CN1552416A - 一种药物组合物在制备治疗高血压病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属医药领域，具体涉及一种药物组合物在制药领域中的新用途。本发明选用人类原发性高血压病的动物模型SHR，在其清醒状态下连续观察该药物组合物对其血压、左心室肥厚相关指标、肾功能形态、和肾素－血管紧张素－醛固酮等的影响，结果证实本发明可明显地使原发性高血压大鼠的血压下降，而对于高血压引起的左心室肥厚，心肌纤维化及肾功能形态等具有很好的保护作用。此外，通过基因芯片技术初步探讨了其降血压及保护靶器官的机制。本发明可用于抗高血压，并可治疗原发性高血压病，同时具有明显的心肾保护作用。本发明的新用途为传统中药组合物扩展了适应症。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种药物组合物在制备治疗高血压病药物中的应用。
背景技术
高血压是全球性重大公共卫生问题。国内外研究证明高血压不仅导致血流动力学异常，糖、胰岛素、脂肪障碍，而且引起心、脑、肾靶器官的严重损害，是冠心病，脑卒中的主要危险因素，因而成为心血管疾病防治工作中的重点。研究表明，未经治疗的高血压能明显增加心、脑、肾、血管等靶器官的损害和功能衰竭的发生率。1994年世界卫生组织和国际高血压联盟(WHO/ISH)制定的诊疗指南指出：经过治疗的高血压患者，冠心病、脑中风的总死亡率已明显下降但仍未达到同龄正常人群水平。这与靶器官损害直接有关。
因此，高血压的治疗目标不仪降低血压至理想水平，而且要降低或逆转靶器官的病理变化，减少心脑血管事件发生率，改善生存质量，才是治疗高血压的关键。中医辨证论治治疗本病，不在于单纯降低血压，其着重点在于调整机体明阳的平衡，从而明显改善症状，促进心、脑、肾、血管病理改变的恢复等多方面的综合作用。因此，中医药着眼整体调理而降压，同时纠正功能失调改善机体症状，提高生活质量，在这方面具有潜在优势。
心脏是高血压累及的靶器官之一，主要损害为左室肥厚(LVH)。近年来的研究还表明，高血压病LVH时，不仅有心肌细胞的肥大，而且常伴有心肌间质细胞的增生及胶原纤维的异常堆积，导致心肌纤维化(MF)的发生。MF的主要表现为心肌间质原有胶原增粗，新胶原沉积于原来缺乏胶原的心肌间质内，胶原体积比例增加。心肌中的胶原纤维相互连接，形成一个庞大的网架，包裹着各种细胞，使心脏成为一个整体，共同完成心脏的功能。左心室肥厚和心肌纤维化发展使左心室舒张和收缩功能减退，最终导致心力衰竭；可使冠状动脉循环的储备能力降低，加重并存的冠心病；还可导致各种心率失常和猝死的发生。
在肾脏方面，早在1826年Bright就指出肾脏与高血压有相互关系。50年代Perera跟踪随访了500例未经治疗的原发性高血压患者，从诊断发现至死亡平均生存时间为20年，其中仅有高血压无并发症时间为15年，以后出现靶器官并发症。肾脏并发症的发生率为42％，仅次于心脏并发症，约10％死于肾功能衰竭，进一步说明人类高血压对肾脏的危害。
目前，临床上治疗高血压病以化学药物为主，其主要特点是对症治疗，显效快，作用强，能够较好的控制血压水半，如血管紧张素转换酶抑制剂，卡托普利等。但是，化学药物的作用主要是针对高血压病发病过程中病理变化的某一个环节，作用途径、作用靶点相对单一，不能兼顾高血压发病过程中脂质代谢异常、糖耐量降低以及有效的保护血管内皮细胞及其功能以及它们之间的相互影响和调节等复杂环节，而这些环节对于保护靶器官都有重要作用；同时化学药物的副作用，限制了一些特殊人群使用。
中药复方治疗高血压病，不仅仅是每一味中药降压作用的简单相加，它是通过多途径、多靶点的整合调节，发挥降压作用，降压特点是作用缓和，与化学药物相比，副作用小，适合长期服用；而且由于中药复方本身的复杂性及其多组分的特点，在其发挥降压作用的同时，有效的调整着较高血压水平所导致的其它系统的异常，发挥其脏器保护作用。
肾脏方面，祖国医学认为高血压的基本病理在于阴虚阳亢，进而导致风火痰淤等病理因素的产生及气血升降失调，病位主要在肝肾。肾为先天之本，藏真阴，寓元阳，宜固藏而不宜泄露。高血压早期肾损害者系肾虚不能固摄精微，加之痰浊，血瘀阻肾络，壅而外泻。临床检查可见TG(甘油三脂)，TC(胆固醇)，LDL(低密度脂蛋白)等和尿β2-MG(β2微球蛋白)，IgG(免疫球蛋白G)，Alb(白蛋白)增高及多尿等肾脏损害征象，进一步发展可见恶心，呕吐，腹胀，全身浮肿等肾功能衰竭症状。严东等[严东，蒋卫民，唐蜀华.降压益肾颗粒治疗高血压病早期肾损害35例疗效观察.中医药研究[J].1999，L5(I)：6-7.]观察轻、中度原发性高血压35例口服降压益肾颗粒(鬼针草，制首乌，萸肉、玄参、防己)3个月，发现血压降低，而且其血代谢及血尿LgG、β2-MG、Alb均有明显改善作用，提示此方降压降脂及保护肾脏的作用。唐树德等[唐树德等.首乌治疗早期肾脏损害血淤型高血压患者28例.中国中西医结合杂志[J].1994，5；302-303.]研究表明首乌降压作用保护肾脏，减轻肾损伤，达到防治高血压早期肾损害目的。
发明人已经申请了药物组合物专利，专利号：93100050.5，是由当归、川芎等组成。它是在祖国医学理论的指导下，并经多年临床实践总结而成，具有治疗内伤引起的头痛的作用，临床上适用于血管神经性头痛、偏头痛以及高血压引起的头晕、头痛等症状。按本处方比例，可以制成药剂学上任何一种剂型。其中的颗粒剂型由天津天士力制药股份有限公司生产，名称为“养血清脑颗粒”。获准的“功能与主治”为养血平肝，活血通络。用于血虚肝亢所致各种头痛、创伤性脑神经综合症、眩晕眼花、心烦易怒、失眠多梦等。临床上主要用于治疗血虚、血瘀、阴虚阳亢所致的头痛。由于其确切的疗效，自上市以来，赢得了广大患者的信赖。
经过近年来的临床与实验研究，养血清脑颗粒的应用范围得到了进一步的扩展。朱玉环[养血清脑颗粒治疗慢性紧张性头痛45例，山东中医杂志J.2002年1月21卷第1期22]报道了以镇脑宁为对照药，治疗慢性紧张性头痛，结果取得了满意的效果。陈颖贤[养血清脑颗粒与盐酸氟桂嗪胶囊治疗偏头痛临床观察，解放军药学学报J.第17卷第2期100]观察了养血清脑颗粒与盐酸氟桂嗪胶囊治疗偏头痛的疗效，结果显示养血清脑颗粒与盐酸氟桂嗪胶囊联合使用可以明显提高疗效。至今未发现报道养血清脑颗粒治疗原发性高血压及其对心、肾等靶器官保护方面的报道。
发明内容
本发明是在已有专利[93100050.5]的基础上，完成的新用途发明，处方的组成按重量配比如下：
当归4～9％，川芎4～9％，白芍2～8％，熟地2～8％，勾藤10～15％，鸡血藤10～15％，夏枯草10～15％，决明子10～15％，珍珠母10～15％，元胡4～9％，细辛0.5～2％；
最佳配比为：
当归6.75％，川芎6.75％，白芍5.4％，熟地5.4％，勾藤13.5％，鸡血藤13.5％，夏枯草13.5％，决明子13.5％，珍珠母13.5％，元胡6.75％，细辛1.34％。
该专利药物组合物通过以下方案予以实施：
