln Ile Pro Val Lys Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Pro His Gly Ala Gly Val Leu Gly Leu His Leu Glu Gly Pro Phe
                165                 170                 175
Ile Ser Arg Glu Lys Arg Gly Ala His Pro Glu Ala His Leu Arg Ser
            180                 185                 190
Phe Glu Ala Asp Ala Phe Gln Asp Leu Leu Ala Thr Tyr Gly Pro Leu
        195                 200                 205
Asp Asn Val Arg Ile Val Thr Leu Ala Pro Glu Leu Gly Arg Ser His
    210                 215                 220
Glu Val Ile Arg Ala Leu Thr Ala Arg Gly Ile Cys Val Ser Leu Gly
225                 230                 235                 240
His Ser Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Glu Asp Ala Val Trp Ser Gly
                245                 250                 255
Ala Thr Phe Ile Thr His Leu Phe Asn Ala Met Leu Pro Phe His His
            260                 265                 270
Arg Asp Pro Gly Ile Val Gly Leu Leu Thr Ser Asp Arg Leu Pro Ala
        275                 280                 285
Gly Arg Cys Ile Phe Tyr Gly Met Ile Ala Asp Gly Thr His Thr Asn
    290                 295                 300
Pro Ala Ala Leu Arg Ile Ala His Arg Ala His Pro Gln Gly Leu Val
305                 310                 315                 320
Leu Val Thr Asp Ala Ile Pro Ala Leu Gly Leu Gly Asn Gly Arg His
                325                 330                 335
Thr Leu Gly Gln Gln Glu Val Glu Val Asp Gly Leu Thr Ala Tyr Val
            340                 345                 350
Ala Gly Glu Arg Pro Asp Pro Leu Gly Pro Arg Ser Gln Pro Ala Cys
        355                 360                 365
Gln Val Ala His Asp Pro Pro Arg Ala Cys Pro Leu Cys Ser Gln Gly
    370                 375                 380
Thr Lys Thr Leu Ser Gly Ser Ile Ala Pro Met Asn Val Cys Val Arg
385                 390                 395                 400
His Phe Leu Gln Ala Thr Gly Cys Ser Met Glu Ser Ala Leu Glu Ala
                405                 410                 415
Ala Ser Leu His Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Glu Lys Ser Lys Gly
            420                 425                 430
Thr Leu Asp Phe Gly Ala Asp Ala Asp Phe Val Val Leu Asp Asp Ser
        435                 440                 445
Leu His Val Gln Ala Thr Tyr Ile Ser Gly Glu Leu Val Trp Gln Ala
    450                 455                 460
Asp Ala Ala Arg Gln Gln Gly Pro Arg Leu Arg Gly His Leu Ala Ala
465                 470                 475                 480
Ala Gly Cys His Gln Gly Arg Val Val Gly Glu Leu Val Ser Arg Glu
                485                 490                 495
Val Gly Ser Pro Ala Gly
            500
<210>5
<211>1725
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
gagcagctca aaactcacgt ccaggtgatc aagaggtcag ccaagccgag tgagaagccc 60
cggctgcggc agataccctc ggctgaagac ctggagacag atggcggggg accgggccag 120
gtggtggacg atggcctgga gcacagggag ctgggccatg ggcagcctga ggccagaggc 180
cccgctcctc tccagcagca ccctcaggtg ttgctctggg aacagcagcg actggctggg 240
cggctccccc ggggcagcac cggggacact gtgctgcttc ctctggccca gggtgggcac 300
cggcctctgt cccgggctca gtcttcccca gccgcacctg cctcactgtc agccccagag 360
cctgccagcc aggcccgagt cctctccagc tcagagaccc ctgccaggac cctgcccttc 420
accacagggc tgatctatga ctcggtcatg ctgaagcacc agtgctcctg cggtgacaac 480
agcaggcacc cggagcacgc cggccgcatc cagagcatct ggtcccggct gcaggagcgg 540
gggctccgga gccagtgtga gtgtctccga ggccggaagg cctccctgga agagctgcag 600
tcggtccact ctgagcggca cgtgctcctc tacggcacca acccgctcag ccgcctcaaa 660
ctggacaacg ggaagctggc agggctcctg gcacagcgga tgtttgtgat gctgccctgt 720
ggtggggttg gggtggacac tgacaccatc tggaatgagc ttcattcctc caatgcagcc 780
cgctgggccg ctggcagtgt cactgacctc gccttcaaag tggcttctcg tgagctaaag 840
aatggtttcg ctgtggtgcg gcccccagga caccatgcag atcattcaac agccatgggc 900
ttctgcttct tcaactcagt ggccatcgcc tgccggcagc tgcaacagca gagcaaggcc 960
agcaagatcc tcattgtaga ctgggacgtg caccatggca acggcaccca gcaaaccttc 1020
taccaagacc ccagtgtgct ctacatctcc ctgcatcgcc atgacgacgg caacttcttc 1080
ccagggagtg gggctgtgga tgaggtaggg gctggcagcg gtgagggctt caatgtcaat 1140
gtggcctggg ctggaggtct ggaccccccc atgggggatc ctgagtacct ggctgctttc 1200
aggatagtcg tgatgcccat cgcccgagag ttctctccag acctagtcct ggtgtctgct 1260
ggatttgatg ctgctgaggg tcacccggcc ccactgggtg gctaccatgt ttctgccaaa 1320
tgttttggat acatgacgca gcaactgatg aacctggcag gaggcgcagt ggtgctggcc 1380
ttggagggtg gccatgacct cacagccatc tgtgacgcct ctgaggcctg tgtggctgct 1440
cttctgggta acagggtgga tcccctttca gaagaaggct ggaaacagaa acccaacctc 1500
aattccatcc gctctctgga ggccgtgatc cgggtgcaca gtaaatactg gggctgcatg 1560
cagcgcctgg cctcctgtcc agactcctgg gtgcctagag tgccaggggc tgacaaagaa 1620
gaagtggagg cagtaaccgc actggcgtcc ctctctgtgg gcatcctggc tgaagatagg 1680
ccctcggagc agctggtgga ggaggaagaa cctatgaatc tctaa                 1725
<210>6
<211>574
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>6
Glu Gln Leu Lys Thr His Val Gln Val Ile Lys Arg Ser Ala Lys Pro
  1               5                  10                  15
