EA005853B1 - N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, взаимодействующая с каспазой-8, и способы ее применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии и раскрывает белки, взаимодействующие с каспазой-8, в частности к N-ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазе человека или к ее вариантам. Изобретение также раскрывает последовательность ДНК, кодирующей белок по изобретению. Представлены вектор, содержащий указанную ДНК, и клетка-хозяин, которая может продуцировать указанный белок. Представлены специфический для указанной ДНК рибозим, а так же антисмысловой олигонуклеотид и антитело к заявленному белку. Белок, рибозим, антитело используются для модуляции активности каспазы-8, апоптоза и, соответственно, для лечения ряда заболеваний, связанных с каспазой-8. Антитело против указанного белка может использоваться в иммуноанализе, а сам белок - для идентификации и выделения белков с подобной активностью.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится в основном к области цистеин-протеаз. Конкретнее, изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8 (МАСН) и/или модулирующим ее функции на пути гибели клеток (или при апоптозе), опосредованном СЭ95 (Еа§/Аро-1) или СЭ120а (рецептор для ΤΝΡ р55).

В частности, настоящее изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8/МАСН прямо или косвенно. Изобретение также относится к получению и применению белков, взаимодействующих с каспазой-8/МАСН.

Предпосылки создания изобретения

Фактор некроза опухоли (ΤΝΡ-альфа) и лимфотоксин (ΤΝΡ-бета) (далее обозначение ΤΝΡ относится как к ΤΝΡ-альфа, так и к ΤΝΡ-бета) являются многофункциональными провоспалительными цитокинами, образованными главным образом мононуклеарными фагоцитами, и оказывают ряд воздействий на клетки (АаПаск Ό, (1986) в 1п1сгГсгоп 7 (1оп Сгс55сг. ей.), рр. 83-122, Асайсппс Ргс55. Ьопйоп; и ВспЙсг апй Ссгага1 (1987). Как ΤΝΡ-альфа, так и ΤΝΡ-бета начинают свое воздействие через связывание со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Некоторые такие воздействия, вероятно, благоприятны для организма: они разрушают, например, опухолевые клетки или клетки, зараженные вирусом, и повышают антибактериальную активность гранулоцитов. В этом отношении ΤΝΡ вносит вклад в защиту организма от опухолей и инфекционных агентов и вносит вклад в восстановление после повреждений. Таким образом, ΤΝΡ можно использовать в качестве противоопухолевого средства, которое при применении связывается со своими рецепторами на поверхности опухолевых клеток и посредством этого инициирует события, приводящие к гибели опухолевых клеток. ΤΝΡ также можно использовать в качестве противоинфекционного средства.

Однако как ΤΝΡ-альфа, так и ΤΝΡ-бета обладают также разрушительным действием. Очевидно, что сверхпродуцирование ΤΝΡ-альфа может играть роль главного патогена при некоторых заболеваниях. Например, известно, что воздействие ΤΝΡ-альфа, в первую очередь, на сосудистую сеть является основной причиной симптомов септического шока ^гассу с! а1., 1986). При некоторых заболеваниях ΤΝΡ может вызвать чрезмерную потерю веса (кахексия), подавляя активность адипоцитов и вызывая анорексию, и поэтому ΤΝΡ-альфа назван кахектином. Он также описан как медиатор повреждения тканей при ревматоидных заболеваниях (ВсиЙсг апй Ссгат1, 1987) и как главный медиатор повреждения, наблюдаемого при реакциях трансплантат против хозяина (Рк|ис1 с! а1., 1987). Кроме того, известно, что ΤΝΡ вовлекается в процесс воспаления и во многие другие болезненные состояния.

Два разных, экспрессируемых независимо, рецептора ΤΝΡ-К р55 (СЭ120а) и р75 (СЭ120Ь), которые специфически связываются как с ΤΝΡ-альфа, так и с ΤΝΡ-бета, инициируют и/или опосредуют указанное выше биологическое действие ΤΝΡ. Эти два рецептора имеют различные по структуре внутриклеточные домены, причем предполагается, что они передают сигнал по-разному (см. Нойтапп с! а1., 1989; Епдс1тапп с! а1., 1990; Вгоскйащ с! а1., 1990; Ьосйсйсг с! а1, 1990; 8сйа11 с! а1., 1990; №рйаг с! а1., 1990; διηίΐΐι с! а1 1990 и Но11сг с! а1., 1990). Однако клеточные механизмы, например различные белки и другие факторы, вовлекаемые во внутриклеточную передачу сигналов СП 120а и СЭ120Ь, еще не выяснены. Речь идет о внутриклеточной передаче сигнала, которая происходит, как правило, после связывания лиганда, т.е. ΤΝΡ (альфа или бета), с рецептором, что является ответственным за начало каскада реакций, конечным результатом которого является наблюдаемая реакция клетки на ΤΝΡ.

Что касается вышеуказанного действия ΤΝΡ, вызывающего гибель клетки, в большинстве клеток, изученных до настоящего времени, то это действие инициируется, главным образом, СЭ120а. Антитела против внеклеточного домена (домена связывания лиганда) СЭ120а сами могут инициировать действие, вызывающее гибель клеток (см. ЕР 412486), коррелирующее с эффективностью поперечного сшивания рецепторов антителами, что предположительно является первой стадией при генерации процесса внутриклеточной передачи сигнала. Далее, исследования мутаций (ВгаксЬиксй с! а1., 1992; Τа^ιад1^а с! а1., 1993) показали, что биологическая функция СЭ120а зависит от целостности его внутриклеточного домена и, соответственно, предполагается, что инициация внутриклеточной передачи сигнала, приводящего к вызывающему гибель клетки действию ΤΝΡ, происходит в результате ассоциации двух или большего числа внутриклеточных доменов СЭ120а. Кроме того, ΤΝΡ (альфа и бета) встречается в виде гомотримера, и как таковой, предположительно, индуцирует внутриклеточную передачу сигнала через СП 120а за счет своей способности связываться с молекулами рецептора и образовывать поперечные сшивки, т.е. вызывать агрегацию рецепторов.

Еще одним членом суперсемейства рецепторов ΤΝΡ/ΝΟΡ является рецептор ΡΑ8/ΑΡΟ1 (СЭ95) , который также называют ΡΑδ-антигеном, белок поверхности клетки, экспрессируемый в различных тканях и гомологичный ряду рецепторов клеточной поверхности, включая ΤΝΡ-К. и ΝΟΡ-К. СП95 опосредует гибель клетки в форме апоптоза (Ной с! а1., 1991) и представляется служащим в качестве отрицательного селектора аутореактивных Т-клеток, т.е. во время созревания Т-клеток СЭ95 опосредует гибель Т-клеток вследствие апоптоза, распознающих аутоантигены. Также обнаружено, что мутации в гене СП95 (1рг) вызывают нарушение лимфопролиферации у мышей, что имеет сходство с аутоиммунной болезнью человека системной красной волчанкой (8ЬЕ) (ΑаΐапаЬс-Ρикипада с! а1., 1992). Оказывается, что лиганд

- 1 005853

СО95 представляет собой молекулу, связанную с поверхностью клетки, содержащейся среди прочих в киллерных Т-клетках (или цитотоксичных Т-лимфоцитах СТЬ), и, следовательно, когда такие СТЬ контактируют с клетками, содержащими ί.Ό95, они способны индуцировать апоптозную гибель клеток, содержащих СЭ95. Далее получены моноклональные антитела, специфичные для СЭ95, причем такие моноклональные антитела способны индуцировать апоптозную гибель клеток, содержащих ί.Ό95, включая мышиные клетки, трансформированные кДНК, кодирующей СЭ95 человека (Ной с1 а1., 1991).

Несмотря на то, что цитотоксическое действие лимфоцитов опосредуется через взаимодействие продуцированного лимфоцитами лиганда с встречающимся повсеместно рецептором поверхности клетки ί.Ό95, обладающим способностью инициировать гибель клетки, также обнаружено, что различные другие здоровые клетки, кроме Т-лимфоцитов, экспрессируют СЭ95 на своей поверхности и могут быть убиты через инициирование этого рецептора. Предполагается, что неуправляемая индукция такого киллинга вносит вклад в повреждение тканей при некоторых заболеваниях, например разрушение клеток печени при остром гепатите. Соответственно, поиск способов сдерживания цитотоксической активности СО95 может иметь лечебное значение.

С другой стороны, так как также обнаружено, что некоторые злокачественные клетки и ВИЧинфицированные клетки содержат СО95 на своей поверхности, антитела против СО95 или лиганд для СО95 можно использовать для инициации опосредуемого СО95 цитотоксического действия в этих клетках и посредством этого создать способ борьбы со злокачественными клетками или ВИЧинфицированными клетками (см. йой е1 а1., 1991). Поиск еще и других способов усиления цитотоксической активности поэтому также может иметь лечебный потенциал.

Уже длительное время существует потребность в способе модуляции клеточной реакции на ΤΝΕ (альфа или бета) и лиганд СО95. Например, в случаях указанной выше патологии, когда ΤΝΕ или лиганд СО95 экспрессируются в избытке, желательно подавлять вызываемое ΤΝΕ или СО95 действие, убивающее клетки, в то время как в других случаях, например при применениях для заживления ран, желательно усиливать действие ΤΝΕ, или, в случае СО95, усиливать опосредуемое СО95 действие в опухолевых клетках или в ВИЧ-инфицированных клетках.

Заявители предприняли попытки (см. заявки на европейский патент №№ ЕР 186833, ЕР 308378, ЕР 398327 и ЕР 412486) регулировать губительное действие ΤΝΕ посредством ингибирования связывания ΤΝΕ с его рецепторами с использованием антител против ΤΝΕ или с использованием растворимых рецепторов для ΤΝΕ (являющихся, по существу, растворимыми внеклеточными доменами рецепторов), для того, чтобы создать конкуренцию связыванию ΤΝΕ с ΤΝΕ-В, связанным с поверхностью клетки. Кроме того, на том основании, что связывание ΤΝΕ с его рецепторами необходимо для индуцируемого ΤΝΕ действия в клетке, заявители предприняли попытки (см. например ЕР 568925) модулировать действие ΤΝΕ посредством модуляции активности ΤΝΕ-В.

Например, в ЕР 568925 описывается способ модуляции сигнальной трансдукции и/или расщепления в ΤΝΕ-В, в результате чего пептиды или другие молекулы могут взаимодействовать или с самим рецептором или с эффекторными белками, взаимодействующими с рецептором, причем таким образом модулируется нормальная функция ΤΝΕ-В. В ЕР 568925 описывается конструирование и характеризация различных мутантных форм СО 120а, имеющих мутации в его внеклеточных, трансмембранных и внутриклеточных доменах. При таком способе области в пределах вышеуказанных доменов СО 120а идентифицированы как существенные для функционирования рецептора, т.е. для связывания лиганда (ΤΝΕ) и последующей трансдукции сигнала и внутриклеточной передачи сигнала, конечным итогом которых становится наблюдаемое действие ΤΝΕ на клетки. Далее также описывается ряд подходов для выделения и идентификации белков, пептидов или других факторов, способных связываться с различными участками в указанных выше доменах СО120а, и эти белки, пептиды и другие факторы могут вовлекаться в процессы регуляции или модуляции активности ΤΝΕ-В. Ряд подходов к выделению и клонированию последовательностей ДНК, кодирующих такие белки и пептиды; к конструированию экспрессирующих векторов для продуцирования таких белков и пептидов; и к получению антител или их фрагментов, взаимодействующих с СО 120а или вышеуказанными белками и пептидами, связывающимися с различными участками СО120а, также указаны в ЕРО 368925. Однако в ЕР 568925 не описываются ни реальные белки и пептиды, связывающиеся с внутриклеточными доменами ΤΝΕ-В (например, СО95), ни двухгибридный способ с дрожжами для выделения и идентификации таких белков или пептидов, связывающихся с внутриклеточными доменами ΤΝΕ-В. Подобным образом в ЕР 568925 не описываются белки или пептиды, способные связываться с внутриклеточным доменом СО95.

Таким образом, когда требуется ингибировать действие ΤΝΕ или лиганда СО95, следует снизить количественно активность ΤΝΕ-В или СО95 на поверхности клетки, хотя количественное повышение активности ΤΝΕ-В или СО95 может потребоваться, когда добиваются усиленного действия ΤΝΕ или СО95. С этой целью секвенированы и проанализированы промоторы как для СО120а, так и для СЭ120Ь, и найден ряд ключевых мотивов последовательностей, специфичных для различных факторов регуляции транскрипции, и, по существу, экспрессию этих ΤΝΕ-В можно регулировать на уровне их промоторов, т.е. ингибировать транскрипцию от промоторов для снижения числа рецепторов и усиливать транскрипцию от промоторов для увеличения числа рецепторов (ЕР 606869 и \УО 9531206).

- 2 005853

Несмотря на то, что известно, что рецепторы для фактора некроза опухоли (ΤΝΕ) и структурно родственный рецептор СБ95 инициируют в клетках, после стимуляции лигандами, продуцированными лейкоцитами, деструктивную активность, приводящую к их собственной гибели, механизмы такого инициирования пока мало понятны. Исследования с мутациями показывают, что в передаче цитотоксиче-ского сигнала в СБ95 и СБ 120а участвуют разные участки в пределах их внутриклеточных доменов (ВгакеЬихсй е! а1., 1992; Тайадйа е! а1., 1993; Ной аиб №ща1а. 1993). Эти области (домены гибели) имеют схожие последовательности. Домены гибели как СБ95, так и СБ120а имеют тенденцию к самоагрегации. Их самоагрегация, по-видимому, промотирует агрегацию рецепторов, необходимую для инициации передачи сигнала (см. 8оид е! а1., 1994; \Уа11ас11 е! а1., 1994; Во1бш е! а1., 1995), и при высоком уровне экспрессии рецепторов может привести к инициации лиганднезависимой передаче сигнала (Во1бш е! а1., 1995).

Некоторые из цитотоксических действий лимфоцитов опосредуются через взаимодействие продуцированного лимфоцитами лиганда с СБ95 встречающимся повсеместно рецептором поверхности клетки, способным инициировать гибель клетки (см. также №ща1а апб 6о1бх!ет, 1995); и такая гибель клетки, опосредованная мононуклеарными фагоцитами, включает участие пары лиганд и рецептор - ΤΝΕ и его рецептора СБ120а, родственной по строению паре СБ95 и его лиганду (см. также УаибеиаЬее1е е! а1., 1995). Как и в случае других индуцируемых рецепторами воздействий, индукция гибели клеток рецепторами ΤΝΕ и СБ95 происходит через ряд белок-белковых взаимодействий, ведущих от связывания рецептора с лигандом к возможной активации эффекторных функций ферментов, которые при исследованиях разъяснили неферментные белок-белковые взаимодействия, инициирующие передачу сигналов гибели клеток: связывание тримерного ΤΝΕ или молекул лиганда СБ95 с рецепторами, итоговые взаимодействия их внутриклеточных доменов (ВтакеЬихй е! а1., 1992; Τа^ίад1^а е! а1., 1993; ПоН апб №да!а, 1993), усиленные склонностью мотивов доменов гибели к самоагрегации (Во1бш е! а1., 1995а), и индуцированное связывание двух цитоплазматических белков (которые также могут связываться друг с другом) с внутриклеточными доменами рецепторов - ΜΟΚΤ-1 (или ЕАББ) с СБ95 (Во1б1и е! а1., 1995Ь; СЫипай уаи е! а1., 1995; К18сйке1 е! а1., 1995) и ТСАББ с СБ120а (Нхи е! а1., 1995; Нхи е! а1., 1996). Три белка, связывающиеся с внутриклеточным доменом СБ95 и СБ120а в области домена гибели, вовлеченные в индукцию гибели клетки рецепторами через гетероассоциацию гомологичных областей, и которые, независимо, способны также инициировать гибель клетки, идентифицированы с помощью метода скрининга с двумя гибридами дрожжей. Одним из них является белок ΜΟΚΤ-1 (Во1бш е! а1., 1995Ь), известный также как ЕЛББ (СЫипшуаи е! а1., 1995), который специфически связывается с СБ95. Второй белок таАББ (см. также Нхи е! а1., 1995, 1996) связывается с СБ120а, и третий ΚΙΡ (см. также 8!апдет е! а1., 1995) связывается как с СБ95, так и с СБ120а. Кроме связывания с СБ95 и с СБ120а эти белки также способны связываться друг с другом, что обеспечивает функциональное кросс-общение между СБ95 и СБ120а. Такое связывание осуществляется через консервативный мотив последовательности - модуль домена гибели, обычный для рецепторов и ассоциированных с ними белков. Кроме того, хотя при испытании с двумя гибридами дрожжей показано, что ΜΟΚΤ-1 в клетках млекопитающих спонтанно связывается с СБ95, такое связывание происходит только после стимуляции рецептора, причем предполагается, что ΜΟΚΤ-1 участвует в инициации событий передачи сигнала СБ95. ΜΟΚΤ-1 не содержит какого-либо мотива последовательности, характеризующегося ферментативной активностью, и, следовательно, представляется, что его способность инициировать гибель клетки не вызывает истинной активности самого ΜΟΚΤ-1, а скорее активирует какой-либо другой белок или белки, связывающиеся с ΜΟΚΤ-1, и действует далее в каскаде передачи сигнала. Показано, что экспрессия в клетках мутантов ΜΟΚΤ-1, лишенных Ν-концевой части молекулы, блокирует индукцию цитотоксичности СБ95 или СБ120а (Нхи е! а1., 1996; СЫппа1уап е! а1., 1996), что указывает на то, что эта Ν-концевая область передает сигнал вызывающего гибель клетки действия обоих рецепторов через белок-белковые взаимодействия.

Выполненные в последнее время исследования охватывают группу цитоплазматических тиолпротеаз, родственных по строению протеазе СаепотйаЬбШх е1едапх СЕБ3 и конвертирующему ферменту интерлейкина-1-бета млекопитающих (1СЕ), в начале различных физиологических процессов гибели клеток (обзор в работах Кишат, 1995, и Непкай, 1996). Имеется также ряд показаний, что протеаза(ы) этого семейства могут принимать участие в индуцированной СБ95 и ΤΝΕ-К цитотоксичности в клетке. Обнаружено, что специфические пептидные ингибиторы протеаз и блокирующие их функции белки, кодированные двумя вирусами - белок вируса коровьей оспы сгтА и белок бакуловируса р35, обеспечивают защиту клеток от такой цитотоксичности в клетке (Епап е! а1., 1995; Ьох е! а1., 1995; Τе\νаπ е! а1., 1995; Хие е! а1., 1995; Ве1б1ег е! а1., 1995). Быстрое расщепление некоторых специфических клеточных белков, явно опосредованное протеазой(ами) семейства СЕБ3ДСЕ, можно показать в клетках вскоре после стимуляции СБ95 или ΤΝΕ-К.

Одна из таких протеаз и ее различные изоформы (включая ингибирующие формы), известная как МАСН (теперь каспаза-8), являющаяся белком, связывающим ΜΟΚΤ-1, и служащая для модуляции активности ΜΟΚΤ-1 и, следовательно, СБ95 и СБ120а, и которая также может действовать независимо от ΜΟΚΤ-1, недавно выделена, клонирована, охарактеризована, и также описаны ее возможные применения, как подробно указано во включенных в настоящее описание в качестве ссылок находящихся в со

- 3 005853 вместной собственности одновременно рассматриваемых заявках на патент Израиля №№ 1Ь 114 615, 114986, 115319, 116588 и 117932, а также в соответствующем им аналоге РСТ/И896/10521, и в последних публикациях авторов настоящего изобретения (Βοϊάίη е! а1., 1996). Авторами настоящего изобретения (неопубликованные данные) и другими (Еегпапбе8-А1петп е! а1., 1996; δπηίναχιιία е! а1., 1996) также недавно выделена и охарактеризована еще одна такая протеаза и ее различные изоформы (включая ингибирующие формы), названная МсН4 (также называемая каспазой-10). Каспаза-10 также является белком, связывающим МОРТ-1, служащим для модуляции активности МОРТ-1 и, следовательно, также вероятно, СЭ95 и СЭ120а. и который также может действовать независимо от МОРТ-1. Итак, подробности относительно всех аспектов, особенностей, свойств и применения каспазы-10 приводятся в указанных выше публикациях, которые все включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Следует также отметить, что каспазы - каспаза-8 и каспаза-10, имеющие подобные продомены (см. Βοϊάίη е! а1., 1996; Ми/ίο е! а1., 1996; Еегпапбех-АНчетп е! а1., 1996; Утсеп! апб Όίχίΐ, 1997), взаимодействуют через свои продомены с МОРТ-1, причем такое взаимодействие осуществляется через мотив домена гибели или эффекторный домен гибели ΌΕΌ, присутствующий в Ν-концевой части МОРТ-1 и присутствующий в двух копиях в каспазе-8 и каспазе-10 (см. Во1бш е! а1., 19951; СН1ппа1уап е! а1., 1995).

Такие протеазы, известные в настоящее время как каспазы (цистеин-аспартатспецифические протеазы), относятся к семейству цистеинпротеаз, способствующих росту, имеющих общие признаки. Обнаружено, что большинство таких каспаз участвуют в инициации и осуществлении запрограммированной гибели клеток или апоптозе, в то время как оказывается, что другие участвуют в продуцировании провоспалительных цитокинов (№сНо1хоп Ό.Α. е! а1., 1997; 8а1уехеп С.8. е! а1., 1997; СоНеп С.М., 1997). Они синтезируются как каталитически неактивные предшественники и, как правило, активируются посредством расщепления после специфических внутренных аспартатовых остатков, присутствующих в междоменных линкерах. Сайты расщепления каспаз определяются тетрапептидной последовательностью (Х-ХХ-Ό), и расщепление всегда происходит после аспарагиновой кислоты. В результате некоторые зрелые активные каспазы могут процессировать и активировать как свои собственные, так и другие, неактивные предшественники (Еегпапбе8-А1петп Т. е! а1., 1996; 8пшуахи1а 8.М. е! а1., 1996).

Активация процесса запрограммированной гибели клеток, как правило, специфична и включает последовательный процессинг нижних каспаз, называемых исполняющими каспазами, верхними каспазами, называемых инициирующими каспазами. Функциональные характеристики двух классов каспаз также отражаются в их строении. Действительно, инициирующие каспазы содержат более длинную продоменную область, по сравнению с исполняющими каспазами (8а1уехеп С.8. е! а1., 1997; СоНеп С.М., 1997). Длинный продомен позволяет инициирующим или апикальным каспазам активироваться путем инициации рецепторов гибели семейства рецепторов для ЮТ. После индуцированной лигандом тримеризации рецепторов гибели, инициирующие каспазы набираются через их длинный Ν-концевой продомен для взаимодействия со специфическими адаптерными молекулами с образованием комплекса, передающего сигнал индуцирования гибели (С’оНеп С.М., 1997; 1<1хсНке1 Е.С., е! а1., 1995). Например, каспаза-8/МАСН и, вероятно, каспаза-10, которые содержат два эффекторных домена гибели (ΌΕΌ) или ΕΑΌΌ-домена, включаются в рецепторный комплекс с помощью адаптерных молекул ЕАОП/МОРТ-1, в то время как каспаза-2 включается при помощи СРАОИ/РАГОИ и Р1Р (№ща!а 8. е! а1., 1997; МсЕаг1апе М. е! а1., 1997; АНтаб М. е! а1., 1997; Эиап Н. е! а1., 1997). Вследствие тримерной природы активированного рецепторного комплекса полагают, что по меньшей мере две молекулы каспазы приходят в непосредственную близость друг с другом, приводящую, таким образом, их к активации путем аутокаталитического процессирования (Уапд е! а1., 1998; Михю е! а1., 1998) .

Каспазы синтезируются как проферменты, состоящие из трех основных субъединиц - Ν-концевого продомена и двух субъединиц, иногда разделенных линкерным пептидом. Эти две субъединицы названы длинной или субъединицей 1, содержащей активный участок фермента, и короткой или субъединицей 2. Для полной активации фермента продомен и две субъединицы расщепляются. Две отщепленные субъединицы образуют гетеродимер, в соответствии с чем длинный домен образуется из Ν-конца, а короткая субъединица образуется из С-концевой области предшественника каспазы. Исходя из установленной трехмерной структуры каспазы-3 оказывается, что С-конец длинного домена также, как и Νконец короткого субдомена, свободны, и С-конец короткой субъединицы приходит в непосредственную близость с Ν-концом длинной субъединицы для того, чтобы образовать правильно сложенный и активный фермент (Ро!опба е! а1., 1996; Мйб е! а1., 1997; 8пшуахи1а е! а1., 1998).

№Ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза является внутриклеточным ферментом, участвующим, как известно, во внутриклеточном метаболизме глюкозамина. Фрагмент геномной ДНК, содержащий Νацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу, клонирован из продуцирующей хитиназу бактерии УФгю сНо1егае (Уатапо е! а1., Вюкск Вю1есНпо1. ВюсНет., 61, р. 1349-53, 1997).

Ген падА, кодирующий №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу Ε. сой, также известен [см., например, Реп е! а1., 1апиагу 1990, 68(1), рр. 123-137]. О клонировании и секвенировании Νацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека пока не сообщается.

Краткое изложение сущности изобретения

Изобретение относится к белку, взаимодействующему с каспазой-8, способным взаимодействовать

- 4 005853 с субъединицей 1 и/или субъединицей 2 каспазы-8.

Изобретение также относится к Ν-ацетилглюкозамин-б-фосфатдеацетилазе человека или к ее вариантам.

Изобретение также относится к белку, содержащему аминокислотную последовательность, представленную на фиг. 2, 3, 5В или б.

Также в объем изобретения входит белок, содержащий аминокислотную последовательность, кодированную, в частности, клоном 12, как описано ниже.

Изобретение также относится к описанному выше белку, который расщепляется каспазой-8 ίη νίίτο или ίη νίνο.

Изобретение также относится к выделенной последовательности ДНК, кодирующей белок изобретения. В объем изобретения входит последовательность ДНК, представленная на фиг. 2 и 3. В объем изобретения также входит выделенная ДНК, способная гибридизироваться с указанной последовательностью ДНК в умеренно строгих условиях.

Изобретение также относится к вектору, содержащему последовательность ДНК, определение которой дано выше.

Изобретение также относится к эукариотной или прокариотной клетке-хозяину, содержащей вектор изобретения.

Изобретение также относится к способу получения белка, взаимодействующего с каспазой-8, включающему выращивание клетки-хозяина по изобретению в условиях, допускающих продуцирование указанного белка, воздействие на посттрансляционные модификации, необходимое для получения указанного белка, и выделение указанного белка.

Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является прокариотическая клетка.

Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является эукариотическая клетка.

Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является клетка млекопитающего, насекомого или дрожжей.

Изобретение также относится к указанному способу, где клеткой является клетка НеЬа или 293 Т НЕК.

Изобретение также относится к указанному способу, где в качестве промотора используют промотор СМУ человека.

Изобретение также относится к рибозиму, специфическому для нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности ДНК изобретения.

Изобретение также относится к антисмысловому олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере 9 нуклеотидов последовательности, соответствующей последовательности ДНК изобретения.

Изобретение также относится к антителу против эпитопа белка изобретения.

Изобретение также относится к набору для иммуноанализа, предназначенного для обнаружения белка, взаимодействующего с каспазой-8, с участием антитела изобретения.

Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции активности каспазы-8.

Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции действий, опосредованных рецептором для ΤΝΡ или Раз.

Изобретение также еще относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения при модуляции апоптоза.

Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения в качестве лечебного средства.

Изобретение также относится к указанному белку, взаимодействующему с каспазой-8, указанным рибозиму, антисмысловому олигонуклеотиду или антителу для применения в качестве лечебного средства при лечении рассеянного склероза с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунного увеоретинита, диабета, волчанки, аутоиммунного миокардита I, опосредованного НСУ хронического гепатита, хронического гастрита, например гастрита типа А, смешанной болезни соединительной ткани (МСТИ), болезни Крона или неспецифического язвенного колита.

Изобретение также относится к Ν-ацетилглюкозамин-б-фосфатдеацетилазе человека, которая применяется для выделения, идентификации и клонировании другого белка того же класса.

Термин взаимодействующий в контексте данного описания, относящийся к взаимодействию белка изобретения с каспазой-8, предназначен для обозначения форм прямого взаимодействия, таких как связывание и расщепление, и косвенного взаимодействия, например, через адаптерные белки. Взаимодействие может привести, необязательно, к модуляции сигнала, опосредуемого каспазой-8.

- 5 005853

Термин связывание в контексте данной заявки, когда относится к связыванию белков, взаимодействующих с каспазой-8, предназначен для обозначения физической связи белка, взаимодействующего с каспазой-8. Эту физическую связь можно измерить при иммуноанализах, таких как анализы ЕЫ8А или РИА, при двухгибридном испытании, анализах с иммунопреципитацией или анализах на основе разделения по размеру, таких как электрофорез в неденатурирующем геле или гель-хроматография, смеси каспазы-8 или ее субъединицы и белка изобретения. При использовании двухгибридного испытания имеется в виду, что каспаза-8 или ее субъединица экспрессируются в виде гибрида домена активации ДНК, а белок, взаимодействующий с каспазой-8, экспрессируется в виде гибрида домена связывания ДНК, или наоборот.

Термин двухгибридное испытание относится к двухгибридному анализу, когда белок-белковые взаимодействия можно измерить посредством введения в дрожжевые клетки первого экспрессирующего вектора, кодирующего гибрид первого белка и домена связывания ДНК, и второго экспрессирующего вектора, кодирующего гибрид второго белка и домена активации ДНК. Дрожжевые клетки должны содержать по меньшей мере один репортерный ген, управляемый промотором, содержащим мотив последовательности ДНК, распознаваемый указанным доменом связывания ДНК. Как правило, используют два репортерных гена, например, гистидинсинтетазу и бета-галактозидазу. Это позволяет исследователям избежать ложных положительных результатов, которые могут появиться от мутации. Этот метод модифицирован и усовершенствован авторами настоящей заявки для применения при скрининге, выделении и испытании белков, опосредующих сигналы ΤΝΕ-К. и Рак, см., например, \¥О 97/03998 и приведенные там ссылки. Двухгибридное испытание опирается на локализацию обоих слитых белков в ядре клетки.