按上述比例取药材，加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓缩，加2倍量的乙醇，静置24小时沉淀，取上清液浓缩成浸膏，相对密度为1.3～1.4，出膏率为10％，取清膏、蔗糖和糊精按1∶3∶1的比例制成颗粒。其中，制剂部分还可以按照常规的工艺方法制成其他药剂学上的任何一种剂型。
头痛与高血压有着密切的联系，但在发病机制及治疗方法等方面又有着明显的区别。目前，临床上分别有治疗头痛与高血压的药物二类，治疗头痛的药物不一定具有抗高血压的作用，甚至还会引起其他不良反应，更不用说具有对于高血压引起损伤的靶器官的保护作用了。
所说的养血清脑颗粒经动物实验证实在一定的剂量可明显降低自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)的动脉压。研究结果表明，原属于治疗头痛的药物养血清脑颗粒具有抗原发性高血压的作用，同时具有对于高血压引起损伤的心、肾等靶器官具有保护作用。
为了更好地理解本发明的内容，下面通过该专利药物的颗粒剂型——养血清脑颗粒，在高血压动物模型中的试验结果，说明其在制药领域中的新用途。
自发性高血压大鼠，又称原发性高血压大鼠(Spontaneous Hypertension Rat，SHR)，其发病机理及发展变化接近于人类，而且血压水平较高较稳定，是一种遗传性高血压模型。本实验采用这一模型研究养血清脑颗粒对收缩血压的影响，明确其降压作用及强度。并且运用了高通量的基因芯片检测技术，对养血清脑治疗后SHR大鼠肾脏差异表达基因进行了筛选，同时观察了左心室基因表达谱的变化。试图从以上观测中，研究该药的降压作用，并从分子水平上探讨中药对高血压病靶器官损害保护作用的机制。
第一部分：养血清脑颗粒对自发性高血压大鼠血压的影响
1.实验动物与仪器
SHR大鼠60只，雌雄各半，14周龄，体重210.89±39.34，东京都威斯特大鼠(WKY)10只，雌雄各半，作为正常对照，体重220.17±37.67g(上海市高血压研究所，动物合格证号：医动字第0237-1号)，RBP-1B型大鼠血压心率仪(北京中日友好临床医学研究所)，养血清脑颗粒(天津天士力制药股份有限公司，批号20020404)，牛黄降压丸(天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，批号0484035)，卡托普利(天津市华新制药厂，批号20010901)
2.实验方法
(1)测压方法
采用尾动脉容积无创测压法。测压前，将大鼠放入37±1℃电热加温箱内，预热约12～13分钟，然后选择合适的鼠笼，固定于测压台上测压。在大鼠安静状态下，连续测压3-5次，取平均值作为测压结果。测压过程中，动作要轻柔，避免引起大鼠不安。正式实验前，适应性测压约1周。待大鼠适应环境，血压稳定后，开始正式实验。本研究中所测血压均为收缩压。
(2)分组及给药
适应性测压结束后，计算每只大鼠的基础血压，按血压分层，再按随机数字表分为6组，每组10只，以WKY为对照：
WKY组
模型组 蒸馏水
牛黄降压丸组 0.168g/kg/d
卡托普利组 7.785g/kg/d
养血清脑颗粒组 31.5g生药/kg/d
所有药物均于实验前按1ml/100g体重配置成溶液，灌胃给药。
每日上午测大鼠血压。第1周每天测量大鼠血压，第2、3、4、6、8周每周测血压一次，每次连续测三天取平均值为该周血压。每周一测一次体重，随时调整给药量。首次给药后，每隔1小时测血压1次，连续4小时。大鼠饲养于恒温(22±2℃)室内通风柜内，每笼5～6只，标准饲料，自由饮水。
(3)结果统计：用Spss10.0软件包进行统计学处理，数据用(
x±s)表示，前后比较用配对t检验，组间比较用t检验。
3.结果
一、单次给药对SHR收缩压的影响
单次灌服养血清脑颗粒，可以使自发性高血压大鼠收缩压下降。在给药后约1小时开始显示降压作用，高峰在药后2～4小时之间。2小时后收缩压下降即有差异，3小时达到降压高峰约9mmHg。24小时后。见表1、附图1。
表1养血清脑颗粒对SHR收缩压的影响(mmHg)(
x±s)
组别 剂量 n 药前 药后1h 药后2h
(g/kg/d)
模型组 10 183.9±8.7 188.9±13.2 188.7±14.0
牛黄降压丸组 0.17g 10 185.6±16.3 184.1±15.9 178.8±11.75
卡托普利组 7.79mg 10 184.8±13.9 174.4±11.2c 168.9±10.4b
养血清脑颗粒组 31.5 10 181.9±9.4 177.5±6.7 173.9±7.7a
注：与给药前比较ap＜0.05，t＝3.11；bp＜0.001，t＝5.65；cp＜0.05，t＝2.80
续表1养血清脑颗粒对SHR收缩压的影响(mmHg)(
x±s)
剂量
组别 n 药后3h 药后4h 药后24h
(g/kg/d)
模型组 10 189.7±11.9 189.5±12.1 187.1±9.5
牛黄降压丸组 0.17g 10 181.2±27.1 179.3±10.6 180.0±12.8
卡托普利组 7.79mg 10 173.5±12.3b 177.5±14.2 181.1±12.5
养血清脑颗粒组 31.5 10 172.7±7.7a 175.4±9.8 179.9±8.5
注：与给药前比较ap＜0.05，t＝3.01；bp＜0.01，t＝3.50。
二、养血清脑颗粒连续给药8周对SHR收缩压的影响
连续灌服养血清脑颗粒，可以抑制自发性高血压大鼠血压随年龄的增加而增加的趋势，给药2周后，养血清脑颗粒组与模型比较即有统计学意义(p＜0.05)；给药8周后，收缩压比模型组低26.1mmHg，见表2，附图2。
表2养血清脑颗粒对SHR收缩压的影响(mmHg)(
x±s)
剂量
组别 例数 基础血压 1W 2W 3W
(g/kg/d)
WKY组 10 129.4±4.2** 130.6±7.5** 124.0±6.4** 124.6±5.9**
模型组 10 181.6±13.9 187.1±9.3 188.8±9.4 193.1±11.9
牛黄降压丸 0.1 10 182.7±12.2 185.1±19.3 181.6±10.7 181.2±12.9*
组 68g
卡托普利组 7.785mg 10 181.3±14.3 174.8±12.1* 170.7±10.98* 169.7±7.9**
养血清脑颗 31.5 10 181.9±9.4 179.1±10.3 178.3±7.3* 174.1±8.3*
粒组
注：*和模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01
续表2养血清脑颗粒对SHR收缩压的影响(mmHg)(
x±s)
剂量
组别 N 4W 6W 8W
(g/kg/d)
WKY组 10 127.5±11.2** 121.6±6.8** 117.5±5.6**
模型组 10 192.1±105 199.9±13.1 199.3±11.5
牛黄降压丸组 0.168g 10 178.8±8.4** 177.9±13.8** 181.9±10.9**
卡托普利组 7.785g 10 169.7±8.6** 169.7±12.9** 171.1±6.9**
