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CN102459630B - 样本分析方法和用于该方法的检测试剂盒 - Google Patents

样本分析方法和用于该方法的检测试剂盒 Download PDF

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CN102459630B CN200980160163.3A CN200980160163A CN102459630B CN 102459630 B CN102459630 B CN 102459630B CN 200980160163 A CN200980160163 A CN 200980160163A CN 102459630 B CN102459630 B CN 102459630B
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Abstract

本发明提供如下分析多个样本的方法：对多个样本，使用包含具有对每个样本不同的序列的标签序列的第1引物和与该第1引物成对使用的第2引物，在对每个样本独立的反应体系中进行扩增，将多个所述反应体系获得的导入了标签序列的扩增产物混合，使混合后的扩增产物与固定化于基体的核酸探针反应，检测生成的杂交量。

Description

样本分析方法和用于该方法的检测试剂盒
技术领域
本发明涉及核酸的分析方法。 
背景技术
DNA芯片是在各数cm的载玻片和/或硅基板上固定化10～105种DNA核酸链作为探针而得的器件。在使用DNA芯片分析样本时，首先，将所含的核酸用荧光色素、放射性同位素等标记，接着，使其与芯片上的探针反应。如果样本中的核酸含有与芯片上的探针互补的核酸，则发生杂交。被固定于芯片上的探针的序列和固定位置是明确的。因此，通过特定得到来源于标记的信号的芯片上的位置，可以确定样本中所含的核酸序列(非专利文献1)。DNA芯片是对于1个样品一次分析多个基因非常有用的器件(检测器具)。通常对于1个样品使用1个芯片。在观察2个样品的表达量之差时，对于2个样品使用1个芯片。 
另一方面，例如，在传染病领域等，有时所研究的基因数为少数，但样本数多。然而，现有技术中需要根据样本数而使用多个芯片，因此包括芯片、劳力、时间的检测成本提高。 
非专利文献1：Pease et al.Proc Natl Acac Sci U S A.1994，91，5022-5026 
发明内容
发明要解决的课题 
鉴于上述情况，本发明的目的是提供降低每1个样本的检测成本、迅速且简便地分析多个样本的方法。 
用于解决课题的方法 
为了实现上述目标，本发明提供多个样本的分析方法，该分析方法具备下述工序(a)～(e)： 
工序(a)对每个样本准备包含第1引物和第2引物的引物组，所述第1引物包含具有对每个所述样本不同的序列的标签序列，所述第2引物与所述第1引物成对使用，其中，所述标签序列被设计成在所述第1引物与每个所述样本的模板核酸中的模板序列杂交时环出(loop out)那样； 
工序(b)在对每个所述样本独立的反应体系中，使用与每个所述样本对应的所述引物组，扩增每个所述样本的模板核酸，得到导入了所述标签序列的扩增产物； 
工序(c)将由每个所述样本得到的所述扩增产物混合在一起； 
工序(d)使具有检测包含所述标签序列的目标序列的序列且被固定化于基体上的核酸探针与在工序(c)中被混合的所述扩增产物反应； 
工序(e)通过检测在工序(d)中生成的杂交量，从而对于各样本检测所述目标核酸的有无和/或量。 
发明的效果 
通过本发明的方法，可以用1个芯片检查多个样本，因此可提供降低每1个样本的检查成本、迅速且简便地分析多个样本的方法。 
附图说明
图1是显示标签序列导入引物和核酸探针的图。 
图2是显示扩增工序的方案图。 
图3是显示检测工序的图。 
图4是显示扩增工序的方案图。 
图5是显示引物的图。 
图6是显示LAMP扩增的中间产物的图。 
图7是显示扩增工序的方案图。 
图8是显示检测工序的图。 
图9是显示引物的图。 
图10是显示扩增工序的方案图。 
图11是DNA芯片的平面图。 
图12是DNA芯片的平面图。 
图13是显示通过限制性酶处理来切割扩增产物的结果的图。 
图14A是显示多个样本的检测结果的图。 
图14B是显示多个样本的检测结果的图。 
图14C是显示多个样本的检测结果的图。 
具体实施方式
[定义] 
本说明书中使用的“核酸”的用语概括地表示DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、寡脱氧核苷磷酸甲酯等可以将其部分结构用碱基序列表示的物质。 
所谓“样本”，是应该进行本发明的分析方法的对象，只要是可能包含核酸的样品即可。样本优选处于不妨碍扩增反应和/或杂交反应的状态。例如，为了使用从生物体等获得的材料作为本发明的样本，可以通过其自身公知的任一方法来进行前处理。例如，样本也可以是液体，这时也可以称作“被检液”。因此，“被检液”可以解释为可能存在核酸或模板核酸的溶液。 
“多样本(multiple samples)”和“多个样本(plural samples)”的词语表示2个或2个以上的样本，可以以可交换的方式使用。 
样本所含的核酸称为“样本核酸”。在样本核酸中，将要通过本发明的引物进行扩增的序列称为“模板序列”。将包含模板序列的核酸称为“模板核酸”或“模板”。将模板核酸所含的一部分序列称为“部分核酸序列”。部分核酸序列是要分析的序列或碱基，本发明的引物被设计成扩增包含部分核酸序列的区域那样。部分核酸序列可以等于模板序列，也可以包含在模板序列中。 
所谓“目标核酸”，是指将模板核酸或模板序列使用本发明的正向引物和反向引物扩增而得的扩增产物。目标核酸的一部分中包含目标序列。 