 Ser Glu Lys Pro Arg Leu Arg Gln Ile Pro Ser Ala Glu Asp Leu Glu
              20                  25                  30
 Thr Asp Gly Gly Gly Pro Gly Gln Val Val Asp Asp Gly Leu Glu His
          35                  40                  45
Arg Glu Leu Gly His Gly Gln Pro Glu Ala Arg Gly Pro Ala Pro Leu
     50                  55                  60
Gln Gln His Pro Gln Val Leu Leu Trp Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly
 65                  70                  75                  80
Arg Leu Pro Arg Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val Leu Leu Pro Leu Ala
                 85                  90                  95
Gln Gly Gly His Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gln Ser Ser Pro Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Ala Ser Leu Ser Ala Pro Glu Pro Ala Ser Gln Ala Arg Val Leu
        115                 120                 125
Ser Ser Ser Glu Thr Pro Ala Arg Thr Leu Pro Phe Thr Thr Gly Leu
    130                 135                 140
Ile Tyr Asp Ser Val Met Leu Lys His Gln Cys Ser Cys Gly Asp Asn
145                 150                 155                 160
Ser Arg His Pro Glu His Ala Gly Arg Ile Gln Ser Ile Trp Ser Arg
                165                 170                 175
Leu Gln Glu Arg Gly Leu Arg Ser Gln Cys Glu Cys Leu Arg Gly Arg
            180                 185                 190
Lys Ala Ser Leu Glu Glu Leu Gln Ser Val His Ser Glu Arg His Val
        195                 200                 205
Leu Leu Tyr Gly Thr Asn Pro Leu Ser Arg Leu Lys Leu Asp Asn Gly
    210                 215                 220
Lys Leu Ala Gly Leu Leu Ala Gln Arg Met Phe Val Met Leu Pro Cys
225                 230                 235                 240
Gly Gly Val Gly Val Asp Thr Asp Thr Ile Trp Asn Glu Leu His Ser
                245                 250                 255
Ser Asn Ala Ala Arg Trp Ala Ala Gly Ser Val Thr Asp Leu Ala Phe
            260                 265                 270
Lys Val Ala Ser Arg Glu Leu Lys Asn Gly Phe Ala Val Val Arg Pro
        275                 280                 285
Pro Gly His His Ala Asp His Ser Thr Ala Met Gly Phe Cys Phe Phe
    290                 295                 300
Asn Ser Val Ala Ile Ala Cys Arg Gln Leu Gln Gln Gln Ser Lys Ala
305                 310                 315                 320
Ser Lys Ile Leu Ile Val Asp Trp Asp Val His His Gly Asn Gly Thr
                325                 330                 335
Gln Gln Thr Phe Tyr Gln Asp Pro Ser Val Leu Tyr Ile Ser Leu His
            340                 345                 350
Arg His Asp Asp Gly Asn Phe Phe Pro Gly Ser Gly Ala Val Asp Glu
        355                 360                 365
Val Gly Ala Gly Ser Gly Glu Gly Phe Asn Val Asn Val Ala Trp Ala
    370                 375                 380
Gly Gly Leu Asp Pro Pro Met Gly Asp Pro Glu Tyr Leu Ala Ala Phe
385                 390                 395                 400
Arg Ile Val Val Met Pro Ile Ala Arg Glu Phe Ser Pro Asp Leu Val
                405                 410                 415
Leu Val Ser Ala Gly Phe Asp Ala Ala Glu Gly His Pro Ala Pro Leu
            420                 425                 430
Gly Gly Tyr His Val Ser Ala Lys Cys Phe Gly Tyr Met Thr Gln Gln
        435                 440                 445
Leu Met Asn Leu Ala Gly Gly Ala Val Val Leu Ala Leu Glu Gly Gly
    450                 455                 460
His Asp Leu Thr Ala Ile Cys Asp Ala Ser Glu Ala Cys Val Ala Ala
465                 470                 475                 480
Leu Leu Gly Asn Arg Val Asp Pro Leu Ser Glu Glu Gly Trp Lys Gln
                485                 490                 495
Lys Pro Asn Leu Asn Ser Ile Arg Ser Leu Glu Ala Val Ile Arg Val
            500                 505                 510
His Ser Lys Tyr Trp Gly Cys Met Gln Arg Leu Ala Ser Cys Pro Asp
        515                 520                 525
Ser Trp Val Pro Arg Val Pro Gly Ala Asp Lys Glu Glu Val Glu Ala
    530                 535                 540
Val Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Val Gly Ile Leu Ala Glu Asp Arg
545                 550                 555                 560
Pro Ser Glu Gln Leu Val Glu Glu Glu Glu Pro Met Asn Leu
                565                 570
<210>7
<211>1428
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>7
Met Phe Ala Arg Ser Ala Gly Leu Cys Phe Pro Trp Val Pro Gly Val
  1               5                  10                  15
Ser His Gly Gly Asp Ala Glu Glu Val Leu Ala Gln His Pro Thr Pro
             20                  25                  30
Thr Gly Arg Gly Ala Glu Arg Arg Pro Arg Pro Pro Asp Ser Ser Ala
         35                  40                  45
Glu Gly Asp Pro Gly Met Leu Lys Pro Cys Gly Cys Val Pro Ser Pro
     50                  55                  60
Gln Lys Val Ala Leu Lys Val Gly Ala Pro Phe Cys Thr Cys Gly Cys
 65                  70                  75                  80
Phe Gln Arg Phe His Leu Pro Lys Ala Cys Pro Gly Gln Gln Gly Ser
