CN1514016A - 一种基因型测定的方法 - Google Patents

Abstract

一种基因型测定的方法，其特征是多态性引物和基因型引物的5’端部分分别具有专一的外源序列，多态性引物和基因型引物的3’端部分分别具有与靶序列相互补的序列，外源序列和互补序列之间有非自然性结构。本发明的优点是可用通用的基因芯片，无需在PCR后进行标记等反应，利用通用的基因型探针可省时、省料、减低消耗、降低成本，并能降低检测中出现的假阳性提高检测质量。

Description

一种基因型测定的方法

本发明涉及一种生物技术，更具体地说涉及一种基因型测定的方法。

所有生物物种的遗传物质是核酸，包括核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA)，决定核酸功能特征的基本组成是四种碱基，在DNA中它们分别由A、C、G、T代表，在RNA中它们分别由A、C、G、U代表。这些在自然界可以找到并存在于核酸中的核苷酸或碱基称为自然核苷酸或自然碱基，此外通过化学合成方法可把非自然核苷酸或非自然碱基或其它非正常核酸组分加入到核酸链中，因此核酸的非自然性结构定义为：不存在于自然界的结构(只能人工合成)或除正常的四种核苷酸(或四种碱基)外的其它结构(如U在DNA中也属非自然结构)。碱基在核酸中以串连方式组成链状结构，RNA一般为单链结构，DNA一般为双链结构，在双链结构中碱基A与另一链的T(U)通过氢键相配，同理G与另一链的C相配，自然界(生物中)的整个双链DNA都是完全相配的，当有不完全相配的情况出现时双链结构的稳定性就会降低，两条在序列上相配的核酸链称为互补链。核酸序列在进化过程中和外界条件的影响下会发生变化，最常见的变化为一碱基被另一碱基所取代，在同一物种中，同一核酸序列的同一位置(单碱基位置)在不同的个体之间如有不同的碱基成分，则这一种现象称为单碱基(核苷酸)多态性(SNP)。在特定个体中，多态性位点的一种碱基组成为这一位点的一种基因型(基因为核酸的功能性区域)，一个单倍体生物个体在一个多态点上只能有一个基因型，在双倍体的生物个体中如二同源基因具有相同的基因型，这一个体为纯合子，如有不同的基因型，则这一个体为杂合子。基因型测定对遗传诊断、物种鉴定、药物筛选等具有重大意义。DNA可以在聚合酶等的作用下被复制，即由模板链复制出互补链，DNA的复制需要有一引物，引物一般为一含有几个或几十个碱基的核酸链，核酸链具有方向性分别用5’端和3’端表示，接近5’端的序列称为5’端部分，接近3’端的称为3’端部分，核酸复制前引物与模板在3’端有特异性地根据碱基配对原理结合成双链结构(这一过程称为分子杂交)，此后聚合酶可从引物的3’端开始沿5’→3’方向合成与模板相互补的新链，新形成的双链可在高温下(＞90℃)分离成独立的单链，当温度下降时余下的引物分子可再与相应的模板核酸分子杂交，并可在聚合酶的作用下复制出新的核酸链，反复如上过程，一个核酸片段可被扩增出千万个同样的分子片段，如上过程即为聚合酶链反应过程(PCR)。一核酸样品需扩增的部分为靶片段，进行PCR反应一般在靶片段两端要有相应的引物，对一多态位点附近的序列专一的引物为多态性引物，对一多态性位点的特定基因型有专一性的为基因型引物，多态性引物可和基因型引物结合使用对靶片段进行PCR扩增，并测定基因型。用化学的方法可以人工合成核酸片段作为引物，引物的碱基序列与靶片段序列相互补，另外引物序列中可具有与核酸样品中的序列非互补的序列，这种与样品不具互补性的序列称为外源序列，外源序列可作为引物的部分结构。基因芯片是一种把不同核酸分子分别排列于特定位置，并用于核酸分子杂交的装置，固定于基因芯片上的核酸分子为探针分子，与探针分子进行特异性杂交的为靶分子，探针分子可通过在芯片的位置或所带的标记进行靶分子识别，标记可有多种形式，如放射性标记、荧光标记、纳米颗粒标记、酶标记、色素标记等，用以区别不同基因型的具标记的核酸探针分子为基因型探针。常用的基因型测定方法有核酸测序法、基因芯片杂交法等，核酸测序法速度慢成本高不适合大规模的基因型测定；基因芯片杂交法的使用效果决定于样品的制备过程，一般的样品制备过程包括多步酶反应、PCR反应、标记反应等，使用多步酶反应会使成本增高，基因型测定时间增长等。