“目标序列”由标签序列和模板序列的一部分序列组成。该目标序列用于使用核酸探针来检测目标核酸。 
“核酸探针”是包含与目标序列互补的序列的核酸。核酸探针被固定化于基体等固相上使用，与包含来源于模板序列的区域的扩增产物形成杂种。 
所谓“来源于模板序列的区域”，是指在被引物扩增的区域中，在引物结合的区域以外的区域反映模板的序列的区域。在检测基因多态性或基因突变时，设计成这些部位被收纳于该区域内。 
“DNA芯片”是利用具有与要检测的核酸互补的序列的核酸探针与检测对象核酸之间的杂交反应来分析核酸的装置。DNA芯片的用语与一般使用的“核酸芯片”、“微阵列”和“DNA阵列”等用语含义相同，可以彼此互换使用。 
所谓“分析多样本”，是指同时分析多个样本。所谓“分析样本中的多个核酸序列”是指同时分析1个样本中所含的多个部分核酸序列。同时分析的多个部分核酸序列可以包含在1条的模板核酸中，也可以包含在样本所含的不同种类的样本核酸中。 
另外，分析的项目例如，可以是来源于病毒和/或细菌等的基因等特定核酸的检测、基因表达量的测定、关于多态性的基因型的鉴定和/或突变的有无的检测等。但不限于此。 
[实施方式] 
以下，对于本发明的实施方式进行说明。 
图1是显示标签序列导入引物和核酸探针的图。 
<引物> 
如图1的标签导入F引物所例示的那样，在引物中导入与模板核酸的引物结合部位结合的序列、和用于分析多样本的标签序列。 
标签序列根据样本不同而使用各自不同的序列。例如，在准备5个碱基的标签序列、且该标签序列由A、T、C、G的4种碱基构成的情况下，有45即1024种的标签序列作为候选。然而，在使用1个碱基不同的标签序列的情况下错配杂交的危险性高，因此优选准备2个碱基以上序列不同的标签序列。关于所准备的标签序列的数，只要准备构成一次要分析的样本群的样本的数即可。由此，可以识别构成样本群的全部样本。 
标签序列被设计成在包含该标签序列的引物与模板核酸结合时，标签序列部分不与模板核酸结合而环出(loop out)那样。标签序列长度只要是在能够环出(loop out)、且包含该标签序列的引物能够扩增模板核酸的范围内即可。可以为20个碱基以下，优选为10个碱基以下，但不限于此。例如，可以为1～20个碱基、2～20个碱基、1～10个碱基、2～10个碱基。 
引物的长度可以为13～40个碱基，例如为15～30个碱基。 
关于所述标签序列在引物上的插入位置，只要是距离引物的3’末端1个碱基以上的位置即可，引物由于需要标签序列部分环出(loop out)并与模板结合，因而优选距离引物的3’末端3个碱基以上的位置。另外在如图1中那样检测突变和/或单碱基多态性等多态性的情况下，核酸探针需要包含标签序列和来源于模板序列的序列两者。这时，如果使插入部位位于5’末端侧，则探针变长，特异性降低。由此，插入部位只要是引物环出(loop out)且能够扩增的范围即可，优选靠近3’末端侧，距离3’末端侧为25个碱基以内、更优选为15个碱基以内。 
在利用PCR作为扩增法的情况下，所使用的导入了标签序列的引物可以是正向引物(F引物)或反向引物(R引物)的任一者，如果需要，也可以在两引物中都导入标签序列。 
在利用LAMP法作为扩增法的情况下，准备在F2区域和/或B2区域导入了所述标签序列的引物。 
构成标签序列的核酸的种类只要是DNA、RNA、PNA、LNA、S-寡核苷酸、寡脱氧核苷磷酸甲酯等可以将其一部分结构用碱基序列表示的物质即可，不特别限定。 
<核酸探针> 
核酸探针由于用于检测目标核酸中所含的标签序列，因而设计成包含与标签序列互补的序列那样。另外可根据需要如图1所示设计成包含与来源于模板序列的区域互补的序列那样。 
例如在检测样本中的核酸的基因突变和/或多态性的情况下，使基因突变和/或基因多态性部位位于引物结合部位附近的来源于该模板序列的区域。然后，分别使用具有标签序列检测用序列和基因突变和/或多态性检测用序列的野生型检测用核酸探针、突变型检测用核酸探针，比较野生型检测用核酸探针与目标核酸的杂交量、突变型检测用核酸探针与目标核酸的杂交量，从而判定样本的基因型。 
另外，在鉴定分类于同属的细菌的多个种的情况下，例如，对每个样本准备属共有地扩增的所述标签导入引物进行扩增。此时，使各个种内特征的、与其他种出现特异性的区域位于引物结合部位附近的来源于该模板序列的区域。然后，通过比较具有标签序列检测用序列和各个种特征的序列的种鉴定用核酸探针与目标核酸的杂交量、显示与种无关的序列的阴性对照用核酸探针与目标核酸的杂交量，从而可以进行种的鉴定。 
检测样本中的核酸扩增的有无作为用于分析的指标的情况下，不一定要包含与来源于模板序列的区域互补的序列，但也可以包含。 
对本发明的核酸探针的链长不特别限定，优选5～50个碱基的范围，更优选10～40个碱基的范围，进一步优选15～35个碱基的范围。 
另外，核酸探针为了固定化于基体上而可以用氨基、羧基、羟基、硫醇基、磺基等反应性官能基、亲和素、生物素等物质修饰。还可以在官能基与核苷酸之间导入间隔物。间隔物可以使用例如烷烃骨架、乙二醇骨架等。 
用于固定化核酸探针的固相可以是一般可以作为用于DNA芯片的固相使用的任一基体。这样的基体可以由玻璃、硅、硝酸纤维素膜、尼龙膜、微板、电极、磁石、珠、塑料、胶乳、合成树脂、天然树脂、或光纤等构 成，但不限于这些。可以在这些基体上固定化多种核酸探针，从而构成DNA芯片。 
<方法> 
接着对于导入了标签序列的引物和使用DNA芯片的多样本的分析方法进行说明。 
如图2所示，首先，对每个样本(样本1、样本2、样本3)准备导入了序列不同的标签序列(标签序列1、标签序列2、标签序列3)的引物(样本1用引物、样本2用引物、样本3用引物)，在对每个样本独立的反应体系中进行扩增。所谓对每个样本独立的反应体系，只要是各样本不混合的反应体系即可。例如，只要对每个样本分别用不同的管进行扩增即可。“反应体系”是指能在那里进行反应的空间，例如，管和孔等容器。 