Термин двухгибридное испытание, используемый здесь, также включает модификацию двухгибридного метода, когда используют белки, подающие сигнал роста клетки, такие как так и кок (Вгобег е! а1., Сигг. ΒίοΙ., 1998, 8, р. 1121-4; Лгопйепп е! а1., ΝιιοΚίο Лабк Кек., 1997, 25, р. 3373-4, и указанные в этих работах ссылки). Для того чтобы быть функциональными, этим белкам требуется перемещение в клеточную мембрану. Это достигается посредством экспрессии белка, подающего сигнал роста клетки, в виде гибрида с первым белком, и экспрессии сигнала локализации в клеточной мембране, такого как сигнальная последовательность миристилирования, в виде гибрида со вторым белком. Взаимодействие между первым и вторым белком будет перемещать белок, подающий сигнал роста клетки, в клеточную мембрану, и таким образом инициировать рост клетки. Затем отбирают агрессивно растущие клетки для дальнейшего исследования. Эта система отличается от описанной выше двухгибридной системы, поскольку не основана на локализации обоих гибридов в ядре клетки.

Термин наживка относится к белку в вышеуказанном двухгибридном испытании, который экспрессируется в виде слитого белка с доменом связывания ДНК.

Термин добыча относится к белку в вышеуказанном двухгибридном испытании, который экспрессируется в виде слитого белка с доменом активации ДНК.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 показывает схематическое изображение одноцепочечной конструкции каспазы-8, используемой в качестве наживки при двухгибридном скрининге, описанном в примере 1 В.

Фиг. 2 представляет предварительный неполный нуклеотид (Послед. № 1) и расшифрованную аминокислотную последовательность (Послед. № 2) клона 32, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, полученный из клона кДНК.

Фиг. 3 показывает предполагаемую полноразмерную последовательность нуклеотида человека (Послед. № 3) и расшифрованную аминокислотную последовательность (Послед. № 4) Νацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы, составленную из наращивания по 5' клона 12 клона Е8Т АА4 60869 и клона ловушки экзона Ь48741.

Фиг.4А показывает функциональную активность экспрессированного клона 12 в виде процента апоптозных клеток после трансфекции клеток НЕК-293Т или одним рецептором для ΤΝΕ р55 (обозначенным р55 ΤΝΕΚ), или рецептором для ΤΝΕ р55 вместе с р35-бакуловирусным ингибитором каспаз (р55+р35), или с клоном 12 (р55+12), или рецептором для ΤΝΕ р55 вместе с нерасщепляемым мутантом 12 (обозначенным 1*), содержащим замену Акр на С1и в позиции 346 на фиг. 3 (р55+12*). Этот мутант нельзя расщепить ни ίη νίΐτο, ни ίη νίνο.

Фиг. 4В показывает процент апоптозных клеток НеЬа, одних или после трансфекции р35, или 12, или 12*, обработанных ΤΝΕ и циклогексимидом.

Фиг. 5А показывает 1725 кодирующих пар оснований в 5'-конце клона Р74 (Послед. № 5).

Фиг. 5В показывает последовательность 574 аминокислот (Послед. № 6), расшифрованную из последовательности клона Р74, показанной на фиг. 5А.

Фиг. 6 показывает последовательность 1428 аминокислот (Послед. № 7) открытой рамки считывания, полученную из расшифрованной аминокислотной последовательности клона РАС, инвентарный номер КРС15-1057120.

Фиг. 7 показывает расположенные в ряд 574 аминокислоты открытой рамки считывания, полученной из расшифрованной аминокислотной последовательности клона р74 (обозначенной клонирован

- 6 005853 ная), в сравнении с 1428 аминокислотами открытой рамки считывания, полученной из расшифрованной аминокислотной последовательности клона РАС, КРС15-1057120 (обозначенной расшифрованная).

Фиг. 8 показывает расположенную в ряд открытую рамку считывания расшифрованной аминокислотной последовательности клона КРС15-1057120 (верхняя последовательность) с последовательностью гистондеацетилазы А (нижняя последовательность, инвентарный номер СепЬаик ΝΡ-006028.1) (Послед. № 9).

Фиг. 9А показывает ауторадиографию Βίά-белка и белков, кодированных клонами кДНК 12, или Р16, или Р43, или Р70, или Р74, или Р79, полученных в лизате ретикулоцитов в присутствии ³⁵8метионина, разделенных методом 8Э8-РЛОЕ.

Фиг. 9В показывает ауторадиографию Βίά-белка и белков, кодированных клонами кДНК 12, или Р16, или Р43, или Р70, или Р74, или Р79, полученных так же, как в случае фиг. 9А, при анализе на связывание с каспазой-8, экспрессированной в бактериях в виде слитого белка двух ее субъединиц, гибридизированных с Ο8Τ. Положение маркеров молекулярной массы показано на геле слева.

Фиг. 10 показывает результаты расщепления белка, кодированного неполным клоном кДНК Р43, каспазой-8 или каспазой-10, или каспазой-3, или каспазой-9, или мутантами каспазы-3, или каспазы-9, или каспазы-10. Объемы всех использованных бактериальных лизатов рекомбинантных каспаз, экспрессированных в Е.еой, показаны в относительных единицах (КП). Положение маркеров молекулярной массы показано на геле слева. Представляющие интерес белки помечены звездочками: стрелки с заштрихованными остриями показывают полноразмерный белок Р43, а стрелки с незаштрихованными остриями показывают продукты расщепления.

Фиг. 11 показывает функциональную активность белков, кодированных клонами кДНК, идентифицированными посредством двухгибридного скрининга, выраженную в виде процента клеток, претерпевающих апоптоз, после котрансфекции клеток НЕК-293Т рецептором для ΤΝΕ р55 и белком зеленой флуоресценции (помеченным РС), без или с вставками кДНК клонов 12, или Р16, или Р27, или Р43, или Р79, или Р74, или Р70.

Фиг. 12 показывает ингибирующую активность в отношении гибели клеток дикого типа и нерасщеплямого мутанта Τίρ60 в клетках НЕК-293Т, котрансфицированных рецептором для ΤΝΕ р55 и белком зеленой флуоресценции, а также действие Ό32-Τίρ60, лишенного первых 32 Ν-концевых аминокислот. Контрольные клетки трансфицированы одним вектором ρί,'ΟΝ.

Подробное описание изобретения

Многие методы молекулярной биологии здесь подробно не описываются, так как они хорошо известны специалистам в этой области техники. К таким методам относятся сайтнаправленный мутагенез, клонирование методом РСК, скрининг фаговой библиотеки с использованием олигонуклеотидных или кДНК-зондов, экспрессия кДНК, анализ рекомбинантных белков, трансформация бактериальных и дрожжевых клеток, трансфекция клеток млекопитающих и т. п. К литературе, где описываются такие методы, относятся, например, издания 8атЬгоок е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд Α ЬаЬогаФгу Мапиа1, Со1б 8ргшд НагЬог ЬаЬога!огу; Ι8ΒΝ: 0879693096, 1989, Сштеп! Рго!осо1§ ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Ьу Е.М. Аи8иЬе1, Ι8ΒΝ: 047150338Х, 1988, и 8йой Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду, Ьу Е.М. Аи8иЬе1 е! а1. (еб§.), 3гб еб., Шоп ^11еу & 8ощ; Ι8ΒΝ: 0471137812, 1995. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Для того, чтобы методом двухгибридного скрининга идентифицировать белки, взаимодействующие с каспазой-8, можно использовать систему с двумя гибридами или тремя гибридами.

Систему с двумя гибридами в способе изобретения используют, по существу, в том виде, в каком она описана Е1е1б§ апб 8опд (№!иге, 340, р. 245, 1989). Предпочтительно, отдельные векторы, дрожжевые штаммы и библиотеки можно получить от С1оп!есй (Пало-Альто, США), как компоненты двухгибридной системы Ма!сйтакег (#РТ 1265-1).

Предпочтительный вариант системы с двумя дрожжевыми гибридами, используемой в способе изобретения, описан Βо1б^η е! а1., Се11, 85, р. 803-15, 1996. Система с двумя дрожжевыми гибридами также описана в патенте США 5580736, Βκώ е! а1. Эти публикации включены в настоящее описание в качестве ссылок.

Трехгибридная система используется, по существу, так, как описано Тпобе е! а1., 1. ΒΦΡ СЕет.. 272, р. 22995-9, 1997. Для обнаружения соответствующих изобретению белков, взаимодействующих с каспазой-8, необходимо, чтобы две субъединицы каспазы-8 экспрессировались независимо. С этой целью две субъединицы каспазы-8 экспрессируют, предпочтительно по отдельности под контролем разных промоторов. В предпочтительном варианте воплощения изобретения субъединица каспазы-8 р10 (от серина 375 до аспарагиновой кислоты 479) экспрессируется под контролем слабого промотора, операбельного в дрожжах, в рамке с доменом связывания ДНК. Предпочтительно, слабый промотор представляет собой промотор дрожжей ΑΌΗ, а белком, связывающимся с ДНК, является домен связывания ДНК дрожжевого активатора транскрипции Са1-4 или бактериальный белок БехЛ. ΑΌΗ-промотор и домен связывания ДНК Са1-4 имеются, например, в доступном коммерчески ρΟΒΌ, Пало-Альто, США. Однако для специалистов в этой области техники будет очевидно, что можно использовать другие промоторы, до тех пор, пока промотор эффективен в дрожжевых клетках. По этому же признаку можно использовать другие

- 7 005853 домены связывания ДНК, до тех пор, пока такие домены связывания ДНК не имеют функции активатора транскрипции.

Длинная активная субъединица каспазы-8 р20 (от серина 217 до аспарагиновой кислоты 374) экспрессируется в виде отдельного белка под контролем индуцибельного промотора, операбельного в дрожжевых клетках. Предпочтительно, можно использовать репрессируемый промотор метионин Ме!25, как описано в указанной выше публикации Тпобе е! а1. Использование индуцибильного промотора упрощает обнаружение комплекса р10-р20 посредством иммунопреципитации и электрофореза в полиакриламидном геле. Индуцибельный промотор имеет также преимущество в том, что он делает возможной экспрессию в дрожжах белка, который может быть токсичным для дрожжевых клеток, вследствие возможности ограничения периода, в пределах которого экспрессируется потенциально токсичный белок.

Белки, скринируемые по способу изобретения, предпочтительно, представляют в форме библиотеки кДНК. Однако можно использовать также геномные библиотеки или комбинированные библиотеки. Библиотеку клонируют по С-концу домена активации транскрипции, операбельного в дрожжах. Предпочтительно используют дрожжевой домен активации транскрипции Оа1-4, однако можно использовать многие другие активаторы транскрипции. Предпочтительно для клонирования библиотеки используют вектор ρΟΛΌ ОН, доступный от С1оШее11.

Штамм дрожжей, используемый для скрининга, должен содержать селективный маркер, такой как гистидинсинтетаза, под контролем промотора, содержащего последовательность ДНК, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. Предпочтительно дрожжевая клетка также содержит репортерный ген под контролем промотора, содержащего последовательность ДНК, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. Штамм дрожжей НБ7е, доступный от С1оп1ес11. можно использовать для скрининга с гибридами домена связывания Оа1-4; штамм Ь40 можно использовать, когда используют домен связывания ДНК 1ехА.

После трансформации дрожжевые клетки помещают в условия, селективные для активного высевания в среды, лишенные некоторых аминокислот, что требуется для устойчивости введенных в них плазмид.

Среда является селективной для дрожжевых клеток, в которых активируется ген для вышеуказанного селективного маркера. Предпочтительно селективный маркер представляет собой ген гистидинсинтетазы. Клетки дрожжей, экспрессирующие этот ген, можно отобрать для культивирования в среде, лишенной гистидина. Преимуществом такой системы является возможность добавления в среду для роста ингибитора гистидинсинтетазы 3-аминотриазола. Таким образом, возможно подавлять рост дрожжевых клеток, в которых гистидинсинтетаза экспрессируется в небольшом количестве, что вызвано утечкой промотора, содержащего последовательность, с которой специфически связывается вышеуказанный домен связывания ДНК. В некоторых клонах слабое неспецифическое взаимодействие между субъединицей каспазы-8 р10 и/или р20 и указанным клоном может вызвать кажущуюся активацию указанного промотора. Таким образом, повышая концентрацию указанного ингибитора в среде, используемой для селекции взаимодействующих клонов, можно отобрать только такие клоны, которые взаимодействуют с определенной минимальной силой. Концентрация 3-аминотриазола составляет, предпочтительно, 7,5 мМ.

Клоны, идентифицированные по их способности расти в среде, лишенной гистидина, затем анализируют путем количественного определения активности их репортерного гена. Предпочтительно в качестве репортерного гена используют ген 1ас2. Количественное определение активности ΕκΖ осуществляют предпочтительно в жидкой культуре, как описано Βοϊάίη е! а1., 1. Βΐο1. Сйет., 270, 7795-8, 1995.

Описанный выше способ скрининга можно осуществить подобным образом с использованием двухгибридного испытания. Существенное отличие состоит в том, что две субъединицы каспазы-8 экспрессируются в виде единой пептидной цепи и представляют собой слитый белок с указанным выше доменом связывания ДНК. Субъединицу р20 мутируют в ее активном сайте (цистеин 360 - серии 360) так, как описано ниже.

Предпочтительно субъединицу р10 отделяют от субъединицы р20 с помощью линкера, который, предпочтительно, имеет длину от 10 до 50 аминокислот. Указанный линкер содержит, предпочтительно, небольшие незаряженные аминокислоты, такие как глицин, серии, треонин, аланин и валин. Предпочтительнее, линкер состоит из остатков серина и глицина. Наиболее предпочтительно, когда соотношение между остатками глицина и остатками серина в указанном линкере составляет примерно от 3:1 до 4:1.

Получение клонов с использованием двухгибридной системы с описанной выше наживкой каспазы8 подобно описанному выше применению трехгибридной системы, за исключением того, что клоны, связывающиеся только с одной из субъединиц, трудно отличить от клонов, связывающихся с обеими субъединицами или требующих для связывания комплекс из двух субъединиц. Однако любой клон, обнаруженный при двухгибридном способе, можно легко проверить на связывание с двумя субъединицами посредством оценки ^Ζ^τ^μο™ двойных трансформантов, т.е. дрожжевых клеток, трансформированных вновь идентифицируемым клоном и субъединицей каспазы-8 - или р10 или р20, где указанная субъединица слита с доменом связывания ДНК. Связывание с комплексом субъединиц р10 и р20 также можно легко оценить посредством определения М-активности тройных трансформантов, где

- 8 005853 одна из субъединиц каспазы-8 экспрессируется в виде слитого белка с доменом связывания ДНК, а другая является отдельным белком. Очевидно, что вышеуказанная трехгибридная система, следовательно, также полезна для определения характеристик связывания клонов, найденных с помощью двухгибридной системы, так как индуцибельный промотор, используемый в ней, дает возможность быстрой идентификации клонов, взаимодействующих только с субъединицей 10 или с комплексом субъединиц р10р20.

Клоны, способные расти в среде, лишенной гистидина, и экспрессирующие 1ас2-активность, затем отбирают для дальнейшего исследования. Сначала белки, кодированные указанными клонами, проверяют на их способность связываться с нерелевантными белками, такими как ламин. Как правило, клоны, связывающиеся с ламином, отбрасывают.

Клоны, найденные для специфического взаимодействия с каспазой-8, затем анализируют далее. Такой анализ проводят с неполными клонами, полученными непосредственно при описанных выше способах скрининга, а также с полноразмерными клонами, полученными на основе последовательности указанных неполных клонов. Для того, чтобы получить полноразмерные клоны, получают последовательность неполного клона посредством экстракции ДНК указанного клона из дрожжевых клеток способами, известными специалистам в этой области техники. Затем ДНК переносят в бактерии для того, чтобы получить большое количество очищенной ДНК, которое можно использовать для секвенирования. С другой стороны, для целей секвенирования вставку в векторе, представляющем собой, предпочтительно, вышеуказанный вектор рСВБ. можно вырезать с использованием рестриктаз и клонировать в другой вектор, такой как рВ1иезспр1, доступный от 81га1адепе. Секвенирование осуществляют методом терминации цепи, предпочтительно, с использованием фермента секвеназы-2, доступной из набора для секвенирования от Ипйеб 81а1ек Вюсйешюак.

Затем полученную таким образом последовательность можно ввести в базу данных программы поиска и посредством компьютерного поиска идентифицировать перекрывающиеся последовательности. Используемые программы хорошо известны специалистам в этой области техники и включают, например, пакет ССС (депейсз сотри!ег дтоир). Предпочтительно используют сервисную программу поиска, такую как Ваис Ьоса1 АНдтеп! ЗеагсН Тоо1 (ВБА8Т), доступную с сервера БМВБ (например, 1Шр://6оуе.етЬ1-11е1бе1Ьегд.6е/В1аз12/). Команды В1ак1п можно использовать для поиска нуклеотидных последовательностей, перекрывающих или схожих с идентифицированными клонами.

Белок, идентифицированный по способу изобретения, представляют в виде слитого белка с доменом связывания ДНК. Следовательно, рамка, в которой должна транслироваться нуклеотидная последовательность, известна, так как она должна быть в рамке с кодирующей последовательностью домена связывания ДНК. Последовательность ДНК клона, идентифицированного по изобретению, можно, следовательно, однозначно транслировать в аминокислотную последовательность. Затем для идентификации перекрывающихся белковых последовательностей или подобных белков можно использовать программу В1ак1р, доступную на вышеуказанном сервере БМВБ.

С другой стороны, или кроме вышеуказанных способов поиска в базе данных, для того, чтобы идентифицировать полные клоны, можно скринировать библиотеку, такую как геномная библиотека или библиотека кДНК. Такие способы скрининга описаны в указанных выше изданиях 8атЬтоок е1 а1. и АизиЬе1 е1 а1. С другой стороны, или, кроме того, можно использовать методы клонирования на основе РСК, такие как быстрая амплификация концов кДНК (5' апб 3' КАСЕ, СгаНат е1 аБ, ВюсНет. ВюрНуз. Кез. Соттип., 177, р. 8-1б, 1991, и указанные в этой работе ссылки).

Неполные клоны, идентифицированные при скрининг-анализе по изобретению, или полноразмерные клоны, полученные любым из описанных выше способов, затем исследуют далее. Это осуществляют, например, путем испытания чувствительности этих клонов к протеолитическому расщеплению активной каспазой-8. Этот анализ можно проводить ш νί\Ό. Для этой цели линию клеток млекопитающего трансфицируют экспрессирующим вектором, который продуцирует белок, кодированный испытываемым клоном, и экспрессирующим вектором, кодирующим второй белок, экспрессия которого будет индуцировать активность каспазы-8. Экспрессирующие векторы предпочтительно содержат сильный промотор для экспрессии клона и второго белка, такой как вирус саркомы Рауса (К8У, УататоЮ е1 аБ, Се11, 22, р. 787-97, 1980), вирус миелопролиферативной саркомы (МР8У, Аг(е11 Р. е! а1., Сепе, б8, р. 213-9, 1988), цитомегаловирус (СМУ, ТНотзеп е! аБ, ΡΝΑ8, 81, р. б59-б3, 1984), или подобные промоторы вирусного или клеточного происхождения.

Второй белок, экспрессия которого индуцирует активность каспазы-8, выбирают среди внутриклеточного домена Раз, внутриклеточного домена СБ120а, МОКТ-1, каспазы-8, или эквивалента белка, способного индуцировать активность каспазы-8. С другой стороны, активность каспазы-8 можно индуцировать в клетках посредством обработки Т№ или лигандом СБ95. Подробности эксперимента, возможный механизм и другие технические подробности анализа такого типа описаны в указанной выше работе Во16т е! а1.. Се11, 199б.

После введения в клетку млекопитающего указанного выше экспрессирующего вектора, кодирующего второй белок, и испытываемого белка, выращивают культуру клеток в течение времени, достаточного для осуществления экспрессии белков, активации или экспрессии каспазы-8 и расщепления испы

- 9 005853 тываемого белка. Указанный период времени обычно составляет от 4 до 72 ч, предпочтительно от 16 до 30 ч, и наиболее предпочтительно от 20 до 24 ч. Для того, чтобы определить степень расщепления, получают лизат целых клеток. С другой стороны, можно очистить меченый белок с использованием антител против метки или хроматографии с никелем и нитрилоуксусной кислотой, реагенты и подробные протоколы которых доступны от 01адсп СтЬН, Хилден, Германия. Метод иммунопреципитации описан в указанной выше работе Βο16ίη с1 а1., Се11, 1996. Реагенты и указания по иммунопреципитации также доступны в форме набора от Воейгшдег Маппйет, Маннгейм, Германия.

Затем лизат целых клеток очищенного белка разделяют по размеру посредством электрофореза в полиакриламидном геле с добавлением 8Э8.

Испытываемый белок или его меченые фрагменты теперь можно визуализировать методом вестернблоттинга с использованием антител против метки. Предпочтительной меткой является гистидиновая метка в сочетании с антителом против полигистидина. Однако можно использовать другие сочетания последовательности-метки и антитела, специфического к ней, до тех пор, пока антитело остается специфическим к последовательности-метке, т. е. не узнает другие белки в лизате целых клеток. Специфичность расщепления можно проверить путем проведения контрольных реакций, при которых к культуре клеток млекопитающего в указанный выше период времени добавляют специфический ингибитор каспазы. Предпочтительный ингибитор представляет собой ингибитор, выбранный среди /УЛО-Гтк. ζΌΕνΌГтк. ζΙΕΤϋ-Гтк (см. Керр1ег-НаГкетеуег е1 а1., Вюсйетгйту, 37, р. 16934-42, 1998). Более предпочтительным ингибитором является ζνΆΌ-Гтк. Другие ингибиторы, которые можно использовать, представляют собой белки, такие как Вс1х или белок р35, действующие как клеточные ингибиторы каспаз. Подавление расщепления, когда в ходе анализа коэкспрессируются такие белки, показывает, что расщепление специфично для каспаз.

Другим анализом с целью испытания, может ли испытываемый белок расщепляться каспазой-8, является анализ ίη νίίτο, при котором рекомбинантно продуцированная каспаза-8 используется в ферментативной реакции вместе с меченым испытываемым белком. Испытываемый белок можно получить, как описано выше, посредством клонирования его кодирующей последовательности в экспрессирующий вектор, содержащий сильный промотор, и трансфекции в клетку млекопитающего. Выгодно метить испытываемый белок, как описано выше, с тем, чтобы его можно было выделить в чистом виде из экстракта клеток млекопитающего с помощью антител против метки или других агентов, способных специфически связываться с последовательностью-меткой. С другой стороны, испытываемый белок можно получить ίη νίίτο с использованием системы трансляции ίη νίίτο. Метод трансляции ίη νίίτο хорошо известен специалистам в этой области техники, и все реагенты для него и подробные протоколы доступны, например, от 8^Шдепе, Ьа кПа, И8Л.

С другой стороны, испытываемый белок можно пометить, например, с использованием радиоизотопа. Выгодно, при мечении изотопами, экспрессировать испытываемый белок ίη νίίτο, и во время реакции трансляции ίη νίίτο меченную изотопами аминокислоту добавлять вместе с немеченой кислотой. Предпочтительно изотоп представляет собой 8³⁵. Также предпочтительно, чтобы меченая аминокислота представляла собой 8³⁵-метионин, и соотношение между меченой и немеченой аминокислотой составляло от 1:1 до примерно 1:1000.

Затем полученный рекомбинантно испытываемый белок и полученный рекомбинантно активный белок каспазу-8 соединяют в подходящем буфере и дают проходить реакции расщепления в течение достаточного для этого времени. Предпочтительный буфер и другие предпочтительные параметры анализа описаны в указанной выше работе Βο16ίη еί а1., Се11, 1996. Предпочтительный период времени, как правило, составляет от 10 мин до нескольких часов, предпочтительно от 30 мин до 1 ч.

После осуществления расщепления реакционную смесь разделяют по размеру молекул методом электорофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8. Если использовано мечение изотопами, гель можно высушить, и обнаружить изотоп с помощью фотопленки или люминофоров (Бир). Испытываемый белок метят, и обнаружить его можно с использованием специфических к метке антител при вестерн-блоттинге.

Появление дополнительных низкомолекулярных полос в реакционных смесях, в которые добавлен белок каспаза-8, по сравнению с контрольными реакционными смесями без каспазы-8, указывает на расщепление испытываемого белка каспазой-8. Кроме того, размер низкомолекулярных полос указывает приблизительное расположение сайта расщепления.

Настоящее изобретение относится к последовательности ДНК, кодирующей белки, взаимодействующие с каспазой-8.

Кроме того, настоящее изобретение также относится к последовательностям ДНК, кодирующим биологически активные изоформу, аллельный вариант, функциональный аналог, мутант или производное белка, взаимодействующего с каспазой-8, и к кодированным ими белку, изоформе, аллельному варианту, функциональному аналогу, мутанту или производному. Получение таких аналогов, фрагментов, мутантов и производных является стандартной процедурой (см., например, δηπ^τοοίί еί а1., 1989), при которой в последовательностях ДНК, кодирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, один или несколько кодонов можно делетировать, добавить или заменить другими и получить аналоги, имеющие по меньшей

- 10 005853 мере одну замену аминокислотного остатка относительно нативного белка.

Среди последовательностей ДНК по изобретению, кодирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, изоформу, аллельный вариант, функциональный аналог, мутант или производное, также имеются, как вариант воплощения изобретения, последовательности ДНК, способные к гибридизации с последовательностью кДНК, полученной из кодирующей области нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, и такая гибридизация осуществляется в умеренно строгих условиях, и способные к гибридизации последовательности ДНК кодируют биологически активный белок, взаимодействующий с каспазой-8. Следовательно, к таким способным к гибридизации последовательностям ДНК относятся последовательности ДНК, имеющие относительно высокую гомологию с последовательностью кДНК нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, и, как таковые, представляют последовательности, похожие на белок, взаимодействующий с каспазой-8, которые могут представлять собой, например, последовательности природного происхождения, кодирующие различные изоформы белка, взаимодействующего с каспазой-8, или встречающиеся в природе последовательности, кодирующие белки, принадлежащие к группе последовательностей, похожих на белок, взаимодействующий с каспазой-8, кодирующих белок, обладающий активностью белка, взаимодействующего с каспазой-8. Кроме того, к таким последовательностям также могут относиться, например, последовательности, не встречающиеся в природе, полученные синтетически, подобные последовательности кДНК нативного белка, взаимодействующего с каспазой-8, но включающие ряд требуемых модификаций. Следовательно, такие синтетические последовательности включают все возможные последовательности, кодирующие аналоги, фрагменты и производные белка, взаимодействующего с каспазой-8, которые все обладают активностью белка, взаимодействующего с каспазой-8.

Используемые здесь строгие условия являются функцией температуры, используемой при экспериментах по гибридизации, молярности одновалентных катионов и процентного содержания формамида в растворе для гибридизации. Для того чтобы определить степень строгости для любого данного набора условий, используют, в первую очередь, уравнение Мейнкота (Метко111) е! а1. (1984) для определения устойчивости гибридов 100% идентичности, выраженное в виде температуры плавления Т_т гибрида ДНК-ДНК:

Т_т = 81,5°С + 16,6(ЬодМ) + 0,41(%СС) - 0,61(%1огт) - 500/Ь, где М представляет собой молярность одновалентных катионов, %СС представляет собой % нуклеотидов С и С в ДНК, %1огт представляет собой процентное содержание формамида в растворе для гибридизации, и Ь представляет собой длину гибрида в парах оснований. На каждый 1°С, когда Тт снижается, исходя из величины, вычисленной для 100% идентичного гибрида, количество допускаемых ошибочных спариваний возрастает примерно на 1%. Таким образом, если Тт, используемая для любого данного эксперимента по гибридизации с определенной солью и концентрациями формамида, на 10°С ниже Тт, вычисленной для 100% гибрида в соответствии с уравнением Мейнкота, гибридизация будет происходить, даже если имеются примерно до 10% ошибочных спариваний.

Умеренно строгими условиями являются условия, обеспечивающие Т_т, которая не более, чем на 20°С ниже Т_т, которая должна быть для совершенного дуплекса с намеченной последовательностью, вычислена ли она по указанной выше формуле или измерена фактически. Без ограничений, в умеренно строгих (на 15-20°С ниже вычисленной или измеренной Т_т гибрида) условиях используют раствор для промывки 2 X ББС (стандартный солевой раствор цитрата) и 0,5% (натрийдодецилсульфат) при соответствующей температуре ниже вычисленной Т_т гибрида. Окончательная строгость условий обусловлена в первую очередь условиями промывки, особенно, если используемые условия гибридизации таковы, при которых наряду с устойчивыми гибридами образуются менее устойчивые гибриды. В таком случае более строгие условия промывки позволяют удалить менее устойчивые гибриды. Обычным условием гибридизации, которое можно использовать с умеренно строгими условиями промывки, описанными выше, является гибридизация в растворе 6 х ББС (или 6 X ББРЕ (стандартный солевой фосфат-ЭДТК раствор)), 5 X раствор Денхардта, 0,5% и 100 мкг/мл денатурированной фрагментированной ДНК спермы лосося при температуре приблизительно на 20-25°С ниже Т_т. Если используют смешанные зонды, предпочтительно использовать тетраметиламмонийхлорид (ТМАС) вместо 88С (Ан5иЬе1. 1987, 1999).

Для того чтобы получить указанные выше встречающиеся в природе последовательности, подобные белку, взаимодействующему с каспазой-8, можно использовать стандартные процедуры скрининга и выделения образцов ДНК или РНК природного присхождения из различных тканей с использованием в качестве зонда кДНК природного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или ее части (см., например, стандартные процедуры, описанные в БатЬтоок е! а1., 1989).