养血清脑颗粒组 31.5 10 175.2±6.7** 173.9±5.5** 173.2±5.68*
注：*和模型组比较*p＜0.05，**p＜0.01
第二部分：养血清脑颗粒对自发性高血压大鼠左室肥厚相关指标的影响
左室肥厚(LVH)是高血压病最常见的并发症之一。长期较高的血压水平导致后负荷增大，心脏长期处于代偿状态，心肌细胞肥大、增生，并激活心脏局部及全身因素，如肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，ET-NO系统等，促进心室的进一步肥厚，心肌间质增生，造成恶性循环，发展为心肌纤维化。心肌纤维化是临床上导致心力衰的常见原因之一。本实验采用14周龄的SHR大鼠模型，连续给药8周，观察养血清脑颗粒对SHR左室肥厚的逆转及对早期心肌纤维化的保护作用。
1.实验动物与主要仪器
SHR大鼠60只，雌雄各半，14周龄，体重210.89±39.34，东京都威斯特大鼠(WKY)10只，雌雄各半，体重220.17±37.67(上海市高血压研究所，动物合格证号：医动字第0237-1号)，养血清脑颗粒(天士力集团，批号20020404)，牛黄降压丸(天津中新药业集团股份有限公司达仁堂制药厂，批号0484035)，卡托普利(天津市华新制药厂，批号20010901)。聚丙烯酰氨、甲叉双丙烯酰氨、胃蛋白酶等(美国，Sigma)。羟脯氨酸标准品(华北特种试剂中心，批号20020215)。超速低温离心机(德国，贝克曼)，DYY-IIIB电泳仪(北京六一仪器厂)，CS-9300PC薄层色谱扫描仪(日本，岛津)，722RS型分光光度计(上海第二分析仪器厂)，PHS-2C酸度计(上海雷磁仪器厂)，DY8f-I型电动玻璃匀浆机(宁波新芒科器研究所)。
2.实验方法
(1)分组及给药
SHR大鼠60只，按随机数字表分为6组，每组10只，以WKY10为对照：
WKY
模型组 蒸馏水
牛黄降压丸组 0.168g/kg/d
卡托普利组 7.785g/kg/d
养血清脑颗粒组 35.5g生药/kg/d
所有药物均于实验前按1ml/100g体重配置成溶液，灌胃给药。
(2)取材
给药8周后，称体重(BW)，颈动脉放血处死大鼠，开胸迅速取出心脏，生理盐水冲洗残血，吸干，沿房室交界处剪去心耳、心房、大血管等，称取全心重，小心剪除右心室游离壁，准确称取左心室+室间隔重量(LVW)，并计算LVW与BW之比，作为左心室肥厚的指标。取中段横截面心肌组织，投入10％福尔马林固定。取左心室游离壁心肌组织约1m3，立即置入冰冷2.5％戊二醛(Ph7.2)中固定。将其余左心室用锡纸包裹，投入液氮中保存备用。
(3)组织形态学观察：取10％福尔马林固定的心肌组织，常规石蜡包埋，脱水，切片，行VG染色，光镜下心肌细胞呈黄色，胶原纤维呈红色。行HE染色，观察心肌细胞的形态结构。取2.5％戊二醛的心肌组织，锇酸固定，脱水，包埋，行超薄切片，用透射电子显微镜观察心肌和血管结构。
(4)心肌总胶原含量的测定
取适量心肌组织，称重，放在95％酒精中脱水6h，然后用丙酮脱脂48小时。脱脂样品于110℃拷箱中烘干，称干重后研成细末，保存。准确称取一定量的组织干粉，于安瓿中加入5ml 6mol/L盐酸(6mol/L)，封口，于125℃拷箱中水解5小时，然后将水解液移入25ml容量瓶中，加入2～2.5ml NaOH(6ml/L)，使pH值接近6，稀释至刻度，放置过夜。吸取稀释液2ml放在试管中，加1ml氯胺-T溶液(0.05ml/L)，摇匀，室温下放置20分钟。加入1ml过氯酸溶液(3.15ml/L)，摇匀。5分钟后，加入1ml对二甲氨基苯甲醛溶液(10％)，摇匀，60℃水浴中保温20分钟，显色，冷却，在550nm波长下比色。标准曲线的制作：准确称取标准100mg溶于0.01ml/L盐酸内，定容至100ml，为标准液，其浓度为1000μg/ml。取标准液2ml，稀释至100ml，其浓度为20μg/ml，依次配置2、5、8、10、16μg/m的不同浓度的的标准液，按上述操作比色，根据浓度和光密度绘制标准曲线，计算回归系数。
心肌胶原浓度(mg/mg心肌干粉)＝[(样品吸光度/标准液吸光度)×标准液浓度×稀释倍数×7.46]÷称重的组织干粉重
注：7.46是从羟脯氨酸换算为胶原时的系数。
(5)心肌I、III型胶原比例的测定
心肌I、III胶原混合物的提取：准确称取一定量的心肌组织，剪碎，加2ml预冷的生理盐水，冰浴中匀浆。匀浆液中加入8ml含5mol/ml NaCl的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液(预冷)，混匀，放入冰浴中2-4小时。4℃，3000-4000r/min，离心15min，取沉淀，用足量冷去离子水洗涤，去盐，加入20倍体积的0.5mol/L的乙酸，吹打，混匀。加入足量的胃蛋白酶，使终浓度不低于2mol/L，混匀，于低温下(4℃)进行限制性降解48小时。整个操作过程须在4℃以下。加入0.2mol/L EDTA-Na2，终浓度为20mmol/L，终止降解。4℃，3000r/min，离心10min，取上清，加入研为极细末的NaCl，缓缓加入，边加边搅拌，至终浓度为2mol/L，4℃静置24小时。4，35000×g，离心45分钟，收集沉淀物，用冷去离子水洗涤，除去盐。所得物即为I、III型混合胶原。冷冻保存。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备及电泳：分离胶制备：含30％丙烯酰胺和0.8％N，N′-亚甲双丙烯酰胺的储备液6mol，1.5mol/L Tris-HCl缓冲液8ml，10％SDS0.18ml，去离子水3.8ml，TEMED 15μl，10％过硫酸铵0.16ml。浓缩胶制备，含30％丙烯酰胺和0.8％N，N′-亚甲双丙烯酰胺的储备液0.68ml，0.5mol/L Tris-HCl缓冲液1.8ml，10％SDS0.04ml，去离子水1.5ml，TEMED 5μl，10％过硫酸铵0.05ml。取约5-8mg I、III型混合胶原，加60～80μl去离子水，用含5％β-巯基乙醇的样品处理液60～80μl溶解样品，100℃煮沸5分钟，取上清点样每孔20μl，置电压100V，至分离胶前沿，调电压至200V，电泳至示踪染料到达距分离胶低部1～2cm时停止。取出凝胶，于染色液中染色2小时，同时振荡，染色毕，用脱色液脱色至凝胶本底透明。
将脱色后的凝胶置CS-9300PC型薄层色谱扫描仪，做光谱扫描，确定最大吸收波长为560纳米；然后在560纳米波长处对电泳条带进行扫描，计算I型和III型胶原峰面积的比值，即为I、III型胶原的比值。
3.结果
一、养血清脑颗粒对SHR左室重量指数的影响
养血清脑颗粒各剂量组均有降低左心室重量的作用，养血清脑颗粒组与模型组比较具有统计学意义(p＜0.01)。养血清脑颗粒组有降低左室重量指数作用，与模型组比较，养血清脑颗粒组有统计学意义(p＜0.01)，优于卡托普利组，见表3。
表3养血清脑颗粒对SHR左室指数的影响(
x±s)
剂量
组别 n LVW(g) BW(g) LVW/BW(mg/g)
(g/kg/d)