扩增后，获得了根据样本不同而一部分序列不同的扩增产物。在不存在模板核酸的情况下(样本2)不发生扩增，得不到扩增产物。各反应体系中得到的扩增产物包含对每个样本不同的标签序列和来源于模板核酸的区域(样本1、样本3)。因此，通过鉴定扩增产物所含的标签序列，可以特定样本。 
将该扩增产物混合，如图3所示使其与固定化于基体上的包含与各标签序列互补的序列的核酸探针杂交。然后，通过适宜的检测法来检测扩增产物与核酸探针的杂交。 
在图2和图3中显示3个样本的例子，当然样本数不限于此。另外，如图1所示，如果设计引物使得突变和/或多态性部位位于扩增产物的来源于模板序列的区域，则可以通过使用包含标签序列、和具有用于检测或鉴定这些突变和/或多态性的序列的来源于模板序列的序列的核酸探针，来进行突变和/或多态性的分析。 
而且，如图4所示，还可以在1个反应体系内多项扩增序列不同的多个模板序列。扩增后，只要对样本的扩增产物进行DNA芯片检测，就可以进行多个模板序列的检测。检测如下进行：使扩增产物与固定化于基体上的包含与各标签序列互补的序列的核酸探针杂交。然后，通过适宜的检 测法来检测扩增产物与核酸探针的杂交。图4中显示了3个模板序列的例子，当然模板核酸的数不限于此。另外，如果设计引物使得突变、多态性和/或要鉴定的生物种中特征的、与其他生物种具有特异性的部位位于扩增产物的来源于模板序列的区域，则可以通过使用包含标签序列、和具有用于检测或鉴定这些突变、多态性和/或生物种特征性部位的序列的来源于模板序列的序列的核酸探针，来进行突变、多态性、生物种等的分析。 
本发明中的检测对象包含例如个体的基因组DNA、基因组RNA、mRNA等。个体包含人、除人以外的动物、植物、以及病毒、细菌、真细菌、酵母和支原体等微生物，但不限于这些。 
这些核酸可以从由个体采集的样品中提取，所述样品例如，血液、血清、白血球、尿、粪便、精液、唾液、组织、活组织检查、口腔内粘膜、培养细胞、喀痰等。或者，从微生物直接提取。核酸的提取可以利用市售的核酸提取试剂盒QIAamp(QIAGEN社制)、スマイテスト(住友金属社制)等来进行，但不限于这些。将包含从个体样品和/或微生物中提取出的核酸的溶液作为被检液。 
样本通过本发明的方法所涉及的扩增法来扩增。在检测对象是RNA的情况下，可以在扩增前通过例如逆转录酶转换成互补链DNA。也可以将逆转录酶和DNA聚合物两者添加到同一管内，同时进行逆转录和DNA扩增。 
对于扩增法，可以使用例如，聚合酶链反应(Polymerase chain reaction)法(PCR法)、环介导等温扩增(Loop mediated isothermal amplification)法(LAMP法)、等温和嵌合引物引发的核酸扩增(Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids)(ICAN法)、核酸序列依赖性扩增(Nucleic acid sequence-based amplification)法(NASBA法)、链置换扩增(Strand displacement amplification)(SDA法)、连接酶链反应(Ligase chain reaction)(LCR法)、滚环扩增(Rolling Circle Amplification)法(RCA法)等方法。所得的扩增产物可以根据需要片段化，或者单链化。作为单链化的方法，例如有，热变性、使用珠和/或酶等的方法、使用T7 RNA聚合 物进行转录反应的方法。在通过LAMP法、ICAN法等扩增、产物中存在单链区域、并以该单链区域为目标序列的情况下，可以直接供给杂交工序。 
为了省略该单链化工序，通过扩增而得的目标核酸优选具有茎环(stem-loop)结构。具有茎环结构的扩增产物可以适合使用作为单链的环(loop)部分的序列与探针反应。 
目标核酸的扩增优选使用LAMP法(例如，请参照日本专利第3313358号)。LAMP法是迅速且简便的基因扩增法，扩增产物中具有茎环结构。 
图5是显示LAMP法中使用的基本引物的设计例的图。使用图5的模式图来简单地说明LAMP法的原理。在LAMP法中，使用识别模板核酸的最大8个区域的6种引物和链置换型DNA合成酶。模板核酸在等温(60～65℃)条件下扩增。上述8个区域从模板核酸的5’末端侧起依次被定义为F3区域、F2区域、LF区域、F1区域，从3’末端侧起依次被定义为B3c区域、B2c区域、LBc区域、和B1c区域。此外，F1c、F2c、F3c、B1、B2、和B3区域分别显示F1、F2、F3、B1c、B2c、和B3c区域的互补链中的区域。图5所示8种引物是：5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP内部引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP内部引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，具有与LBc区域相同的序列的LBc引物。扩增反应所需的是FIP内部引物、BIP内部引物，F3引物、B3引物、LF引物和LB引物是为了提高扩增效率而添加的。 
LAMP法所产生的扩增产物中形成了如图6所示的环结构，F2区域至F1区域之间、F2c区域至F1c区域之间、B2区域至B1区域之间、和B2c区域至B1c区域间是单链的区域。因此，如果在该区域设计目标序列，则能够简便且高灵敏度地检测目标核酸(例如，请参照特开2005-143492号公报)。在LF引物和/或LB引物与目标序列重合的情况下，最好不添加LF引物和/或LB引物。 
使用图7，对于在使用LAMP法时的标签序列导入引物和使用DNA芯片的多样本分析方法进行说明。 