                 85                  90                  95
Pro Glu Ser Ala Arg Pro Arg Asn Arg Gln Pro Tyr Ala Thr Gln Asn
            100                 105                 110
Gly Pro Ala Pro Arg Pro Gln Val Leu Pro Gly Ser Ser Ser Arg Cys
        115                 120                 125
Cys His Gly Tyr Ile Cys Phe Leu Phe Asp Ser Ser Gln Thr Ala Glu
    130                 135                 140
Val Glu Val Gly Trp Gly Gly Asp Thr Gly Ser Gln Leu Arg Pro Leu
145                 150                 155                 160
Leu Arg Gly Ala Val Tyr Asn Ser Arg Met Trp Asp Ser Gln Lys Glu
                165                 170                 175
Asp Ser Lys Pro Asp Ile Leu Arg Leu Gln Asn Thr Gln Leu Phe His
            180                 185                 190
Ser Val Ser Leu Ser Thr Asp Gly Thr Gln Val Ser Pro Gly Ala His
        195                 200                 205
Tyr Cys Ser Pro Thr Gly Ala Gly Cys Pro Arg Pro Cys Ala Asp Thr
    210                 215                 220
Pro Gly Pro Gln Pro Gln Pro Met Asp Leu Arg Val Gly Gln Arg Pro
225                 230                 235                 240
Pro Val Glu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Gln Arg Pro
                245                 250                 255
Gln Arg Leu His His His Leu Phe Leu Ala Gly Leu Gln Gln Gln Arg
            260                 265                 270
Ser Val Glu Pro Met Arg Val Lys Met Glu Leu Pro Ala Cys Gly Ala
        275                 280                 285
Thr Leu Ser Leu Val Pro Ser Leu Pro Ala Phe Ser Ile Pro Arg His
    290                 295                 300
Gln Ser Gln Ser Ser Thr Pro Cys Pro Phe Leu Gly Cys Arg Pro Cys
305                 310                 315                 320
Pro Gln Leu Ser Met Asp Thr Pro Met Pro Glu Leu Gln Val Gly Pro
                325                 330                 335
Gln Glu Gln Glu Leu Arg Gln Leu Leu His Lys Asp Lys Ser Lys Arg
            340                 345                 350
Ser Lys Glu Val Ala Thr Pro Ala Gln Pro Ser Pro Thr Ser Gln Val
        355                 360                 365
Pro Ala Ala Ala Cys Val Ala Cys Ala Val Ala Ser Ser Val Val Lys
    370                 375                 380
Gln Lys Leu Ala Glu Val Ile Leu Lys Lys Gln Gln Ala Ala Leu Glu
385                 390                 395                 400
Arg Thr Val His Pro Asn Ser Pro Gly Ile Pro Tyr Arg Ser Gln Gly
                405                 410                 415
Pro Cys Ser Gly Gln Cys Pro Cys Ser Val Pro Thr Pro Leu Lys Gln
            420                 425                 430
Pro Trp His Ser Phe Cys Arg Thr Leu Glu Pro Leu Glu Thr Glu Gly
        435                 440                 445
Ala Thr Arg Ser Met Leu Ser Ser Phe Leu Pro Pro Val Pro Ser Leu
    450                 455                 460
Pro Ser Asp Pro Pro Glu His Phe Pro Leu Arg Lys Thr Val Ser Glu
465                 470                 475                 480
Pro Asn Leu Lys Leu Arg Tyr Lys Pro Lys Lys Ser Leu Glu Arg Arg
                485                 490                 495
Lys Asn Pro Leu Leu Arg Lys Glu Ser Ala Pro Pro Ser Leu Arg Arg
            500                 505                 510
Arg Pro Ala Glu Thr Leu Gly Asp Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr
        515                 520                 525
Pro Ala Ser Gly Cys Ser Ser Pro Asn Asp Ser Glu His Gly Pro Asn
    530                 535                 540
Pro Ile Leu Gly Ser Glu Ala Leu Leu Gly Gln Arg Leu Arg Leu Gln
545                 550                 555                 560
Glu Thr Ser Val Ala Pro Phe Ala Leu Pro Thr Val Ser Leu Leu Pro
                565                 570                 575
Ala Ile Thr Leu Gly Leu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Asp Ser Asp Arg
            580                 585                 590
Arg Thr His Pro Thr Leu Gly Pro Arg Gly Pro Ile Leu Gly Ser Pro
        595                 600                 605
His Thr Pro Leu Phe Leu Pro His Gly Leu Glu Pro Glu Ala Gly Gly
    610                 615                 620
Thr Leu Pro Ser Arg Leu Gln Pro Ile Leu Leu Leu Asp Pro Ser Gly
625                 630                 635                 640
Ser His Ala Pro Leu Leu Thr Val Pro Gly Leu Gly Pro Leu Pro Phe
                645                 650                 655
His Phe Ala Gln Ser Leu Met Thr Thr Glu Arg Leu Ser Gly Ser Gly
            660                 665                 670
Leu His Trp Pro Leu Ser Arg Thr Arg Ser Glu Pro Leu Pro Pro Ser
        675                 680                 685
Ala Thr Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Met Gln Pro Arg Leu Glu Gln
    690                 695                 700
Leu Lys Thr His Val Gln Val Ile Lys Arg Ser Ala Lys Pro Ser Glu
705                 710                 715                 720
Lys Pro Arg Leu Arg Gln Ile Pro Ser Ala Glu Asp Leu Glu Thr Asp
                725                 730                 735