Изобретение относится к белку, взаимодействующему с каспазой-8, который можно идентифицировать с помощью описанного выше скрининг-анализа. Изобретение также относится к полипептиду или белку, по существу, соответствующему белку, взаимодействующему с каспазой-8. Термин по существу, соответствующий включает не только белок, взаимодействующий с каспазой-8, но также полипептиды или белки, являющиеся его аналогами.

Аналоги, по существу, соответствующие белку, взаимодействующему с каспазой-8, представляют

- 11 005853 собой полипептиды, в которых одна или несколько аминокислот аминокислотной последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8, заменены другими аминокислотами, делетированы и/или встроены, при условии, что полученный белок обнаруживает, по существу, такую же или более высокую биологическую активность, чем белок, взаимодействующий с каспазой-8, которому он соответствует.

Для соответствия, по существу, белку, взаимодействующему с каспазой-8, изменения в последовательности белков, взаимодействующих с каспазой-8, такие как изоформы, являются, как правило, незначительными. Хотя число изменений может превышать 10, предпочтительно, чтобы изменений было не более 10, предпочтительнее не более 5, и наиболее предпочтительно - не более 3 таких изменений. Можно использовать многие методы для поиска потенциально биологически активных белков, которые, по существу, соответствуют белкам, взаимодействующим с каспазой-8, и одним из таких методов является применение обычного метода мутагенеза для ДНК, кодирующей белок, приводящего к нескольким модификациям. Затем белки, экспрессированные клонами, можно скринировать на их способность связываться с каспазой-8 и модулировать активность каспазы-8 при модуляции/посредничестве в указанных выше внутриклеточных каскадах реакций.

Консервативными изменениями являются изменения, в результате которых не ожидают изменения активности белка, и, как правило, сначала скринируются как изменения, в результате которых не ожидают изменений размера, заряда или конфигурации белка, и не ожидают изменения его биологических свойств. К консервативным заменам белков, взаимодействующих с каспазой-8, относится аналог, где по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде консервативно заменен другой аминокислотой. Такие замены предпочтительно осуществляют в соответствии со списком, представленным в табл. 1А, и такие замены можно определить путем обычного эксперимента и обеспечить модификацию структурных и функциональных свойств молекулы синтезированного полипептида при сохранении свойств биологической активности белка, взаимодействующего с каспазой-8.

Таблица1А

С другой стороны, другую группу замен белка, взаимодействующего с каспазой-8, составляют замены, при которых по меньшей мере один аминокислотный остаток в полипептиде удаляют и на его место встраивают другой остаток в соответствии с приведенной далее табл. 1В. Типы замен, которые можно сделать в полипептиде, могут основываться на анализе частоты встречаемости аминокислотных замен в гомологичных белках разного вида, таких как замены, представленные в табл. 1-2 в работе Зе1ш1х с1 а1., 6.Е., Ргшс1р1е5 о£ Рго1еш §1гис1иге, 8ргшдег-Уег1ад, Νο\ν Уогк, ΝΥ, 1978, и на фиг. 3-9 в работе Сгсщк1ои, Т.Е. Рго1еш5: 81шс1иге апб Мо1еси1аг РгорегНеБ, XV. Н. Ргеешаи & Со., 8ап Егаис15со, СА, 1983. На основании такого анализа альтернативные консервативные замены определены здесь как замены в пределах одной из указанных далее групп.

- 12 005853

ТаблицаΙΒ

1. Небольшие алифатические неполярные или слабополярные остатки: А1а, 8ег, ТЬг, (Рго, С1у)

2. Полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Акр, Аки, С1и. С1п

3. Полярные положительно заряженные остатки: НШ Агд, Ьук

4. Большие алифатические неполярные остатки: Мек Ьеи, 11е, Уа1 (Сук)

5. Большие ароматические остатки: РЬе, Туг, Тгр

Три аминокислотных остатка, указанные выше в скобках, играют особую роль в строении белка. С1у является единственным остатком, лишенным какой-либо боковой цепи, и, таким образом, придает цепи гибкость. Однако это обстоятельство вызывает тенденцию промотирования образования вторичной структуры иного типа, чем а-спираль. Рго, в силу своей необычной геометрии, жестко сдерживает цепь и, как правило, имеет склонность промотировать структуры, подобные бета-повороту, хотя в некоторых случаях Сук может быть способен принимать участие в образовании дисульфидной связи, которая важна для структуры белка. 8с1ш1х е1 а1., цит. выше, смогли соединить указанные выше группы 1 и 2. Следует также отметить, что Туг, в силу его возможности образования водородной связи, имеет существенное сходство с 8ег и ТЬг и т.п.

Консервативные замены аминокислот в соответствии с настоящим изобретением, например, такие, какие указаны выше, известны в технике, и можно ожидать, что после замены аминокислот биологические и структурные свойства полипептида сохраняются. Большинство делеций и замен в соответствии с настоящим изобретением являются такими, которые не вызывают радикальных изменений в характеристиках белковой или пептидной молекулы. Характеристики не являются исключительным определением как замен во вторичной структуре, например, а-спирали на бета-складку, а также изменений биологической активности, например, связывания с каспазой-8, так и/или опосредования действия каспазы-8 на гибель клеток.

Примеры получения замен аминокислот в белках, которые можно использовать для получения аналогов белков, взаимодействующих с каспазой-8, для использования в настоящем изобретении включают стадии любых известных способов, например, представленные в патентах США КЕ 33653, 4959314, 4588585 и 4737462, Магк е1 а1.; 5116943, КоЛк е1 а1.; 4965195, Ыатеп е1 а1.; 4879111, СЬопд е1 а1.; и 5017691, Ьее е1 а1; а в патенте США 4904584 (81ю\у е1 а1.) представлены лизинзамещеные белки.

Подразумевается, что в объем изобретения, кроме описанных выше консервативных замен, которые, по существу, не изменяют активность белка, взаимодействующего с каспазой-8, входят или консервативные изменения или менее консервативные и более случайные замены, приводящие к возрастанию биологической активности аналогов белков, взаимодействующих с каспазой-8.

Когда специалист в данной области техники подтверждает точное воздействие замены или делеции, следует иметь в виду, что действие замены(замен), делеции(ий) и т.п. будет оцениваться с помощью обычных анализов связывания и гибели клеток. Скрининг с использованием такого стандартного испытания не включает уникальных экспериментов.

Приемлемыми аналогами, взаимодействующими с каспазой-8, являются аналоги, сохраняющие, по меньшей мере, способность взаимодействовать с каспазой-8 и, в силу этого, опосредовать активность каспазы-8 во внутриклеточном метаболизме, или модулировать активность самой каспазы-8. При этом можно получить аналоги, которые имеют так называемое доминантотрицательное действие, а именно, аналог, который дефектен в отношении связывания с каспазой-8 или последующей передачи сигнала, или в отношении другой активности после такого связывания. Такие аналоги можно использовать, например, для ингибирования цитотоксического действия каспазы-8 или для его усиления, в зависимости от того, требуется усилить гибель клеток или их выживаемость, и в зависимости от того, какая из этих активностей является главной, модулируемой взаимодействием белка, взаимодействующего с каспазой8, и каспазой-8 (см. выше), и это с помощью таких аналогов, конкурирующих с природным белком, взаимодействующим с каспазой-8, за связывание или взаимодействие с каспазой-8.

На генетическом уровне такие аналоги получают, как правило, посредством сайтнаправленного мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей белок, взаимодействующий с каспазой-8, причем посредством этого продуцируется ДНК, кодирующая аналог, и затем в рекомбинантной клеточной культуре синтезируется ДНК и экспрессируется полипептид. Аналоги, как правило, обнаруживают такую же или качественно повышенную биологическую активность по сравнению с встречающимся в природе белком, АикиЬе1 е1 ак, Сиггеп! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, Огеепе РиЬйсайопк апб УПеу 1п1егкшепсе, Νο\ν Уогк, ΝΥ, 1987-1995; 8атЬгоок е1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬогаЮгу, Со1б 8ргшд НагЬог, ΝΥ, 1989.

Получение таким образом белка, взаимодействующего с каспазой-8, или альтернативной нуклеотидной последовательности, кодирующей тот же полипептид, но отличающейся от природной последовательности вследствие замен, дозволенных известным вырождением генетического кода, можно достичь с помощью сайтнаправленного мутагенеза ДНК, кодирующей полученный ранее аналог или нативный вариант белка, взаимодействующего с каспазой-8. Сайтспецифический мутагенез позволяет получить аналоги посредством применения специфических олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательность ДНК нужной мутации, а также достаточное число соседних нуклеотидов,

- 13 005853 чтобы получить последовательность-затравку достаточного размера и сложности последовательности для образования устойчивого дуплекса по обеим сторонам пересекающейся области делеции. Как правило, предпочтителен праймер длиной примерно в 20-25 нуклеотидов, примерно с 5-10 комплементирующими нуклеотидами с каждой стороны изменяемой последовательности. Вообще, метод сайтспецифического мутагенеза хорошо известен в технике, например, из таких публикаций, как Айс1тап с! а1, ΌΝΑ, 2:183 (1983), включенной в настоящее описание в качествке ссылки.

Как будет понятно, в методе сайтспецифического мутагенеза, как правило, используется фаговый вектор, существующий как в одноцепочечной, так и в двухцепочечной форме. Типичные векторы, полезные при сайтнаправленном мутагенезе, включают такие векторы, как фаг М13, например, как описано в работе Мскыпд с! а1., Ннгй С1сус1апй Зутроыит оп Масгото1сси1с8 апй КссотЬшап! ΌΝΑ, Еййог А. Аа1!оп, Ексушг, Атйсгйат (1981), включенной в настоящее описание в качестве ссылки. Такие фаги доступны коммерчески, и их применение хорошо известно специалистам в этой области техники. С другой стороны, для получения одноцепочечной ДНК можно использовать плазмидные векторы, содержащие одноцепочечный фаговый ориджин репликации (Успа с! а1., Мс!й. Епхуток 153:3, 1987).

Вообще, сайтнаправленный мутагенез в соответствии с описанным выше осуществляют посредством получения сначала одноцепочечного вектора, включающего в свою последовательность последовательность ДНК, кодирующую релевантный полипептид. Олигонуклеотидный праймер, содержащий нужную мутированную последовательность, получают синтетически посредством автоматизированного синтеза ДНК/олигонуклеотидов. Затем этот праймер отжигают с одноцепочечным вектором, содержащим последовательность белка, и подвергают воздействию ферментов, полимеризующих ДНК, таких как фрагмент Кленова полимеразы I Е. сой, для завершения синтеза цепи, содержащей мутацию. Таким образом, мутированная последовательность и вторая цепь содержат нужную мутацию. Затем этот гетеродуплексный вектор используют для трансформации соответствующих клеток, таких как клетки Е. со11 1М101, и отбирают клоны, которые включают рекомбинантные векторы, содержащие порядок мутированной последовательности.

После того, как такой клон отобрали, последовательность белка, взаимодействующего с каспазой-8, можно извлечь и поместить в соответствующий вектор, как правило, вектор переноса или экспрессирующий вектор типа, который можно использовать для трансфекции соответствующего хозяина.

Соответственно, ген или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, также можно обнаружить, получен он и/или модифицирован 1п У1!го, 1п δίΐιι и/или 1п у1уо, путем использования известных методов амплификации ДНК или РНК, таких как РСК и химический синтез олигонуклеотидов. РСК дает возможность амплификации последовательностей ДНК посредством повторяющихся полимеразных реакций ДНК. Такую реакцию можно использовать как замену клонирования; все, что требуется, - это знание нуклеотидной последовательности. Для того чтобы осуществить РСК, создают праймеры, комплементарные к последовательности, представляющей интерес. Затем праймеры получают посредством автоматизированного синтеза ДНК. Поскольку можно создать праймеры для гибридизации любой части гена, условия можно создать такие, что можно допустить ошибки при спаривании комплементарных оснований. Амплификация таких ошибочных областей может привести к синтезу мутагенного продукта, и причем результатом является генерация пептида с новыми свойствами (т.е. сайтнаправленный мутагенез). См. также Аи8иЬс1, цит. выше, гл.16. Кроме того, посредством сочетания синтеза комплементарных ДНК (кДНК) с использованием обратной транскриптазы с РСК можно использовать РНК в качестве исходного вещества для синтеза внеклеточного домена рецептора пролактина без клонирования.

Кроме того, можно создать праймеры РСК для внесения новых сайтов рестрикции или других признаков, таких как кодоны терминации, в концы амплифицируемого сегмента гена. Такое размещение сайтов рестрикции по 5' и 3'-концам амплифицированной последовательности гена позволяет создать сегменты гена, кодирующие белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его фрагмент, для лигирования других последовательностей и/или сайтов клонирования с векторами.

РСК и другие способы амплификации РНК и/или ДНК хорошо известны в технике и могут применяться в соответствии с настоящим изобретением без излишнего экспериментирования на основе положений и указаний, приведенных здесь. К известным способам амплификации ДНК или РНК относятся, но не ограничиваются перечисленным, полимеразная цепная реакция (РСК) и родственные способы амплификации (см., например, патенты США 4683195, 4683202, 4800159, 4965188, Мц11щ с! а1.; 4795699 и 4921794, ’ГаЬог с! а1.; 5142033, 1ппщ; 5122464, Айкоп с! а1.; 5091310, 1ппщ; 5066584, 6у11сп8!сп с! а1.; 4889818, Сс1Гапй с! а1.; 4994370, 8йусг с! а1.; 4766067, Вк\уа5; 4656134, Ктдо1й; и 1пш§ с! а1., сйк. , РСК Рго!осо1§: А Сшйс !о Мс!йой апй Аррйсайопк), и амплификация, опосредуемая РНК, при которой в качестве матрицы для синтеза двухцепочечной ДНК используется антисмысловая РНК к последовательности-мишени (патент США 5130238, Ма1ск с! а1., торговое название ЫА8ВА); и иммуно-РСК, соединяющая применение амплификации ДНК с мечением антител (Кихюка с! а1., 8с1спсс, 260:487 (1993); 8апо с! а1., 8с1спсс, 258:120 (1992); 8апо с! а1., Вю!ссйщдис8, 9:1378 (1991)), которые включены в настоящее описание в качестве ссылок.

- 14 005853

Аналогичным образом биологически активные фрагменты белков, взаимодействующих с каспазой8 (т. е. фрагменты любых белков, взаимодействующих с каспазой-8, или их изоформ), можно получить так, как указано выше в отношении аналогов белка, взаимодействующего с каспазой-8. Подходящими фрагментами белка, взаимодействующего с каспазой-8, являются фрагменты, которые сохраняют способность белка, взаимодействующего с каспазой-8, и могут опосредовать биологическую активность каспазы-8 или других белков, непосредственно или косвенно связанных с каспазой-8. Соответственно, можно получить фрагменты белка, взаимодействующего с каспазой-8, которые обладают доминантотрицательным или доминантположительным действием, как указывалось выше в отношении аналогов. Следует отметить, что такие фрагменты представляют особый класс аналогов по изобретению, а именно, они определяются как части белков, взаимодействующих с каспазой-8, образованные от полной последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8 (например, от последовательности любого из белков, взаимодействующих с каспазой-8, или их изоформ), причем каждая такая часть или фрагмент обладает любой из указанных выше активностей. Такой фрагмент может представлять собой, например, пептид.

Подобным образом производные можно получить путем стандартных модификаций боковых групп одного или нескольких аминокислотных остатков белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов или фрагментов, или посредством конъюгации белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов или фрагментов, с другой молекулой, например антителом, ферментом, рецептором и т.п., что хорошо известно в технике. Соответственно, используемый здесь термин производные охватывает производные, которые можно получить из функциональных групп, встречающихся в боковых цепях остатков, или Ν- или С-концевых групп, способами, известными в технике, и все они входят в объем изобретения. Производные могут иметь химические группы, такие как углеводные или фосфатные остатки, при условии, что такая фракция обладает такой же или более высокой биологической активностью, как белки, взаимодействующие с каспазой-8.

Например, производными могут являться алифатические эфиры, полученные по карбоксильным группам, амиды, полученные по карбоксильным группам посредством взаимодействия с аммиаком или первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, образованные с помощью ацильных групп (например, алканоильных или карбоциклических ароильных групп), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, серильных или треонильных остатков), образованные с помощью ацильных групп.

Термин производные предназначен для обозначения только таких производных, в которых нет замены одной аминокислоты на другую из числа двадцати обычно встречающихся в природе аминокислот.

Как описано выше, анализы с расщеплением можно использовать для определения того, расщепляется ли белок, взаимодействующий с каспазой-8, каспазой-8. Разделение по размеру расщепленных фрагментов приблизительно указывает местоположение сайта расщепления.

Сайт расщепления также можно определить посредством получения делеционных мутантов испытываемого белка и испытанием кажого делеционного мутанта на его подверженность расщеплению каспазой-8, как описано выше. Делеционные мутанты можно сконструировать посредством РСКклонирования нужных фрагментов испытываемого белка с использованием в качестве матрицы последовательности ДНК клона, кодирующего указанный испытываемый белок. Фрагменты, амплифицированные методом РСК, затем можно клонировать в экспрессирующие векторы, за счет чего должны обеспечиваться стартовый кодон ΑΤΟ и предпочтительно последовательность Козак (Кохак. М., ΝιιοΕίο Ас1кк Век., 12, р. 857-72, 1984). Другие подробности экспрессирования белков можно найти в указанных выше сведениях от О|адеп. относящихся к меченным гистидином белкам, а также вообще к экспрессии белков. Другой ссылкой, содержащей сведения об экспрессии белков, являются указанные выше Сиггеп! Рго!осо1к, и особенно глава 16 в них.

Таким образом, сайт расщепления испытываемого белка можно определить посредством получения его делеционных мутантов и определения наименьшего такого делеционного мутанта, отщеплямого каспазой-8.

При другом способе идентификации сайта расщепления используют пептиды, которые образуются в соответствии с предсказанной белковой последовательностью испытываемого клона. Пептиды можно синтезировать химическим способом, например, так, как подробно описано в Вокапкхку апк Вокапкхку. Не ргасксе о£ реркке кугИйекк. 8рппдег. №\ν Уогк, Ι8ΒΝ 0-387-13471-9, и в Вокапкхку, 'Уйе рппар1ек о£ реркке кугИйекк 8рппдег. №\ν Уо1к, Ι8ΒΝ 0-387-12359-4. Синтез нужного пептида также доступен от некоторых коммерческих компаний, например, 8упРер Согр., ОиЬйп, СА, И8А, и СаЖогша Реркке Кекеагсй, 1пс., №ра. СА, И8А. Пептиды также можно получить или в виде гибридов с другими белками или отдельно посредством экспрессии рекомбинантной ДНК, кодирующей их, что подробно описано в цитированной выше главе 16 СиггеП Рго!осо1к.

Для того чтобы использовать пептиды для картирования сайта расщепления испытываемого белка, предсказанную аминокислотную последовательность указанного белка разделяют на зоны, и синтезируют пептид, соответствующий каждой зоне. Кроме того, синтезируют пептиды, содержащие примерно половину аминокислот одной из зон и содержащие в соприкосновении также примерно половину аминокислот непосредственно прилегающей области, для того,чтобы перекрыть границу между двумя зонами.

- 15 005853

Зоны содержат от 5 до 100 аминокислот, предпочтительно от 9 до 40 аминокислот, и наиболее предпочтительно - от 20 до 30 аминокислот. Затем полный набор пептидов испытывают так, как описано выше, на подверженность расщеплению каспазой-8. Полученные пептиды можно очистить и получить в большом количестве. После реакции расщепления их можно затем проанализировать непосредственно методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 8Ό8 и УФ-детекции или визуализации посредством окрашивания, например, с использованием кумасси синего. С другой стороны, для более легкого обнаружения пептиды можно пометить, например, путем изотопного мечения концов (см., например, ЗНеусНенко А. е! а1., Кар1б Соттип. Макк 8рес1гит, 11, р. 1015-24, 1997).

После завершения скрининга пептидов, описанного выше, пептид, который, как теперь известно, содержит сайт расщепления каспазой-8, затем можно исследовать, повторив те же приемы, но отбирая более мелкие зоны, выбранные из последовательности идентифицированного пептида.

Фактический сайт расщепления пептидов должен соответствовать последовательности расщепления каспазой ΧΧΧΌ (см. Βο16ίη е! а1., Се11, 1996, и Νχΐιοίκοη е! а1., КШег сакракек, Τκη68 ίη ВюсНет. 8ск, 22, 299-306, 1997). Вклад каждой аминокислоты в пептид можно оценить посредством получения пептидов, мутированных по одной из аминокислот, и испытанием таких мутированных пептидов на подверженность расщеплению каспазой-8. Мутированную аминокислоту предпочтительно заменяют аминокислотой, выбранной из группы заряженных неполярных аминокислот (см. кекшпдег. ВюсйетШту, \νοΠ1ι. ΝΥ, 1979, с11ар1ег 4), и наиболее предпочтительно выбранных среди глицина или аланина.

Путем мутации критических аминокислот можно получить пептиды, связывающиеся с каспазой-8, но невосприимчивые к расщеплению ею. Связывание можно проверить посредством разделения по размеру комплексов пептида и каспазы-8 в условиях без денатурации с использованием электрофореза в акриламидном геле.

Также можно сконструировать модифицированные пептиды, способные к взаимодействию с активным цистеином каспазы-8, при этом они ковалентно связываются с указанным цистеином. Для этой цели можно использовать реагенты, взаимодействующие с тиольными группами, известные специалистам в области химии. Например, с 8Н-группой активного цистеина каспазы-8 могут реагировать реагенты, содержащие тиольную группу. Образовавшуюся ковалентную связь 8-8 можно расщепить посредством восстановления, например, в физиологических условиях в цитозоле или с использованием реагента, восстанавливающего 8-8-группы, такого как дитиотреитол (ΌΤΤ). Реагенты, взаимодействующие с тиольными группами, можно также необратимо присоединить к каспазе-8. Такие реагенты можно легко найти среди кросс-линкеров, способных взаимодействовать с тиольными группами, известных в технике, таких как описанные на с. О-90 и далее в каталоге Р1ЕКСЕ Ы£е 8с1спсск (Р1ЕКСЕ, КοскΓο^б. 1Ь, И8А) .

Подходящими группами, реагирующими с тиольными группами, являются, например, пиридилдитио-, иодацетамидо- или малеимидогруппы. Эти группы можно присоединить к пептиду через линкеры, содержащие цепи необязательно ненасыщенных алифатических углеводородов, -О-, -8-, -ΝΗ- или ароматические группы. Линкеры, необязательно, могут содержать заместители.

Тиолреактивные группы можно присоединить к пептиду путем химического синтеза, как известно в технике; функциональные группы пептида можно ввести во взаимодействие с подходящими функциональными группами молекул линкера с тиолреагирующей группой. Например, остаток лизина, присутствующий в пептидной последовательности или введенный в нее с целью создания подходящей функциональной группы, которой, в случае лизина, является эпсилонаминогруппа, можно ввести во взаимодействие с гетеробифункциональным кросс-линкером, таким как Ν-гамма-малеимидобутирилоксисукцинимидэфир, и создать пептид, где указанная эпсилонаминогруппа реагирует с Ν-гидроксисукцинимидной группой кросс-линкера, в то время как малеимидогруппа кросс-линкера не вступает в реакцию и может после контакта с цистеином каспазы8, который встречается, когда указанный пептид специфически связывается с указанной каспазой-8, реагировать с тиольной группой указанного цистеина и посредством этого инактивировать указанную каспазу-8.

Позицию в пептиде, используемую для взаимодействия с ним тиолреактивного реагента, можно выбрать так, чтобы она была вблизи аминокислоты (как правило, аспарагиновой кислоты), где происходит расщепление каспазой-8. Линкер, с помощью которого тиолреактивная группа связывается с пептидом, может изменяться по своей длине, наличию полярных групп, таких как гидрокси, заряженных групп, таких как нитро- и сульфогруппы, и ароматических групп, таких как фениленовый или фенильный остаток. Такие вариации в строении линкера позволят получить реагент, содержащий пептид и связанную с ним ковалентно тиолреактивную группу, которая специфически связывается с каспазой-8 и эффективно реагирует с тиольной группой ее активного цистеина.

Испытываемый белок или его пептидный фрагмент можно также охарактеризовать посредством введения указанного белка или пептида в клетку млекопитающего и измерения его действия на реагенты, вызывающие апоптоз в указанной клетке.

Экспрессию белка или пептида в клетке млекопитающего можно осуществить путем встраивания ДНК, кодирующей испытываемый белок, в вектор, содержащий промотор, необязательно, интронную последовательность и донорные/акцепторные сигналы сплайсинга, и также, необязательно, содержащий последовательность терминации. Эти методы в целом описаны в указанных выше Синей РюЮ^Е, глава 16.

- 16 005853

Вышеуказанные промоторная, интронная и терминационная последовательности операбельны в клетках млекопитающего. Промотор, предпочтительно, является сильным промотором, таким как указанные выше промоторы В8У, СМУ или МР8У. Промотор также может представлять собой ранний промотор 8У40 (Еуеге!! е! а1., Ыис1е1с Ас1бк Век., 11, ρ. 2447-64, 1983, и указанные там ссылки) или клеточный промотор, такой как промотор бета-актин или промотор ЕЬЕ-1 (ТокикЫде е! а1., 1. У1го1. Ме!1юбк, 64, ρ. 73-80, 1997). Можно также использовать гибридный промотор, такой как гибрид 1ас-оператора и ЕЬЕ-1 альфа-промотора человека, описанный Ебата!ки е! а1. (Оепе, 187, ρ. 289-94, 1997), гибридный промотор СМУ-бета-актин, описанный Акад е! а1., К1бпеу 1п!., 51, ρ. 1265-9, 1997, или гибрид !е!-операторных последовательностей и промотора СМУ (Еиг!к е! а1., ΡΝΑ8, 91, 9302-6, 1994, и указанные там ссылки).

Интронные последовательности, которые можно встраивать в виде полных последовательностей, т.е. включающие сайты донора и акцептора сплайсирования, можно встраивать в кодирующую последовательность белка, который нужно экспрессировать. Встраивание таких интронных последовательностей может усилить устойчивость РНК и, таким образом, увеличить продуцирование нужного белка. Несмотря на то, что, в принципе, подходящие интронные последовательности можно выбрать среди любых интронов, содержащих ген, предпочтительными интронными последовательностями являются интрон бетаактина, интрон 8У40 и интрон рецептора к ΤΝΕ р55.

Интронная последовательность может содержать энхансерные элементы, которые могут усилить транскрипцию от вышеуказанных промоторов.

Часто интронные последовательности также содержат транскрипционные или транскрипционные контрольные последовательности, которые придают экспрессии тканеспецифичность. Следовательно, когда белок изобретения нужно экспрессировать тканеспецифически, может быть выгодным использование таких интронных последовательностей. Примером интрона, содержащего тканеспецифические энхансерные элементы, является эритроидспецифический энхансер, расположенный в интроне 8 гена 5аминолевулинатсинтазы 2 человека (8иппуа е! а1., 1. Вю1. Скега., 273, ρ. 16798-809, 1998), а обсуждение принципов усиления продуцирования белков с использованием интронных последовательностей, наряду с примерами интронных последовательностей, описаны Ниапд е! а1., №1с1ею Ас1бк Век., 18, ρ. 937-47, 1990).

Транскрипционные терминационные последовательности и сигналы полиаденилирования можно добавить к 3'-концу ДНК, кодирующей белок, который нужно экспрессировать. Такие последовательности можно найти во многих или даже в большинстве генов. Выгодно использовать сигнал полиаденилирования 8У40 (8сйек е! а1., Мо1. Се11. Вю1., ρ. 5386-93, и приведенные там ссылки).

Предпочтительным вектором экспрессии белка в клетке млекопитающего является вектор ρс^NΑН1к (1пу1!годеп), содержащий промотор СМУ для управления экспрессией гена, кодирующего нужный белок. Другими векторами, которые можно использовать, являются векторы ρί.ΟΝΑ3 или ρМΡ8УЕН. Эти векторы содержат промоторы СМУ и МР8У соответственно.

Используя рекомбинантную экспрессию испытываемого белка, указанный белок теперь можно оценить по его действию на сигнал апоптоза, опосредуемый каспазой-8. С этой целью можно индуцировать апоптоз или путем сверхэкспрессии индуцирующего апоптоз белка, такого как внутриклеточный домен СО120а, внутриклеточный домен СО95, белок МОВТ-1, каспаза-8 или их эквиваленты, или путем активации сигнала апоптоза посредством инициации СО 120а, СО95, ТВАМР/ОВ3 или эквивалентного рецептора. Активации рецептора можно добиться или посредством приведения рецепторов в контакт с лигандом, или посредством поперечного сшивания рецепторов с антителами, предпочтительно - поликлональными антителами (см. Епде1тапп е! а1., 1. Вю1. Сйет., 265, ρ. 14497-504, 1990).

Несмотря на то, что, вообще, инициация рецептора, подобного СО 120а, требует добавления ингибитора синтеза белка, подобного циклогексимиду, для того, чтобы добиться сильного сигнала для апоптоза, сверхэкспрессии рецепторных внутриклеточных доменов или белков, вовлеченных в трансдукцию сигнала апоптоза, не происходит (см. Во1бш е! а1., Се11, 85, ρ.803, 1996). Детекция апоптоза, время инкубации и другие подробности и параметры этого анализа описаны в цитированной выше работе Во1бш е! а1.

Гибель клеток, экспрессирующих испытываемый белок, по сравнению с клетками, белок не экспрессирующими, можно оценить любым из многих способов, таким как способ на основе фрагментации ДНК или обнаружении апоптозспецифических антигенов и эпитопов, а реагенты и протоколы для обнаружения апоптоза в форме набора доступны от вышуказанной компании Воекппдег Маппйепп и от других компаний.

Гибель клеток можно также определить путем оценки морфологического состояния клеток. Гибель клеток вследствие апоптоза характеризуется волнистой мембраной у клеток и сморщиванием клеток при отсутствии лизиса.