首先，对每个样本准备在F2区域和/或B2区域中导入了所述标签序列的引物。 
接着，使用该引物对每个样本在对每个样本独立的反应体系中进行扩增。例如，对每个样本在不同管中进行扩增即可。扩增后，得到了在单链环部分根据样本不同而一部分序列不同的扩增产物。在不存在模板核酸的情况下不发生扩增，得不到扩增产物。将该扩增产物混合，如图8所示那样，使其与固定化于基体上的包含与各标签序列互补的序列的核酸探针杂交。然后，通过适宜的检测法来检测扩增产物与核酸探针的杂交。 
在图7和图8中，显示了3个样本的例子，当然对于样本数不限于此。 
另外，如果如图9所示那样，使突变和/或多态性部位位于用核酸探针检测的来源于模板序列的区域、即F2区域至F1区域之间、F2c区域至F1c区域之间、B2区域至B1区域之间、和B2c区域至B1c区域间之间，则可以通过使用检测这些突变和/或多态性的核酸探针来进行检测。 
而且，如图10所示，还可以在1个反应体系内多项扩增包含不同序列的多种模板序列。扩增后，对样本的扩增产物进行DNA芯片检测，则可以对于多个目标序列来分析多个样本。检测如下进行：使扩增产物与固定化于基体上的包含与各标签序列互补的序列的核酸探针杂交。然后，通过适宜的检测法来检测扩增产物与核酸探针的杂交。图10中显示了3个模板核酸的例子，当然模板核酸数不限于此。另外，如果设计引物使得突变、多态性部位、和/或要鉴定的生物种中特征的且与其他生物种具有特异性的部位位于扩增产物的来源于模板序列的区域，则可以通过使用包含标签序列、和具有用于检测或鉴定这些突变、多态性和/或生物种的序列的来源于模板序列的序列的核酸探针，来进行突变、多态性、生物种等的分析。 
<DNA芯片> 
本发明中使用的DNA芯片只要具备基体和固定化于基体上的核酸探针即可。DNA芯片的基体可以是以电流检测型为代表的电化学检测型、荧 光检测型、化学发色型和放射能检测型等现有技术公知的任一种类的微阵列用基体。 
任一种类的微阵列都可以通过其本身公知的方法来制造。例如，电流检测型微阵列的情况下，将阴性对照探针固定化区域和检测用探针固定化区域分别配置在不同的电极上即可。 
图11中作为模式图显示DNA芯片的例子，但是不限于此。DNA芯片在基体1上具备固定化区域2。核酸探针被固定化于该固定化区域2。这样的DNA芯片可以通过本领域公知的方法来制造。配置于基体1上的固定化区域2的数量及其配置可以由本领域技术人员根据需要适宜设计并改变。这样的DNA芯片可以适合用于使用荧光的检测方法。 
图12显示DNA芯片的其他例。图12的DNA芯片在基体11上具备电极12。核酸探针被固定化于该电极12。电极12与焊盘13连接。来自电极12的电信息介由焊盘13取得。这样的DNA芯片可以通过本领域公知的方法来制造。配置于基体11的电极12的数量及其配置可以由本领域技术人员根据需要适宜设计并改变。另外，本例的DNA芯片根据需要还可以具备参考电极和对电极。 
电极可以使用金、金的合金、银、铂、汞、镍、钯、硅、锗、镓或钨等金属单体和它们的合金，或者石墨、玻璃碳等碳或它们的氧化物或化合物，但不限于这些。 
如本例的DNA芯片可以适合用于电化学检测方法。 
<杂交条件> 
杂交只要在杂种能够充分形成的适当条件下进行即可。适当条件根据目标核酸的种类和结构、目标序列所含的碱基的种类、核酸探针的种类不同而不同。例如，可以在离子强度为0.01～5的范围、pH值为5～9的范围的缓冲液中进行杂交。反应温度可以在10℃～90℃的范围。还可以通过搅拌和/或振荡等来提高反应效率。反应溶液中还可以添加硫酸葡聚糖、鲑鱼精DNA、和牛胸腺DNA等杂交促进剂、EDTA、或表面活性剂等。 
<洗涤条件> 
杂交后，用于洗涤DNA芯片的洗涤液优选使用离子强度为0.01～5的范围、pH值为5～9的范围的缓冲液。洗涤液优选包含盐和表面活性剂等。例如，使用氯化钠或柠檬酸钠调制的SSC溶液、Tris-HCl溶液、Tween20溶液、或SDS溶液等可以优选使用。洗涤温度例如在10℃～70℃的范围内进行。使洗涤液通过或滞留在探针固定化基体的表面或固定化有核酸探针的区域。或者，也可以在洗涤液中浸渍DNA芯片。这种情况下，洗涤液优选被收纳在温度可控制的容器中。 
<检测方法> 
通过杂交工序而生成的杂种的检测可以利用荧光检测方式和电化学检测方式。 
(a)荧光检测方式 
使用荧光标记物质进行检测。将在核酸的扩增工序中使用的引物用像FITC、Cy3、Cy5、或罗丹明等荧光色素那样的荧光活性的物质进行标记。或者，还可以使用用这些物质标记后的二次探针。还可以同时使用多个标记物质。通过检测装置来检测标记后序列或二次探针中的标记。根据所使用的标记来使用适当的检测装置。例如，在使用荧光物质作为标记的情况下，使用荧光检测器进行检测。 
(b)电化学检测方式 
使用本领域公知的双链识别物质。双链识别物质可以从Hoechst33258、吖啶橙、喹吖因、道诺霉素、金属嵌入剂、双吖啶等双嵌入剂、三嵌入剂和多嵌入剂中选择。而且，还可以将这些双链识别物质用电化学活性的金属络合物、例如二茂铁、紫晶等修饰。 
双链识别物质的使用浓度根据种类不同而不同，一般以1ng/mL～1mg/mL的范围的浓度使用。此时，使用离子强度为0.001～5的范围、pH值为5～10的范围的缓冲液。 
测定如下进行，例如施加大于等于双链识别物质电化学反应的电位以上的电位，测定来源于双链识别物质的反应电流值。此时，电位可以定速施加，或者脉冲施加，或者施加定电位。可以使用恒电位仪、数位表、和 函数发生器等装置来控制电流、电压。电化学检测可以通过本领域公知的方法来实施。例如，可以使用特开平10-146183号公报所记载的方法。 
[检测试剂盒] 
另外本发明还提供用于在上述的核酸分析方法中使用的检测试剂盒。这样的检测试剂盒可以具备下述引物组和DNA芯片： 