Gly Gly Gly Pro Gly Gln Val Val Asp Asp Gly Leu Glu His Arg Glu
            740                 745                 750
Leu Gly His Gly Gln Pro Glu Ala Arg Gly Pro Ala Pro Leu Gln Gln
        755                 760                 765
His Pro Gln Val Leu Leu Trp Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Arg Leu
    770                 775                 780
Pro Arg Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val Leu Leu Pro Leu Ala Gln Gly
785                 790                 795                 800
Gly His Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gln Ser Ser Pro Ala Ala Pro Ala
                805                 810                 815
Ser Leu Ser Ala Pro Glu Pro Ala Ser Gln Ala Arg Val Leu Ser Ser
            820                 825                 830
Ser Glu Thr Pro Ala Arg Thr Leu Pro Phe Thr Thr Gly Leu Ile Tyr
        835                 840                 845
Asp Ser Val Met Leu Lys His Gln Cys Ser Cys Gly Asp Asn Ser Arg
    850                 855                 860
His Pro Glu His Ala Gly Arg Ile Gln Ser Ile Trp Ser Arg Leu Gln
865                 870                 875                 880
Glu Arg Gly Leu Arg Ser Gln Cys Glu Cys Leu Arg Gly Arg Lys Ala
                885                 890                 895
Ser Leu Glu Glu Leu Gln Ser Val His Ser Glu Arg His Val Leu Leu
            900                 905                 910
Tyr Gly Thr Asn Pro Leu Ser Arg Leu Lys Leu Asp Asn Gly Lys Leu
        915                 920                 925
Ala Gly Leu Leu Ala Gln Arg Met Phe Val Met Leu Pro Cys Gly Gly
    930                 935                 940
Val Gly Pro Leu Ala Thr Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Leu Ala Pro
945                 950                 955                 960
Thr Val Pro Gln Gly Leu Ser Arg Val Ser Trp Gly Leu Lys Pro Pro
                965                 970                 975
Pro Gly Pro Asn Pro Lys Ser Arg Pro Ala Pro Cys Pro Trp Gly Pro
            980                 985                 990
Gly Arg Gly Val Gly Thr Thr Pro Leu Gly Pro Gly Ser Cys Val Lys
        995                1000                1005
Pro Trp Met Met Arg Ala Leu Thr Leu Ala Pro Gln Val Asp Thr Asp
   1010                1015                1020
Thr Ile Trp Asn Glu Leu His Ser Ser Asn Ala Ala Arg Trp Ala Ala
1025               1030                1035                1040
Gly Ser Val Thr Asp Leu Ala Phe Lys Val Ala Ser Arg Glu Leu Lys
               1045                1050                1055
Asn Gly Phe Ala Val Val Arg Pro Pro Gly His His Ala Asp His Ser
           1060                1065                1070
Thr Ala Met Gly Phe Cys Phe Phe Asn Ser Val Ala Ile Ala Cys Arg
       1075                1080                1085
Gln Leu Gln Gln Gln Ser Lys Ala Ser Lys Ile Leu Ile Val Asp Trp
   1090                1095                1100
Asp Val His His Gly Asn Gly Thr Gln Gln Thr Phe Tyr Gln Asp Pro
1105               1110                1115                1120
Ser Val Leu Tyr Ile Ser Leu His Arg His Asp Asp Gly Asn Phe Phe
               1125                1130                1135
Pro Gly Ser Gly Ala Val Asp Glu Val Gly Ala Gly Ser Gly Glu Gly
           1140                1145                1150
Phe Asn Val Asn Val Ala Trp Ala Gly Gly Leu Asp Pro Pro Met Gly
       1155                1160                1165
Asp Pro Glu Tyr Leu Ala Ala Phe Arg Ile Val Val Met Pro Ile Ala
   1170                1175                1180
Arg Glu Phe Ser Pro Asp Leu Val Leu Val Ser Ala Gly Phe Asp Ala
1185               1190                1195                1200
Ala Glu Gly His Pro Ala Pro Leu Gly Gly Tyr His Val Ser Ala Lys
               1205                1210                1215
Cys Phe Gly Tyr Met Thr Gln Gln Leu Met Asn Leu Ala Gly Gly Ala
           1220                1225                1230
Val Val Leu Ala Leu Glu Gly Gly His Asp Leu Thr Ala Ile Cys Asp
       1235                1240                1245
Ala Ser Glu Ala Cys Val Ala Ala Leu Leu Gly Asn Arg Val Asp Pro
   1250                1255                1260
Leu Ser Glu Glu Gly Trp Lys Gln Lys Pro Asn Leu Asn Ala Ile Arg
1265               1270                1275                1280
Ser Leu Glu Ala Val Ile Arg Val His Ser Lys Cys Gly Asp Gly Thr
               1285                1290                1295
Leu Ala Glu Leu Arg Leu Lys Asp Leu Gly Gly Thr Leu Pro His Arg
           1300                1305                1310
Gly Gln Ile Leu Gly Phe Arg Cys Gln Pro Gly Asp Leu Leu Leu Val
       1315                1320                1325
Trp Ser Lys Ile Pro Val Ser Asp Pro Gly Ser Asn Gly Glu His Pro
   1330                1335                1340
Pro Val Arg Gly Tyr Pro Leu Ser Pro Pro Asp Gly Ala Ser Arg Ala
1345               1350                1355                1360
Tyr Gln Thr Val Ala Pro Gln Gly Lys Tyr Trp Gly Cys Met Gln Arg
               1365                1370                1375
Leu Ala Ser Cys Pro Asp Ser Trp Val Pro Arg Val Pro Gly Ala Asp
           1380                1385                1390