Выгодно экспрессировать в клетке млекопитающего репортерный ген для того, чтобы обеспечить маркер для успешной трансфекции. Так как сама процедура трансфекции приводит к гибели некоторых клеток, в том числе клеток, которые не трансфицированы, выгодно оценивать только те клетки, которые трансфицированы. Предпочтительным репортерным геном для этой цели является ген ΕκΖ, который легко обнаруживается путем инкубации трансфицированных клеток с Хда1 или подобным реагентом, ука

- 17 005853 зывающим на активную бета-галактозидазу. Однако можно использовать любой другой репортерный ген, предпочтительно ген, продукты которого легко обнаруживаются с использованием простой реакции окрашивания, результаты которой можно оценить с использованием микроскопа. Например, для непосредственной детекции без реакции окрашивания можно использовать белок зеленой флуоресценции. Этот репортерный ген требует применения флуоресцентного микроскопа.

Таким образом, рассматривая только клетки, которые трнсфицированы, т. е. которые экспрессируют репортерный ген, и подсчитывая процент клеток, демонстрирующих морфологию, характерную для апоптоза, можно оценить действие определенного трансфицированного клона и экспрессированного им белка на апоптоз.

Клетки млекопитающего представляют собой, предпочтительно, НеЬа или эмбриональные клетки почки человека (НЕК) 293-Т. Трансфекцию предпочтительно осуществляют кальцийфосфатным способом, как описано в цитированных выше Сиггеи! Рго!осок. Морфологию клеток оценивают через 1-150 ч после трансфекции, предпочтительно через 4-35 ч, и наиболее предпочтительно через 20 ч после трансфекции.

Получение антител

Поликлональные антитела можно получить в кроликах, курах, мышах, крысах, овцах или подобных млекопитающих. Для получения антител против белка или пептида изобретения в клетках млекопитающего получают белок или пептид, как описано выше, с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Белок также можно получить в клетках бактерий или насекомых, как подробно описано в цитированных выше Сиггеи! Рго!осок, глава 16.

Белок или пептид очищают от клеток, в которых он продуцирован. Способы очистки белков известны специалистам в этой области техники и описаны подробно, например, в цитированных выше Сиггеи! Рго!осок ίη Мо1еси1аг Вю1оду, глава 16, и в Сиггеи! Рго!осок ίη Рго!ет Баеисе,АПеу апб 8ои§ 1ис., главы 5 и 6. Белок можно выгодно получить в виде гибрида с другим белком, таким как глутатион-8трансфераза, или подобным белком, или последовательностью-меткой, такой как последовательность гистидиновой метки. Использование гибридных или меченых белков упрощает процедуру очистки, что подробно описано в цитированных выше Сиггеи! Рго!осо1§ ш Мо1еси1аг Вю1оду, глава 16, и в инструкциях для указанного выше набора для экспрессии и очистки белков с гистидиновой меткой от Οίηςοι.

Если белок или пептид экспрессирован в виде слитого белка, желательно отщепить партнера по гибридизации перед применением белка для получения антител против партнера по гибридизации. Расщепление партнеров по гибридизации и выделение нужного белка описано в цитированных выше Сиггеи! Рго!осо1§ 1и Мо1еси1аг Вю1оду, глава 16. Векторы, протоколы и реагенты для экспрессии и очистки рекомбинантных белков, слитых с белком связывания мальтозы, также доступны коммерчески.

При получении пептида изобретения может быть желательно не удалять партнера по гибридизации, так как слитый белок может стимулировать продуцирование антител против пептида. Как правило, это соображение будет уместно, когда получают антитела из пептидов, длина которых менее 50 аминокислот.

Как отмечено также выше, пептид также можно синтезировать химическими способами, известными в химии.

Получение поликлональных антител против белков описано в главе 2 Сиггеи! Рго!осо1§ ш 1ттиио1оду, Абеу аиб 8ои§ 1ис. При получении антител против пептидов могут потребоваться некоторые изменения в протоколе, как правило, вследствие более низкой антигенности пептидов по сравнению с белками. Получение поликлональных антител против пептидов описано в цитированных выше Сиггеи! Рго!осоИ 1и 1ттиио1оду, глава 9.

Моноклональные антитела можно получить из В-клеток, взятых из селезенки или лимфоузлов иммунизированных животных, в частности, крыс или мышей, путем слияния с иммортализованными Вклетками в условиях, благоприятных для роста гибридных клеток. Для слияния с В-клетками мышей предпочтительна клеточная линия Ад-8.

Методы получения моноклональных антител описаны во многих статьях и книгах, таких как цитированные выше Сиггеи! Рго!осок 1и 1ттиио1оду. В главе 9 этого издания описывается иммунизация животных с помощью пептидов. Клетки селезенки или лимфоузлов этих животных можно использовать для получения моноклональных антител так же, как клетки селезенки или лимфоузлов животных, иммунизированных белками, как это описано в этом издании в главе 2.

Методы, используемые при получении моноклональных антител, также описаны в КоЫег аиб М115!еш, №!иге, 256, 495-497, и в И8Р 4376110.

Для получения антител из банка генов антител человека гипервариабельные области генов заменяют почти случайными последовательностями, как описано в И8Р 5840479. Такие антитела предпочтительны, если иммунизация животного данным пептидом или белком затруднительна. Некоторые структуры являются слабоиммуногенными и могут оставаться такими, несмотря на добавление адъювантов и связь с другими белками в гибридные конструкции. Антитела, описанные в И8Р 5840479, также предпочтительны, если требуется использование антител со структурой, подобной антителам человека, например, когда нужны антитела с низкой иммуногенностью у людей.

- 18 005853

Как только подходящие антитела идентифицированы, может потребоваться изменение их свойств. Например, при получении можно достичь более высоких выходов с химерными антителами. Химерные антитела, где константные области заменены на константные области антител человека, также могут потребоваться, когда желательно, чтобы антитела имели низкую иммуногенность у людей. Получение химерных антител описано во многих публикациях, например, в СаЬ111у е! а1., ΡΝΑ8, 81, р. 3273, 1984; Μо^пзоп е! а1., ΡΝΆ8, 81, р.6851, 1984; ВоиНаппе е! а1., №!иге, 312, р. 643, 1984; ЕР 125023, ЕР 171496, ЕР 173494, ЕР 184187, \νΟ 86/01533, \νΟ 87/02671 и в Наг1оте апб Ьапе, АпйЬоб1е8: А ЬаЬога!огу Μапиа1, Со1б 8рппд НагЬог ЬаЬога!огу, 1988.

Другим типом антител являются антиидиотипические антитела. Антиидиотипические (анти-1б) антитела являются антителами, распознающими уникальные детерминанты, как правило, ассоциированные с антигенсвязывающим сайтом антитела. Антитела против 1б можно получить посредством иммунизации животного того же вида и генетического типа (например, штамма мышей), что и источник тАЬ, к которому получают анти-1б. Иммунизированное животное будет узнавать и реагировать на идиотипические детерминанты иммунизирующего антитела путем продуцирования антител к этим идиотипическим детерминантам (анти-1б антитела). См., например, патент США 4699880, включенный в настоящее описание в качестве ссылки.

Анти-1б антитела также можно использовать в качестве иммуногена для индукции иммунной реакции еще и у другого животного, продуцируя так называемые анти-анти-1б антитела. Анти-анти-1б могут быть эпитопно идентичны исходным тАЬ, которые индуцировали анти-1б. Таким образом, используя антитела к идиотипическим детерминантам тАЬ, возможно идентифицировать другие клоны, экспрессирующие антитела идентичной специфичности.

Соответственно, тАЬ, полученные против белка, взаимодействующего с каспазой-8, его аналогов, фрагментов или производных настоящего изобретения можно использовать для индукции анти-1б антител у подходящих животных, таких как мыши ВАЬВ/с. Клетки селезенки таких иммунизированных мышей используют для получения анти-1б гибридом, секретирующих анти-1б тАЬ, Далее, анти-1б тАЬ можно сочетать с носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (КЬН) и использовать для иммунизации других мышей ВАЬВ/с. Сыворотка этих мышей будет содержать анти-анти-1б антитела, обладающие свойством связываться с исходными тАЬ, специфичными для эпитопа вышеуказанного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его аналогов, фрагментов или производных.

Таким образом, анти-1б тАЬ имеют свои собственные идиотипические эпитопы или идиотопы, схожие по строению с оцениваемым эпитопом.

Термин антитело также обозначает как интактные молекулы, и их фрагменты, такие, как, например, ЕаЬ и Е(аЬ')2, способные связываться с антигеном. Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2, лишенные Есфрагмента интактного антитела, быстро выводятся из кровообращения и могут иметь меньше нетканеспецифического связывания, чем интактное антитело (\νη1ι1 е! а1., 1. №с1. Μеб., 24:316-325 (1983)).

Следует иметь в виду, что ЕаЬ и Е(аЬ')2 и другие фрагменты антител, полезные в настоящем изобретении, можно использовать для детекции и количественного определения белка, взаимодействующего с каспазой-8, в соответствии со способами, описанными здесь для молекул интактных антител. Такие фрагменты, как правило, получают посредством протеолитического расщепления с использованием ферментов, таких как папаин (для получения ЕаЬ-фрагментов) или пепсин (для получения Е(аЬ')2фрагментов).

Об антителе говорят, что оно способно к связыванию с молекулой, если оно способно специфически взаимодействовать с молекулой, и посредством этого молекула связывается с антителом. Термин эпитоп относится к той части любой молекулы, способной связываться антителом, которую это антитело может узнать. Эпитопы или антигенные детерминанты, как правило, состоят из химически активных групп молекул на поверхности, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и имеют специфические трехмерные структурные характеристики, так же как и специфические характеристики по заряду.

Антиген представляет собой молекулу или часть молекулы, способную связываться антителом, которое также способно индуцировать животное к продуцированию антител, способных к связыванию с эпитопом этого антигена. Антиген может иметь один или несколько эпитопов. Специфическое взаимодействие, упомянутое выше, означает, что антиген будет взаимодействовать с высокой селективностью со своим соответствующим антителом, а не со многими другими антителами, которые могут вызываться другими антигенами.

Антитела, в том числе, фрагменты антител, полезные в настоящем изобретении, можно использовать для качественной и количественной детекции белка настоящего изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Это можно осуществить иммунофлуоресцентными методами с использованием флуоресцентно помеченных антител (см. ниже) вместе с детекцией оптическими методами, методом поточной цитометрии или флуорометрическими методами.

Антитела (или их фрагменты), полезные в настоящем изобретении, можно использовать для гистологии с методами иммунофлуоресценции или иммуноэлектронной микроскопии для детекции ш 8Йи белка настоящего изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Детекцию ш 8Йи можно выполнить по

- 19 005853 средством взятия гистологического образца у пациента и предоставления меченого антитела настоящего изобретения к такому образцу. Антитела (или их фрагменты) предпочтительно предоставляют посредством нанесения или наслоения меченых антител (или фрагментов) на биологический образец. Применяя такую процедуру, можно определить не только наличие белка, взаимодействующего с каспазой-8, но также его распределение в проверяемой ткани. Применяя настоящее изобретение, специалисты легко представят, что любой из многочисленных гистологических методов (таких как процедуры окрашивания) можно модифицировать для того, чтобы добиться такой детекции ш χί!ιι.

Такие анализы на белок настоящего изобретения, взаимодействующий с каспазой-8, как правило, включают инкубацию биологического образца, такого как биологическая жидкость, тканевый экстракт, свежесобранные клетки, такие как лимфоциты или лейкоциты, или клетки, инкубированные в культуре ткани, в присутствии обнаруживаемых меченых антител, способных идентифицировать белок, взаимодействующий с каспазой-8, и детекцию антител любым из многих способов, известных в технике.

Биологический образец можно обработать с помощью твердофазной подложки или носителя, таких как нитроцеллюлоза, или других твердой подложки или носителя, способных иммобилизовать клетки, частицы клеток или растворимые белки. Затем подложку или носитель можно промыть подходящими буферами с последующей обработкой детектируемыми мечеными антителами в соответствии с настоящим изобретением, как указано выше. Затем твердофазную подложку или носитель можно промыть буфером во второй раз и удалить несвязанные антитела. Затем обычными способами можно определить количество связанной метки на указанной подложке или носителе.

Под твердофазной подложкой, твердофазным носителем, твердой подложкой, твердым носителем, подложкой или носителем подразумеваются любые подложки или носители, способные связывать антиген или антитела. Хорошо известными подложками или носителями являются стекло, полистирол, полипропилен, полиэтилен, декстран, найлонамилазы, природные и модифицированные целлюлозы, полиакриламиды, габбро и магнетит. Носитель для целей настоящего изобретения по природе может быть или растворимым до некоторой степени или нерастворимым. Материал подложки фактически может иметь любую возможную структурную конфигурацию до тех пор, пока присоединенная молекула способна связываться с антигеном или антителом. Так, конфигурация подложки или носителя может быть сферической, как у гранул, цилиндрической, как внутренняя поверхность пробирки или как наружная поверхность стержня. С другой стороны, поверхность может быть плоской, такой как лист, тестпластина и т. п. Предпочтительными подложками или носителями являются полистирольные гранулы. Специалистам в этой области техники известны многие другие подходящие носители для связывания антител или антигенов, или в этом можно удостовериться с помощью простых экспериментов.

Связывающую активность полученных антител, по изобретению, как указано выше, можно определить с соответствии с хорошо известными способами. Специалисты в этой области техники смогут определить рабочие и оптимальные условия анализа в случае каждого определения, используя обычные эксперименты.

Другие стадии, такие как промывка, перемешивание, встряхивание, фильтрация и т.п., можно включить в анализы как обычные или необходимые в данной ситуации.

Одним из способов, которым антитела в соответствии с настоящим изобретением можно пометить для обнаружения, является связывание их с ферментом и применение иммуноферментного анализа (Е1А). Фермент, в свою очередь, при дальнейшем воздействии соответствующего субстрата будет реагировать с субстратом таким образом, что получится химическая группа, которую можно обнаружить, например, спектрофотометрическим, флуорометрическим или визуальным способом. Ферменты, которые можно использовать для детектируемого мечения антител, включают, но не ограничиваются перечисленным, малатдегидрогеназу, стафилококкоковую нуклеазу, дельта-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, альфа-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, бета-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу. Детекцию можно осуществить колориметрическими методами, при которых используют хромогенный субстрат для фермента. Детекцию также можно осуществить посредством визуального сравнения с полученными таким же способом стандартами.

Детекцию можно осуществить с использованием многих других иммуноанализов. Например, с помощью мечения антител или фрагментов антител радиоизотопами можно обнаружить Р-РТРазу, применяя радиоиммуноанализ (Р1А). Хорошее описание Р1А можно найти в БаЬога!огу ТесНп1циех апб ВюсНет181гу т Мо1еси1аг Вю1оду, Аогк, Т.8., е! а1., №г!Н Но11апб РиЬйкЫпд Сотрапу, ΝΥ (1978), особенно в главе под названием Ап 1п!гобис!юп !о Рабю1ттипе Аххау апб Ре1а!еб ТесНтдиек, СНагб, Т., включенных в настоящее описание в качестве ссылок. Радиоактивные изотопы можно обнаружить с помощью таких средств, как счетчик гамма-квантов или сцинтилляционный счетчик, или методом ауторадиографии.

Антитела в соответствии с настоящим изобретением также можно пометить флуоресцентным соединением. Когда на антитела с флуоресцентными метками действует свет с подходящей длиной волны, их присутствие можно обнаружить вследствие флуоресценции. Среди наиболее часто используемых со

- 20 005853 единений для флуоресцентного мечения находятся изотиоцианат, родамин, фикоэритрин, пикоцианин, аллофикоцианин, о-фтальдегид и флуорескамин.

Антитела также можно пометить для детекции с использованием флуресциирующих металлов, таких как ¹⁵²Е, или других металлов ряда лантанидов. Эти металлы можно присоединить к антителам с использованием таких образующих комплексы с металлами групп, как остаток диэтилентриаминпентауксусной кислоты (ЕТРА).

Антитела также можно пометить для детекции посредством сочетания их с хемилюминесцентным соединением. Присутствие меченных хемилюминесцентным соединением антител затем определяют путем детекции наличия люминесценции, которая появляется в ходе химической реакции. Примерами соединений, особенно полезных для хемилюминесцентного мечения, являются люминол, изолюминол, Шеготайс эфир акридиния, имидазол, соль акридиния и эфир щавелевой кислоты.

Подобным образом, для мечения антител настоящего изобретения можно использовать биолюминесцентное соединение. Биолюминесценция является видом хемилюминесценции, обнаруженной в биологических системах, в которых каталитический белок повышает эффективность хемилюминесцентной реакции. Наличие биолюминесцентного белка определяют посредством детекции наличия люминесценции. Важными биолюминесцентными соединениями для целей мечения являются люциферин, люцифераза и аэкорин.

Молекулу антитела настоящего изобретения можно адаптировать для применения в иммунометрическом анализе, известном также как двухслойный или сэндвич-анализ. При типичном иммунометрическом анализе некоторое количество помеченных антител (или фрагментов антител) связывается с твердой подложкой или носителем, и добавляют некоторое количество меченных для детекции растворимых антител, чтобы создать возможность детекции и/или количественного определения тройного комплекса, образуемого антителами твердой фазы, антигеном и мечеными антителами.

Типичными и предпочтительными иммунометрическими анализами являются прямые анализы, при которых антитела, связанные с твердой фазой, сначала вводят в контакт с бинарным твердофазным комплексом антитело-антиген. После соответствующего периода инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца, включая непрорегировавший антиген, если таковой есть, и затем вводят в контакт с раствором, содержащим неизвестное количество меченого антитела (которое функционирует как репортерная молекула). После второго периода инкубации для создания комплекса меченого антитела с антигеном, связанным с твердой подложкой или носителем с помощью немеченого антитела, твердую подложку или носитель промывают во второй раз для удаления непрореагировавших меченых антител.

В другом типе сэндвич-анализа, который также можно применять с антигенами настоящего изобретения, используют так называемые одновременные и обратные анализы. Одновременный анализ включает одну стадию инкубации, так как антитела, связанные с твердой подложкой или носителем, и меченые антитела добавляют к испытываемому образцу одновременно. После завершения инкубации твердую подложку или носитель промывают для удаления остатков жидкого образца и не вступивших в комплекс меченых антител. Затем определяют наличие меченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, так, как это обычно делают при прямом сэндвич-анализе.

При обратном анализе используют постадийное добавление к жидкому образцу сначала раствора меченых антител, а затем немеченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, после соответствующего периода инкубации. После второй инкубации твердую фазу промывают обычным способом для освобожения ее от остатков испытываемого образца и раствора непрореагировавших меченых антител. Затем осуществляют определение меченых антител, связанных с твердой подложкой или носителем, как при одновременном и прямом анализах.

Иммуноанализы

Осуществление иммуноанализов, таких как ША или ЕЫБА, описано во многих статьях, книгах и других публикациях. Дается ссылка на АО 97/03998, со с. 48, строка 4, по с. 52, строка 27. Иммуноанализы изобретения могут быть двух общих типов: во-первых, можно использовать иммуноанализы с использованием иммобилизованного белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его эквивалента для количественного определения каспазы-8; во-вторых, можно использовать иммуноанализы с использованием иммобилизованных антител, направленных против эпитопа белка, взаимодействующего с каспазой8, для количественного определения белков, взаимодействующих с каспазой-8.

Такие анализы могут найти применение в диагностике, когда нужно оценить содержание каспазы-8 и других белков, вовлеченных в апоптозный каскад реакций, при многих нарушениях или синдромах, где возможно участие таких каскадов.

Нуклеиновые кислоты

Ожидается, что клоны, полученные при скрининге по изобретению, будут неполными клонами. Получение полных клонов, когда это необходимо, также описано выше. Последовательность ДНК полного клона и неполного клона, найденная сначала при скрининге по изобретению, может найти разные применения.

Например, для того, чтобы управлять экспрессией белка, взаимодействующего с каспазой-8, может

- 21 005853 потребоваться получение в клетке антисмысловой РНК. Для этой цели полную или неполную кДНК, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой-8, встраивают в экспрессирующий вектор, содержащий промотор, что также указано выше. Посредством этого 3'-конец кДНК встраивают по соседству с 3'концом промотора, причем 5'-конец кДНК отделяется от 3'-конца промотора указанной кДНК. Поэтому, после экспрессии кДНК в клетке продуцируется антисмысловая РНК, неспособная кодировать белок. Наличие антисмысловой РНК в клетке снижает экспрессию клеточной (геномной) копии гена, взаимодействующего с каспазой-8.

Для получения антисмысловой РНК можно использовать полную кДНК. С другой стороны, можно использовать ее фрагмент, который предпочтительно имеет длину от 9 до 2000 нуклеотидов, предпочтительнее от 15 до 500 нуклеотидов, и наиболее предпочтительно от 30 до 150 нуклеотидов.

Фрагмент предпочтительно соответствует области в пределах 5'-половины кДНК, предпочтительнее 5'-области, содержащей 5'-нетранслируемую область и/или первую экзонную область, и наиболее предпочтительно - содержащей сайт начала трансляции АТС. С другой стороны, фрагмент может соответствовать последовательности ДНК только 5'-нетранслируемой области.

В качестве антисмыслового олигонуклеотида можно использовать синтетический олигонуклеотид. Олигонуклеотид, предпочтительно, представляет собой олигонуклеотид ДНК. Длина антисмыслового олигонуклеотида составляет предпочтительно от 9 до 150, предпочтительнее от 12 до 60, и наиболее предпочтительно от 15 до 50 нуклеотидов. Область, перекрываемая антисмысловым олигонукле-отидом, содержит предпочтительно 3'-нетранслируемую область кДНК, предпочтительнее она содержит сигнал полиаденилирования или стоп-кодон трансляции, или то и другое.

Обзор механизма действия антисмысловой РНК и сегодняшнее состояние техники использования антисмысловых инструментов приведен в Китаг еί а1., МюгоЬю1. Μο1. Βίο1. Вег., 62, р. 1415-1434, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов при ингибировании синтеза рецептора ВМР описано Υеη еί а1., 1. Βοικ Мшег. Век., 13, р. 1870-9, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза гена вольтзависимого калиевого канала Κνς.4 описано Меш еί а1., ΡΝΑδ, 95, р. 150371042, 1998. Применение антисмысловых олигонуклеотидов для ингибирования синтеза Вс1-х описано Κοηάο еί а1., Θμο^^, 17, р. 2585-91, 1998.

Лечебное применение антисмысловых лекарственных средств описывают 8йх. 8сг Ат., 279, р. 46, 50, 1998; Б^адат Сагтсег Ме1ак1акЬ Веν., 17, р. 169-76, 1998; ΟιιίηοΙ апб Теткаташ, Ра11ю1. Βίοι. (Рагк), 46, р. 347-54, 1998; и в приведенных в этих работах ссылках.

Когда создают антисмысловые олигонуклеотиды, как правило, используют модификации олигонуклеотидов, усиливающие нужные свойства. Например, вместо фосфоэфирных связей, встречающихся в природных ДНК, используют фосфоротиоатные связи, главным образом, вследствие того, что такие фосфоротиоатсодержащие олигонуклеотиды менее расположены к разрушению клеточными ферментами. Реид еί а1. сообщают, что нежелательные ίη νίνο побочные действия фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов можно ослабить при использовании смешанного фосфодиэфирфосфоротиоатного скелета. Предпочтительно 2'-метоксирибонуклеотидные модификации используют в 60% нуклеотида. Такие модифицированные олигонуклеотиды способны выявлять антисмысловое действие, сравнимое с действием, наблюдаемым в случае фосфоротиоатсодержащих олигонуклеотидов. Регщ еί а1. также сообщают, что аналоги олигонуклеотидов, не способные к поддержанию активности рибонуклеазы Н, являются неактивными.

Следовательно, предпочтительный антисмысловой олигонуклеотид изобретения имеет смешанный фосфодиэфирфосфоротиоатный скелет. Наиболее предпочтительно, 2'-метоксирибонуклеотидные модификации используют в примерно 30-80%, наиболее предпочтительно в примерно 60% олигонуклеотида.

В антисмысловой олигонуклеотид можно ввести другие модификации. Например, молекулу олигонуклеотида можно соединить с группой, содержащей необязательно частично ненасыщенную углеводородную цепь и одну или несколько полярных или заряженных групп, таких как карбоксильная кислотная группа, сложноэфирные группы и спиртовые группы. С другой стороны, олигонуклеотиды можно соединить с пептидными структурами, которые, предпочтительно, являются мембранотропными пептидами. Такие модифицированные олигонуклеотиды проникают через мембраны легче, что является критическим для их функционирования, и, следовательно, можно существенно усилить их активность. Проникновение сквозь мембраны особенно желательно для антисмысловых лекарственных средств, которым нужно достичь головного мозга. Олигонуклеотиды, соединенные с пальмитилом, описаны Сегк1ег еί а1., Апа1. Бюс^ет., 262, р. 177-84, 1998. Олигонуклеотиды, соединенные с гераниолом, описаны 8Ηο_)ί еί а1., ί. Эгид Тагдек 5, р. 261-73, 1998. Олигонуклеотиды, соединенные с пептидами, например, мембранотропными пептидами, и их получение описаны 8οι.ι1^1ΐί·ι^Γΐη еί а1., Βίο^ημι^. СЬет., 9, р. 466-75, 1998. Модификации антисмысловых молекул или других лекарственных средств, которые направляют молекулу в определенные клетки и усиливают поглощение олигонуклеотида указанными клетками, описаны \Уа1'1д, 1. ^ηίτο1Β6 Веа1еаке, 53, р. 39-48, 1998.

Рибозимы

Получив известную последовательность мРНК гена, можно создать рибозимы, представляющие собой молекулы РНК, которые специфически связываются и расщепляются указанной последовательно

- 22 005853 стью мРНК (см., например, СНеп е! а1., Апп. ΝΥ Асаб. 8с1, бб0, 271-3, 1992; 2Нао апб Р1ск, №!иге, 3б5, р.448, 1993; 8Ноге е! а1., Опсодепе, 8, 3183, 1993; 1озерН апб Вигке, I. Вю1. СНет., 24515, 1993; 8Ытауата е! а1., №с1ек Ас1бз 8утр, 8ег. 29 р.177, 1993; Сап!ог е! а1., ΡNΑ8, 90, р.10932, 1993).

Соответственно, можно создать последовательность РНК, кодирующую рибозим, которая расщепляет мРНК белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8. Место расщепления располагается предпочтительно в кодирующей области или в 5'-нетранслируемой области, предпочтительнее в 5'-части кодирующей области, примыкающей к стартовому кодону трансляции АИС.

ДНК, кодирующую рибозим по изобретению, можно ввести в клетки путем поглощения ДНК, поглощения модифицированной ДНК (см. модификации олигонуклеотидов и белков, приводящие к усиленной мембранной проницаемости, как описано ниже) или переносу гена, опосредованному вирусным вектором, что подробно описано ниже.

Введение в клетки белков, взаимодействующих с каспазой-8, пептидов и ДНК

Настоящее изобретение относится к белкам, взаимодействующим с каспазой-8, полученным из них пептидам, антисмысловым молекулам ДНК и олигонуклеотидам. Применение для лечения или исследований таких инструментов требует введения их в клетки живого организма. Для этой цели нужно усилить мембранную проницаемость для пептидов, белков и олигонуклеотидов. Способы улучшения мембранной проницаемости для олигонуклеотидов описаны выше. Те же принципы, а именно, дериватизацию лиофильными структурами, можно также использовать при создании белков и пептидов с усиленной способностью проходить через мембрану. Например, к последовательности пептида или белка можно добавить последовательность известного мембранотропного пептида, как указано выше. Кроме того, пептид или белок можно дериватизировать с помощью частично лиофильных структур, таких как вышеуказанные углеводородные цепи, которые замещены по меньшей мере одной полярной или заряженной группой. Например, лауроилпроизводные пептидов описаны МигашзЫ е! а1., РНагт. КезеагсН, 8, б49, 1991. Другие модификации пептидов и белков включают окисление метиониновых остатков, посредством чего создаются сульфоксидные группы, как описано 2асНапа е! а1., Еиг. I. РНагтасо1, 203, р.353, 1991. 2асНапа с сотрудниками также описывают пептид или производные, где относительно гидрофобная пептидная связь заменяется ее кето-метиленовым изоэфиром (СОСН₂). Такие и другие модификации, известные специалистам в области химии белков и пептидов, усиливают способность проникать через мембрану.

Другим способом усиления мембранной проницаемости является использование рецепторов, таких как вирусные рецепторы, на поверхности клетки для индукции поглощения клеткой пептида или белка. Этот механизм часто используется вирусами, специфически связывающимися с некоторыми молекулами поверхности клетки. После связывания клетка пропускает вирус вовнутрь. Такая молекула поверхности клетки называется вирусным рецептором. Например, молекулы интегрина САК и АбУ описаны как вирусные рецепторы для аденовируса, см. Нетт1 е! а1., Нит. Сепе ТНег, 9, р. 23б3-73, 1998, и приведенные там ссылки. Молекулы СБ4, СРК1, СРК15 и 8ТКБ33 идентифицированы как рецепторы/корецепторы для ВИЧ, см. Ебтдег е! а1., У1го1оду, 249, р. 3б7-78, 1998, и приведенные там ссылки.

Таким образом, конъюгирование пептидов, белков и олигонуклеотидов с молекулами, известными как рецепторы для связывания с поверхностью клетки, будет усиливать мембранную проницаемость для указанных пептидов, белков или олигонуклеотидов. Примерами подходящих групп для образования конъюгатов являются сахара, витамины, гормоны, цитокины, трансферрин, азиалогликопротеин и подобные молекулы. В патенте США 5108921, Боте е! а1., описывается применение таких молекул для целей усиления мембранной проницаемости для пептидов, белков и олигонуклеотидов, и получение указанных конъюгатов.

Бо\у с сотрудниками также указывают, что молекулы, такие как фолат или биотин, можно использовать для направленной доставки конъюгата ко многим клеткам организма, в силу обильной и неспецифической экспрессии рецепторов для этих молекул.