所述引物组包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含具有对每个样本不同的序列的标签序列，所述标签序列被设计成在与每个所述样本的模板核酸中的模板序列杂交时环出(loop out)那样，所述第2引物与所述第1引物成对使用； 
所述DNA芯片具备基体、和固定化于所述基体上的与包含所述标签序列的目标序列互补的核酸探针。 
此时核酸探针可以是与包含标签序列和来源于样本中的模板序列的序列的至少一部分的目标序列互补的核酸探针。 
另外，检测试剂盒可以具备下述引物组和DNA芯片： 
所述引物组包含第1引物和第2引物，所述第1引物包含具有对每个核酸部分序列不同的序列的标签序列，所述标签序列被设计成在与所述每个核酸部分序列的模板序列杂交时环出(loop out)那样，所述第2引物与所述第1引物成对使用； 
所述DNA芯片具备基体、和固定化于所述基体上的与包含所述标签序列的目标序列互补的核酸探针。 
此时核酸探针可以是与包含标签序列和来源于每个核酸部分序列的模板序列的序列的至少一部分的目标序列互补的核酸探针。 
另外，检测试剂盒所含的第1引物，包含至少1次分析中使用所需的种类和量的引物。在同时分析n个样本的情况下，使用n种第1引物。如果将不同种类的第1引物比较序列，则除标签序列以外可以是相同的序列。 
检测试剂盒所含的第2引物，包含至少1次分析中使用所需的量的引物。另外，除了第1引物之外，第2引物也可以包含标签序列。这时，第2引物含有至少1次分析中使用所需的种类和量的引物即可。在同时分析n 个样本时，使用n种第2引物。如果将不同种类的第2引物比较序列，则除标签序列以外可以是相同的序列。 
在检测试剂盒利用PCR法的情况下，第1引物例如，可以是包含至少与能含有模板核酸的n个样本对应的标签序列、和该模板核酸的一部分序列的互补序列的n种正向引物或反向引物(这里，n是2以上的整数)。第2引物包含至少1次分析中使用所需的量的引物。这样的第2引物是与第1引物成对使用的至少1种反向引物或正向引物即可。如果第1引物是正向引物，则第2引物是反向引物，如果第1引物是反向引物，则第2引物是正向引物。 
本发明还提供用于利用LAMP法的分析方法的检测试剂盒。在从模板序列的5’末端侧起设有F3区域、F2区域、LF区域、F1区域、从3’末端侧起设有B3c区域、B2c区域、LBc区域、B1c区域的情况下，包含选自以下(1)～(9)中的至少1组引物组： 
(1)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物(第1引物)，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物(第2引物)； 
(2)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物(第2引物)，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物(第1引物)； 
(3)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物(第1引物)，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物(第2引物)； 
(4)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物(第1引 物)，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物(第2引物)，具有与F3区域相同的序列的F3引物(第3引物)，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物(第4引物)； 
(5)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物(第2引物)，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物(第1引物)，具有与F3区域相同的序列的F3引物(第3引物)，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物(第4引物)； 
(6)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物(第1引物)，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物(第2引物)，具有与F3区域相同的序列的F3引物(第3引物)，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物(第4引物)； 
(7)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物(第1引物)，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物(第2引物)，具有与F3区域相同的序列的F3引物(第3引物)，具有与B3c区域互补的序列的B3引物(第4引物)，具有与LF区域互补的序列的LFc引物(第5引物)，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物(第6引物)； 
(8)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物(第2引物)，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物(第1引物)，具有与F3区域相同的序列的F3引物(第3引物)，具有与B3c区域互补的序列的B3引物(第4引物)，具有与LF区域互补的序列的LFc引物(第5引物)，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物(第6引物)； 