Lys Glu Glu Val Glu Ala Val Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Val Gly
       1395                1400                1405
Ile Leu Ala Glu Asp Arg Pro Ser Glu Gln Leu Val Glu Glu Glu Glu
   1410                1415                1420
Pro Met Asn Leu
1425
<210>8
<211>1200
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>8
Pro Gln Pro Gln Pro Met Asp Leu Arg Val Gly Gln Arg Pro Pro Val
  1               5                  l0                  15
Glu Pro Pro Pro Glu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Gln Arg Pro Gln Arg
             20                  25                  30
Leu His His His Leu Phe Leu Ala Gly Leu Gln Gln Gln Arg Ser Val
         35                  40                  45
Glu Pro Met Arg Val Lys Met Glu Leu Pro Ala Cys Gly Ala Thr Leu
     50                  55                  60
Ser Leu Val Pro Ser Leu Pro Ala Phe Ser Ile Pro Arg His Gln Ser
 65                  70                  75                  80
Gln Ser Ser Thr Pro Cys Pro Phe Leu Gly Cys Arg Pro Cys Pro Gln
                 85                  90                  95
Leu Ser Met Asp Thr Pro Met Pro Glu Leu Gln Val Gly Pro Gln Glu
            100                 105                 110
Gln Glu Leu Arg Gln Leu Leu His Lys Asp Lys Ser Lys Arg Ser Lys
        115                 120                 125
Glu Val Ala Thr Pro Ala Gln Pro Ser Pro Thr Ser Gln Val ProAla
    130                 135                 140
Ala Ala Cys Val Ala Cys Ala Val Ala Ser Ser Val Val Lys Gln Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ala Glu Val Ile Leu Lys Lys Gln Gln Ala Ala Leu Glu Arg Thr
                165                 170                 175
Val His Pro Asn Ser Pro Gly Ile Pro Tyr Arg Ser Gln Gly Pro Cys
            180                 185                 190
Ser Gly Gln Cys Pro Cys Ser Val Pro Thr Pro Leu Lys Gln Pro Trp
        195                 200                 205
His Ser Phe Cys Arg Thr Leu Glu Pro Leu Glu Thr Glu Gly Ala Thr
    210                 215                 220
Arg Ser Met Leu Ser Ser Phe Leu Pro Pro Val Pro Ser Leu Pro Ser
225                 230                 235                 240
Asp Pro Pro Glu His Phe Pro Leu Arg Lys Thr Val Ser Glu Pro Asn
                245                 250                 255
Leu Lys Leu Arg Tyr Lys Pro Lys Lys Ser Leu Glu Arg Arg Lys Asn
            260                 265                 270
Pro Leu Leu Arg Lys Glu Ser Ala Pro Pro Ser Leu Arg Arg Arg Pro
        275                 280                 285
Ala Glu Thr Leu Gly Asp Ser Ser Pro Ser Ser Ser Ser Thr Pro Ala
    290                 295                 300
Ser Gly Cys Ser Ser Pro Asn Asp Ser Glu His Gly Pro Asn Pro Ile
305                 310                 315                 320
Leu Gly Ser Glu Ala Leu Leu Gly Gln Arg Leu Arg Leu Gln Glu Thr
                325                 330                 335
Ser Val Ala Pro Phe Ala Leu Pro Thr Val Ser Leu Leu Pro Ala Ile
            340                 345                 350
Thr Leu Gly Leu Pro Ala Pro Ala Arg Ala Asp Ser Asp Arg Arg Thr
        355                 360                 365
His Pro Thr Leu Gly Pro Arg Gly Pro Ile Leu Gly Ser Pro His Thr
    370                 375                 380
Pro Leu Phe Leu Pro His Gly Leu Glu Pro Glu Ala Gly Gly Thr Leu
385                 390                 395                 400
Pro Ser Arg Leu Gln Pro Ile Leu Leu Leu Asp Pro Ser Gly Ser His
                405                 410                 415
Ala Pro Leu Leu Thr Val Pro Gly Leu Gly Pro Leu Pro Phe His Phe
            420                 425                 430
Ala Gln Ser Leu Met Thr Thr Glu Arg Leu Ser Gly Ser Gly Leu His
        435                 440                 445
Trp Pro Leu Ser Arg Thr Arg Ser Glu Pro Leu Pro Pro Ser Ala Thr
    450                 455                 460
Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Met Gln Pro Arg Leu Glu Gln Leu Lys
465                 470                 475                 480
Thr His Val Gln Val Ile Lys Arg Ser Ala Lys Pro Ser Glu Lys Pro
                485                 490                 495
Arg Leu Arg Gln Ile Pro Ser Ala Glu Asp Leu Glu Thr Asp Gly Gly
            500                 505                 510
Gly Pro Gly Gln Val Val Asp Asp Gly Leu Glu His Arg Glu Leu Gly
        515                 520                 525
His Gly Gln Pro Glu Ala Arg Gly Pro Ala Pro Leu Gln Gln His Pro
    530                 535                 540
Gln Val Leu Leu Trp Glu Gln Gln Arg Leu Ala Gly Arg Leu Pro Arg
545                 550                 555                 560
Gly Ser Thr Gly Asp Thr Val Leu Leu Pro Leu Ala Gln Gly Gly His
                565                 570                 575
Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gln Ser Ser Pro Ala Ala Pro Ala Ser Leu
            580                 585                 590
Ser Ala Pro Glu Pro Ala Ser Gln Ala Arg Val Leu Ser Ser Ser Glu
        595                 600                 605