Описанное выше применение белков поверхности клетки для усиления мембранной проницаемости для пептида, белка или олигонуклеотида изобретения можно также использовать при направленной доставке указанного пептида, белка или олигонуклеотида изобретения к клеткам или тканям определенного типа. Например, если необходимо попасть в раковые клетки, предпочтительно использовать белок поверхности клетки, который экспрессируется обильнее на поверхности таких клеток. Примерами являются фолатные рецепторы, антигены к муцину МИС1, МИС2, МИС3, МИС4, МИС5АС, МИС5В и МИС7, гликопротеиновые антигены К8А, карциномоэмбриональный антиген, специфический для предстательной железы мембранный антиген (Р8МА) НЕК-2/пеи и хорионный гонадотропин-бета человека. В цитированной выше работе \Уапд е! аБ, 1998, описывается применение фолата для направленной доставки в раковые клетки, а в 2Напд е! аБ, С1т. Сапсег Кез., 4, р. 2бб9-7б, 1998, указывается на относительное обилие каждого из других антигенов, указанных выше, в раковых и здоровых клетках разного типа.

Следовательно, белок, пептид или олигонуклеотид изобретения можно, с использованием описанного выше метода конъюгации, направленно доставить в определенный, какой требуется, тип клеток. Например, если нужно усилить апоптоз в клетках лимфоцитарной линии, в эти клетки можно направить белок или пептид изобретения, положительно модулирующие каспазу-8, например, используя молекулы

- 23 005853

КГС класса II, которые экспрессируются на этих клетках. Этого можно достичь посредством сочетания антитела, или его антигенсвязывающего сайта, направленного против константной области указанной молекулы КГС класса II, с белком или пептидом изобретения. Далее описаны многие рецепторы клеточной поверхности для разных цитокинов и других молекул клеточной коммуникации, и многие из этих молекул экспрессируются более или менее ткане- или клеточноспецифически. Так, когда нужна направленная доставка подгруппы Т-клеток, для получения конъюгата изобретения можно использовать молекулу поверхности клетки СЭ4. Молекулы, связывающие СЭ4, предоставляются вирусом ВИЧ, чей поверхностный антиген др42 способен связываться с молекулой СИ4. Белок изобретения, взаимодействующий с каспазой-8, или пептид изобретения, усиливающие апоптоз, можно направленно доставить преимущественно в Т-клетки при лечении пациента, страдающего от аутоиммунных реакций на основе Т-клеток, таких как пациенты с красной волчанкой.

Направленная доставка в клетки, опосредованная вирусами

Белки, пептиды и антисмысловые последовательности изобретения можно ввести в клетки, используя вирусный вектор. Применение вакцинного вектора для таких целей подробно описано в цитированной выше главе 16 Сштеп! Рго!осо1к ш Мо1еси1аг Βώ^^. Применение аденовирусного вектора описано, например, Теой е! а1., Β^ά, 92, р. 4591-4601, 1998; ΝηΓίιιηί е! а1., Αт. 1. Кекрп. Се11. Мо1. Βώ® 19, р. 936941, 1998; Ребегкоп е! а1., 1. Са8!гош!е8!. 8игд., 2, р. 283-91, 1998; Сиапд-Ьт е! а1., Тгапкр1ап!. Ргос, 30, р. 2923-4, 1998, и в цитированных в этой работе ссылках; №кЫба е! а1., 8рте, 23, р. 2437-42, 1998; 8сй\уагхепйегдег е! а1., 1. ^типой, 161, р. 6383-9, 1998; и Сао е! а1., 1. Iттиηо1., 161, р. 6238-44, 1998. Ретровирусный перенос антисмысловых последовательностей описан Иаше1 е! а1., 1. Β^ιτ^. δοΐ., 5, 383-94, 1998.

Когда в качестве векторов используют вирусы, для направленной доставки вируса обычно используют белки вирусной поверхности. Так как многие вирусы, такие как вышеуказанный аденовирус, скорее неспецифичны в своем клеточном тропизме, может потребоваться придание большей специфичности посредством использования промотора клеточного типа или тканеспецифического промотора. СпксеШ е! а1., Нит. Сепе Тйег., 9, р. 1919-28, 1998, описывают применение промотора легкой цепи 2 кардиального миозина, специфического для желудочка, для специфической направленной доставки в сердце гена, перенос которого опосредуется аденовирусом.

С другой стороны, можно создать методами генной инженерии вирусный вектор для экспрессии другого белка на его поверхности, или белок поверхности вирусного вектора можно заменить для введения нужной пептидной последовательности. Таким образом, можно создать вирусный вектор для экспрессии одного или нескольких дополнительных эпитопов, пептидов, связывающихся с КГС класса II или можно использовать эпитопы, образованные от хоминг-молекул, для направления вирусного вектора в соответствии с указаниями изобретения.

Применения описанных выше инструментов

Белки изобретения, взаимодействующие с каспазой-8, взаимодействуют специфически с субъединицами каспазы-8, вовлеченными в протеолитическую активность каспазы-8. Не углубляясь в теорию, авторы изобретения полагают, что белки изобретения, взаимодействующие с каспазой-8, являются последующими элементами в каскаде передачи сигнала с участием каспазы-8. Оказывается, что предыдущие агенты связываются через продомен каспазы-8, опосредующий домен взаимодействия белокбелок. Оказывается, что экстенсивное кросс-общение со многими средствами, организующими апоптозную реакцию, может быть опосредовано взаимодействиями белок-белок с участием эффекторного домена гибели (ΌΕΌ) и родственных доменов, таких как домены, локализованные в продомене каспазы8. В противоположность таким белкам, белки настоящего изобретения, взаимодействующие с каспазой8, могут находиться среди непосредственных исполнителей процесса гибели клеток. Например, один из белков изобретения, взаимодействующих с каспазой-8, Т1р-60 является ферментом гистондеацетилазой. Следовательно, указанный белок может непосредственно участвовать в изменениях структуры хроматина.

Взаимодействие белков изобретения с каспазой-8 имеет ряд смежных последствий. Во-первых, происходит модуляция активности каспазы-8. Это показано здесь при анализе ш у1уо, где клон 12 изобретения ингибирует апоптоз, опосредуемый каспазой-8.

Во-вторых, белок, взаимодействующий с каспазой-8, может повысить активность каспазы-8 посредством предупреждения разрушения каспазы-8, или снизить ее активность, действуя как ингибитор.

В-третьих, активность белка, взаимодействующего с каспазой-8, можно модулировать. Это показано здесь через способность каспазы-8 расщеплять белки, взаимодействующие с каспазой-8. Возможно, что некоторые из таких белков инактивируются путем расщепления. Однако также возможно, что активность белков изменяется, индуцируются новые активности, или что белок, взаимодействующий с каспазой-8, активируется путем расщепления, именно как сами каспазы.

Следовательно, белки, взаимодействующие с каспазой-8, пептиды, олигонуклеотиды и антитела изобретения полезны при модуляции активности каспазы-8. Модуляция каспазы-8 по нисходящей желательна в ситуациях, где происходит избыточная гибель клеток вследствие апоптоза. Например, предполагается, что при рассеянном склерозе с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунном увеоретините, диабете, волчанке, аутоиммунном миокардите I, печеночной недостаточности, независимо от этиоло

- 24 005853 гии, опосредованном НСУ хроническом гепатите, гастрите, например, гастрите типа А, смешанной болезни соединительной ткани (МСТИ), болезни Крона и неспецифическом язвенном колите разрушение тканей организма вызывается сигналами апоптоза. Следовательно, для пациентов, страдающих от таких болезней, может быть благоприятной модуляция активности каспазы-8 по нисходящей в тех клетках, которые разрушаются путем апоптоза.

Например, при указанной выше олигодендропатии нужно ингибировать активность каспазы-8 в олигодендроцитах. Рецептор фосфолипидлизофосфатидной кислоты в сочетании с О-протеином клеточной поверхности экспрессируется в олигодендроцитах и в различных других клетках головного мозга, но не в других тканях организма. Следовательно, пептид или белок изобретения направляют в эти клетки. Этого можно достичь или посредством сочетания указанного пептида или белка с фосфолипидлизофосфатидной кислотой или посредством введения последовательности антитела, специфически узнающего указанный рецептор фосфолипидлизофосфатидной кислоты, в вирусный вектор, так что указанный вирусный вектор специфически связывается с указанным рецептором фосфолипидлизофосфатидной кислоты.

Подобным образом пептиды или белки изобретения можно направить в клетки другого типа, затрагиваемые при других заболеваниях, перечисленных выше, и других заболеваниях, при которых, как показано, избыток апоптозных клеток опосредует повреждение в наблюдаемой ткани организма.

Подобным образом антисмысловую ДНК, антисмысловой олигонуклеотид и рибозим изобретения также можно направить в вышеуказанные олигодендроциты или в соответствующие клетки при других заболеваниях. В таком случае подавляется экспрессия белков, взаимодействующих с каспазой-8, а не экспрессия самой каспазы-8. Путем ингибирования экспрессии ряда белков, взаимодействующих с каспазой-8, можно снизить апоптозное действие каспазы-8. Однако снижение экспрессии определенных белков, взаимодействующих с каспазой-8, может фактически повысить действие каспазы-8, так как некоторые белки, взаимодействующие с каспазой-8, способны действовать как отрицательные регуляторы активности каспазы-8. Следовательно, сначала следует проверить эффект использования антисмысловых олигонуклеотидов и антисмысловой РНК и рибозимов, например, в описанном выше анализе ίη νίλΌ, прежде чем обсуждать применение таких средств для лечения.

С другой стороны, существуют определенные ситуации, когда может потребоваться повышение активности каспазы-8. Это может произойти в случае тех же заболеваний, указанных выше, например, при системной красной волчанке. Однако типы клеток, которые должны стать мишенями, другие. Например, при волчанке популяция Т-клеток может содержать аутореактивные клетки, которые не разрушаются в тимусе. Следовательно, к Т-клеткам следует направить средство изобретения, модулирующее активность каспазы-8 по восходящей. Предполагается, что при некоторых заболеваниях, таких как рассеянный склероз, некоторые клоны Т-клеток играют критическую роль в развитии заболевания. Следовательно, в такие клетки можно направить средство по изобретению, модулирующее активность каспазы-8 по восходящей, используя одно или несколько антител, специфически направленных на вариабельную область Тклеточного рецептора клонов аутореактивных Т-клеток, для направления средства изобретения, модулирующего активность каспазы-8 по восходящей, которое может представлять собой белок, взаимодействующий с каспазой-8, или пептид, соответствующие изобретению.

Ввиду вышеуказанного, настоящее изобретение относится к фармацевтическим препаратам, содержащим активное вещество, состоящее из одного или нескольких белков, взаимодействующих с каспазой8, пептидов, антител, рибозимов, антисмысловых РНК или антисмысловых олигонуклеотидов, соответствующих изобретению.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей вирусный вектор, способный инфицировать клетки млекопитающего, где указанный вектор содержит операбельно связанный промотор и последовательность ДНК изобретения, кодирующую белок, взаимодействующий с каспазой8, или пептид, рибозим, антисмысловую РНК, антисмысловой олигонуклеотид или антитело, соответствующие изобретению. Вирусный вектор может содержать, необязательно, кодирующую последовательность, операбельно связанную с промотором, кодирующую пептид или белок, расположенные на поверхности вируса, которая способна к связыванию с белком поверхности клетки млекопитающего. Белок поверхности, предпочтительно, представляет собой белок, который может поглощать вирусный вектор, и, предпочтительно, экспрессируется тканеспецифически или специфически для типа клеток, так что создается возможность направленной доставки вирусного вектора.

Белок, взаимодействующий с каспазой-8, его аналоги, фрагменты или производные также можно использовать для выделения, идентификации и клонирования других белков того же класса, т.е. белков, связывающихся с каспазой-8, или функционально родственных протеаз или белков, вовлеченных в процесс внутриклеточной передачи сигнала. При таком применении можно использовать указанную выше систему с двумя гибридами дрожжей, или можно использовать недавно разработанную систему с использованием гибридизации по Саузерну в нестрогих условиях с последующим клонированием методом РСК (^УИкк е1 а1., 1989). В публикации ^УИкк е1 а1. описаны идентификация и клонирование двух предполагаемых протеинтирозинкиназ посредством применения гибридизации по Саузерну в нестрогих условиях с последующим клонированием методом РСК на основе известной последовательности мотива ки

- 25 005853 назы задуманной последовательности киназы. Такой подход можно применить в соответствии с настоящим изобретением, с использованием последовательности белка, взаимодействующего с каспазой-8, для идентификации и клонирования белков, родственных белкам, взаимодействующим с каспазой-8.

Другой подход к применению белка, взаимодействующего с каспазой-8, или его аналогов, фрагментов или производных по изобретению состоит в использовании их в методах аффинной хроматогра-фии для выделения и идентификации других белков или факторов, вовлеченных в процесс внутриклеточной передачи сигнала. При таком применении белок, взаимодействующий с каспазой-8, его аналоги, фрагменты или производные настоящего изобретения можно по отдельности присоединить к матрицам для аффинной хроматографии и затем привести в контакт с клеточными экстрактами или выделенными белками или факторами, которые, как предполагаются, вовлечены в процесс внутриклеточной передачи сигнала. Следуя процедуре аффинной хроматографии, можно элюировать, выделить и охарактеризовать другие белки или факторы, связывающиеся с белком, взаимодействующим с каспазой-8, или его аналогами, фрагментами или производными изобретения.

Как указывалось выше, белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его аналоги, фрагменты или производные изобретения можно также использовать в качестве иммуногенов (антигенов) для получения специфических антител к ним. Такие антитела также можно использовать для целей очистки белка, взаимодействующего с каспазой-8 (например, №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека или ее любых изоформ), или от клеточных экстрактов или от трансформированных клеточных линий, продуцирующих белок, взаимодействующий с каспазой-8, или его аналоги или фрагменты. Далее эти антитела можно использовать для целей диагностики для идентификации нарушений, связанных с аномальным функционированием опосредованных каспазой-8 лиганда ЕА8-К или системы ΤΝΕ. Таким образом, если такие нарушения связаны с нарушениями в системе внутриклеточной передачи сигнала с участием белка каспазы-8 или белка, взаимодействующего с каспазой-8, такие антитела могли бы служить в качестве важного диагностического инструмента.

Следует также отметить, что выделение, идентификацию и характеризацию белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8, можно осуществить с использованием любой из хорошо известных стандартных процедур скрининга. Например, одну из таких процедур скрининга - процедуру с двумя гибридами дрожжей, как указано ниже, использовали для идентификации белка, взаимодействующего с каспазой-8 (см. 8!апдег е! а1., 1995), и затем различных белков изобретения, взаимодействующих с каспазой-8 (кроме различных других новых белков, указанных выше и ниже, в совместных находящихся на рассмотрении заявках). Подобным образом, как указывается выше и ниже, для выделения, идентификации и характеризации белка изобретения, взаимодействующего с каспазой-8, или для выделения, идентификации и характеризации других белков, факторов, рецепторов и т.п., способных связываться с белками изобретения, взаимодействующими с каспазой-8, можно использовать другие процедуры, такие как аффинная хроматография, методы гибридизации ДНК и т.п., хорошо известные в технике.

Пример 1А. Двухгибридный скрининг для идентификации белков, взаимодействующих с каспазой-8

Для скрининга белков, взаимодействующих с каспазой-8, и их потенциальных субстратов использовали модифицированную систему с двумя гибридами дрожжей, описанную как УеакИйгее НуЬпк кук1еш (Пгоке Ε. е! а1., 1997). Отдельные использованные векторы, штаммы дрожжей и библиотеки получали от С1оп1ес11 (Ра1о А11о, И8А) в виде компонентов двухгибридной системы Ма!сйтакег (#РТ12651).

Две субъединицы каспазы-8 экспрессировали по отдельности под контролем разных промоторов. Короткую субъедининцу р10 (от серина 375 до аспарагиновой кислоты 479) клонировали в вектор рСΒΤ9 (С1ои!есй) в рамке с доменом связывания ДНК дрожжевого белка Са14 (аминокислоты 1-147, числа в последовательностях в соответствии с БаидНоп е! а1., Мо1еси1аг апк Се11и1аг Вю1оду, 4, 260-267, 1984). Длинную активную субъединицу р20 (от серина 217 до аспарагиновой кислоты 374) мутировали в позиции 360, т.е. цистеин, находящийся в этой позиции, заменяли на серин (С3608), придавая протеазную активность неактивному ферменту. Мутированную субъединицу С3608 р20 экспрессировали в виде неслитого белка под контролем промотора Ме!25, который положительно регулируется в среде, лишенной метионина (8апдкока, Мо1. Сеп. Сенек. 200, р. 407-14, 1985). Возможность регулирования активности промотора, управляющего экспрессией субъединицы р20, посредством подбора концентрации метионина в среде для роста дрожжевых клеток делает возможным (1) использование субъединиц токсичного белка в качестве наживки и (2) регулирование зависимости взаимодействия белок-белок от третьего партнера, т.е. субъединицы р20. Экспрессирующие единицы р10 и р20 можно локализовать в разных векторах. Их можно локализовать также в одном и том же векторе. В описываемом примере использовали модифицированный рСВТ9-вектор рСΒΤ9-ЗН (см. выше Пгоке е! а1.). Субъединицу р20, предпочтительно, экспрессируют в виде гибрида с сигналом ядерной локализации.

После экспрессии в отсутствие метионина две субъединицы ассоциируют друг с другом в дрожжевой клетке. Ассоциация двух субъединиц показана с помощью экспериментов по коиммунопреципитации и вестерн-блоттинга.

Библиотеку кДНК В-клетки, клонированную в вектор рСАЭ СН (ЭигГее е! а1., Сепек Эеу., 7, 555

- 26 005853

569), получили в дар от д-ра 8. Е11ебде. Вектор содержит домен активации Са14 (аминокислоты 768-881). Этого домена активации САЬ4 достаточно, когда слит с доменом связывания ДНК САЬ4, для индукции существенной транскрипционной активности гена САЬ4, см. Ма апб Р1а51те. Се11, 48, 847-853 (1987).

Вышерасположенный сайт активации САЬ (ИАБ.киЬ.С), как описано Кеедап е! а1., (1986), цит. выше, присутствует в вышерасположенной области репортерного гена (1ас2) и гена, допускающего селекцию (Н18) в штамме дрожжей НР7с, полученном от С1оп!есН.

Культуру НР7с трансформировали вышеуказанной каспазой-8, содержащей плазмиды, и трансформанты дрожжевых клеток отбирали посредством выращивания в среде для селекции, как описано в протоколах С1оп!есН для дрожжей, т.е. лишенной триптофана, лейцина, метионина, тирозина. Необязательно добавляли гомосерин в количестве 80 мг/л.

Затем культуру указанных трансформантов трансформировали далее библиотекой В-клеток, содержащей вектор, с последующим высеванием на вышеуказанную среду, лишенную гистидина (среда для селекции).

Необязательно, к среде для селекции добавляли 3-аминотриазол, который является ингибитором фермента гистаминсинтетазы. Добавление ингибитора служит для регуляции утечки из промотора, управляющего Нщ-геном в дрожжевых клетках, не содержащих белков, взаимодействующих с каспазой8. В некоторых случаях слабое неспецифическое взаимодействие может привести к ложной транскрипции от промотора Са14-иАС-Ы§, что ведет к дрожжевым клонам, растущим в среде для селекции.

Трансформанты, растущие в среде для селекции, отбирали и экстрагировали ДНК-плазмиды. Затем ДНК трансформировали в бактерии НВ101, которые допускают селекцию в среде, лишенной лейцина.

После выращивания бактерий и экстракции и очистки от них плазмидной ДНК затем трансформировали плазмидную ДНК в дрожжевые клетки 8ΡΥ526. Затем проводили испытания 1ас2-активности трансформантов 8ΡΥ526 посредством высевания на среду для селекции, включающую гистидин и содержащую Хда1. Затем колонии дрожжей снимали с использованием фильтровальной бумаги №50, АНа1тапп 3 мм (описание съема колоний см. в цит. выше, БатЬгоок е! а1.), затем помещали примерно на 20 с на алюминиевую фольгу, переносили примерно на 25 с в жидкий азот для того, чтобы заморозить дрожжевые клетки, выдерживали примерно 1 мин при комнатной температуре для того, чтобы дрожжевые клетки оттаяли, помещали в чашку Петри на фильтровальную бумагу №1, АНа1тапп 3 мм, которую предварительно смачивали в Ζ-буфере (буфер для реакции с бета-галактозидазой, см., например, протоколы С1оп1есН, цит. выше, БатЬгоок е! а1. или цит. выше Сиггеп! РтоЮсок ш Мо1еси1аг Вю1оду), содержащем Хда1 и бета-меркаптоэтанол. Появление синего окрашивания в колониях указывает на активную бета-галактозидазу. Белки, взаимодействующие с каспазой-8, как правило, дают синюю окраску при этом анализе в интервале от минут до нескольких часов, предпочтительно - от 5 мин до 3 ч, и наиболее предпочтительно - в интервале от 5 мин до 1 ч. С другой стороны, проводили количественную оценку бетагалактозидазной активности путем выращивания жидкой культуры в среде, содержащей Хда1, удаления клеток посредством центрифугирования и измерения поглощения среды с использованием спектрофотометра.

Клоны кДНК, идентифицированные в описанной выше процедуре скрининга, затем испытывали далее на взаимодействие с другими белками. Это испытание осуществляли посредством трансформации испытываемых клонов вместе с нерелевантным белком, экспрессированным в виде гибрида с доменом активации ДНК в векторе рСЛЭ СН.

Двойные трансформанты, способные расти в среде, лишенной гистидина, или показывающие ΡκΖактивность, указывали, что библиотечный клон связывался неспецифически.

В качестве нерелевантных белков использовали белки, известные как прилипающие, т.е. взаимодействующие неспецифически с другими белками, так же, как другие нерелевантные белки. Например, белки испытывали на связывание с ламином, В1Р, ВАГОН, ТВАР2 и МОВТ1. Вообще, ламинсвязывающие белки отбрасывали.

Указанное выше трехгибридное испытание также осуществляли с субъединицей каспазы-8 р10, слитой с доменом связывания ДНК 1ехА. Предпочтительным вектором является вектор рЬехА, доступный от С.'1оп1ес11. Когда в качестве домена связывания ДНК используют 1ехА, следует использовать штамм дрожжей Ь40 или эквивалентный штамм.

Белки, взаимодействующие с каспазой-8, идентифицировали с помощью описанного выше метода скрининга и затем анализировали с использованием анализов на расщепление ш у1уо и ίπ νίΙΐΌ и анализов на трансдукцию сигналов, как описано далее.

Пример 1В. Модифицированная наживка для двухгибридного скрининга для идентификации белков, взаимодействующих с каспазой-8

Модифицированную каспазу-8 использовали для другого скрининга белков, взаимодействующих с каспазой-8, с системой с двумя гибридами дрожжей (Ие1й8 апб 8опд, 1989). Каспазу-8 экспрессировали из вектора-наживки рСВТ9 (С1оп!есН) в виде одноцепочечного белка. Для того чтобы создать белокнаживку, который имел бы сходство с конформацией активной каспазы, удаляли предомен, и малую субъединицу 2 (начинающуюся от серина 375 и заканчивающуюся аспарагиновой кислотой 479) гибридизировали с доменом связывания ДНК Са14. С-Конец малой субъединицы отделяли от Ν-конца боль

- 27 005853 шой субъединицы 1 (начинающейся от серина 217 и заканчивающейся аспарагиновой кислотой 374) 16аминокислотным глицинсериновым линкером (СССС8СССС8СССС8С). Таким образом, две субъединицы активной каспазы образуются при спонтанном образовании складчатой структуры одной молекулы. Цистеин активного сайта в субъединице 1 мутировали на серии (киЬ 1 С3608). Показано, что сверхэкспрессия такой одноцепочечной каспазы-8 функционально схожа со сверхэкспрессией каспазы-8 дикого типа, что определяется по ее способности индуцировать апоптоз в клетках НЕК 293Т при сверхэкспрессии из вектора рсПМАНЦ, подобно каспазе-8. Активность одноцепочечной каспазы-8 можно блокировать посредством коэкспрессии р35, являющегося ингибитором каспаз.

Двухгибридный скрининг осуществляли так, как описано выше, за исключением того, что одноцепочечную каспазу-8, как описано выше, экспрессировали из вектора ιι^ΕΤ*) (С1оп!ссй).

Пример 2. Идентификация белков, взаимодействующих с каспазой-8

Используя модифицированную двухгибридную систему скрининга, описанную в примере 1А, идентифицировали несколько клонов, кодирующих белки, связывающиеся с каспазой-8. Специфичность связывания клонов подтверждали при двухгибридном испытании с дрожжами, в то время как обнаруживалось отсутствие связывания с контрольными белками. Отобранные клоны кДНК выделяли и секвенировали, и нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, найденными в СспЬапк, как описано ниже.

Пример 2.1.

Обнаружено, что клон Ь1 содержит неполную последовательность кДНК, идентичную аминокислотам 690-750 8!а! 1. 8!а! 1 идентифицировали как фактор транскрипции, который связывается с интерферон-стимулированным восприимчивым элементом (18КЕ) и с элементом гамма-активированной последовательности (СА8) (обзор см. в 1ГПс 8.Ν., 1998). Недавно показано, что 8!а! 1 вовлекается в регуляцию содержания конститутивной каспазы (Кшпсг с! а1., 1997) и служит субстратом 1п У1!го для каспазы-8 (Кшд Р. с! а1., 1998). Сделано предположение, что 8!а! 1 может играть некую роль в регуляции самой апоптозной реакции.

Пример 2.2.

Обнаружено, что клон Ь7 кодирует неполную кДНК, которая почти полностью соответствует Сконцевой части клона Е8Т найденного в СспЬапк, которому функционирование не приписывается (инвентарный номер АА608733).

Пример 2.3.

Обнаружено, что клон Ь20 идентичен аминокислотам 104-420 ΝΈΤΑ (инвентарный номер 462693). ΝΈΤΑ является новым белком, содержащим домен связывания основных аминокислот предполагаемой ДНК с потенциальным ядерным сигналом направления доставки, две области мотива спираль-петляспираль (НЬН), действующие совместно мотивы ЕЕ-Наий, кислотную богатую аминокислотами область между ЕЕ-йаηй. и лейциновый мотив-молнию (Вагшко1-\Уа1апаЬс с! а1., 1994). Также обнаружено, что NЕΡΑ является кальцийсвязывающим белком, и обнаружено, что он локализуется как в цитоплазме, так и на поверхности клетки, и его также можно обнаружить в культуральной среде. NЕΡΑ принадлежит к субсемейству нуклеобиндина. Однако биологическая роль NЕΡΑ пока не выяснена. Клон Ь20 расщепляется каспазой-8 как ш уйго, так и 1п у1уо.

Пример 2.4.

Обнаружено, что клон Ь12 кодирует кДНК, которая почти полностью соответствует клону Е8Τ человека, найденному в базе данных (инвентарный номер М62097) . Клон Ь12 расщепляется каспазой-8 1п У1!го, как показано при анализе 1п \йго с протеазами. Коротко, синтезированный ш уйго меченный ³⁵8 белок инкубировали в течение 30-60 мин в протеазном буфере в присутствии каспазы-8, продуцированной бактериями. Белки и их фрагменты разделяли методом 808-РАСЕ, и результаты визуализировали с помощью ауторадиографии или люминофоров. Активность белка можно было блокировать специфическим ингибитором панкаспазы ζ-УАО-фторметилкетоном.

Пример 2.5.

Обнаружено, что клон Ь5 кодирует кДНК, идентичную белку Пр60 (инвентарный номер 3024755). Τί]360 (взаимодействующий с Τа! белок в 60 кД) впервые описан как белок, взаимодействующий с клеточным трансактиватором Н1УШа! (Катшс с! а1., Уйо1оду, 216, 357-366, 1996), а позднее показано, что он обладает гистон-ацетил-трансферазной активностью (Уатато!о апй НопкокЫ, 1997). Биологическую роль Пр60, кроме его способности усиливать Τа!-опосредуемую активацию промотора Н1У, остается определить.

При двухгибридном испытании в дрожжах обнаружено, что клон Ь5 связывается с одной субъедининцей 2 каспазы-8, а также с комплексом р10-р20. Клон Ь5 расщеплялся каспазой-8 1п уйго при анализе 1п уйго с протеазами, описанном в примере 2.4. Пр60 также расщеплялся зависимо от каспазы после коверхэкспрессии вместе с рецептором для ΤΝΡ р55 в клетках НсЬа и НЕК 293-Т. Он также расщеплялся в клетках НсЬа после обработки ΤΝΡ даже в отсутствие ингибиторов синтеза белка. Коротко, белок клонировали в вектор рсОЫАНй Цпуйгодсп) и экспрессировали в клетках НЕК 293-Т или НсЬа вместе с белком, индуцирующим апоптоз (например, р55ΤNЕ-К или каспазой-8). Через 20 ч после трансфекции клетки собирали и к лизатам 0,5-1х10⁶ целых клеток применяли 8Э8-РАСЕ и затем вестерн-блоттинг с

- 28 005853 антителами против поли-Н1к (81дта). Результаты визуализировали с помощью ЕСЬ. Выделили несколько клонов кДНК, кодирующих вставки, соответствующие белку ^р60. Обнаружено, все клоны, включая полноразмерный, дикого типа клон Τίμί)!), лишены сегмента на протяжении от аминокислоты 94 (пролин) до 145 (треонин). Эта часть белка не является частью ацетилазактивного сайта и не считается существенной для функционирования белка. Обнаружено, что мутант Τίμί)!), где остатки аспарагиновой кислоты в позициях 200 и 203 заменены остатками аланина, не поддается расщеплению.

Пример 2.6.

Обнаружено, что клон М26 кодирует неполную кДНК, которая почти полностью соответствует клону Е8Τ человека, найденному в СенЬанк (инвентарный номер С18037). При испытании с 2 гибридами в дрожжах обнаружено, что клон М26 связывается с одной субъединицей 2 каспазы-8.

Пример 3. Выделение белков, взаимодействующих с каспазой-8.