WKY组 10 0.600±0.09a 257.90±52.5 2.35±0.19b
模型组 10 0.907±0.08 229.40±49.9 4.08±0.68
牛黄降压丸组 0.168g 10 0.858±0.12 239.44±34.7 3.62±0.54
卡托普利组 7.785mg 10 0.767±0.17c 223.30±42.5 3.45±0.50d
养血清脑颗粒组 31.5 10 0.724±0.09e 217.00±28.3 3.35±0.38f
注：与模型组比较ap＜0.01，t＝7.72；bp＜0.01，t＝7.73；cp＜0.05，t＝2.39；dp＜0.05，t＝2.34；
ep＜0.01，t＝4.65；fp＜0.0 1，t＝2.92；gp＜0.05，t＝2.54。
二、养血清脑颗粒对SHR左室胶原的影响
各药物组均能降低左心室胶原含量和I、III型胶原比例。其中养血清脑颗粒组在降低左心室胶原含量方面有统计学意义，各组在改善I、III型胶原比例方面均有统计学意义(p＜0.01)。组织学观察发现，模型组大鼠血管周围有大面积的胶原增生，心肌中也有散在的大面积胶原分布，而且明显多于WKY组大鼠。养血清脑颗粒组血管周围也有胶原分布，但是明显少于模型组，心肌组织中也有散在呈点状或丝状的胶原分布，也比较少，见表4、5；附图3至图8所示。
表4养血清脑颗粒对SHR左室胶原含量的影响(
x±s)
剂量 胶原
组别 n
(g/kg/d) (μg/mg心肌干粉)
WKY组 10 28.19±5.29b
模型组 10 36.39±5.92
牛黄降压丸组 0.168g 9 32.63±4.82
卡托普利组 7.785mg 10 30.74±7.89
养血清脑颗粒组 31.5 10 30.11±7.32a
注：与模型组比较ap＜0.05，t＝2.10； bp＜0.01 t＝3.27。
表5养血清脑颗粒对SHR左室I、III胶原比值的影响(
x±s)
剂量
组别 n I、III胶原比值
(g/kg/d)
WKY组 10 2.44±0.85a
模型组 9 6.03±2.01
牛黄降压丸组 0.168g 9 2.81.±1.23b
卡托普利组 7.785mg 7 3.00±1.21c
养血清脑颗粒组 31.5 9 2.69±1.12d
注：与模型组比较ap＜0.01，t＝5.16；bp＜0.01，t＝4.09；cp＜0.01，t＝3.5 1；dp＜0.01，t＝4.36；ep＜0.01，t＝4.33；fp＜0.01，t＝4.07。
三、养血清脑颗粒对SHR左室组织形态学的影响
形态学观察表明，模型组大鼠心肌纤维变粗、间距缩小；或心肌纤维萎缩间距增大，部分心肌肿胀间隙不清，有些心肌纤维断裂排列紊乱，较为明显的大面积心肌水样变性，细胞内容物成颗粒状，断裂融合，甚至有坏死，血管壁增厚；养血清脑颗粒组心肌纤维的分布接近于正常，上述病变程度也较轻，有灶性的心肌细胞水样变性、断裂和坏死。如附图9至图16所示。透射电镜结果显示，模型组心肌细胞之间距离增大，毛细血管也可见狭窄或闭合，狭窄血管腔内可见血小板粘附，内皮细胞饮液泡增加，周围基底膜物质增厚；血管外可见大量的血性物质渗出，其间可见单核性吞噬细胞、成纤维细胞、红细胞及线粒体、溶酶体等细胞器，胶原纤维明显增加及心脏细胞分泌胶原现象，较大的血管可见增厚。养血清脑颗粒组毛细血管结构较好，无明显渗出，管腔开放，血管内皮细胞紧靠实质细胞，管腔明显开放，周围无血浆性物质渗出或仅有少量渗出，未见红细胞及线粒体、溶酶体等细胞器，少量胶原性物质沉着，细胞组织较好。图17至图22所示。
以上可以看出，养血清脑颗粒能改善长期高血压导致的LVH，降低心肌间质胶原蛋白含量，降低心肌I、III型胶原的比值，从而改善心肌胶原网的构架，预防或减轻了LVH和左室重构的进程。组织形态学的表现与上述结果一致。
第三部分：养血清脑颗粒对自发性高血压大鼠左心室基因表达谱的影响
本实验在明确养血清脑颗粒降压及减轻左室肥厚的基础上，进一步采用基因芯片技术研究养血清脑颗粒对SHR左心室相关基因表达的影响，探讨该药对减轻心室肥厚的机制。
1.实验动物：第一部分。
2.试剂：TRIzol、异丙醇、氯仿、75％乙醇(RNase-free)、Milli-Q水(RNase-free)无水乙醇、dNTPs、Cy5-dCTP和Cy3-dCTP、杂交试剂1、标记试剂I、杂交试剂2、标记试剂II、反转录酶、标记试剂III、反转录引物、洗片试剂1、反转录酶、缓冲液、洗片试剂2、DTT、洗片试剂3，大鼠4000点cDNA芯片(R40s)。上述试剂均由上海博星基因芯片有限责任公司提供
3.仪器与设备：电动玻璃匀浆机、电子天平、低温高速离心机、低温高速台式离心机、超净工作台、制冰机、电热恒温水槽、电泳槽、电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、台式离心机、核酸定量分析仪、移液枪、可调电炉、旋涡混合器、杂交箱、杂交舱、S-200纯化柱、真空浓缩仪、盖玻片、ScanArry4000芯片扫描仪
4.实验方法
(1)分组及给药：同第一部分，但此实验中仅观察SHR模型组和养血清脑高剂量组。选取灌服养血清脑颗粒8周SHR以及同期饲养的SHR各10只，称体重，处死大鼠，开胸迅速取出心脏，用DEPC处理过的生理盐水冲洗，洗净残血，在左心室心尖部位剪取约100mg心肌组织，迅速放入冻存管中，投入液氮中保存(组织剪取在冰上进行；整个过程所用器械、锡纸、烧杯等均用0.1％DEPC溶液处理，高温消毒或烤箱中烘烤消毒)。各组中每5只心尖组织等量混合作为1个样品，药物组2个样品，模型组2个样品，分别进行总RNA提取。
(2)总RNA提取
将超低温保存的样品称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，置于冰浴中，进行匀浆。将匀浆液转移至15mL离心管中，于4℃，12000g，离心10min。吸取上清液转入新的15mL离心管，在15-30℃放置5min。向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15-30℃放置3min。于4℃，12000g，离心15min。从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15mL离心管。向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15-30℃放置10min。于4℃，12000g，离心10min。弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇5mL，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。再加入75％乙醇10mL，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8000g离心10min。小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5min。加入RNase-ffee的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。