Thr Pro Ala Arg Thr Leu Pro Phe Thr Thr Gly Leu Ile Tyr Asp Ser
    610                 615                 620
Val Met Leu Lys His Gln Cys Ser Cys Gly Asp Asn Ser Arg His Pro
625                 630                 635                 640
Glu His Ala Gly Arg Ile Gln Ser Ile Trp Ser Arg Leu Gln Glu Arg
                645                 650                 655
Gly Leu Arg Ser Gln Cys Glu Cys Leu Arg Gly Arg Lys Ala Ser Leu
            660                 665                 670
Glu Glu Leu Gln Ser Val His Ser Glu Arg His Val Leu Leu Tyr Gly
        675                 680                 685
 Thr Asn Pro Leu Ser Arg Leu Lys Leu Asp Asn Gly Lys Leu Ala Gly
     690                 695                 700
 Leu Leu Ala Gln Arg Met Phe Val Met Leu Pro Cys Gly Gly Val Gly
 705                 710                 715                 720
 Pro Leu Ala Thr Leu Ser Ala Phe Leu Ala Ser Leu Ala Pro Thr Val
                 725                 730                 735
Pro Gln Gly Leu Ser Arg Val Ser Trp Gly Leu Lys Pro Pro Pro Gly
            740                 745                 750
Pro Asn Pro Lys Ser Arg Pro Ala Pro Cys Pro Trp Gly Pro Gly Arg
        755                 760                 765
Gly Val Gly Thr Thr Pro Leu Gly Pro Gly Ser Cys Val Lys Pro Trp
    770                 775                 780
Met Met Arg Ala Leu Thr Leu Ala Pro Gln Val Asp Thr Asp Thr Ile
785                 790                 795                 800
Trp Asn Glu Leu His Ser Ser Asn Ala Ala Arg Trp Ala Ala Gly Ser
                805                 810                 815
Val Thr Asp Leu Ala Phe Lys Val Ala Ser Arg Glu Leu Lys Asn Gly
            820                 825                 830
Phe Ala Val Val Arg Pro Pro Gly His His Ala Asp His Ser Thr Ala
        835                 840                 845
Met Gly Phe Cys Phe Phe Asn Ser Val Ala Ile Ala Cys Arg Gln Leu
    850                 855                 860
Gln Gln Gln Ser Lys Ala Ser Lys Ile Leu Ile Val Asp Trp Asp Val
865                 870                 875                 880
His His Gly Asn Gly Thr Gln Gln Thr Phe Tyr Gln Asp Pro Ser Val
                885                 890                 895
Leu Tyr Ile Ser Leu His Arg His Asp Asp Gly Asn Phe Phe Pro Gly
            900                 905                 910
Ser Gly Ala Val Asp Glu Val Gly Ala Gly Ser Gly Glu Gly Phe Asn
        915                 920                 925
Val Asn Val Ala Trp Ala Gly Gly Leu Asp Pro Pro Met Gly Asp Pro
    930                 935                 940
Glu Tyr Leu Ala Ala Phe Arg Ile Val Val Met Pro Ile Ala Arg Glu
945                 950                 955                 960
Phe Ser Pro Asp Leu Val Leu Val Ser Ala Gly Phe Asp Ala Ala Glu
                965                 970                 975
Gly His Pro Ala Pro Leu Gly Gly Tyr His Val Ser Ala Lys Cys Phe
            980                 985                 990
Gly Tyr Met Thr Gln Gln Leu Met Asn Leu Ala Gly Gly Ala Val Val
        995                1000                1005
Leu Ala Leu Glu Gly Gly His Asp Leu Thr Ala Ile Cys Asp Ala Ser
   1010                1015                1020
Glu Ala Cys Val Ala Ala Leu Leu Gly Asn Arg Val Asp Pro Leu Ser
1025               1030                1035                1040
Glu Glu Gly Trp Lys Gln Lys Pro Asn Leu Asn Ala Ile Arg Ser Leu
               1045                1050                1055
Glu Ala Val Ile Arg Val His Ser Lys Cys Gly Asp Gly Thr Leu Ala
           1060                1065                1070
Glu Leu Arg Leu Lys Asp Leu Gly Gly Thr Leu Pro His Arg Gly Gln
       1075                1080                1085
Ile Leu Gly Phe Arg Cys Gln Pro Gly Asp Leu Leu Leu Val Trp Ser
   1090                1095                1100
Lys Ile Pro Val Ser Asp Pro Gly Ser Asn Gly Glu His Pro Pro Val
1105               1110                1115                1120
Arg Gly Tyr Pro Leu Ser Pro Pro Asp Gly Ala Ser Arg Ala Tyr Gln
               1125                1130                1135
Thr Val Ala Pro Gln Gly Lys Tyr Trp Gly Cys Met Gln Arg LeuAla
           1140                1145                1150
Ser Cys Pro Asp Ser Trp Val Pro Arg Val Pro Gly Ala Asp Lys Glu
       1155                1160                1165
Glu Val Glu Ala Val Thr Ala Leu Ala Ser Leu Ser Val Gly Ile Leu
   1170                1175                1180
Ala Glu Asp Arg Pro Ser Glu Gln Leu Val Glu Glu Glu Glu Pro Met
1185               1190                1195                1200
<210>9
<211>1041
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>9
 Pro Ser Ala Val Pro Met Asp Leu Arg Leu Asp His Gln Phe Ser Leu
   1               5                  10                  15
 Pro Val Ala Glu Pro Ala Leu Arg Glu Gln Gln Leu Gln Gln Glu Leu
              20                  25                  30
 Leu Ala Leu Lys Gln Lys Gln Gln Ile Gln Arg Gln Ile Leu Ile Ala
          35                  40                  45
Glu Phe Gln Arg Gln His Glu Gln Leu Ser Arg Gln His Glu Ala Gln
     50                  55                  60