(9)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物(第1引物)，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物(第2引物)，具有与F3区域相同的序列的F3引物(第3引物)，具有与B3c区域互补的序列的B3引物(第4引物)，具有与LF区域互补的序列的LFc引物(第5引物)，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物(第6引物)。 
而且，该检测试剂盒还可以包含用于进行扩增反应的酶和/或容器、洗涤液、缓冲液、用于调制缓冲液的盐类等。另外，DNA芯片还可以以不一体化的状态包含核酸探针和基体。 
通过这样的检测试剂盒，可以更简便地进行核酸的分析。 
[例] 
显示利用本发明的方法进行检测的具体例。以下例子是使用插入有对每个样本不同的标签序列的引物和DNA芯片来分析多个样本的方法的例子。 
(1)模板核酸的扩增 
首先，使用插入有标签序列的引物进行基因扩增，通过限制性酶来确认是否生成了目标基因产物。使用序列号21的人MTHFR基因作为模板核酸，通过LAMP法扩增该模板核酸。 
[引物] 
表1显示目标核酸的扩增中使用的合成DNA寡聚引物。 
准备无碱基插入的FIP引物(FIP-1；序列号1)、在从FIP引物的3’末端侧起第4个碱基处插入了AC(FIP-2；序列号2)、ACAC(FIP-3；序列号3)、ACACAC(FIP-4；序列号4)、TGTG(FIP-5；序列号5)、TCTC(FIP-6；序列号6)的、在从FIP引物的3’末端侧第6个碱基处插入了AC(FIP-7序列号7)、ACAC(FIP-8；序列号8)、ACACAC(FIP-9；序列号9)、TGTG(FIP-10；序列号10)、TCTC(FIP-11；序列号11)的共计11种 FIP引物。另外，BIP引物(序列号12)、F3引物(序列号13)、B3引物(序列号14)、LBc引物(序列号15)通用。 
[LAMP反应液] 
表2显示使用LAMP法的反应溶液的组成。 
表2 
  Bst DNA聚合酶   2μL
  2×Buffer   12.5μL
  Tris·HCl pH8.0 40mM  
  KCl 20mM  
  MgSO4 16mM  
  (NH4)2SO4 20mM  
  Tween20 0.2％  
  甜菜碱1.6M  
  dNTP 2.8mM  
  F3引物(20μM)   0.5μL
  B3引物(20μM)   0.5μL
  FIP引物(40μM)   2μL
  BIP引物(40μM)   2μL
  LFc引物(20μM)   2μL
  人基因组(60ng/μL)   1μL
  灭菌超纯水   2.5μL
  总量   25μL
[核酸的扩增] 
通过LAMP法，在63℃经过1小时扩增核酸。作为阴性对照，使用灭菌水代替模板核酸。扩增的上升时间通过使用Loopamp实时浊度测定装置，检测伴随扩增反应而生成的焦磷酸与溶液中的镁产生的白浊来进行。 
[利用限制性酶的目标产物确认] 
将在从FIP引物的3’末端侧起第4个碱基处导入了AC(FIP-2)、ACAC(FIP-3)、ACACAC(FIP-4)的样品用AccI切割。无碱基插入的FIP引物(FIP-1)不被AccI切割，但插入了AC(FIP-2)、ACAC(FIP-3)、ACACAC(FIP-4)的样品，引物的插入部分环出(loop out)并与模板核酸退火。因此，在生成了目标产物的情况下，该扩增产物被该AccI切割。 
同样地，将在从FIP引物的3’末端侧第6个碱基处插入了AC(FIP-7)、ACAC(FIP-8)、ACACAC(FIP-9)的引物用CviQI切割。无碱基插入的FIP引物(FIP-1)不被CviQI切割。插入了AC(FIP-7)、ACAC(FIP-8)、ACACAC(FIP-9)的引物，引物的插入部分环出(loop out)并与模板核酸退火。因此，如果生成了目标产物，则扩增产物被CviQI切割。 
[结果] 
无碱基插入的(FIP-1)样品，上升时间为29分钟。在从FIP引物的3’末端侧起第4个碱基处插入了AC(FIP-2)、ACAC(FIP-3)、ACACAC(FIP-4)、TGTG(FIP-5)、TCTC(FIP-6)的样品的上升时间为32分钟、37分钟、38分钟、38分钟、37分钟。而且，在从FIP引物3’末端侧起第6个碱基处插入了AC(FIP-7)、ACAC(FIP-8)、ACACAC(FIP-9)、TGTG(FIP-10)、TCTC(FIP-11)的样品的上升时间为30分钟、38分钟、47分钟、32分钟、35分钟。在阴性对照中扩增不上升。由此可知，通过碱基插入，可以毫无问题地在50分钟以内扩增上升，获得扩增产物。另外，如图13所示，通过限制性酶确认了目标产物被扩增。 
(2)目标核酸的DNA芯片检测 
使用在从FIP引物的3’末端侧起第4个碱基处插入了ACAC(FIP-3)、TGTG(FIP-5)、TCTC(FIP-6)的引物进行扩增。B3、F3、BIP、LBc引物通用(参照表1)。作为模板，调制了添加了人基因组的样品，和添加灭菌水代替该人基因组的样品2种。然后，对得到的扩增产物进行芯片检测。 
[核酸探针] 
表3显示检测中使用的合成DNA寡核酸探针。在本例中，作为核酸探针，准备在从FIP引物的3’末端侧起第4个碱基处插入了ACAC的探针(探针2；序列号17)、插入了TGTG的探针(探针3：序列号18)、插入了TCTC的探针(探针4；序列号19)、和在作为来源于模板序列的区域的互补链的部分引入了单碱基突变的探针(探针5；序列号20)。作为阴性对照，使用具有与MTHFR基因序列无关的序列的负探针(探针1；序列号16)。以上5种探针为了固定化于金电极上而将3’末端侧进行硫醇基修饰。 