(3)探针标记与杂交
配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中30sec，晾干。将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6hr。
标记探针：Cy5-dCTP标记养血清脑颗粒药物组，Cy3-dCTP标记SHR模型组。(以下在冰浴中进行)于一已灭菌的1.5mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50μL，以下试剂均为RNase-free)：ddH2O，23μL；逆转录引物，5μL；总RNA，50～100μg
振荡混匀，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。分别加入以下试剂：逆转录酶缓冲液，10μL；DTT，5μL；dNTPs，4μL。而后在暗室中加入以下试剂：逆转录酶，2μL；Cy5-dCTP或Cy3-dCTP，3μL。
用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min。将Eppendorf管置于42℃水浴2h。依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4μL，65℃水浴10min后加入标记试剂II 4μL。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50μL左右。使用DNA纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DNA。将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。将柱置于一个1.5mL的Eppendorf管中，以3000rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5mL Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。加入标记试剂III 8μL，真空抽干。
杂交：在抽干的探针管中加6.5μL杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5μL杂交试剂II，混匀备用。将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。将探针置于95℃水浴中变性2min；玻片置于95℃水浴中变性30sec，玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上。将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16～18h)。
洗片：用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。准备两个染色缸，分别装有0.5％的洗片试剂1+2％的洗片试剂2、5％的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中。将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min。用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。
(4)检测与分析：基因芯片由General Scanning公司生产的ScanArray4000扫描仪进行两个波长的激光扫描，再用ImaGene3.0软件分析cy3、cy5两种荧光信号强度和比值。将所有数据项的cy3标记强度乘上Normalize系数，得出调整后的cy3*。算出所有基因调整后的Ratio值(cy5/cy3*)。筛选出Ratio大于2或小于0.5的数据，Ratio＞2说明此基因在养血清脑组中呈高表达，Ratio＜0.5说明此基因在养血清脑组中为低表达。
5.结果
1.差异表达的基因表达谱：扫描图谱的基因表达谱，X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值和cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号，愈靠近X轴或Y轴表明该点基因差异表达愈显著。数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间，基本属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外(该点很可能属于表达差异)。见附图23、24。
2.差异表达的基因数：两张芯片阳性基因重叠有20条，其中高表达的基因有4条，低表达的有16条。未知基因有14条，已知基因有6条见下表。
基因名称 Ratio1 Ratio2
Glycine methyltransferase(Gnmt) 0.353 0.132
LTBP-2 like protein(Ltbp2) 0.451 0.212
beta-galactoside-alpha 2，6-sialyltransferase 0.485 0.437
CD36 antigen 2.251 2.743
heart fatty acid binding protein(Fabp3) 2.002 3.610
Propionyl Coenzyme A carboxylase，beta polypeptide(Pccb) 2.010 2.174
养血清脑颗粒是通过上调和下调多种基因协同发挥作用。其改善和减轻LVH和MF的机制可能与LTBP-2基因表达下调有关。Gnmt是体内的一种生物酶，是调节体内甲基代谢的关键蛋白质，其表达下调对于保证以S-腺苷甲硫氨酸为主的体内甲基集团的供给具有重要作用。CD36、Fabp3、Pccb都是体内重要的活性物质，在调节心脏脂肪酸、胆固醇等物质的代谢，保护心肌细胞，防止动脉粥样硬化方面都有积极意义。
第四部分：养血清脑颗粒对SHR肾功能和形态的影响
本实验通过观察SHR大鼠肾功能与病理的改变，探讨养血清脑颗粒的肾脏保护作用。
1材料和方法
1.1实验动物：SHR大鼠和WKY大鼠，13周龄，体重210.89±39.34g，东京都威斯特大鼠(WKY)，雌雄各半，体重220.17±37.67g，购自上海高血压研究所，合格证号：医动字第02631号，饲养在普通动物房层流柜中，室温26±2℃，湿度恒湿(55±5％)，按雌雄分笼，每笼5只，自由饮水，标准饲料喂养，环境安静。
1.2主要试剂与仪器：尿素氮(BUN)(批号020701)、血清肌酐(Scr)(批号320041)、尿酸(UA)(批号380031)试剂盒，购自中北北控生物科技股份有限公司，仪器：200型95版半自动生化分析仪(产自荷兰威图)