Leu His Glu His Ile Lys Gln Gln Gln Glu Met Leu Ala Met Lys His
 65                  70                  75                  80
Gln Gln Glu Leu Leu Glu His Gln Arg Lys Leu Glu Arg His Arg Gln
                 85                  90                  95
Glu Gln Glu Leu Glu Lys Gln His Arg Glu Gln Lys Leu Gln Gln Leu
            100                 105                 110
Lys Asn Lys Glu Lys Gly Lys Glu Ser Ala Val Ala Ser Thr Glu Val
        115                 120                 125
Lys Met Lys Leu Gln Glu Phe Val Leu Asn Lys Lys Lys Ala Leu Ala
    130                 135                 140
His Arg Asn Leu Asn His Cys Ile Ser Ser Asp Pro Arg Tyr Trp Tyr
145                 150                 155                 160
Gly Lys Thr Gln His Ser Ser Leu Asp Gln Ser Ser Pro Pro Gln Ser
                165                 170                 175
Gly Val Ser Thr Ser Tyr Asn His Pro Val Leu Gly Met Tyr Asp Ala
            180                 185                 190
Lys Asp Asp Phe Pro Leu Arg Lys Thr Ala Ser Glu Pro Asn Leu Lys
        195                 200                 205
Leu Arg Ser Arg Leu Lys Gln Lys Val Ala Glu Arg Arg Ser Ser Pro
    210                 215                 220
Leu Leu Arg Arg Lys Asp Gly Pro Val Val Thr Ala Leu Lys Lys Arg
225                 230                 235                 240
Pro Leu Asp Val Thr Asp Ser Ala Cys Ser Ser Ala Pro Gly Ser Gly
                245                 250                 255
Pro Ser Ser Pro Asn Asn Ser Ser Gly Ser Val Ser Ala Glu Asn Gly
            260                 265                 270
Ile Ala Pro Ala Val Pro Ser Ile Pro Ala Glu Thr Ser Leu Ala His
        275                 280                 285
Arg Leu Val Ala Arg Glu Gly Ser Ala Ala Pro Leu Pro Leu Tyr Thr
    290                 295                 300
Ser Pro Ser Leu Pro Asn Ile Thr Leu Gly Leu Pro Ala Thr Gly Pro
305                 310                 315                 320
Ser Ala Gly Thr Ala Gly Gln Gln Asp Thr Glu Arg Leu Thr Leu Pro
                325                 330                 335
Ala Leu Gln Gln Arg Leu Ser Leu Phe Pro Gly Thr His Leu Thr Pro
            340                 345                 350
Tyr Leu Ser Thr Ser Pro Leu Glu Arg Asp Gly Gly Ala Ala His Ser
        355                 360                 365
Pro Leu Leu Gln His Met Val Leu Leu Glu Gln Pro Pro Ala Gln Ala
    370                 375                 380
Pro Leu Val Thr Gly Leu Gly Ala Leu Pro Leu His Ala Gln Ser Leu
385                 390                 395                 400
Val Gly Ala Asp Arg Val Ser Pro Ser Ile His Lys Leu Arg Gln His
                405                 410                 415
Arg Pro Leu Gly Arg Thr Gln Ser Ala Pro Leu Pro Gln Asn Ala Gln
            420                 425                 430
Ala Leu Gln His Leu Val Ile Gln Gln Gln His Gln Gln Phe Leu Glu
        435                 440                 445
Lys His Lys Gln Gln Phe Gln Gln Gln Gln Leu Gln Met Asn Lys Ile
    450                 455                 460
Ile Pro Lys Pro Ser Glu Pro Ala Arg Gln Pro Glu Ser His Pro Glu
465                 470                 475                 480
Glu Thr Glu Glu Glu Leu Arg Glu His Gln Ala Leu Leu Asp Glu Pro
                485                 490                 495
Tyr Leu Asp Arg Leu Pro Gly Gln Lys Glu Ala His Ala Gln Ala Gly
            500                 505                 510
Val Gln Val Lys Gln Glu Pro Ile Glu Ser Asp Glu Glu Glu Ala Glu
        515                 520                 525
Pro Pro Arg Glu Val Glu Pro Gly Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gln Glu
    530                 535                 540
Leu Leu Phe Arg Gln Gln Ala Leu Leu Leu Glu Gln Gln Arg Ile His
545                 550                 555                 560
Gln Leu Arg Asn Tyr Gln Ala Ser Met Glu Ala Ala Gly Ile Pro Val
                565                 570                 575
Ser Phe Gly Gly His Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gln Ser Ser Pro Ala
            580                 585                 590
Ser Ala Thr Phe Pro Val Ser Val Gln Glu Pro Pro Thr Lys Pro Arg
        595                 600                 605
Phe Thr Thr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Leu Met Leu Lys His Gln Cys
    610                 615                 620
Thr Cys Gly Ser Ser Ser Ser His Pro Glu His Ala Gly Arg Ile Gln
625                 630                 635                 640
Ser Ile Trp Ser Arg Leu Gln Glu Thr Gly Leu Arg Gly Lys Cys Glu
                645                 650                 655
Cys Ile Arg Gly Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Leu Gln Thr Val His
            660                 665                 670
Ser Glu Ala His Thr Leu Leu Tyr Gly Thr Asn Pro Leu Asn Arg Gln
        675                 680                 685
Lys Leu Asp Ser Lys Lys Leu Leu Gly Ser Leu Ala Ser Val Phe Val
    690                 695                 700
Arg Leu Pro Cys Gly Gly Val Gly Val Asp Ser Asp Thr Ile Trp Asn
705                 710                 715                 720