С использованием двухгибридного скрининга, описанного в примере 1В, идентифицировали несколько других клонов, кодирующих специфические белки, связывающиеся с каспазой-8. Отобранные клоны кДНК выделяли и секвенировали, и нуклеотидные последовательности сравнивали с последовательностями, найденными в СенЬанк, как описано ниже.

Скринировали библиотеку В-клеток (ЭнгГее Т. е! а1., 1993) и библиотеку Т-клеток юрката. В табл.2 приводится начальная характеризация первой группы клонов.

Таблица 2

Клон(ы) Часть/гомо- Источник 1асг Длина Расщепле лог к(ЗГУ) вставки ние

Несколько	ΝΕΕΑ	АЪЪ-клетки	+	650-1100	ίη νίνο/ ίη νίΕΓΟ
ВЗЗ	Нуклеобиндин	1рг-клетки	+	2000	ίη ίη	νίνο/ νίίτο
В4.2	ΚΙΑΑ0615	мозг самца	+++	3000	ίη	νίϊΓΟ
В8.1	ЕЗТ00156		+++	1500	ίη ίη	νίνο/ νίίΤΟ
В 11	Фосфоэта ноламинцитидилилтрансфераза	+++	1500	ίη	νίίτο
В 17.1	Н23509	мозг младенца	++	1200
В 13.1	Рибонуклеозиддифосфатредуктаэа	ЕВУ	+++	700	ίη	νίίτο
В22	Циклофилин А		+	700
В27	дЬАА936350		+	2700	ίη ίη	νίνο/ νίΐ,ΓΟ
В37.1	ЕВУ	ЕВУ	++++	1400
^2	АА746639	человек	++++	600	ίη ίη	νίΐίΓΟ/ νίνο
640	ΚΙΑΑ0419	мозг самца	+ 4-	2300	ίη	νίίτο

ίη νίνο: клетки 293-Т и/или НеЬа

Неполные клоны, кодирующие части NЕΕА, так же, как и клон В8.1, выделяли также методом с двумя гибридами дрожжей, описанным в примере 1А.

Пример 3.1.

Клоны В4 (инвентарный номер 3327044), В17 (инвентарный номер Н23509), В27 (инвентарный номер АА936350) и 140 (инвентарный номер 2887413), кодируют вставки кДНК, гомологичные терминальному концу соответствующих Е8Е

Пример 3.2.

Клон В11 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу СТР-фосфоэтаноламинцитидилилтрансферазы (ЕТ, инвентарный номер Ό84307). ЕТ является ферментом, вовлеченным в метаболизм фосфолипидов, и катализирует конверсию фосфоэтаноламина в СЭР-этаноламин (№как1пта е! а1., 1997). Клон В11 расщеплялся ίη νίίτο каспазой-8, что показано при анализе, описанном выше в примере 2.4.

Пример 3.3.

Клоны В13 и В37 кодируют кДНК-вставку, гомологичную С-концу клона, кодирующего часть ге

- 29 005853 нома ЕВУ (инвентарный номер Υ01555).

Пример 3.4.

Клон В22 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу Т-клеточного циклофилина (инвентарный номер Υ00052). Т-Клеточный циклофилин идентифицирован как внутриклеточный рецептор для циклоспорина А и РК506 и обладает активностью подлинной пептидилпролил-цис-транс-изомеразы (Наеиб1ег В. е! а1., 1987).

Пример 3.5.

Клон В33 кодирует кДНК-вставку, гомологичную С-концу нуклеобиндина (инвентарный номер 2506255). Нуклеобиндин является секретируемым белком со свойствами связывания ДНК и Са²⁺, который весьма схож с белком ΝΕΡΑ, описанным в примере 3.3. Нуклеобиндин первоначально описан как белок в 55 кД, усиливающий продуцирование антител против ДНК в культурах аутоиммунных клеток 1рг селезенки мыши (Мшга К. е1 а1., 1992). Клон В33 расщеплялся каспазой-8 как ίη νίίτο, так и ίη νίνο, как показали анализы, указанные выше в примерах 2.4 и 2.5.

Пример 3.6.

Клон 12 содержит вставку в 600 п.о., кодирующую неполную белковую последовательность, которая вырастает в полипептид в ~20 кД, когда экспрессируется ίη νίίτο в бесклеточной системе, а также в клетках. Полипептид, кодированный клоном 12, расщепляется ίη νίίτο каспазой-8 и ίη νίνο в клетках НЕК 293-Т и клетках НеЬа после коэкспрессии с ρ55ΤΝΡ-Κ или каспазой-8 при анализах, указанных выше в примерах 2.4 и 2.5.

Нуклеотидная последовательность и расшифрованная аминокислотная последовательность клона 12 приводятся на фиг. 2.

Сравнение и выстраивание в ряд 5'-наращивания клона 12 с помощью РСК. с последовательностями, опубликованными в базе данных, показали гомологию клона 12 с Ε8Τ человека (инвентарный номер АА4 60869), что соответствует предполагаемой Ν-ацетилглюкозамин-б-фосфатдеацетилазе человека, а также другому клону (Ь48741), и дало состав предполагаемой полноразмерной №ацетилглюкозамин-6фосфатдеацетилазы человека, приведенный на фиг. 3.

Пример 4. Функциональная характеризация клона 12

Первоначальная функциональная характеризация клона 12 показала, что клон обладает ингибирующей активностью в отношении каспазы-8 и апоптоза, индуцируемого ρ55ΤΝΡ-Κ человека в клетках НЕК 293-Т и НеЬа. Экспрессия 12 подавляла/замедляла апоптоз клеток НЕК 293-Т, котрансфицированных рецептором для ΤΝΡ р55, или клеток НеЬа, обработанных ΤΝΡ и циклогексимидом, на 25-50%, что иллюстрируется фигурой 3. Количественное определение гибели вследствие апоптоза осуществляли путем определения части экспрессирующих бета-галактозидазу клеток, показывающих апоптозную морфологию через 20 ч после трансфекции указанных конструкций. Результаты выражены в виде среднего процента синих клеток, показывающих признаки апоптоза, как части общего числа подсчитанных синих клеток (примерно 500 клеток на образец). С другой стороны, использовали белок зеленой флуоресценции в качестве маркера, и проводили определение с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа.

Пример 5. Клонирование белков, взаимодействующих с каспазой-8.

Библиотеку кДНК плаценты человека, экспрессированную из вектора рАСТ2 (доступного от Οοη1ее11. Ρηΐο Α1ίο, И8А), скринировали методом двухгибридного скрининга с использованием наживки, описанной выше в примере 1В. Используя такую процедуру скрининга, идентифицировали несколько клонов, кодирующих специфические белки, взаимодействующие с каспазой-8. Также исследовали клоны Р16, Р27, Р43, Р70, Р74 и Р79.

Секвенирование кДНК-вставок клонов кДНК Р43, Р16 и Р74 показало, что они участвуют в некоторых гомологичных последовательностях. Клон Р74 имел самую длинную кДНК-вставку примерно в 3000 п.о. и, как оказалось, кодирует белок с расшифрованной открытой рамкой считывания из 574 аминокислот и с ожидаемой молекулярной массой примерно 68-70 кД. Последовательности трех вышеуказанных кДНК-вставок сравнивали с последовательностями, найденными в опубликованных базах данных. Обнаружено, что кДНК-вставки клонов Р43, Р16 и Р74 имеют некоторую гомологию с последовательностью двух клонов Ε8Τ, найденных в СенЬанк (А04418 и N64095). Оказалось, что последовательность всех трех кДНК-вставок составляет 3'-концы различных сплайсинг-изоформ того же белка. Выстраивание в ряд последовательностей трех кДНК-вставок подтвердило открытую рамку считывания из 574 аминокислот в последовательности Р74 (показана на фиг. 5). Подобную последовательность также нашли в геномном клоне, идентифицированном в другой опубликованной базе данных (КРС15-1057120; библиотека Κο5\\ό11 Рагк Саиеег 1п51Ци1е Нитаη РАС), которая локализуется на хромосоме человека 12μ31. Открытая рамка считывания, расшифрованная из последовательности этого клона РАС, имела 1428 аминокислот (показана на фиг. 6), и она содержит указанную выше открытую рамку считывания, имеющую 574 аминокислоты. Фиг. 7 показывает выстроенную в ряд последовательность открытой рамки считывания расшифрованной аминокислотной последовательности кДНК-вставки клона Р74 (обозначенной клонированная) с открытой рамкой считывания, расшифрованной из последовательности клона РАС (обозначенной расшифрованная).

При сравнении расшифрованной аминокислотной последовательности клона Р74 и последователь

- 30 005853 ности, расшифрованной из полноразмерного клона РАС, оказалось, что полноразмерный белок, соответствующий Р74, длиннее в 5'-конце и может, вероятно, начинаться с первого или одного из первых метионинов последовательности РАС, показанной на фиг. 6.

Также обнаружено, что последовательность клона Р74 показывает существенную гомологию с высокогомологичной областью гистондеацетилаз мыши и человека, областью, которая могла являться доменом, содержащим сайт ферментной активности гистондеацетилазы, причем предполагается, что белок, кодированный Р74, может разделять функцию этих белков. Последовательность в области 163-1716 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает примерно 80% гомологию с гистондеацетилазой А (инвентарный номер ΝΡ-006028). Последовательность в области 385-1707 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает гомологию с последовательностью гистондеацетилазы 5 (инвентарный номер ΝΡ_005465). Последовательность в области 418-1629 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает гомологию с последовательностью гистондеацетилазы шНОА1 (инвентарный номер ΑΑΌ09834), и последовательность в области 4241551 п.о. неполной кДНК клона Р74 показывает гомологию с последовательностью гистондеацетилазы 6 (инвентарный номер ΝΡ-006035). Выстраивание в ряд аминокислотной последовательности полноразмерного белка, расшифрованной из последовательности РАС, с последовательностью гистондеацетилазы А (СепЬапк, инвентарный номер ΝΡ_006028.1) показано на фиг. 8.

Пример 6. Функциональная характеризация белков, взаимодействующих с каспазой-8

А) Белки, кодированные клонами кДНК 12, или Р16, или Р43, или Р70, или Р74, или Р79, идентифицированные методом двухгибридного скрининга, экспрессировали в лизатах ретикулоцитов в присутствии 358 метионина в системе лизатов сочетания ретикулоцитов ТпТ Т7 (доступной от Рготеда, кат.№ Ь4 610) и разделяли в геле методом 8Ό8-ΡΑΟΕ (см. фиг. 9А). Такие же количества белков, экспрессированных в лизатах ретикулоцитов, анализировали на связывание с гибридным белком двух субъединиц каспазы-8 О8Т-82-81 (С3608) из вышеописанного примера 1В, слитого с С8Т и экспрессированного в бактериях. После предварительной очистки посредством 1-часовой инкубации при 4°С только с гранулами С8Т, продуцированные ТпТ белки осаждали гибридным белком С8Т-82-81 каспазы-8, соединенного с гранулами С8Т посредством 1-часовой инкубации при 4°С с гранулами С8Т, С8Т-преципитаты промывали, и белки, связывающиеся с каспазой-8, отделяли от гранул посредством кипячения в содержащем 8Ό8 буфере для образцов и разделяли методом 8Ό8-ΡΑΟΕ. Белки, способные к связыванию с конструкцией каспазы-8, можно затем визуализировать методом ауторадиографии. Оказалось, что белок, кодированный клоном Р74, специфически связывается ίη νίίτο с каспазой-8 (см. фиг. 9В), если сравнивать со связыванием О8Т-82-81 (С3608) с Βίά-известным проксимальным субстратом каспазы-8 в каскаде передачи сигнала апоптоза Еа§. Полноразмерные белки, полученные в лизате ретикулоцитов, помечены на фигуре звездочками.

При испытаниях с двумя гибридами, описанных выше в примере 1А, обнаружено, что белок, кодированный Р74, связывается с гибридным белком, кодированным двумя субъединицами каспазы-8, а не с малой субъединицей каспазы-8, экспрессированной отдельно. Для сравнения, другие белки, указанные в приведенных выше примерах, такие как Т1р60, связываются с малой субъединицей 82 каспазы-8, когда она экспрессируется одна (данные не приводятся).

Β) Белок, кодированный кДНК Р43, экспрессировали ίη νίίτο в лизатах ретикулоцитов в присутствии 358 метионина с использованием системы лизатов сочетания ретикулоцитов ТпТ Т7 и подвергали расщеплению рекомбинантом дикого типа или мутированной каспазой-3, или каспазой-9, или каспазой10, экспрессированными в Е.со11 в виде помеченных гистидином гибридных белков субъединицы 2 субъединицы 1 (82-81). Каспазу-8 экспрессировали в виде помеченного гистидином гибридного белка субъединицы 1 - субъединицы 2 (81-82). В анализе с протеазами использовали 1 и 4 объема полного бактериального лизата, определенных как 1 и 4 относительных единицы (КН) (фиг. 10). Коротко, синтезированные 1п νίίτο меченые 358 белки инкубировали в протеазном буфере в течение 30 мин при 37°С в присутствии каспазы-8, продуцированной бактериями. Белки и их фрагменты разделяли методом 8Ό8-ΡΑΟΕ и результаты визуализировали методом ауторадиографии или с помощью люминофоров. Результаты показали, что белок, кодированный кДНК Р43, используемый в качестве субстрата, эффективно расщеплялся каспазой-8, слабо расщеплялся каспазой-10 и не расщеплялся ни каспазой-3, ни каспазой-9 (фиг. 10). Таким образом, оказалось, что белок является специфическим субстратом каспазы-8.

С) Для анализа действия вновь клонированных белков на апоптозную гибель клеток, индуцированную каскадом передачи сигнала рецептором для ΊΝΕ, отобранные кДНК клонировали в экспрессирующие векторы рс^NΑ 3.1/Н18 С (доступные от 1пуЦгодеп) и неустойчиво котрансфицировали рецептором для Т№Е р55 в векторе рс^NΑ 3 (1пуЦгодеп) и белком зеленой флуоресценции (ΟΕΡ), экспрессированным из экспрессирующего вектора рЕОЕРС1 (С1оп1ес11). в клетки НЕК 293-Т. Клонировали кДНК Т1р60 и Д32-Т1р60, лишенный первых 32 Ν-концевых аминокислот, в векторе рС6N (описан М. Тапака апб №. Негг, Се11, 60, 375-386, 1990), в котором гемагглутининовая (НА) метка слита с Ν-концом кДНК, и использовали в таком же эксперименте.

Через 24 ч трансфицированные клетки проверяли под флюоресцентным микроскопом, и гибель клеток учитывали путем определения числа клеток из всей популяции флуоресцирующих клеток, показывающих апоптозную морфологию. Обнаружили, что белок Р74, экспрессированный в избытке из не

- 31 005853 полной кДНК, клонированной в вектор рсБНА-НЬ, защищает клетки НЕК 293-Т и НеЬа от гибели, вызванной сверхэкспрессией рецептора для Τ№ р55 (фиг. 11) или сверхэкспрессией слитых двух субъединиц каспазы-8 (не показано). Обнаружено, что ^р60 дикого типа и неспособный к расщеплению мутант Пр60, где остатки аспарагиновой кислоты в позициях 200 и 203 заменены на остатки аланина, защищают клетки НЕК 293-Т от гибели, вызванной сверхэкспрессией рецептора для Τ№ р55 (фиг. 12), в то время как Δ32-Τ^р60. лишенный первых 32 Ν-концевых аминокислот, не оказывал такого защитного действия.

Имея теперь полное описание данного изобретения, специалистам в этой области техники следует иметь в виду, что такие же операции можно выполнить с широким рядом эквивалентных параметров, концентраций и условий без отхода от сущности и объема изобретения и без излишнего экспериментирования.

Несмотря на то, что данное изобретение описано в связи с конкретными вариантами его воплощения, следует иметь в виду, что возможны другие модификации. Подразумевается, что данная заявка перекрывает любые вариации, применения или адаптации изобретения, вытекающие, вообще, из основных положений изобретения и включающие такие отклонения от настоящего описания, которые возникают в известной или обычной практике в области техники, к которой относится изобретение, и которые можно применить к существенным признакам, изложенным выше, как следует из объема прилагаемой формулы изобретения.

Все ссылки, цитированные здесь, включая журнальные статьи или рефераты, опубликованные или соответствующие заявкам на патент США или других стран, или любые другие ссылки, включены в настоящее описание в качестве ссылок во всей полноте, включая все данные, таблицы, фигуры и тексты, представленные в цитированных ссылках. Кроме того, все содержание цитированных здесь работ также во всей полноте включено в качестве ссылки.

Ссылки на известные стадии способов, стадии традиционных способов, известные способы или традиционные способы никоим образом не являются признанием факта, что какой-либо аспект, описание или вариант воплощения настоящего изобретения раскрываются, поясняются или предполагаются в родственных технических решениях .

Вышеизложенное описание конкретных вариантов воплощения изобретения будет настолько полно раскрывать общий характер изобретения, что другие могут, используя знания в данной области техники (включая содержание цитированных здесь ссылок), легко модифицировать и/или адаптировать для разных применений такие конкретные варианты воплощения изобретения без излишнего экспериментирования, без отхода от общей концепции настоящего изобретения. Следовательно, подразумевается, что такие адаптации и модификации находятся в пределах целей и круга эквивалентов описанных вариантов воплощения изобретения, основанных на пояснениях и указаниях, изложенных здесь.

Следует иметь в виду, что фразеология или терминология использованы здесь для целей описания, а не для ограничения, так что терминология или фразеология в описании настоящего изобретения должны интерпретироваться специалистами в свете пояснений и указаний, представленных здесь, в сочетании со знаниями рядового специалиста в этой области техники.

Список литературы

Айтаб Μ е! а1. Сапсег Кек 1997; 57(4):615-9

Ват1ко1-^а!апаЬе 8. е! а1. Вю1 Сйот Норре 8еу1ег 1994;375(8):497-512

Сойеп ΟΜ Вюсйет 1 1997;326 ( Р! 1). 1-16

Пиан Н. е! а1. Ханне 1997;385(6611):86-9

БигГее Τ. е! а1. Сепек Беу 1993;7(4)..888-69

Еетапбек-А1петп Τ е! а1. Ρ^осNайАсаб8с^υ8А1996;93(15):7464-9.

Е1е1бк 8, 8опд 0 \а111ге 1989;340(6230):245-6

Наепб1ег В. е! а1, ЕΜВΟ 1 1987;6(4):947-50

1Ь1е 1Ν Се11 1996;84(3)..331-4

Катше 1. е! а1. У1го1@ 1996;216(2):357-66

Ктд Р. е! а1. 1 Бю1 Сйет 1998;273(15)..8699-704

К1ксйке1 ЕС е! а1. ЕΜВΟ^ 995; 1 4(22);5579-88

Китаг А. е! а1. 8с1епсе 1997;278(5343): 1630-2

Оие11е Е\У е! а1. 1 Вю1 Сйет 1995;270(35):20775-80 \1асЕаг1апе Μ е! а1. ЛВгоХ Сйет 1997;272(41):25417-20

Μί!ί1 РК е! а1 .га1о1 Сйет 1997;272(10):6539-47

Μίυπ К. е! а1. Вюсйет В1орйук Кек Соттип 1992; 1 87(1),3 75 -80

Μυζώ Μ. е! а1 1Вю1 Сйет 1998.,273(5):2926-30 №ща1а 8. е! а1. Се11 1997;88(3):355-65

NакакЫта А. е! а1. 1Вю1 Сйет 1997;272(14):9567-72 №с1ю1коп Όν е! а1. Вюсйет 8а 1997;22(8):299-306

Ко!опба 1. е! а1 №11 8йис! 8ю1 1996;3(7):619-25

8а1уекеп С8 е! а1. Се11 1997;91(4):443-6

8пшуаки1а 8Μ е! а1. Ρ^осNа!1Асаб8с^υ8А1996;93(25): 14486-91

- 32 005853

8ππίν;·ΐ5ΐ.ι1;·ι 8М е! а1. !Вю1 СНет 1998;273(17)..10107-11

ТНотЬепу т е! а1. ДВю1 СНет 1997;272(29): 17907-1 1

ТЕобе Е. е! а1. 1 Вю1 СНет 1997;272(3 7):22995-9

Υататοΐο Т. е! а1. ДВю1 СНет 1997;272(49):30595-8

Υηπβ X. е! а1. Мо1 Се11 1998; 1(2).319-25

Список последовательностей <110> ИАЬЬАСН, Οβνίά

ЗСНиСНМАЫЫ, Магсиз

СОЫСНАНОУ, Тапуа

Уеба КезеагсЬ апб Οβνβίοραιβηε Со. Ьсб.

<120> Белки, взаимодействующие с каспазой-8 <130> Каспаза-8 <140>

<141>

<150> 132105 <151> 1999-09-28 <150> 127721 ' <151> 1998-12-24 <160> 9 <170> РаСеп£1п Уег. 2.0 <210> 1 <211> 447<212> ДНК <213> Ното 5ар1еп5 <400> 1 сддсасдадд дссСдддсаа сддссддсас асдсьдддас адсаддаадс ддаадсддас60 ддесЕдаодд ссЬасдСддс аддсдадсдс ссЬдасссас £дддгсссад дЬсссадссс120 дсаЬдссадд 1:ддсссасда сссссссада дссЬдсссЬс ЬсЬдсСсГса аддсассаад180 асдепдадед дсадеасадс сссаасдаас дгседПдссс дддсасСЕсс сдсаддссас240 аддсссадса ЬдаадЬсддс сЬЬдааддсЬ дсаЬссЬЬдс ассссдссса дЬЬдскдддд300 ссддадаада деааддддас сссдасссед дСдсСдасдс адаосссдсд д^дсСсдасд360 асСсссссса сдЬссаддсс ассЬасаСс!: сддд^дадсС дд^дкддсад дсддасдсад420 сбаддсадЬд асааддассС сддсбда447 <21С> 2 <211> 148 <212> Белок <213> Ното зарЬепз <400> 2

Агд ΗΪ3 С1и С1у Ьеи С1у Азп С1у Агд Н15 ТЬг Ьеи С1у С1п 61п 61и

5 10 15

- 33 005853

Уа1

31и

Уа1 Азр 20

С1у Ьеи ТЬг

А1а Туг 25

1/а1

А1а С1у

С1и Агд 30

Рго

Азр

Рго

Ьеи

С1у

Рго

Агд

Зег

С1п

Рго

А1а

Суз

С1п

7а 1

А1а

Н1з

Азр

Рго

35

40

45

Рго

Агд

А1а

Суз

Рго

Ьеи

Суз

Зег

С1п

С1у

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Зег

С1у

50

55

60

Зег

Не

А15

Рго

МеС

Азп

7а1

Суз

7а1

Агд

А1а

Ьеи

Рго

А1а

С1у

ΗΪ3

65

70

75

80

Агд

РЬе

Зег

МеС

Ьуз

Зег

А1а

Ьеи

Ьуз

А1а

А1а

Зег

Ьеи

ΗΪ3

Рго

А1а

85

90

95

С1п

Ьеи

Ьеи

С1у

Ьеи

С1и

Ьуз

Зег

Ьуз

С1у

ТЬг

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Уа1

Ьеи

100

105

но

ТЬг

С1п

ТЬг

Зег

Тгр

Суз

Зег

ТЬг

ТЬх

Рго

РЬе

ТЬг

Зег

Агд

Рго

Рго

115

120

125

ТЬг

Зег

Агд

Уа!

Зег

Тгр

Суз

С1у

Агд

Агд

ТЬг

С 1г.

Ьеи

С1у

Зег

Азр

130

135

140

Ьуз Азр Ьеи С1у

145 <210> 3 <211> 1513 <212> ДНК <213> Ното заргепз <400> 3 ддсдсддссс сЬссддадсс сссдсдсссс ссдСдддТдс дгддссдасд садаЬсаасс дгсдоссгсд дЬсасССссс ддСссссасд аадсддддсд ГсдсЬддсса ддссдсадсс сасссадбдд асссассссс сдсссгсддс дсссдсГссс адСгсасСаа дсддаддссд адсддсддда дСддаСССдд Сддсссддад сассддаддс дддсаддддС сдсассссда сссасдддсс асдаадсдаЕ сбдасссдсд ЬсаасдссаС

СддддСЕсдС дасасддсСс ссдссддаЕс саЕсссддас сгдсдддддс едседасгсс дассссдГсд ЬЬабсасаад ссСсдддсСд ддсссасстс ссЕддасааЕ ссдддсдсСд ддсддсадад дсЕдссЕСЕс сасСдддсдс асдасдсдсд сьдсдсддад ссададаадс сдсаЕсГЕдд СсЕсаадсса сасддсдсса дббдЦЬссЬс сассЕддадд сдсСссЕгсд дЕссдсассд асддсссдьд даСдсСдСдС сассассдсд дддасгсддс дсдасадддс ддааасьдсЕ ЕдЕСсЕЬгда сГсссддаСС аддаддасдС ссбссССсСд адаЬсссЬдС дссссьссас аддссдасдс ЬдасдсЬддс дсасседсдс ддадсддадс асссаддсас сдссдсдддд сддсдддддс садддаддаС ддадсддсдс саЬсдасдЬд дддсесдддд ссссасссЬд даададьддь садссдддад сГЕссаддас сссададЦЦд дСсссЕаддд сассЕГсаСс сдЬддддссс

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

- 34 005853 сСдассадсд асдсасасса сьддссассд саддаадЬдд ддссссаддь едсьсгсаад сасгьсссдс сссдсссадг дасгссдгдд додгддсадд дсадсдддаЬ адсссгдстд ассддсЬдсс ассссдссдс аСдссаСссс аадЬддасдд сссадсссдс дсассаадас аддссасадд ГдсЬддддсЕ Сдсгсдасда сддасдсадс дссаЪсаддд даС сдсаддссдс ссЬдсддаЬс Сдссссдддс ЬсЬдасддсс аЬдссаддЬд дссдадгддс ссдсадсасд ддадаададе сгссссссас ЬаддсадЬда ссдддЬддгС

ЬдсаЬсЬЬсЬ дсссассдсд ссдддсаасд •Ьасдгддсад дсссасдасс адсасадссс дадссддссо ааддддассс дСссаддсса сааддассЬс ддддадсЬдд аСдддаСдаь сссаЬсссса дссддсасас дЬдадсдссс сссссададс сааГдаасдс сддаддсгдс Ьддасссгдд сссасаессс ддесдададд СсЕссаддда

ЕдсадаЪддс ддддсЬддтд дссдддасад Сдасссассд сСдсссСсСе сьдьдгссдд ассссгдсас ьдесдасдса дддгдадссд асасссддсе дЬдадГсддд

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1513 <210 4 <211> 502 <212> Белок <213> Ното зархег.з <400> 4

С1у 1

А1а

А1а

Рго

Ьеи 5

Зег

А1а

С1у Уа1 Агд Н1з Тгр 10

А1а Агд

Азр 15

Ьеи

А1а

А1а

А1а

С1у

Ьеи

Агд

Зег

Агд

Зег

Ьеи

Рго

ТЬг

Агд

Ьеи

ТЬг

МеЬ

20

25

30

Агд

б1у

Аар

Агд

А1а

С1у

С1у

С1у

Рго

Уа1

Ьеи

С1п

РЬе

ТЬг

Азп

Суз

35

40

45

Агд

11е

Ьеи

Агд

С1у

С1у

Ьуз

Ьеи

Ьеи

Агд

С1и

Азр

Ьеи

Тгр

Уа1

Агд

50

55

60

С1у

С1у

Агд

11е

Ьеи

Азр

Рго

С1и

Ьуз

Ьеи

РЬе

РЬе

С1и

С1и

Агд

Агд

65

70

75

80

Уа1

А1а

Азр

С1и

Агд

Агд

Азр

Суз

С1у

С1у

Агд

11е

Ьеи

А1а

Рго

С1у

85

90

95

РЬе

Не

Азр

Уа1

С1п

11е

Азп

Агд

С1у

РЬе

С1у

Уа1

Аэр

РЬе

Зег

С1п

100

105

110

А1а

ТЬг

С1и

Азр

Уа1

С1у

Зег

С1у

Уа1

А1а

Ьеи

Уа1

А1а

Агд

Агд

11е

115

120

125

Ьеи

Зег

Н1з

С1у

Уа1

ТЬг

Зег

РЬе

Суз

Рго

ТЬг

Ьеи

Уа1

ТЬг

Зег

Рго

130

135

140

Рго

С1и

А1а

Туг

Н1з

Ьуз

Уа1

Уа1

Рго

С1п

11е

Рго

Уа1

Ьуз

Зег

С1у

145

150

155

160

- 35 005853

61у

Рго

Н1з

С1у А1а 185

С1у Уа1

Ьеи

С1у Ьеи 170

КЬз

Ьеи С1и

С1у

Рго 175

РЬе

Не

Зег

Агд

С1и

Ьуз

Агд

С1у

А1а

НЬз

Рго

<31и

А1а

ΗΪ3

Ьеи

Агд

Зег

180

185

190

РЬе

С1и

А1а

Азр

А1а

РЬе

С1п

Азр

Ьеи

Ьеи

А1а

ТЬг

Туг

С1у

Рго

Ьеи

195

200

205

Азр

Азп

Йа1

Агд

Не

νδΐ

ТЬг

Ьеи

А1а

Рго

С1и

Ьеи

С1у

Агд

Зег

Нхз

210

215

220

С1и

νβΐ

11е

Агд

А1а

Ьеи

ТЬг

А1а

Агд

С1у

Не

Суз

Уа1

Зег

Ьеи

С1у

225

230

235

240

Н1з

Зег

Уа1

А1а

Азр

Ьеи

Агд

А1а

А1а

С1и

Азр

А1а

7а1

Тгр

Зег

С1у

245

250

255

А1а

ТЫ

РЬе

Не

ТЬг

Н1з

Ьеи

РЬе

Азп

А1а

Мер

Ьеи

Рго

РЬе

Н1з

Я1з

260

265

270

Агд

Азр

Рго

С1у

Не

Уа1

С1у

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Зег

Азр

Агд

Ьеи

Рго

А1а

275

280

285

С1у

Агд

Суз

Не

РЬе

Туг

С1у

ЫеС

Не

А1а

Азр

С1у

ТЬг

Н1з

ТЬг

Аэп

290

295

300

Рго

А1а

А1а

Ьеи

Агд

Не

А1а

ΗΪ3

Агд

А1а

Н1з

Рго

С1п

С1у

Ьеи

Уа1

305

310

315

320

Ьеи

7а1

ТЬг

Азр

А1а

Не

Рго

А1а

Ьеи

<31 у

Ьеи

С1у

Азп

<31у

Агд

Н13

325

330

335

ТЬг

Ьеи

С1у

С1п

С1п

С1и

Уа1

С1и

Уа1

Азр

С1у

Ьеи

ТЬг

А1а

Туг

Уа1

340

345

350

А1а

С1у

С1и

Агд

Рго

АЗр

Рго

Ьеи

С1у

Рго

Агд

Зег

С1п

Рго

А1а

Суз

355

360

365

С1п

7а1

А1а

Н15

Азр

Рго

Рго

Агд

А1а

Суз

Рго

Ьеи

Суз

Зег

С1п

<31у

370

375

380

ТЬг

Ьуз

ТЬг

Ьеи

Зег

С1у

Зег

Не

А1а

Рго

Мер

Азп

Уа1

Суз

1/а1

Агд

385

390

395

400

ΗΪ5

РЬе

Ьеи

С1п

А1а

ТЬг

С1у

Суз

Зег

Мес

С1и

Зег

А1а

Ьеи

(31и

А1а

405

410

415

- 3б 005853

А1а Зег

Ьеи

Н15 420

Рго А1а

С1п Ьеи

Ьеи 61 у 425

Ьеи С1и

Ьуз

Зег 430

Ьуз

01 у

ТЫ

Ьеи

Азр

РЬе

Шу

А1а

Азр

А1а

Азр

РЬе

νβΐ

νβΐ

Ьеи

Азр

Азр

Зег

435

440

445

Ьеи

Н1з

νβΐ

61П

А1а

ТЬг

Туг

Не

Зег

С1у

С1и

Ьеи

Уа1

Тор

С1п

А1а

4 50

455

460

Азр

А1а

А1а

Агд

С1п

С1я

С1у

Рсо

Агд

Ьеи

Агд

С1у

Н1з

Ьеи

А1а

А1а

4 65

470

475

480

А1а

С1у

Суз

Шз

С1п

С1у

Агд

Уа1

7а1

С1у

С1и

Ьеи

Ча!