表3 
  探针   序列
  1   GTGCTGCAGGTGCG
  2   CTACACGCGGGAGCCGAT
  3   CTTGTGGCGGGAGCCGAT
  4   CTTCTCGCGGGAGCCGAT
  5   CTACACGCGGGAGGCGAT
[电化学检测用DNA芯片] 
将上述的核酸探针固定化于金电极。核酸探针的固定化可以利用硫醇基与金的强共价结合性来进行。将核酸探针溶液点样在金电极上，在25℃静置1小时。然后，浸渍在1mM巯基己醇溶液中，用0.2×SSC溶液洗涤。同一探针点样在各4个电极上。以下显示各核酸探针的电极的位置。洗涤后，用超纯水洗涤，风干，获得了电化学检测用DNA芯片。 
[电极配置] 
电极与固定化于电极的核酸探针的对应如下。 
1-4电极     负探针(核酸探针1) 
5-8电极     ACAC检测用探针(核酸探针2) 
9-12电极    TGTG检测用探针(核酸探针3) 
13-16电极   TCTC检测用探针(核酸探针4) 
17-20电极   ACAC单碱基突变导入探针(核酸探针5) 
[杂交] 
将如上制作的电化学检测用DNA芯片浸渍在添加了2×SSC的盐的LAMP产物中，在55℃静置10分钟并进行杂交。然后，将电化学检测用DNA芯片在0.2×SSC溶液中在48℃浸渍10分钟并洗涤。接着，将电化学检测用DNA芯片在含有作为嵌入剂的Hoechst 33258溶液50μM的磷酸缓冲液中浸渍1分钟。然后，测定Hoechst 33258溶液的氧化电流应答。 
[结果] 
图14A是将添加人基因组进行扩增的ACAC(FIP-3)插入引物组的扩增产物、与添加灭菌水进行扩增的TGTG(FIP-5)和TCTC(FIP-6)插入引物组的扩增产物混合的结果。图14B是将添加人基因组进行扩增的TGTG(FIP-5)插入引物组的扩增产物、与添加灭菌水进行扩增的ACAC(FIP-3)和TCTC(FIP-6)插入引物组的扩增产物混合的结果。同样地，图14C是将添加人基因组进行扩增的TCTC(FIP-6)插入引物组的扩增产物、与添加灭菌水进行扩增的ACAC(FIP-3)和TGTG(FIP-5)插入引物组的扩增产物混合的结果。芯片检测的结果是，在图14A中，从检测ACAC的核酸探针2获得了高信号。在图14B中，从检测TGTG的核酸探针3获得了高信 号。同样地，在图14C中，从检测TCTC的核酸探针4获得了高信号。由此显示，用插入了本发明的标签序列的引物，可以对多个样本同时进行DNA芯片检测。另外，图14A启示：可以通过使洗涤条件严格，使ACAC检测用探针和1个碱基不同的核酸探针5，与核酸探针2相比信号较低，通过使突变位于来源于模板序列的区域，从而可以检测突变。 
本例显示了3个样本同时检测，当然样本数不限于此。可以根据需要适宜改变。当然对于标签序列的插入位置、和碱基数不限于此。可以根据需要适宜改变。 
如例中所示那样，通过本发明的分析方法，可以在短时间内容易且简便地分析多个样本。 
产业可利用性 
本发明在医疗、医药、食品、农业、渔业、畜产业和园艺等领域用于分析基因等核酸是有用的。 
附图标号说明 
1...基体、2...固定化区域、11...基体、12...电极、13...焊盘 
Figure IDA0000125951470000011
Figure IDA0000125951470000021
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Claims (6)

1.一种非诊断或治疗目的的多个样本的分析方法，该分析方法具备以下工序(a)～(e)：
工序(a)对每个样本准备包含第1引物和与所述第1引物成对使用的第2引物的引物组，所述第1引物包含标签序列，所述标签序列具有根据所述样本不同而不同的序列，其中，所述标签序列被设计成在所述第1引物与每个所述样本的模板核酸中的模板序列杂交时，标签序列部分不与模板核酸结合而环出那样；
工序(b)在对每个所述样本独立的反应体系中，使用与每个所述样本对应的所述引物组，扩增每个所述样本的模板核酸，得到导入了所述标签序列的扩增产物；
工序(c)将由每个所述样本得到的所述扩增产物混合在一起；
工序(d)使具有用于检测目标序列的序列且被固定化于基体上的核酸探针与在工序(c)中被混合的所述扩增产物反应，所述目标序列包含所述标签序列和来源于每个所述样本的模板序列的序列；
工序(e)通过检测在工序(d)中生成的杂交量，从而对于各样本检测所述扩增产物的有无和/或量。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述引物组选自以下(1)～(9)中的至少1者：
当从所述模板序列的5’末端侧起设定有F3区域、F2区域、LF区域、F1区域，从3’末端侧起设定有B3c区域、B2c区域、LBc区域、B1c区域时，
(1)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物；
(2)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物；
(3)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物；
(4)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物；
(5)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物；