Glu Val His Ser Ala Gly Ala Ala Arg Leu Ala Val Gly Cys Val Val
                725                 730                 735
Glu Leu Val Phe Lys Val Ala Thr Gly Glu Leu Lys Asn Gly Phe Ala
            740                 745                 750
Val Val Arg Pro Pro Gly His His Ala Glu Glu Ser Thr Pro Met Gly
        755                 760                 765
Phe Cys Tyr Phe Asn Ser Val Ala Val Ala Ala Lys Leu Leu Gln Gln
    770                 775                 780
Arg Leu Ser Val Ser Lys Ile Leu Ile Val Asp Trp Asp Val His His
785                 790                 795                 800
Gly Asn Gly Thr Gln Gln Ala Phe Tyr Ser Asp Pro Ser Val Leu Tyr
                805                 810                 815
Met Ser Leu His Arg Tyr Asp Asp Gly Asn Phe Phe Pro Gly Ser Gly
            820                 825                 830
Ala Pro Asp Glu Val Gly Thr Gly Pro Gly Val Gly Phe Asn Val Asn
        835                 840                 845
Met Ala Phe Thr Gly Gly Leu Asp Pro Pro Met Gly Asp Ala Glu Tyr
    850                 855                 860
Leu Ala Ala Phe Arg Thr Val Val Met Pro Ile Ala Ser Glu Phe Ala
865                 870                 875                 880
Pro Asp Val Val Leu Val Ser Ser Gly Phe Asp Ala Val Glu Gly His
                885                 890                 895
Pro Thr Pro Leu Gly Gly Tyr Asn Leu Ser Ala Arg Cys Phe Gly Tyr
            900                 905                 910
Leu Thr Lys Gln Leu Met Gly Leu Ala Gly Gly Arg Ile Val Leu Ala
        915                 920                 925
Leu Glu Gly Gly His Asp Leu Thr Ala Ile Cys Asp Ala Ser Glu Ala
    930                 935                 940
Cys Val Ser Ala Leu Leu Gly Asn Glu Leu Asp Pro Leu Pro Glu Lys
945                 950                 955                 960
Val Leu Gln Gln Arg Pro Asn Ala Asn Ala Val Arg Ser Met Glu Lys
                965                 970                 975
Val Met Glu Ile His Ser Lys Tyr Trp Arg Cys Leu Gln Arg Thr Thr
            980                 985                 990
Ser Thr Ala Gly Arg Ser Leu Ile Glu Ala Gln Thr Cys Glu Asn Glu
        995                1000                1005
Glu Ala Glu Thr Val Thr Ala Met Ala Ser Leu Ser Val Gly Val Lys
   1010                1015                1020
Pro Ala Glu Lys Arg Pro Asp Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Pro Pro
1025               1030                1035                1040
Leu

Claims (32)

1.一种能与半胱天冬蛋白酶-8的亚基1和/或亚基2相互作用的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白，或其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，它是克隆p74或其剪接变体编码的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的蛋白质，所述剪接变体选自克隆p16和p43。
4.根据权利要求1所述的蛋白质，它是克隆L7、L12、M26、B4、B17、J40、B13、B37或B33编码的蛋白质。
5.根据权利要求1所述的蛋白，它在体外被半胱天冬蛋白酶-8切割。
6.根据权利要求1所述的蛋白，它在体内被半胱天冬蛋白酶-8切割。
7.一种分离的DNA序列，它编码权利要求1所述的蛋白。
8.一种分离的DNA序列，它能在中等严谨条件下与权利要求7所述的DNA序列杂交。
9.一种载体，它含有权利要求7或8所述的DNA序列。
10.一种真核或原核宿主细胞，它含有权利要求9所述的载体。
11.一种产生权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物的方法，该方法包括使权利要求10所述的宿主细胞在允许所述蛋白产生的条件下生长，按照需要影响翻译后的修饰，获得所述蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，然后分离所述蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中细胞是原核细胞。
13.根据权利要求11所述的方法，其中细胞是真核细胞。
14.根据权利要求13所述的方法，其中细胞是哺乳动物、昆虫或酵母细胞。
15.根据权利要求14所述的方法，其中细胞是HeLa细胞或293 T HEK细胞。
16.根据权利要求11所述的方法，其中用人CMV启动子作为启动子。
17.一种与半胱天冬蛋白酶-8相互作用的肽，它含有权利要求1所述的蛋白质的至少4个连续的氨基酸。
18.权利要求17所述的肽的衍生物。
19.根据权利要求18所述的肽衍生物，它能在接触所述半胱天冬蛋白酶-8时与半胱天冬蛋白酶-8形成共价键。
20.一种核酶，它对对应于权利要求7或8所述DNA序列的核苷酸序列有特异性。
21.一种反义寡核苷酸，它含有对应于权利要求7或8所述DNA序列的序列的至少9个核苷酸。
22.一种抗体，它针对权利要求1所述的蛋白的表位。
23.一种用于检测半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的免疫试验，该试验含有权利要求22所述的抗体作为试剂。
24.一种用于检测半胱天冬蛋白酶-8的免疫试验，该试验含有权利要求17至19任一项所述的肽。
25.一种用于检测半胱天冬蛋白酶-8的免疫试验，该试验含有权利要求1至4任一项所述的蛋白。
26.一种鉴定半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白的方法，该方法包括下列步骤：
a)提供酵母细胞，该酵母细胞含有与启动子相连的含DNA序列基序的报道基因；
b)在所述酵母细胞中表达所述半胱天冬蛋白酶-8的p20亚基；
c)在所述酵母细胞内表达DNA结合域与所述半胱天冬蛋白酶-8的p10和/或p20亚基的融合蛋白，其中所述DNA结合域能结合所述DNA序列基序；
d)任选地，在所述酵母细胞内表达所述半胱天冬蛋白酶-8的未融合的p10或p20亚基；
e)用由驱动融合蛋白表达的表达载体所组成的文库转化所述酵母细胞培养物，该融合蛋白由cDNA文库和转录激活子组成；
f)从转化的酵母细胞中筛选出报道基因被激活的酵母细胞，和
g)分离步骤f)的酵母细胞，并进一步分离出在其诱饵载体中表达的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白。
27.权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，权利要求20所述的核酶，权利要求21所述的反义寡核苷酸或权利要求22所述的抗体，在调节半胱天冬蛋白酶-8活性中的应用。
28.权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，权利要求20所述的核酶，权利要求21所述的反义寡核苷酸或权利要求22所述的抗体，在调节TNF-受体或Fas介导的效应中的应用。
29.权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，权利要求20所述的核酶，权利要求21所述的反义寡核苷酸或权利要求22所述的抗体，在调节凋亡中的应用。
30.权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，权利要求20所述的核酶，权利要求21所述的反义寡核苷酸或权利要求22所述的抗体，在制备药剂中的应用。
31.权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，权利要求20所述的核酶，权利要求21所述的反义寡核苷酸或权利要求22所述的抗体，在制备用于治疗有原发性少突神经胶质病的多发性硬化、自身免疫眼色素层视网膜炎、糖尿病、狼疮、自身免疫心肌炎I、HCV介导的慢性肝炎、慢性胃炎甲型胃炎、混合结缔组织疾病MCTD、Crohn疾病或溃疡性结肠炎的药剂中的应用。
32.权利要求1所述的半胱天冬蛋白酶-8相互作用蛋白、其同种型、等位基因变体、片段、功能类似物、突变体或衍生物，用来分离、鉴定和克隆其它同类蛋白质的应用。
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