Зег

Агд

Й1и

485

490

495

Уа1 С-1у Зег Рго А1а 61у

500 <210> 5 <211> 1725 <212> ДНК <213> Ното зарЬепз <400> 5 дадсадсЕса ааасЕсасдЕ ссаддЕдаЕс аададдЕсад ссаадссдад Едадаадссс60 сддсЕдсддс адаЕасссЕс ддсЕдаадас сЕддадасад аЕддсддддд ассдддссад120 дЕддЕддасд аЕддссгдда дсасадддад сЕдддссаЕд ддсадссЕда ддссададдс130 сссдсЕссЕс Ессадсадса сссЕсаддЕд ЕЕдсЕсЕддд аасадсадсд асЕддсЕддд240 сддсЕссссс ддддсадсас сддддасаОЕ дЕдоЕдсЕЕс сЕсЕддссса дддЕдддсас300 сддссЕОЕдЕ сссдддсЕса дЕсЕЕсссса дссдсассЕд ссЕсасЕдЕс адссссадад360 сссдссадсс аддсссдадЕ ссЕсЕссадс Есададаесе сЕдссаддас ссЕдсссЕЕС420 ассасадддс ЕдаЕсЕаЕда сссддЕсаЕд сЕдаадсасс адЕдсЕссод сддЕдасаас430 адсаддсасс сддадсасдс сддссдсаЕс сададсаЕсЕ ддЕсссддсЕ дсаддадсдд540 · дддсЕссдда дссадЕдЕда дЕдЕсЕссда ддссддаадд ссЕсссЕдда ададсЕдсад600

ЕсддЕсеасЕ сЕдадсддса сдЕдсЕссЕс Еасддеасеа асссдсЕсад ссдссЕсааа660

СЕддасаасд ддаадсЕддс адддсЕссЕд дсасадсдда ЕдЕЕЕдЕдаЕ дсЕдсссЕдЕ720 ддЕддддЕед дддЕддасас ЕдасасеаЕс ЕддааЕдадс ЕЕсаЕЕссЕс сааЕдсадсс780 сдсЕдддосд ссддсадЕдг сасЕдассЕс дссЕЕсааад ЕддсЕЕсЕсд ЕдадсЕааад340 ааЕддЕЕЕсд сЕдЕддЕдсд дсссссадда сассасдсад аЕсаЕЕсаас адссаЕдддс900

ЕЕсЕдсЕЕсЕ ЕсаасЕсадЕ ддссаЕсдсс Едссддсадс Едсаасадса дадсааддсс960 адсаадаЕсс ЕсаЕЕдЕада сЕдддасдЕд сассаЕддса асддсассса дсааассЕЕс1020

Еассаадасс ссадЕдгдсе сЕасаЕсЕсс сЕдсаЕсдсс аЕдасдасдд саасЕЕсЕЕс1030 ссадддадЕд дддсЕдЕдда ЕдаддЕаддд дсЕддсадсд дЕдадддсЕЕ сааЕдЕсааЕ1140 дЕддссЕддд сЕддаддЕсе ддассссссс аЕдддддаЕс сЕдадЕассЕ ддсЕдсЕЕЕс1200 аддаЕадЕсд ЕдаЕдсссаЕ сдсссдадад ЕЕсЕсЕссад ассьадЕссЕ ддЕдЕсЕдсЕ1260 ддаЕЕЕдаЕд ссдсЕдаддд Есасссддсс ссасЕдддгд дсЕаесаЕдЕ СЕсЕдссааа1320

- 37 005853

13ΘΟ

1440

1500

1560

1620

1600

1725

СдССССддаЕ ЕСддадддСд ссссСдддЕа аасЕссаЕсс садсдссЕдд даадсддадд сссгсддадс асасдасдса дссаЕдассЕ асадддсдда дсЕсЕсЕдда ссЕсссдссс садсаассдс адссддсдда дсаассдаЕд сасадссаЕс ЕссссссЕса ддссдЕдаЕс адасьссЕдд асгддсдЕсс ддаддаадаа аассЕддсад ЕдЕдасдссЕ даадааддсЕ сдддЕдсаса дЕдссЕадад сЕсЕсЕдЕдд ссЕаЕдааЕс даддсдсадс сСдаддсссд ддааасадаа дСааасасЕд Едссаддддс дсаЕссЕддс ЕсЕаа ддЕдсЕддсс сдсддсЕдсЕ асссаассЕс дддсСдсаЕд Едасааадаа ЕдаадаЕадд <210> б <211> 574 <212> Белок <213> Ното заргепз <400> 6

С1и С1п 1

Ьеи Ьуз ТЬг 5

Шз

Уа1

С1п

Уа1

11е 10

Ьуз

Агд

Зег

А1а

Ьуз 15

Рго

Зег

С1и

Ьуз

Рго

Агд

Ьеи

Агд

01п

Не

Рго

Зег

А1а

С1и

А.зр

Ьеи

С1и

20

25

30

ТЬг

Азр

С1у

С1у

С1у

Рго

С1у

<31п

Уа1

Уа1

Азр

Азр

С1у

Ьеи

С1и

ΗΪ3

35

40

45

Агд

С1и

Ьеи

С1у

НЬз

С1у

С1п

Рго

С1и

А1а

Агд

С1у

Рго

А1а

Рго

Ьеи

50

55

60

С1п

С1п

Н1з

Рго

С1п

Ча1

Ьеи

Ьеи

Тгр

С1и

01п

С1п

Агд

Ьеи

А1а

С1у

65

Τζ>

75

80

Агд

Ьеи

Рго

Агд

С1у

Зег

ТЬг

С1у

Азр

ТЬг

Уа1

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

85

90

95

С1п

С1у

С1у

Н13

Агд

Рго

Ьеи

Зег

Агд

А1а

С1п

Зег

Зег

Рго

А1а

А1а

100

105

110

Рго

А1а

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Рго

С1и

Рго

А1а

Зег

С1п

А1а

Агд

ν»ι

Ьеи

115

120

125

Зег

Зег

Зег

С1и

ТЬг

Рго

А1а

Агд

ТЬг

Ьеи

Рго

РЬе

ТЬг

ТЬг

С1у

Ьеи

130

135

140

Не

Туг

Азр

Зег

νβΐ

Мес

Ьеи

Ьуз

Н13

С1п

Суз

Зег

Суз

С1у

Азр

Азп

145

150

155

160

Зег

Агд

Н1з

Рго

С1и

НЬз

А1а

С1у

Агд

Не

С1П

Зег

Не

Тгр

Зег

Агд

165

170

175

Ьеи

С1п

С1и

Агд

01 у

Ьеи

Агд

Зег

С1п

Суз

С1и

Суз

Ьеи

Агд

С1у

Агд

- 38 005853

1Θ0

18 5

190

Ьуз

А1а

Зег

Беи

С1и

С1и

Беи

С1п

Зег

Уа1

Н1з

Зег

С1и

Агд

Низ

Уа1

195

200

205

Беи

Беи

Туг

С1у

ТЫ

Аз П

Рго

Беи

Зег

Агд

Беи

Буз

Беи

Азр

Азп

С1у

210

215

220

Ьуз

Беи

А1а

С1у

Беи

Беи

А1а

С1п

Агд

МеС

РЬе

Уа1

МеС

Беи

Рго

Суз

223

230

235

240

С1у

С1у

Уа1

С1у

Уа1

Азр

ТЬг

Азр

ТЫ

Не

Тгр

Азп

С1и

Беи

813

Зег

245

250

255

Зег

Азп

А1а

А1а

Агд

Тгр

А1а

А1а

С1у

Зег

Уа1

ТЬг

Азр

Беи

А1а

РЬе

260

265

270

Буз

Уа1

А1а

Зег

Агд

С1и

Беи

Буз

Аз П

С1у

РЬе

А1а

νβΐ

Уа1

Агд

Рго

275

280

285

Рго

С1у

ΗΪ3

Нхз

А1а

Азр

Н1з

Зег

ТЫ

А1а-

МеС

С1у

РЬе

Суз

РЬе

РЬе

290

295

300

Аз η

Зег

Уа1

А1а

Не

А1а

Суз

Агд

С1п

Беи

С1п

С1п

С1п

Зег

Буз

А1а

305

310

315

320

Зег

Буз

Не

Беи

Не

Уа1

Азр

Тгр

Азр

Уа1

ΗΪ3

813

С1у

Азп

С1у

ТЬг

325

330

335

<Нп

αΐη

ТЬг

РЬе

Туг

С1п

Азр

Рго

Зе с

Уа1

Беи

Туг

Не

Зег

Беи

Низ

340

345

350

Агд

ΗΪ3

Азр

Азр

С1у

Аз η

РЬе

РЬе

Рго

С1у

Зег

С1у

А1а

Уа1

Азр

61и

355

360

365

Уа1

С1у

А1а

С1у

Зег

С1у

С1и

С1у

РЬе

Азп

Уа1

АЗП

Уа1

А1а

Тгр

А1а

370

375

380

С1у

С1у

Беи

Азр

Рго

Рго

Мес

С1у

Азр

Рго

С1и

Туг

Беи

А1а

А1а

РЬе

335

390

395

400

Агд

Не

Уа1

Уа1

Мес

Рго

Не

А1а

Агд

С1и

РЬе

Зег

Рго

Азр

Беи

Уа1

405

410

415

Беи

Уа1

Зег

А1а

С1у

РЬе

Азр

А1а

А1а

С1и

<31у

Нхз

Рго

А1а

Рго

Беи

420

425

430

С1у

С1у

Туг

ΗΪ5

Уа1

Зег

А1а

Буз

Суз

РЬе

С1у

Туг

МеС

ТЬг

С1п

С1п

- 39 005853

435

440

445

Ьеи

Мес

Азп

Ьеи

А1а

С1у

С1у

А1а

Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

(Ни

<31у

С1у

4 50

455

460

ΗΪ5

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Не

Суз

Азр

А1а

Зе с

С1и

А1а

Суз

Уа1

А1а

А1а

465

470

475

480

Ьеи

Ьеи

С1у

Азп

Агд

Уа1

Азр

Рго

Ьеи

Зе с

С1и

С1и

С1у

Тгр

Ьуз

<31п

485

4 90

495

Ьуз

Рго

Азп

Ьеи

Азп

Зег

Не

Агд

Зег

Ьеи

С1и

А1а

Уа1

Не

Агд

Уа1

500

505

510

Н1з

Зег

Ьуз

Туг

Тгр

С1у

Суз

Мес

С1п

Агд

Ьеи

А1а

Зег

Суз

Рго

Азр

515

520

525

Зег

Тер

νβΐ

Рсо

Агд

Уа1

Рго

С1у

А1а

Азр

Ьуз

<31и

С1и

νβΐ

С1и

А1а

530

535

540

Уа1

ТЬг

А1а

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Зег

Уа1

С1у

Не

Ьеи

А1а

С1и

Азр

Агд

545

550

555

560

Рго

Зег

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

С1и

С1и

С1и

С1и

Рго

МеС

Азп

Ьеи

565 570 <210> 7 <2Η> 1428 <212> Белок <213> Ното зарЬепз

<400> 7	Зег А1а 5	С1у	Ьеи
МеС 1	РКе	А1а	Агд
Зег	Н15	С1у	С1у 20	Азр	А1а	С1и	С1и
ТЬг	С1у	Агд 35	С1у	А1а	С1и	Агд	Агд 40
С1и	С1у 50	АЗр	Рго	С1у	мес	Ьеи 55	Ьуз
С1п 65	Ьуз	Уа1	А1а	Ьеи	Ьуз 70	Уа1	С1у

Суз	РНе 10	Рго	Тгр	Уа1	Рго	С1у 15	Уа1
Уа1 25	Ьеи	А1а	С1п	Низ	Рго 30	ТБг	Рго
Рго	Агд	Рго	Рго	Азр 45	Зег	Зег	А1а
Рго	Суз	С1у	Суз 60	Уа1	Рго	Зег	Рго
А1а	Рго	РЬе 75	Суз	ТЬг	Суз	С1у	Суз 80

- 40 005853

РЬе 61η Агд

РЬе Нхз 85

Ьеи Рго

Ьуз АХа

Суз 90

Рго

С1у С1п

С1п

С1у 95

Зег

Рго

С1и

Зег

А1а

Агд

Рго

Агд

Азп

Агд

С1п

Рго

Туг

А1а

ТЬг

С1п

Азп

100

105

110

С1у

Рго

АХа

Рго

Агд

Рго

С1п

Уа1

Ьеи

РГО

СХу

Зег

Зег

Зег

Агд

Суз

115

120

125

СуЗ

Н1з

СХу

Туг

Не

Суз

РЬе

Ьеи

РЬе

Азр

Зег

Зег

СХп

ТЬг

АХа

С1и

130

135

140

Уа1

С1и

Уа1

С1у

Тгр

СХу

С1у

Азр

ТЬг

С1у

Зег

С1п

Ьеи

Агд

Рго

Ьеи

145

150

155

160

Ьеи

Агд

С1у

А1а

Уа1

Туг

Азп

Зег

Агд

Мес

Тгр

Азр

Зег

С1п

Ьуз

С1и

165

170

175

Азр

Зег

Ьуз

Рго

Азр

Не

Ьеи

Агд

Ьеи

СХп

Азп

ТЬг

С1п

Ьеи

РЬе

Н13

180

135

190

Зег

Уа1

Зег

Ьеи

Зег

ТЬг

Азр

СХу

ТЬг

СХп

Уа1

Зег

Рго

С1у

А1а

Н1з

195

200

205

Туг

Суз

Зег

Рго

ТЬг

С1у

А1а

СХу

Суз

Рго

Агд

Рго

Суз

АХа

Азр

ТЬг

210

215

220

Рго

С1у

Рго

С1п

Рго

С1п

Рго

МеС

Азр

Ьеи

Агд

Уа1

С1у

С1п

Агд

Рго

225

230

235

240

Рго

Уа1

С1и

Рго

Рго

Рго

С1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

С1п

Агд

Рго

245

250

255

С1п

Агд

Ьеи

Нгз

Ηί3

Ηί3

Ьеи

РЬе

Ьеи

АХа

С1у

Ьеи

С1п

С1п

С1п

Агд

260

265

270

Зег

Уа1

С1и

Рго

Мес

νβΐ

Ьуз

Мес

С1и

Ьеи

Рго

АХа

Суз

С1у

А1а

275

280

285

ТЬг

Ьеи

Зег

Ьеи

Уа1

Рго

Зег

Ьеи

Рго

АХа

РЬе

Зег

11е

его

Агд

ΗΪ5

290

295

300

С1п

Зег

С1п

Зег

Зег

ТЬг

Рго

Суз

Рго

РЬе

Ьеи

С1у

Суз

Агд

Рго

Суз

305

310

315

320

Рго

С1п

Ьеи

Зег

Мес

Азр

ТЬг

Рго

МеС

Рго

С1и

Ьеи

С1п

Уа!

С1у

Рго

325

330

335

- 41 005853

СДп

СДи

СДп

СДи Ьеи Агд 340

СДп

Ьеи Ьеи 345

НДз

Ьуз Азр

Ьуз

Зег 350

Ьуз

Агд

Зег

Ьуз

СДи

УаД

АДа

ТЬг

Рго

АДа

СДп

Рго

Зег

Рго

ТЬг

Зег

СДп

УаД

355

360

365

Рго

АДа

АДа

АДа

Суз

УаД

АДа

Суз

АДа

УаД

АДа

Зег

Зег

УаД

УаД

Ьуз

370

375

380

51п

Ьуз

Ьеи

АДа

СДи

УаД

ДДе

Ьеи

Ьуз

Ьуз

СДп

СДп

АДа

АДа

Ьеи

СДи

385

390

395

400

Агд

ТЬг

УаД

ΗΪ3

Рго

Аэп

Зег

Рго

СДу

ГДе

Рго

Туг

Агд

Зег

СДп

СДу

405

4 ДО

415

Рго

Суз

Зег

СДу

СДп

Суз

Рго

Суз

Зег

УаД

Рго

ТЬг

Рго

Ьеи

Ьуз

СДп

420

425

430

Рго

Тгр

НДз

Зег

РЬе

Суз

Агд

ТЬг

Ьеи

СДи

Рго

Ьеи

СДи

ТЬг

СДи

СДу

435

440

445

АДа

ТЬг

Агд

Зег

Мео

Ьеи

Зег

Зег

РЬе

Ьеи

Рго

Рго

УаД

Рго

Зег

Ьеи

450

455

460

Рго

Зег

Азр

Рго

Рго

СДи

ΗΪ5

РЬе

Рго

Ьеи

Агд

Ьуз

ТЬг

УаД

Зег

СДи

465

470

475

480

Рго

Азп

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Агд

Туг

Ьуз

Рго

Ьуз

Ьуз

Зег

Ьеи

СДи

Агд

Агд

485

4 90

495

Ьуз

Азп

Рго

Ьеи

Ьеи

Агд

Ьуз

СДи

Зег

АДа

Рго

Рго

Зег

Ьеи

Агд

Агд

500

505

510

Агд

Рго

АДа

СДи

ТЬг

Ьеи

СДу

Азр

Зег

Зег

Рго

Зег

Зег

Зег

Зег

ТЬг

515

520

525

Рго

АДа

Зег

СДу

Суз

Зег

Зег

Рго

Азп

Азр

Зег

СДи

ΗΪ5

СДу

Рго

Азп

530

535

540

Рго

Не

Ьеи

СДу

Зег

СДи

АДа

Ьеи

Ьеи

СДу

СДп

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

СДп

545

550

555

560

СДи

ТЬг

Зег

УаД

АДа

Рго

РЬе

АДа

Ьеи

Рго

ТЬг

УаД

Зег

Ьеи

Ьеи

Рго

565

570

575

АДа

11е

ТЬг

Ьеи

СДу

Ьеи

Рго

АДа

Рго

АДа

Агд

АДа

Азр

Зег

Азр

Агд

580

585

590

- 42 005853

Агд

ТЬг

Нхз 595

Рго

ТЬг

Ьеи С1у

Рго Агд 600

С1у

Рго

11е

Ьеи 605

С1у

Зег

Рго

Ηί5

ТЬг

Рго

Ьеи

РЬе

Ьеи

Рго

Н13

С1у

Ьеи

С1и

Рго

С1и

А1а

<31у

С1у

610

615

620

ТЫ

Ьеи

Рго

Зег

Агд

Ьеи

С1П

Рго

11е

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Азр

Рго

Зег

С1у

625

630

635

640

Зег

Нхз

А1а

Рго

Ьеи

Ьеи

ТЬг

7а1

Рго

С1у

Ьеи

С1у

Рго

Ьеи

Рго

РЬе

64 5

650

655

ΚΪ3

РЬе

А1а

С1п

Зег

Ьеи

Мег

ТЬг

ТЬг

С1и

Агд

Ьеи

Зег

С1у

Зег

С1у

660

665

670

ьеи

Нхз

Тгр

Рго

Ьеи

Зег

Агд

ТЬг

Агд

Зег

С31и

Рго

Ьеи

Рго

Рго

Зег

675

680

68 5

А1а

ТЬг

А1а

Рго

Рго

Рго

Рго

(31 у

Рго

Меь

С1п

Рго

Агд

Ьеи

С1и

(31п

690

695

700

Ьеи

Ьуз

ТЬг

ΗΪ5

Уа1

С1п

Уа1

11е

Ьуз

Агд

Зег

А1а

Ьуз

Рго

Зег

С1и

705

710

715

720

Ьуз

Рго

Агд

Ьеи

Агд

С1п

Не

Рго

Зег

А1а

(31и

Азр

Ьеи

<31и

ТЬг

Азр

725

730

735

61у

С1у

С1у

Рго

С1у

<31п

Уа1

Уа1

Азр

Азр

С1у

Ьеи

С1и

Н1з

Агд

<31и

740

745

750

Ьеи

С1у

.415

С1у

С1п

Рго

С1и

А1а

Агд

С1у

Рго

А1а

Рго

Ьеи

С1п

С1п

755

7 60

765

Ыз

Рго

<31п

Уа1

Ьеи

Ьеи

Тгр

61и

С1п

С1п

Агд

Ьеи

А1а

С1у

Агд

Ьеи

770

775

780

Рго

Агд

С1у

Зег

ТЬг

С1у

Азр

ТЬг

Ча1

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

61П

С1у

785

790

795

800

01 у

Ηί3

Агд

Рго

Зег

Агд

А1а

С1п

Зег

Зег

Рго

А1а

А1а

Рго

А1а

805

810

815

Зег

Ьеи

Зег

А1а

Рго

01и

Рго

А1а

Зег

01п

А1а

Агд

Уа1

Ьеи

Зег

Зег

820

825

830

Зег

01и

ТЬг

Рго

А1а

Агд

ТЬг

Ьеи

Рго

РЬе

ТЬг

ТЬг

С1у

Ьеи

Не

Туг

835

840

845

- 43 005853

Азр

Зег Уа1 850

МеС

Ьеи

Ьуз

Н13 855

С1п Суз

Зег

Суз

С1у 860

Азр Азп

Зег

Агд

Н13

Рго

С1и

ΗΪ5

А1а

С1у

Агд

Не

С1П

Зег

Не

Тгр

Зег

Агд

Ьеи

С1п

865

870

875

880

С1и

Агд

С1у

Ьеи

Агд

Зег

С1п

суз

С1и

Суз

Ьеи

Агд

С1у

Агд

Ьуз

А1а

885

890

895

Зег

Ьеи

<31и

С1и

Ьеи

С1п

Зег

Уа1

Н13

Зег

01 и

Агд

ΗΪ3

Уа!

Ьеи

Ьеи

900

905

910

туг

С1у

ТЬг

Азп

Рго

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Азр

Азп

<31у

Ьуз

Ьеи

915

920

925

А1а

С1у

Ьеи

Ьеи

А1а

С1п

Агд

МеС

РЬе

Уа1

МеС

Ьеи

Рго

Суз

С1у

С1у

930

935

940

¥а1

С1у

Рго

Ьеи

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

А1а

Рго

945

950

955

960

ТЬг

Уа1

Рго

61п

С1у

Ьеи

Зег

Агд

Уа1

Зег

Тгр

С1у

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

965

970

975

Рго

О1у

Рго

Азп

Рго

Ьуз

Зег

Агд

Рго

А1а

Рго

Суз

Рго

Тгр

С1у

Рго

980

985

990

С1у

Агд

С1у

Уа1

01 у

ТЬг

ТЬг

Рго

Ьеи

С1у

Рго

(31 у

Зег

Суз

Уа!

Ьуз

995

1000

1005

Рго

Тгр

Мес

Мес

Агд

А1а

Ьеи

ТПг

Ьеи

А1а

Рго

С1п

¥а1

Азр

ТЬг

Азр

1010

1015

1020

ТЬг

Не

Тгр

Азп

С1и

Ьеи

Ηί3

Зег

Зег

Азп

А1а

А1а

Агд

Тгр

А1а

А1а

1025

1030

1035

1040

С1у

Зег

Уа1

ТЪг

Азр

Ьеи

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

А1а

Зег

Агд

С1и

Ьеи

Ьуз

1045

1050

1055

Азп

С1у

РНе

А1а

Уа1

Уа1

Агд

Рго

Рго

С1у

Н1з

Н15

А1а

Азр

Ηί3

Зег

1060

1065

1070

ТНг

А1а

Мес

С1у

РЬе

Суз

РЬе

РЬе

Азп

Зег

Уа1

А1а

11е

А1а

Суз

Агд

1075

1080

1085

С1п

Ьеи

С1п

С1п

С1п

Зег

Ьуз

А1а

Зег

Ьуз

11е

Ьеи

Не

Уа1

Азр

Тгр

1090

1095

1100

- 44 005853

Азр Уа1 Н1з Низ С1у Азп 31у ТЬг С1п С1п ТЬг РЬе Туг С1п Азр Рго 1105 1110 11151120

Зег Уа1 Ьеи Туг Пе Зег Ьеи Нйз Агд Нйз Азр Азр 31у Азп РЬе РЬе 1125 11301135

Рго С1у Зег С1у А1а Уа1 Азр 31и Уа1 С1у А1а С1у Зег С1у 31и 31у 1140 11451150

РЬе Азп Уа1 Азг. Уа1 А1а Тгр А1а О1у С1у Ьеи Азр Рго Рго Мег С1у 1155 11601165

Азр Рго 31и Туг Ьеи А1а А1а РЬе Агд 11е Уа1 7а1 МеС Рго Г1е А1а 1170 1175ИЗО

Агд С1и РЬе Зег Рго Азр Ьеи Уа1 Ьеи Уа1 Зег А1а С1у РЬе Азр А1а 1185 1190 11951200

А1а

С1и С1у НЬз

Рго А1а 1205

Рго

Ьеи

С1у С1у 1210

Туг

НЬз

Уа1

Зег А1а 1215

Ьуз

Суз

РЬе

31у

Туг

МеС

ТЫ

С1п

С1п

Ьеи

Мес

Азп

Ьеи

А1а

С1у

С1у

А1а

1220

1225

1230

Уа1

Уа1

Ьеи

А1а

Ьеи

ЗЬи

С1у

С1у

Н15

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Пе

Суз

Азр

1235

1240

1245

А1а

Зег

С1и

А1а

Суз

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

Ьеи

31у

Азп

Агд

Уа1

Азр

Рго

1250

1255

1260

Ьеи

Зег

С1и

С1и

31у

Тгр

Ьуз

С1п

Ьуз

Рго

Азп

Ьеи

Азп

А1а

Пе

Агд

1265

1270

1275

1280

Зег

Ьеи

С1и

А1а

Уа1

Пе

Агд

Уа1

ΗΪ3

Зег

Ьуз

Суз

С1у

Азр

31 у

ГЫ

1285

1290

1295

Ьеи

А1а

С1и

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Азр

Ьеи

31 у

61у

ТЬг

Ьеи

Рго

813

Агд

1300

1305

1310

31у

31П

Пе

Ьеи

31у

РЬе

Агд

Суз

31п

Рго

С1у

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

νβΐ

1315

1320

1325

Тгр

5ег

Ьуз

Пе

Рго

Уа1

Зег

Азр

Рго

С1у

Зег

Азп

31у

31и

ΗΪ3

Рго

1330

1335

1340

Рго

Уа1

Агд

С1у

Туг

Рго

Ьеи

Зег

Рго

Рго

Азр 31у

А1а

Зег

Агд

А1а

1343 1350 1355 1360

- 45 005853

Туг

С1п

ТЬг

Уа1

А1а

Рго

С1п С1у

Ьуз

Туг

Тгр

С1у Суз

Мес

С1п

Агд

1365

1370

1375

Ьеи

А1а

Зег

Су5

Рго

Аэр

Зег Тгр

Уа1

Рго

Агд

νβΐ

Рго

С1у

А1а

Азр

1380

1385

1390

Ьуз

С1и

С1и

Уа1

С1и

А1а

Уа1 ТЬг

А1а

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

Зег

7а1

С1у

1395

1400

1405

Не

Ьеи

С1и

Азр

Агд

Рго Зег

С1и

С1п

Ьеи

Уа1

31и

<31и

С1и

51и

1410

1415

1420

Рго

Меи

Азп

Ьеи

1425 <210> 8 <211> 1200 <212> Белок

<213> Ното .

5ар1епз

<400> 8

Рго

С1п

Рго

С1П

Рго

МеС

Азр

Ьеи

Агд

Уа1

С1у

С1п

Агд

Рго

Рго

Уа1

1

5

10

15

С1и

Рго

Рго

Рго

С1и

Рго

ТЬг

Ьеи

Ьеи

А1а

Ьеи

(31П

Агд

Рго

С1П

Агд

20

25

30

Ьеи

Н1з

Н13

Н1з

Ьеи

РЬе

Ьеи

А1а

С1у

Ьеи

С1п

С1г.