(6)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物；
(7)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物；
(8)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物；
(9)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物，
工序(b)的扩增采用LAMP法。
3.非诊断或治疗目的的样本核酸中的多个部分核酸序列的分析方法，该分析方法具备以下工序(a)～(d)：
工序(a)对每个所述部分核酸序列准备包含第1引物和与所述第1引物成对使用的第2引物的引物组，所述第1引物包含标签序列，所述标签序列具有根据所述部分核酸序列不同而不同的序列，其中，所述标签序列被设计成在所述第1引物与每个所述部分核酸序列的模板序列杂交时，标签序列部分不与模板核酸结合而环出那样；
工序(b)使用所述引物组，在1个反应体系内对每个所述部分核酸序列的模板序列进行多项扩增，得到导入了所述标签序列的扩增产物；
工序(c)使具有用于检测目标序列的序列且被固定化于基体上的核酸探针与工序(b)所得的所述扩增产物反应，所述目标序列包含所述标签序列和来源于每个所述部分核酸序列的模板序列的序列；
工序(d)通过检测工序(c)中生成的杂交量，从而对于各核酸序列检测所述扩增产物的有无和/或量。
4.根据权利要求3所述的分析方法，其中，所述引物组选自以下(1)～(9)中的至少1者：
当从所述模板序列的5’末端侧起设定有F3区域、F2区域、LF区域、F1区域，从3’末端侧起设定有B3c区域、B2c区域、LBc区域、B1c区域时，
(1)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物；
(2)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物；
(3)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，和5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物；
(4)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物；
(5)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物；
(6)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，和具有与B3c区域互补的序列的B3引物；
(7)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物；
(8)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物；
(9)5’末端侧具有与F1互补的序列、3’末端侧具有与F2相同的序列、且F2序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的FIP引物，5’末端侧具有与B1c相同的序列、3’末端侧具有与B2c互补的序列、且与B2c互补的序列内插入有根据样本不同而不同的标签序列的BIP引物，具有与F3区域相同的序列的F3引物，具有与B3c区域互补的序列的B3引物，具有与LF区域互补的序列的LFc引物，和具有与LBc区域相同的序列的LBc引物，
工序(b)的扩增采用LAMP法。
5.用于包含以下工序(a)～(e)的多个样本的分析方法中的检测试剂盒，该检测试剂盒具备下述引物组和DNA芯片：
所述引物组包含第1引物和与所述第1引物成对使用的第2引物，所述第1引物包含标签序列，所述标签序列具有根据样本不同而不同的序列，并且所述标签序列被设计成在与每个所述样本的模板核酸中的模板序列杂交时，标签序列部分不与模板核酸结合而环出那样，
所述DNA芯片具备基体、和固定化于所述基体上的与目标序列互补的核酸探针，所述目标序列包含所述标签序列和来源于所述样本中的模板序列的序列，
工序(a)对每个样本准备所述引物组；
工序(b)在对每个所述样本独立的反应体系中，使用与每个所述样本对应的所述引物组，扩增每个所述样本的模板核酸，得到导入了所述标签序列的扩增产物；
工序(c)将由每个所述样本得到的所述扩增产物混合在一起；
工序(d)使所述核酸探针与在工序(c)中被混合的所述扩增产物反应；
工序(e)通过检测在工序(d)中生成的杂交量，从而对于各样本检测所述扩增产物的有无和/或量。
6.用于包含以下工序(a)～(d)的多个部分核酸序列的分析方法中的检测试剂盒，该检测试剂盒具备下述引物组和DNA芯片：
所述引物组包含第1引物和与所述第1引物成对使用的第2引物，所述第1引物包含标签序列，所述标签序列具有根据所述部分核酸序列不同而不同的序列，并且所述标签序列被设计成在与每个所述部分核酸序列的模板序列杂交时，标签序列部分不与模板核酸结合而环出那样，
所述DNA芯片具备基体、固定化于所述基体上的与目标序列互补的核酸探针，所述目标序列包含所述标签序列和来源于每个所述部分核酸序列的模板序列的序列，
工序(a)对每个所述部分核酸序列准备所述引物组；
工序(b)使用所述引物组，在1个反应体系内对每个所述部分核酸序列的模板序列进行多项扩增，得到导入了所述标签序列的扩增产物；
工序(c)使所述核酸探针与工序(b)所得的所述扩增产物反应；
工序(d)通过检测工序(c)中生成的杂交量，从而对于各核酸序列检测所述扩增产物的有无和/或量。
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