1.3药物：养血清脑颗粒由天津天士力制药股份有限公司提供，批号：20020407。卡托普利：由天津市华新制药厂出品，批号：20010901。牛黄降压丸：为天津达仁堂制药厂产品，批号：C484035。
1.4分组及给药：正式实验前每天测血压训练1次，连续7d。待大鼠适应环境、血压稳定后，将SHR随机分为6组，即养血清脑颗粒高剂量组31.56g/kg/d；牛黄降压九组0.168g/kg/d，卡托普利7.78mg/kg/d，模型组和WKY对照组给予相同体积的蒸馏水，给药途径为灌胃，给药时间为每天上午定时给药，自由摄食和饮水，共喂养8周。
1.5肾功能指标测定：灌药八周后，3％的戊巴比妥钠麻醉，颈动脉插管取血约5ml，低温离心3500r，15分钟。取血清，按照Scr、BUN、UA试剂盒说明书严格操作，在200型半自动生化仪检测以上指标。
1.6标本采集：取大鼠一侧肾脏，去掉包膜，取上极部分放人10％中性福尔马林液浸泡固定，常规脱水，石蜡包埋。另取1mm3肾皮质，2.5％戊二醛固定2h，用于制作电镜标本。石蜡切片厚约4μm，VG和HE染色。电镜常规包埋，超薄切片定位，超薄切片经铅一铀双染色，JEM-1200EX型透射电镜观察并拍照。
1.7统计学处理：所有指标均用均数±标准差表示，采用SPSS10.0作组间T检验。
2.实验结果
2.1养血清脑颗粒对SHR肾功能的影响
22周SHR大鼠血清中的Cr、Ua含量均显著高于正常对照组，P＜0.01。各给药组均明显降低，以养血清脑颗粒组最为明显，和模型组相比，Scr有统计学差异，t＝2.690，P＜0.001；Ua在各给药组均有下降趋势，养血清脑颗粒组有统计学意义，高剂量t＝2.580，P＜0.01，低剂量t＝2.452，P＜0.05；BUN牛黄降压丸组有统计学差异，P＜0.05。见表3和图3、4、5。
第五部分.养血清脑颗粒对自发性高血压大鼠(SHR)肾素-血管紧张素-醛固酮影响
本实验的目的在于研究养血清脑颗粒治疗自发性高血压大鼠(SHR)来探讨其对循环和肾组织局部肾素一血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)活性的影响。
1材料和方法
1.1实验动物：同前。
1.2主要试剂与仪器：血管紧张素II(Ang II)、醛固酮(Ald)试剂盒，购自天津洁瑞公司。仪器SN-695B型放免γ测量仪。Ang II批内变异分别＜5％，批间变异均＜10％；Ald批内变异分别＜10％，批间变异均＜15％。
1.3药物：同前
1.4分组及给药：同前
1.5血浆中紧张素I、II、醛固酮测定：实验8周后停药，于次日称体重(BW)、用戊巴比妥钠3％腹腔麻醉，颈动脉插管取血5ml，分别放入预冷的含抑肽酶、EDTA-Na2抗凝管内，摇匀，立即放回冰水浴中冷却，然后4℃，1000转/分，离心10分钟，取血浆置-20℃保存，放免方法测定。
1.6肾脏组织中的紧张素II、醛固酮的测定：8周末麻醉处死后，迅速摘取实验动物肾脏，液氮冷冻后储存于-80℃冰箱。取400mg肾脏组织剪碎后加入5mL0.5mol/L乙酸溶液，再将试管放入100℃水浴中煮沸15min，冷却后匀浆。然后在4°低温离心20分钟(1400r/min)。取上清，-20℃存放，放免方法测定。
1.7统计学处理：所有指标均用均数±标准差表示，采用SPSS10.0作组间t检验。
2.实验结果，
2.1养血清脑颗粒对SHR血浆血管紧张素-醛固酮系统的影响
各给药组血浆中血管紧张素I各组间没有明显差异。ALD养血清脑颗粒组、卡托普利组及牛黄降压丸组均低于模型组，有统计学差异。养血清脑颗粒组t＝4.101，P＜0.001。见表6。
表6各组血浆中血管紧张素和醛固酮测定结果(
x±s)
组别 N Ang I AngII(pg/ml) Ald(ng/ml)
WKY组 10 8.9±1.3 332.8±88.2 0.24±0.04▲
模型组 10 9.0±1.0 349.7±93.6 0.31±0.07
卡托普利组 10 9.1±0.5 216.8±137.1 0.25±0.07▲
牛黄降压组 10 9.3±0.6 294.9±131.8 0.25±0.07▲
养血清脑颗粒组 10 9.3±0.6 287.8±229.3 0.21±0.02▲
与模型组比较▲P＜0.05▲▲P＜0.01▲▲▲P＜0.001
2.2养血清脑颗粒对SHR肾脏组织中紧张素-醛固酮系统的影响
养血清脑颗粒组Ang II含量低于模型组，有统计学差异，t＝7.070，P＜0.001。卡托普利组和牛黄降压丸组都低于模型组，也有统计学差异，P＜0.05；养血清脑颗粒使SHR肾组织中的Ald含量下降，t＝2.956，P＜0.01。卡托普利也有显著性差异，t＝2.706，P＜0.05。见表7。
表7各给药组肾组织中血管紧张素II、醛固酮含量(
x±s)
组别 N Ang II(pg/mg) Ald(pg/mg)
WKY组 10 6.91±3.38▲▲▲ 15.00±4.50▲
模型组 10 11.9±1.96 20.25±4.10
卡托普利组 10 9.35±3.25▲ 15.00±4.50▲
牛黄降压丸组 10 7.59±1.53▲ 16.50±6.38
养血清脑颗粒组 10 6.25±1.31▲▲▲ 14.63±5.63▲
与模型组比较▲P＜0.05▲▲P＜0.01▲▲▲P＜0.001
SHR治疗养血清脑颗粒8周后，可使循环血、肾组织中的Ald含量明显下降，使肾组织Ang II含量也下降，尤以中高剂量为优。这说明养血清脑颗粒是通过减少肾内Ald、Ang II生成发挥降压作用的，阻止肾脏病理损害，产生肾保护作用。见表8。
表3各组肾功能指标结果(
x±s)
组别 N Scr(μmol/L) UA(μmol/L) BUN(mg/dl)
WKY组 10 48.3±6.8△△ 127.5±34.7△△△ 26.2±5.8
模型对照组 10 55.2±7.2 194.4±56.2 26.1±5.1
卡托普利组 10 50.3±9.9 148.4±23.8△ 25.5±4.3
牛黄降压丸组 10 49.5±4.9 149.4±41.1△ 20.4±3.3△
养血清脑颗粒组 10 46.2±7.9△△△ 147.4±20.1△△ 22.8±3.8
与模型对照组比较，△P＜0.05△△P＜0.01
2.2肾组织病理表现
VG和HE染色观察结果：模型组可见肾小球轻度肿大，肾小动脉管壁增厚，动脉周围间质细胞增生。肾皮质内有炎性渗出和炎性细胞浸润。动脉周围可见到胶原纤维增多，动脉的肌层肥厚、内膜纤维组织增生，管腔狭小甚至闭锁，个别肾小球轻度萎缩。局灶性间质细胞增生，以肾小球周围为多。肾小球表现为不同程度的肥大，肾小管相应肥大，可见蛋白管型；间质可见淋巴细胞、单核细胞呈灶性浸润及纤维化。养血清脑颗粒组和模型组比较差异明显，除部分间质细胞轻度增生外，大部分可见肾小球基本恢复正常，周围未见明显间质细胞增生，炎性细胞和炎性渗出以及胶原增生不明显，未见肾小球增大和萎缩。(见附图25至28)