本发明的目的是提供一种基因型测定的方法，它能克服现有技术的上述不足。

一种基因型测定的方法，包括使用多态性引物和基因型引物对含有多态性位点的核酸靶片段进行扩增，使扩增产物与基因芯片的探针分子以及和通用的基因型探针进行杂交，根据基因型探针在基因芯片上的信号判断多态性位点的基因型，其特征是多态性引物和基因型引物的5’端部分分别具有专一的外源序列，多态性引物和基因型引物的3’端部分分别具有与靶序列相互补的序列，外源序列和互补序列之间有非自然性结构。

本发明的优点是可用通用的基因芯片，无需在PCR后进行标记等反应，利用通用的基因型探针可省时、省料、减低消耗降低成本，并能降低检测中出现的假阳性提高检测质量。本方法可用于测定动物、植物、微生物及病毒的基因型或其核酸量的多少，应用本方法也可以制造有商业价值的试剂盒或从事分子诊断服务。

下面通过实施例说明本发明。

制作诊断遗传病的基因芯片，所诊断的遗传病可以是高血压、糖尿病等。基因芯片上的分子探针是与多态性引物的外源序列相互补的核酸分子，其长度由10-50个核苷酸组成，每一种探针分别用已知的方法固定于芯片的表面，配制一个试剂盒，试剂盒包括用于对多态性靶片段进行扩增的引物，扩增一多态性靶片段的引物包括专一的多态性引物和二个专一的基因型引物，试剂盒还包括核酸提纯的试剂PCR反应的酶、缓冲液等，此外试剂盒包括二个或多个分别有不同标记的基因型探针，标记为荧光色素或其它的可用化学或物理方法识别的纳米范围的结构，试剂盒还包括用于分子杂交的缓冲液。在进行基因型测定时采用如下操作程序：①从一病人的血液中提取DNA，一般一滴血的样品可提取数十或数百纳克的DNA，提取的DNA溶于水或适当的缓冲液；②用PCR反应试剂对提取的DNA核酸进行PCR扩增，用一多态性引物和二个专一的基因型引物对一多态性靶片段进行扩增，多组引物可以在同一试管中使用(复合PCR反应)，复合的程度可为二组或二组以上的引物，扩增后的产物具有单链的多态性外源序列和单链的基因型外源序列，反应的体积一般在10-100微升；③多个PCR的反应产物可合并，并进行适当的纯化、浓缩等处理(必要时可除去未反应的引物)，然后与杂交用的缓冲液结合，最终体积在0.1-1毫升范围内。杂交液中包含具不同标记的基因型探针；④用已知的方法和仪器进行芯片杂交和清洗，并用激光扫描仪或其它相应的仪器采集芯片上的信号；⑤根据信号在芯片上的位置、特征和信号的强度的比例，可测定多态性位点的基因型。医院大夫可根据病人的基因型做出诊断并进行适当的治疗。

根据此方法可制成：①试剂盒，试剂盒包括相关的反应引物和生物化学试剂；②基因芯片；③相关的电脑软件(使用说明和数据分析方法)。

此方法用于与核酸相关的测定，主要包括：①人类遗传病的诊断；②人类或动植物的基因型测定；③生物物种鉴定。还可用于药物筛选(不同人群对药物的反应；公安刑侦(查找罪犯)；生物物种改良等领域。

Claims (1)

1. 一种基因型测定的方法，包括使用多态性引物和基因型引物对含有多态性位点的核酸靶片段进行扩增，使扩增产物与基因芯片的探针分子以及和通用的基因型探针进行杂交，根据基因型探针在基因芯片上的信号判断多态性位点的基因型，其特征是多态性引物和基因型引物的5’端部分分别具有专一的外源序列，多态性引物和基因型引物的3’端部分分别具有与靶序列相互补的序列，外源序列和互补序列之间有非自然性结构。