С1п

Агд

Зег

νβΐ

35

40

45

С1и

Рго

Мен

Агд

Уа1

Ьуз

Мес

С1и

Ьеи

Рго

А1а

Суз

С1у

А1а

ТЬг

Ьеи

50

55

60

Зег

Ьеи

Уа1

Рго

Зег

Ьеи

Рго

А1а

РЬе

Зег

11е

Рго

Агд

Н1з

С1П

Зег

65

70

75

80

С1п

Зег

Зег

ТЬг

Рго

Суз

Рго

РЬе

Ьеи

С1у

Суз

Агд

Рго

Суз

Рго

С1п

85

90

95

Ьеи

Зег

Мес

Азр

ТЬг

Рго

мес

Рго

С1и

Ьеи

С1п

7а1

С1у

Рго

С1п

С1и

100

105

110

С1п

С1и

Ьеи

Агд

С1п

Ьеи

Ьеи

Н13

Ьуз

Азр

Ьуз

Зег

Ьуз

Агд

Зег

Ьуз

115

120

125

С1и

Уа1

А1а

ТЬг

Рго

А1а

С1п

Рго

Зег

Рго

ТЬг

Зег

С1п

Уа1

Рго

А1а

130

135

140

- 46 005853

А1а А1а Суэ 145

Уа1

А1а Суз 150

А1а Уа1 А1а

Зег Зег Уа1 155

Уа1

Ьуз

С1п

Ьуз 160

Ьеи

А1а

С1и

Уа1

Не

Ьеи

Ьуз

Ьуз

С1п

С1п

А1а

А1а

Ьеи

С1и

Агд

ТЫ

165

170

175

Уа1

Н13

Рго

Азп

Зег

Рго

С1у

Не

Рго

Туг

Агд

Зег

С1п

С1у

Рго

Суз

180

185

190

Зег

С1у

С1п

Суз

Рго

Суз

Зег

Уа1

Рго

ТЫ

Рго

Ьеи

Ьуз

С1п

Рго

Тхр

195

200

205

Нгз

Зег

РЬе

Суз

Агд

ТЬг

Ьеи

С1и

Рго

Ьеи

С1и

ТЬг

01 и

С1у

А1а

ТЬг

210

215

220

Агд

Зег

Мей

Ьеи

Зег

Зег

РЬе

Ьеи

Рго

Рго

Уа1

Рго

Зег

Ьеи

Рго

Зег

225

230

235

240

Азр

Рго

Рго

С1и

Н13

РЬе

Рго

Ьеи

Агд

Ьуз

ТЬг

Уа1

Зег

С1и

Рго

Азп

245

250

255

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Агд

Туг

Ьуз

Рго

Ьуз

Ьуз

Зег

Ьеи

С1и

Агд

Агд

Ьуз

Азп

260

265

270

Рго

Ьеи

Ьеи

Агд

Ьуз

С1и

Зег

А1а

Рго

Рго

Зег

Ьеи

Агд

Агд

Агд

Рго

275

280

285

А1а

С1и

ТЬг

Ьеи

С1у

Азр

Зег

Зег

Рго

Зег

Зег

Зег

Зег

ТЬг

Рго

А1а

290

295

300

Зег

С1у

Суз

Зег

Зег

Рго

Азп

Азр

Зег

О1и

Н15

С1у

Рго

Азп

Рго

Не

305

310

315

320

Ьеи

С1у

Зег

С1и

А1а

Ьеи

Ьеи

С1у

С1п

Агд

Ьеи

Агд

Ьеи

С1п

С1и

ТЬг

325

330

335

Зег

Уа1

А1а

Рго

РЬе

А1а

Ьеи

Рго

ТЫ

Уа1

Зег

Ьеи

Ьеи

Рго

А1а

Не

340

345

350

ТЬг

Ьеи

С1у

Ьеи

Рго

А1а

Рго

А1а

Ахд

А1а

Азр

Зег

Агр

Агд

Агд

ТЬг

355

360

365

Нхз

Рго

ТЬг

Ьеи

С1у

Рго

Агд

С1у

Рго

Не

Ьеи

С1у

Зег

Рго

ΗΪ3

ТЬг

370

37 5

380

Рго

Ьеи

РЬе

Ьеи

Рго

ΗΪ3

б!у

Ьеи

б1и

Рго

С1и

А1а

б!у

С1у

ТЬг

Ьеи

385

390

395

400

- 47 005853

Рго

Зег

Агд

Ьеи

С1П 405

Рго

Не Ьеи

Ьеи Ьеи 410

Азр

Рго Зег

Шу

Зег 415

ΗΪ3

А1а

Рго

Ьеи

Ьеи

ТЬг

Уа1

Рго

Шу

Ьеи

Шу

Его

Ьеи

Рго

РЬе

Нгз

РЬе

420

425

430

А1а

С1п

Зег

Ьеи

МеС

ТЬг

ТЬг

С1и

Агд

Ьеи

Зег

Шу

Зег

Шу

Ьеи

Н1з

435

440

445

Тгр

Рго

Ьеи

Зег

Агд

ТЫ

Агд

Зег

Ши

Рго

Ьеи

Рго

Рго

Зег

А1а

ТЬг

450

455

460

А1а

Рго

Рго

Рго

Рго

Шу

Рго

Мес

Шп

Рго

Агд

Ьеи

С1и

Шп

Ьеи

Ьуз

465

470

475

480

ТЬг

Н13

Уа1

Шп

Уа1

Не

Ьуз

Агд

Зег

А1а

Ьуз

Рго

Зег

Ши

Ьуз

Его

435

490

495

Агд

Ьеи

Агд

С1п

Це

Рго

Зег

А1а

Ши

Азр

Ьеи

Ши

ТЬг

Азр

Шу

Шу

500

505

510

Шу

Его

Шу

Шп

Уа1

Уа1

Азр

Азр

Шу

Ьеи

Ши

ΗΪ3

Агд

Ши

Ьеи

Шу

515

520

525

ΗΪ3

Шу

Шп

Рго

б1и

А1а

Агд

Шу

Рго

А1а

Рго

Ьеи

Шп

С1п

Н13

Рго

530

535

540

С1л

Уа1

Ьеи

Ьеи

Тгр

Ши

Шп

Шп

Агд

Ьеи

А1а

С1у

Агд

Ьеи

Рго

Агд

545

550

555

560

С1у

Зег

ТЬг

Шу

Азр

ТЫ

Уа1

Ьеи

Ьеи

Рго

Ьеи

А1а

Шп

Шу

Шу

Н1з

565

570

575

Агд

Рго

Ьеи

Зег

Агд

А1а

Шп

Зег

Зег

Рго

А1а

А1а

Рго

А1а

Зег

Ьеи

580

5В5

5 90

Зег

А1а

Рго

Ши

Рго

А1а

Зег

Шп

А1а

Агд

Уа1

Ьеи

Зег

Зег

Зег

Ши

595

600

605

ТЬг

Рго

А1а

Агд

ТЬг

Ьеи

Рго

РЬе

ТЬг

ТЬг

Шу

Ьеи

Не

Туг

Азр

Зег

610

615

620

Уа1

мес

Ьеи

Ьуз

ΗΪ5

Шп

Суз

Зег

суз

Шу

Азр

Азп

Зег

Агд

Н1з

Рго

625

630

635

640

Ши

Н1з

А1а

Шу

Агд

Не

Шп

Зег

Не

Тгр

Зег

Агд

Ьеи

Шп

Ши

Агд

645

650

655

- 48 005853

С1у

Ьеи

Агд

Зег 660

С1п Суз

С1и Суз

Ьеи Агд 665

С1у Агд Ьуз

А1а 670

Зег

Ьеи

(Ни

С1и

Ьеи

С1п

Зег

Уа1

(Из

Зег

(Ни

Агд

(Из

Уа1

Ьеи

Ьеи

Туг

С1у

675

680

685

ТИг

Азп

Рго

Ьеи

Зег

Агд

Ьеи

Ьуз

Ьеи

Азр

Азп

(Ну

Ьуз

Ьеи

А1а

С1у

690

695

700

Ьеи

Ьеи

А1а

С1п

Агд

МеС

РНе

Уа1

МеС

Ьеи

Рго

Суз

С1у

С1у

Уа1

С1у

705

710

715

720

Рго

Ьеи

А1а

ТНг

Ьеи

Зег

А1а

РЬе

Ьеи

А1а

Зег

Ьеи

А1а

Рго

Тпг

Уа1

725

730

735

Рго

С1п

(Ну

Ьеи

Зег

Агд

Уа1

Зег

Тгр

(Ну

Ьеи

Ьуз

Рго

Рго

Рго

С1у

740

745

750

Рго

Азп

Рго

Ьуз

Зег

Агд

Рго

А1а

Рго

Суз

Рго

Тгр

С1у

Рго

С1у

Агд

755

760

765

С1у

Уа1

<Иу

ТНг

ТНг

Рго

Ьеи

(Ну

Рго

С1у

Зег

Суз

Уа1

Ьуз

Рго

Тгр

770

775

780

МеС

Мес

Агд

А1а

Ьеи

ТЫ

Ьеи

А1а

Рго

С1п

Уа1

Азр

ТЬг

Азр

ТНг

Не

785

790

795

800

Тгр

Азп

(Ни

Ьеи

Н13

Зег

Зег

Азп

А1а

А1а

Агд

Тгр

А1а

А1а

(Ну

Зег

805

810

815

Уа1

ТНг

Азр

Ьеи

А1а

РЬе

Ьуз

Уа1

А1а

Зег

Агд

С1и

Ьеи

Ьуз

Азп

С1у

820

825

830

РНе

А1а

Уа1

УаЬ

Агд

Рго

Рго

С1у

Н15

Я15

А1а

Азр

Н1з

Зег

ТНг

А1а

835

840

845

Мес

С1у

РЪе

Суз

РНе

РНе

Азп

Зег

Ча1

А1а

11е

А1а

Суз

Агд

С1п

Ьеи

850

855

860

(Ип

С1п

01П

Зег

Ьуз

А1а

Зег

Ьуз

Не

Ьеи

Не

Уа1

Азр

Тгр

Азр

Уа1

865

870

875

880

НЬз

Я13

С1у

Азп

(Ну

ТЬг

С1п

С1п

ТНг

РНе

Туг

С1п

Азр

Рго

Зег

Уа1

885

8 90

895

Ьеи

Туе

Не

Зег

Ьеи

(Из

Агд

Н1з

Азр

Азр

С1у

Азп

РНе

РНе

Рго

С1у

900

905

910

- 49 005853

Зег 01у А1а 915

Уа1 Азр С1и Уа1

С1у А1а С1у 920

Зег

С1у

С1и 925

С1у

РЬе

Азп

Уа1

Азп

Уа1

А1а

Тгр

А1а

С1у

С1у

Ьеи

Азр

Рго

Рго

Мес

01у

Азр

Рго

930

935

940

С1и

Туг

Ьеи

А1а

А1а

РЬе

Агд

11е

Уа1

Уа1

Мес

Рго

Не

А1а

Агд

С1и

945

950

955

960

РЬе

5ег

Рго

Азр

Ьеи

Уа1

Ьеи

Уа1

Зег

А1а

01 у

РЬе

Азр

А1а

А1а

С1и

965

970

975

31 у

Н15

Рго

А1а

Рго

Ьеи

С1у

С1у

Туг

813

Уа1

Зег

А1а

Ьуз

Суз

РЬе

980

985

990

С1у

Туг

Мес

ТЬг

О1п

С-1п

Ьеи

МеС

Азп

Ьеи

А1а

С1у

С1у

А1а

Уа1

Уа1

995

1000

1005

Ьеи

А1а

Ьеи

С1и

С1у

С1у

ΗΪ3

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

Не

Суз

Азр

А1а

Зег

1010

1015

1020

С1и

А1а

Суз

Уа1

А1а

А1а

Ьеи

Ьеи

С1у

Азп

Агд

Уа1

Азр

Рго

Ьеи

Зег

1025

1030

1035

1040

С1и

О1и

С1у

Тгр

Ьуз

01 п

Ьуз

Рго

Азп

Ьеи

Азп

А1а

Не

Агд

Зег

Ьеи

1045

1050

1055

О1и

А1а

Уа1

Не

Агд

Уа1

ΗΪ3

Зег

Ьуз

Суз

01 у

Азр

01у

ТЬг

Ьеи

А1а

1060

1065

1070

С1и

Ьеи

Агд

Ьеи

Ьуз

Азр

Ьеи

С1у

С1у

ТЬг

Ьеи

Рго

Н1з

Агд

С1у

01л

1075

1080

'085

Не

Ьеи

С1у

РЬе

Агд

Суз

01п

Рго

С1у

Азр

Ьеи

Ьеи

Ьеи

Уа1

Тгр

Зег

1090

1095

1100

Ьуз

Не

Рго

Уа1

Зег

Азр

Рго

С1у

Зег

Азп

С1у

О1и

ΗΪ3

Рго

Рго

Уа1

1105

1110

1115

1120

Агд

С1у

Туг

Рго

Ьеи

Зег

Рго

Рго

Азр

С1у

А1а

Зег

Агд

А1а

Туг

С1п

1125

изо

1135

ТЬг

Уа1

А1а

Рго

С1п

С1у

Ьуз

Туг

Тгр

С1у

Суз

МеС

С1п

Агд

Ьеи

А1а

1140

1145

1150

Зег

Суз

Рго

Азр

Зег

Тгр

Уа1

Рго

Агд

Уа1

Рго

С1у

А1а

Азр

Ьуз

С1и

1155 1160 1165

- 50 005853

СДи УаД 1170

СДи АДа

УаД ТЬг АДа 1175

Ьеи АДа

Зег Ьеи Зег УаД СДу 1180

Не

Ьеи

Α1 й С1 ц

Азр

Агд

Рго Зег

СДи

С1п

Ьеи

УаД СДи

СДи

СДи

СДи

Рго

Мес

1135

1190

1195

1200

<210> θ <211> 1041 <212> Белок <213> Ното зарДепз <400> 9

Рго Зег η Ь

АДа

УаД

Рго 5

МеС

Азр

Ьеи Агд

Ьеи Азр 10

НДз

СДп

РЬе

Зег 15

Ьеи

Рго

УаД

АДа

СДи

Рго

АДа

Ьеи

Агд

СДи

СДп

СДп

Ьеи

СДп

СДп

СДи

Ьеи

20

25

30

Ьеи

АДа

Ьеи

Ьуз

СДп

Ьуз

СДп

СДп

Пе

СДп

Агд

СДп

Г1е

Ьеи

Пе

АДа

35

40

45

СДи

РЬе

СДп

Агд

СДп

НДз

СДи

СДп

Ьеи

Зег

Агд

СДп

НДз

СДи

АДа

СДп

50

55

60

Ьеи

НДз

СДи

НДз

Пе

Ьуз

СДп

СДп

СДп

СДи

МеС

Ьеи

АДа

Мес

Ьуз

НДз

65

70

75

80

СДп

СДп

СДи

Ьеи

Ьеи

СДи

НДз

СДп

Агд

Ьуз

Ьеи

СДи

Агд

НДз

Агд

СДп

85

90

95

СДи

СДп

СДи

Ьеи

СДи

Ьуз

СДп

НДз

Агд

СДи

СДп

Ьуз

Ьеи

СДп

СДп

Ьеи

100

105

110

Ьуз

Азп

Ьуз

СДи

Ьуз

СДу

Ьуз

СДи

Зег

АДа

УаД

АДа

Зег

ТЬг

СДи

УаД

115

120

125

Ьуз

Мес

Ьуз

Ьеи

СДп

СДи

РЬе

УаД

Ьеи

Азп

Ьуз

Ьуз

Ьуз

АДа

Ьеи

АДа

130

135

140

НДз

Агд

Азп

Ьеи

Азп

НДз

Суз

Пе

Зег

Зег

Азр

Рго

Агд

Туг

Тгр

Туг

145

150

155

160

СДу

Ьуз

ТЬг

СДп

НДз

Зег

Зег

Ьеи

Азр

СДп

Зег

Зег

Рго

Рго

СДп

Зег

- 51 005853

				165
С1у	Уа1	Зег	ТЬг 180	Зег	Туг	Аз г.	Н13
Буз	Азр	Азр 195	РЬе	Рго	Беи	Агд	Буз 200
Беи	Агд 210	Зег	Агд	Беи	Буз	С1п 215	Буз
Беи 225	Беи	Агд	Агд	Буз	Азр 230	С1у	Рго
Рго	Беи	АЗр	Уа1	ТЬг 245	Азр	Зег	А1а
Рго	Зег	Зег	Рго 260	Азп	Азп	Зег	Зег
Не	А1а	Рго 275	А1а	Уа1	Рго	Зег	Не 280
Агд	Беи 290	Уа1	А1а	Агд	С1и	С1у 295	Зег
Зег 305	Рго	Зег	Беи	Рго	Азп 310	Не	ТЬг
Зег	А1а	С1у	ТЬг	А1а 325	С1у	С1п	С1п
А1а	Беи	С1п	С1п 340	Агд	Беи	Зег	Беи
Туг	Беи	Зег 355	ТЬг	Зег	Рго	Беи	61и 360
его	Беи 370	Беи	С1п	Ηί3	Мес	Уа1 37 5	Беи
Рго 385	Беи	Уа1	ТЬг	С1у	Беи 390	С1у	А1а
Уа1	С1у	А1а	Азр	Агд 405	Уа1	Зег	Рго
Агд	Рго	Беи	61у	Агд	ТЫ	С1п	Зег

	170					175
Рго 185	Уа1	Беи	С1у	Мес	Туг 190	Азр	А1а
ТЬг	А1а	Зег	С1и	Рго 205	Азп	Беи	Буз
Уа1	А1а	С1и	Агд 220	Агд	Зег	Зег	Рго
Уа1	Уа1	ТЬг 235	А1а	Беи	Буз	Буз	Агд 240
Суз	Зег 250	Зег	А1а	Рго	С1у	Зег 255	С1у
С1у 265	Зег	Уа1	Зег	А1а	С1и 270	Азп	С1у
Рго	А1а	С1и	ТЬг	Зег 285	Беи	А1а	Ηίβ
А1а	А1а	Рго	Беи 300	Рго	Беи	Туг	ТЬг
Беи	С1у	Беи 315	Рго	А1а	ТЬг	С1у	Рго 320
Азр	ТЬг 330	С1и	Агд	Беи	ТЬг	Беи 335	Рго
РЬе 345	Рго	С1у	ТЬг	Н1з	Беи 350	ТЬг	Рго
Агд	Азр	СЬу	С1у	А1а 365	А1а	ΗΪ3	Зег
Беи	С1и	С1п	Рго 380	Рго	А1а	С1п	А1а
Беи	Рго	Беи 395	ΗΪ3	А1а	С1П	Зег	Беи 400
Зег	Не 410	ΗΪ3	Буз	Беи	Агд	С1п 415	Н13
А1а	Рго	Беи	Рго	С1п	Азп	А1а	С1п

- 52 005853

420 425 430

А1а

Ьеи 01п 435

НЬз

Ьеи Уа1

11е

С1п 440

01п С1п

Ηίδ 61П

01п 445

РЬе

Ьеи

61и

Ьуз

НЬз

Ьуз

С1п

С1п

РЬе

01п

С1П

С1п

С1П

Ьеи

С1п

МеЕ

Азп

Ьуз

Не

450

455

4 60

Е1е

Рго

Ьуз

Рго

Зег

01 и

Рго

А1а

Агд

01 п

Рго

С1и

Зег

Н1з

Рго

01и

465

470

475

480

О1и

ТЬг

01и

С1и

С1и

Ьеи

Агд

01и

НЬз

С1п

А1а

Ьеи

Ьеи

Азр

О1и

Рго

435

490

495

Туг

Ьеи

Азр

Агд

Ьеи

Рго

С1у

С1п

Ьуз

С1и

А1а

НЬз

А1а

С1П

А1а

01у

500

505

510

Уа1

С1л

νβι

Ьуз

С1п

С1и

Рго

Не

О1и

Зег

Азр

С1и

С1и

С1и

А1а

01и

515

520

525

Рго

Рго

Агд

31и

Уа1

О1и

Рго

01у

О1п

Агд

С1п

Рго

Зег

С1и

01п

О1и

530

535

540

Ьеи

Ьеи

РЬе

Агд

С1П

С1п

А1а

Ьеи

Ьеи

Ьеи

01и

01п

01п

Агд

11е

Н1з

545

550

555

560

С1п

Ьеи

Агд

Азп

Туг

С1п

А1а

Зег

МеЕ

01и

А1а

А1а

С1у

Г1е

Рго

Уа1

565

570

575

Зег

РЬе

С1у

С1у

Н1з

Агд

Рго

Ьеи

Зег

Агд

А1а

С1п

Зег

Зег

Рго

А1а

530

585

590

Зег

А1а

ТЫ

РЬе

Рго

ναΐ

Зег

νβΐ

С1п

О1и

Рго

Рго

ТЬг

Ьуз

Рго

Агд

595

600

605

РЬе

ТЬг

ТЬг

01 у

Ьеи

УаЬ

Туг

Азр

ТЬг

Ьеи

МеЕ

Ьеи

Ьуз

ΗΪ3

С1п

Суз

610

615

620

ТЬг

Суз

С1у

Зег

Зег

Зег

Зег

Нгз

Рго

С1и

НЬз

А1а

С1у

Агд

Не

С1п

625

630

635

640

Зег

11е

Тгр

Зег

Агд

Ьеи

С1п

С1и

ТЬг

01у

Ьеи

Агд

01у

Ьуз

Суз

01и

645

650

655

Суз

11е

Агд

С1у

Агд

Ьуз

А1а

ТЬг

Ьеи

С1и

С1и

Ьеи

С1п

ТЬг

Уа1

ΗΪ5

660

665

670

Зег

С1и

А1а

Н1з

ТЬг

Ьеи

Ьеи

Туг

С1у

ТЬг

Азп

Рго

Ьеи

Азп

Агд

01 п

- 53 005853

675

680

685

Ьуз

Ьеи

Азр

Зег

Ьуз

Ьуз

Ьеи

Ьеи

С1у

Зег

Ьеи

А1а

Зег

νβ1

РЬе

Уа1

690

695

700

Агд

Ьеи

Рго

Суз

С1у

С1у

Уа1

С1у

\Га1

Азр

Зег

Азр

ТЬг

11е

Тгр

Азп

705

710

715

720

С1и

Уа1

ΗΪ5

Зег

А1а

С1у

А1а

А1а

Агд

Ьеи

А1а

Уа1

С1у

Суз

Уа1

Уа1

725

730

735

С1и

Ьеи

7а1

РЬе

Ьуз

Уа1

А1а

ТЬг

С1у

б1и

Ьеи

Ьуз

Аз η

<31у

РЬе

А1а

740

745

750

Оа1

Уа1

Агд

Рго

Рго

С1у

ΗΪ8

Ηί3

А1а

С1и

С1и

Зег

ТЬг

Рго

МеС

С1у

755

780

765

РЬе

Суз

Туг

РЬе

Аз η

Зег

Уа1

А1а

Уа1

А1а

А1а

Ьуз

Ьеи

Ьеи

С1п

С1п

770

775

780

Агд

Ьеи

Зег

Уа1

Зег

Ьуз

11е

Ьеи

Не

Уа1

Азр

Тгр

Азр

Уа1

Н18

Н13

785

790

795

800

01 у

Азп

С1у

ТЬг

01П

С1п

А1а

РЬе

Туг

Зег

Азр

Рго

Зег

7а1

Ьеи

Туг

805

810

315

Мес

Зег

Ьеи

НЬз

Агд

Туг

Азр

Азр

С1у

Аз η

РЬе

РЬе

Рго

О1у

Зег

С1у

820

825

830

А1а

Рго

Азр

б1и

Уа1

С1у

ТЬг

С1у

Рго

С1у

Уа1

б1у

РЬе

Азп

\Га1

Азп

335

340

845

Мее

А1а

РЬе

ТЬг

С1у

О1у

Ьеи

Азр

Рго

Рго

МеС

С1у

Азр

А1а

С1и

Туг

950

855

860

Ьеи

А1а

А1а

РЬе

Агд

ТЬг

Уа1

Уа1

Мес

Рго

11е

А1а

Зег

С1и

РЬе

А1а

855

870

875

880

Рго

Азр

Уа1

Уа1

Ьеи

Уа1

Зег

Зег

С1у

РЬе

Азр

А1а

Уа1

С1и

С1у

НЬз

8Θ5

390

895

Рго

ТЬг

Рго

Ьеи

С1у

С1у

Туг

Аз η

Ьеи

Зег

А1а

Агд

Суз

РЬе

С1у

Туг

900

905

910

Ьеи

ТЬг

Ьуз

С1п

Ьеи

Мес

С1у

Ьеи

А1а

61у

б1у

Агд

11е

νβΐ

Ьеи

А1а

915

920

925

Ьеи

С1и

С1у

С1у

Я15

Азр

Ьеи

ТЬг

А1а

11е

Суз

Азр

А1а

Зег

С1и

А1а

- 54 005853

930 935 940

Суз 94 5

Уа1

Зег

А1а

Ьеи

Ьеи С1у Азп С1и Ьеи 950

Азр 955

Рго

Ьеи

Рго

С1и

Ьуз 960

Уа1

Ьеи

С1п

СХп

Агд

Рго

Азп

А1а

Азп

А1а

Уа1

Агд

5ег

Мес

О1и

Ьуз

965

970

975

УаХ

Мес

С1и

Не

Н1з

Зег

Ьуз

Туг

Тгр

Агд

Суз

Ьеи

С1п

Агд

ТЬг

ТЬг

980

985

990

Зег

ТЬг

АХа

С1у

Агд

Зег

Ьеи

Не

О1и

А1а

С1п

ТЫ

Суз

С1и

Азп

С1и

995

1000

1005

С1и

А1а

С1и

ТЬг

Уа1

ТЬг

АХа

МеС

АХа

Зег

Ьеи

5ег

Уа1

С1у

УаХ

Ьуз

Ю10

1015

1020

Рго

А1а

О1и

Ьуз

Агд

Рго

Азо

С1и

С1и

Рго

МеС

С1и

С1и

С1и

Рго

Рго

1025

1030

1035

1040

Ьеи

Claims (34)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека, имеющая аминокислотную последовательность, приведенную на фиг. 2, или ее варианты, полученные, как раскрыто в описании, способные взаимодействовать с субъединицей 1 и/или субъединицей 2 каспазы-8.
2. 2. №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека по п.1, расщепляемая ш уйго каспазой-8.
3. 3. №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилаза человека по п.1, расщепляемая ш угуо каспазой-8.
4. 4. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазу человека по любому из пп.1-3.
5. 5. Выделенная последовательность ДНК по п.4, имеющая нуклеотидную последовательность, представленную на фиг. 3.
6. 6. Выделенная последовательность ДНК, способная гибридизоваться с последовательностью ДНК по п.4 в умеренно строгих условиях, раскрытых в описании.
7. 7. Вектор, содержащий последовательность ДНК по п.5 или 6 и регуляторные последовательности, в частности промотор СМУ человека.
8. 8. Эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п.7.
9. 9. Способ получения №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1, включающий выращивание эукариотической клетки-хозяина по п.8 в условиях, обеспечивающих продуцирование указанного белка и его посттрансляционные модификации, и выделение указанного белка.
10. 10. Способ получения №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1, включающий выращивание прокариотической клетки-хозяина по п.8 в условиях, обеспечивающих продуцирование указанного белка, и выделение указанного белка.
11. 11. Способ по п.9, согласно которому эукариотической клеткой является клетка млекопитающего, насекомого или дрожжей.
12. 12. Способ по п. 11, согласно которому клеткой млекопитающего является клетка НеЬа или 293 Т НЕК.
13. 13. Рибозим, специфический для нуклеотидной последовательности, соответствующей последовательности ДНК по п.5 или 6.
14. 14. Антисмысловой олигонуклеотид, содержащий по меньшей мере 9 нуклеотидов, соответствующих последовательности ДНК по п.5 или 6.
15. 15. Антитело, направленное против эпитопа №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1.
16. 16. Набор для иммуноанализа, предназначенный для обнаружения №ацетилглюкозамин-6фосфатдеацетилазы человека, включающий в качестве реагента антитело по п.15.
17. 17. Применение №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1 для модуляции активности каспазы-8.
18. 18. Применение рибозима по п.13 для модуляции активности каспазы-8.
19. 19. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 для модуляции активности каспазы-8.
20. 20. Применение антитела по п.15 для модуляции активности каспазы-8.
21. 21. Применение №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΕ-рецептором или Еак.

    - 55 005853
22. 22. Применение рибозима по п.13 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΤ-рецептором или Га§.
23. 23. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΤ-рецептором или Га8.
24. 24. Применение антитела по п.15 для модуляции активностей, опосредованных ΤΝΤ-рецептором или Га§.
25. 25. Применение №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1 для модуляции апоптоза.
26. 26. Применение рибозима по п.13 для модуляции апоптоза.
27. 27. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 для модуляции апоптоза.
28. 28. Применение антитела по п.15 для модуляции апоптоза.
29. 29. Применение №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
30. 30. Применение рибозима по п.13 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
31. 31. Применение антисмыслового олигонуклеотида по п.14 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
32. 32. Применение антитела по п.15 в качестве лекарственного средства для терапии заболеваний, связанных с необходимостью модуляции активности каспазы-8.
33. 33. Применение по любому из пп.29-32, где указанным заболеванием является рассеянный склероз с первичной олигодендроглиопатией, аутоиммунный увеоретинит, диабет, волчанка, аутоиммунный миокардит I, опосредованный НСУ хронический гепатит, хронический гастрит, например гастрит типа А, смешанная болезнь соединительной ткани (МСТО), болезнь Крона или неспецифический язвенный колит.
34. 34. Применение №ацетилглюкозамин-6-фосфатдеацетилазы человека по п.1 для выделения, идентификации и клонирования другого белка того же класса.