电镜观察结果：模型组可见肾小管之间毛细血管腔狭窄或完全闭合，内皮细胞饮液泡明显增加，少见正常毛细血管结构；血管外有大量的血浆性物质渗出，其中可见RBC、线粒体、溶酶体和胶原纤维沉着。部分肾小管上皮细胞损伤，细胞器溢出。养血清脑颗粒组肾组织里除少数毛细血管狭窄、闭合外，大部分毛细血管结构较好，无明显渗出，管腔开放，血管内皮细胞紧靠，肾实质细胞管腔明显开放，周围无血浆性物质渗出或仅有少量渗出，未见线粒体、溶酶体、RBC和胶原性物质沉着，未见组织破坏。(见附图29、30)
通过本实验可知，养血清脑颗粒治疗8周后，治疗组SHR的BUN、Scr、Ua明显减少；组织切片未见肾小球硬化，肾小动脉管壁、管腔接近正常。说明养血清脑颗粒在降低SHR血压的同时，具有良好的减少组织增生作用，能延缓肾功能的损害，从而起到保护肾脏的作用。
第六部分：养血清脑颗粒对自发性高血压大鼠肾脏基因表达谱的影响
本实验在明确养血清脑颗粒降压及减轻高血压肾损害的基础上，进一步采用基因芯片技术研究养血清脑颗粒对SHR肾脏相关基因表达的影响，探讨该药对降压和减轻高血压肾损害的机制。
1.材料
1.1实验动物：同前。
1.2试剂：TRIzol、异丙醇、氯仿、75％乙醇(RNase-free)、Milli-Q水(RNase-free)无水乙醇、dNTPs、Cy5-dCTP和Cy3-dCTP、杂交试剂1、标记试剂I、杂交试剂2、标记试剂II、反转录酶、标记试剂III、反转录引物、洗片试剂1、反转录酶、缓冲液、洗片试剂2、DTT、洗片试剂3，大鼠4000点cDNA芯片(R40s)。上述试剂均由上海博星基因芯片有限责任公司提供
1.3.仪器与设备：电动玻璃匀浆机、电子天平、低温高速离心机、低温高速台式离心机、超净工作台、制冰机、电热恒温水槽、电泳槽、电泳仪、微波炉、凝胶成像仪、台式离心机、核酸定量分析仪、移液枪、可调电炉、旋涡混合器、杂交箱、杂交舱、S-200纯化柱、真空浓缩仪、盖玻片、ScanArry4000芯片扫描仪
2.方法
2.1分组及给药：同前，观察SHR模型组和养血清脑组。
选取灌服养血清脑颗粒8周SHR以及同期饲养的SHR各10只，称体重，处死大鼠，开腹迅速取出肾脏，用DEPC处理过的生理盐水冲洗，洗净残血，在肾脏中间部位剪取约100mg肾组织，迅速放入冻存管中，投入液氮中保存(组织剪取在冰上进行；整个过程所用器械、锡纸、烧杯等均用0.1％DEPC溶液处理，高温消毒或烤箱中烘烤消毒)。各组中每5只肾脏组织等量混合作为1个样品，药物组2个样品，模型组2个样品，分别进行总RNA提取。
2.2总RNA提取
将超低温保存的样品称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，置于冰浴中，进行匀浆。将匀浆液转移至15mL离心管中，于4℃，12000g，离心10min。吸取上清液转入新的15mL离心管，在15-30℃放置5min。向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在15-30℃放置3min。于4℃，12000g，离心15min。从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15mL离心管。向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在15-30℃放置10min。于4℃，12000g，离心10min。弃去上清，缓慢地沿管壁加入75％乙醇5mL，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。再加入75％乙醇10mL，在涡旋器上短暂涡旋；于4℃，8000g离心10min。小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5min。加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80℃保存。
2.3探针标记与杂交
配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。将配制好的预杂交液放入95℃水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95℃水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中30sec，晾干。将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42℃预杂交5～6hr。
标记探针：Cy5-dCTP标记养血清脑颗粒药物组，Cy3-dCTP标记SHR模型组。(以下在冰浴中进行)于一已灭菌的1.5mL Eppendorf管内依次加入以下试剂(反应终体积为50μL，以下试剂均为RNase-free)：ddH2O，23μL；逆转录引物，5μL；总RNA，50～100μg
振荡混匀，置于70℃水浴10min。取出后，迅速置于冰上。分别加入以下试剂：逆转录酶缓冲液，10μL；DTT，5μL；dNTPs，4μL。而后在暗室中加入以下试剂：逆转录酶，2μL；Cy5-dCTP或Cy3-dCTP，3μL。
用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min。将Eppendorf管置于42℃水浴2h。依次在Eppendorf管中加入标记试剂I 4μL，65℃水浴10min后加入标记试剂II 4μL。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50μL左右。使用DNA纯化柱(或乙醇沉淀)纯化DNA。将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。将柱置于一个1.5mL的Eppendorf管中，以3000rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5mL Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。加入标记试剂III 8μL，真空抽干。
杂交：在抽干的探针管中加6.5μL杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再加入6.5μL杂交试剂II，混匀备用。将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。将探针置于95℃水浴中变性2min；玻片置于95℃水浴中变性30sec，玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上。将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42℃杂交箱内杂交过夜(16～18h)。
洗片：用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。准备两个染色缸，分别装有0.5％的洗片试剂1+2％的洗片试剂2、5％的洗片试剂3，放入60℃水浴锅中。将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min。用0.5％的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。
3.检测与分析：基因芯片由General Scanning公司生产的ScanArray4000扫描仪进行两个波长的激光扫描，再用ImaGene3.0软件分析cy3、cy5两种荧光信号强度和比值。将所有数据项的cy3标记强度乘上Normalize系数，得出调整后的cy3*。算出所有基因调整后的Ratio值(cy5/cy3*)。筛选出Ratio大于2或小于0.5的数据，Ratio＞2说明此基因在养血清脑组中呈高表达，Ratio＜0.5说明此基因在养血清脑组中为低表达。
4.结果
肾组织差异表达基因比较：选择自发性高血压大鼠SHR模型组作SHR中药组的对照组，两张芯片中第一张两种荧光信号的比值小于0.5或大于2.0的基因有389个，其中下表达的基因有273个，209个能在Genbank上登陆；上表达的基因135个，116个基因能在Genbank上登陆；第二张两种荧光信号的比值小于0.5或大于2.0的基因有170个，其中下表达的基因有120个，87个能在Genbank上登陆；上表达的基因50个，42个基因能在Genbank上登陆。肾脏组织样本(对照组/实验组)双色荧光标记叠加图说明：对于某一点的两种叠加荧光信号，如果cy3信号较强，该点多显绿色(下调趋势)；如果cy5信号较强，该点多显红色(上调趋势)；如果强度相似，即显黄色。
肾脏组织样本(对照组/实验组)杂交信号强度散点图中，X轴、Y轴分别以cy3荧光强度值(＝前景值-背景值)和cy5荧光强度值为坐标，每一个数据点代表芯片上一个基因点的杂交信号；数据点若为红色，则代表Y值与X值的比值在0.5至2.0之间，基本属非差异表达；数据点若为黄色，则代表Y值与X值的比值在0.5到2.0范围之外(该点很可能属于表达差异)。由此可见，养血清脑颗粒是通过上调和下调多种基因协同发挥作用，改变了SHR大鼠肾脏基因表达谱，这些改变的基因可能与改善和减轻高血压和肾损害机制有关。
附图说明
图1、单次给药对SHR大鼠收缩压的影响，其中A为模型组，B为牛黄降压组，C为卡托普利对照组，D为养血清脑颗粒组；
图2、养血清脑颗粒对自发性高血压大鼠收缩压的影响，其中A为模型组，B为牛黄降压组，C为卡托普利对照组，D为养血清脑颗粒组；
图3、WKY对照组(血管周围)VG×100；
图4、模型对照组(血管周围)VG×100；
图5、养血清脑颗粒组(血管周围)VG×100
图6、WKY对照组(心肌组织)VG×100
图7、模型对照组(心肌组织)VG×100
图8、养血清脑颗粒组(心肌组织)VG×100
图9、WKY对照组心肌(纵切面)HE×200
图10、WKY对照组心肌(横切面)HE×400
图11、模型组心肌(纵切面)HE×200
图12、模型组心肌(纵切面)HE×200
图13、模型组心肌(横切面)HE×200
图14、养血清脑颗粒组心肌(纵切面)HE×200
图15、养血清脑颗粒组心肌(横切面)HE×200
图16、养血清脑颗粒组心肌(横切面)HE×200
图17、WKY对照组(毛细血管)×7500
图18、WKY对照组(毛细血管)×13500
图19、模型组(毛细血管)×6000
图20、模型组(毛细血管)×13500
图21、养血清脑颗粒组(毛细血管)×13500
图22、养血清脑颗粒组(毛细血管)×13500
图23、双色荧光标记叠加图
图24、杂交信号强度散点图
图25、模型组肾小球与肾小管HE×400
图26、模型组肾小管内蛋白HE×400
图27、养血清脑颗粒组肾小管HE×400
图28、养血清脑颗粒组肾小球HE×400
图29、模型组肾血管电镜像×3750
图30、养血清脑颗粒组肾血管电镜像×3750
图31、双色荧光标记叠加图
图32、杂交信号强度散点图
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，下述该实施例仅用于说明本发明而对本发明没有限制。
实施例1
(1)取当归80g，川芎80g，白芍80g，熟地80g，勾藤120g，鸡血藤120g，夏枯草120g，决明子120g，珍珠母120g，元胡70g，细辛10g；
(2)将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓缩，加2倍量的乙醇，静置24小时沉淀，取上清液浓缩成浸膏，相对密度为1.3，出膏率为10％，取清膏、蔗糖和糊精按1∶3∶1的比例制成片剂200片。
实施例2
(1)取当归67.5g，川芎67.5g，白芍54g，熟地54g，勾藤135g，鸡血藤135g，夏枯草135g，决明子135g，珍珠母135g，元胡67.5g，细辛14.5g；
(2)将上述药材加水提取3次，每次1小时，合并提取液，适当浓缩，加2倍量的乙醇，静置24小时沉淀，取上清液浓缩成浸膏，相对密度为1.3，出膏率为10％，取清膏、蔗糖和糊精按1∶3∶1的比例制成颗粒剂125袋。
Claims (7)
1.一种药物组合物在制备治疗高血压病药物中的应用，其中各药味的重量配比如下：当归4～9％，川芎4～9％，白芍2～8％，熟地2～8％，勾藤10～15％，鸡血藤10～15％，夏枯草10～15％，决明子10～15％，珍珠母10～15％，元胡4～9％，细辛0.5～2％。
2.根据权利要求1所述的一种物组合物在制备治疗高血压病药物中的应用，其中各药味的重量配比如下：
当归6.75％，川芎6.75％，白芍5.4％，熟地5.4％，勾藤13.5％，鸡血藤13.5％，夏枯草13.5％，决明子13.5％，珍珠母13.5％，元胡6.75％，细辛1.34％。
3.根据权利要求1或2所述的一种药物组合物在制备治疗高血压病药物中的应用，其特征在于所述高血压病为原发性高血压。
4.一种药物组合物在制备降低收缩压药物中的应用，其中各药味的重量配比如下：
当归4～9％，川芎4～9％，白芍2～8％，熟地2～8％，勾藤10～15％，鸡血藤10～15％，夏枯草10～15％，决明子10～15％，珍珠母10～15％，元胡4～9％，细辛0.5～2％。
5.一种药物组合物在制备逆转高血压所致的左心室肥厚药物中的应用，其中各药味的重量配比如下：
当归4～9％，川芎4～9％，白芍2～8％，熟地2～8％，勾藤10～15％，鸡血藤10～15％，夏枯草10～15％，决明子10～15％，珍珠母10～15％，元胡4～9％，细辛0.5～2％。
6.一种药物组合物在制备逆转早期心肌纤维化药物中的应用，其中各药味的重量配比如下：
当归4～9％，川芎4～9％，白芍2～8％，熟地2～8％，勾藤10～15％，鸡血藤10～15％，夏枯草10～15％，决明子10～15％，珍珠母10～15％，元胡4～9％，细辛0.5～2％。
7.一种药物组合物在制备延缓高血压造成的肾功能损害药物中的应用，其中各药味的重量配比如下：
当归4～9％，川芎4～9％，白芍2～8％，熟地2～8％，勾藤10～15％，鸡血藤10～15％，夏枯草10～15％，决明子10～15％，珍珠母10～15％，元胡4～9％，细辛0.5～2％。
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