CN114686567A - 一种检测snp的基因芯片及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种检测SNP的基因芯片，其特征为利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性，具体是：通过将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端实现；标记dNTP在DNA聚合酶作用下整合在探针延长链中，去除非探针（含延伸探针）外的所有非固定的核酸链（包括与探针延伸链配对的模板链），利用Click反应完成标记dNTP的最终修饰并形成可检测信号，有效提高信噪比。
Description
技术领域
本发明涉及生物芯片领域，特别涉及一种检测SNP的基因芯片及其使用方法。
背景技术
生物芯片技术已经广泛应用于临床疾病诊断、健康管理、药物研究开发、动植物检疫、食品检测、环境监测、科学研究、法医学检测等众多领域，有广阔的应用前景，市场需求量非常大。基因芯片是生物芯片中的一类，是通过在芯片的基片上定植一系列的序列已知探针而制备，可用于特定标记核酸的杂交检测，能通过识别检测与信息处理来报告检测对象中核酸信息。
SNP是基因组中最大的标记，不仅用于基因来源分析，同时也是决定基因功能变化的主要原因，许多病理因素都涉及到基因的SNP变化。
在当前的SNP检测基因芯片主要是通过寡核苷酸杂交法检测SNP，仅仅是通过检测只有一个碱基差异的探针与靶标的配对差异完成SNP的检测，这种检测的检测要求高，检测时间长，对于检测体系的温度变化、杂交体系的组成要求非常高。快速简便的SNP检测技术能更有效推动SNP检测进展，提高SNP检出的准确性也是生命科学研究及大健康产业发展的迫切需求，特别是SNP与用药效果的关系研究，不同SNP对药物的反应不同。
发明内容
本发明为解决现有技术中存在不足，利用DNA聚合酶的校正活性检测探针与靶标序列配对的准确性，通过碱基互补配对识别及配对正确性的双重识别，极大提高SNP检出的准确性；且，通过把SNP信息转移到探针的延伸链中有效提高，信噪比加强基因芯片检测的准确性。
本发明的发明构思是：根据DNA聚合酶进行PCR反应中引物延伸时要求引物3'末端必须与模板严格配对的原理，将SNP位点设置在探针的3'末端，只有SNP位点配对正确的靶标才能完成探针的延伸；探针3'末端SNP位点不能与靶标序列正确配对就无法延伸；将标记dNTP掺入到探针延伸链中，通过检测标记dNTP就可以确定相应的SNP位点信息。
为解决上述问题，本发明的技术方案如下：一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，包括以下步骤：
S1基于大数据进行探针设计与优化，保证与SNP位点互补配对的碱基为探针的3'末端碱基；
S2在一系列的探针的5'末端增加连接臂并固定到基片上，制作基因芯片；
S3提取样品中的DNA，将样品DNA与基因芯片杂交并组装PCR反应体系，利用DNA聚合酶识别能够与样品DNA中SNP位点准确配对的探针并以探针为引物进行以靶标DNA为模板的PCR延伸，获得探针延伸链；
S4充分洗涤去除PCR反应中相关的各种组分，保证基因芯片上只有探针及与探针连接的探针延长链，其他所有核酸及相关核苷酸均洗掉，与探针延伸链配对的模板链也通过变性后洗涤的方式去除；
S5由于PCR反应底物中一种dNTP为标记dNTP，该标记dNTP在探针延伸时进入探针的延伸链中，利用Click反应完成标记dNTP的最终修饰，基于标记dNTP的信号识别及基因芯片上各探针的位置信息形成基因芯片检测结果。
优选的，利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性。
优选的，将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端。
优选的，标记dNTP整合在探针延长链中，直接对探针进行标记，不是杂交法标记。
优选的，标记dNTP的标记是荧光基团标记，或是同位素标记，或是酶标记。
优选的，样品中目标序列的扩增与基因芯片杂交同时进行，不同于传统基因芯片的扩增后杂交检测。
优选的，基因芯片最终的信号识别过程中只有延伸探针有检测标记且检测标记整合在探针延伸链中，信号检出时的信噪比更高。
优选的，利用Click反应完成标记dNTP的最终修饰并形成可检测信号。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述。以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。本发明所应用的化学试剂以及仪器如未经特别说明，均可从商业渠道购买。
实施例1
一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，包括以下步骤：
S1基于大数据进行探针设计与优化，保证与SNP位点互补配对的碱基为探针的3'末端碱基；将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端，利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性。
S2在一系列的探针的5'末端增加聚乙二醇连接臂并固定到玻璃基片上，制作基因芯片；
S3提取样品中的DNA，将样品DNA与基因芯片杂交并组装PCR反应体系，利用pfuDNA聚合酶识别能够与样品DNA中SNP位点准确配对的探针并以探针为引物进行以靶标DNA为模板的PCR延伸，获得探针延伸链；标记dCTP在聚合酶作用下整合到探针延长链中，直接对探针进行标记，不是杂交法标记，标记dCTP的标记是cy3荧光基团。
样品中目标序列的扩增与基因芯片杂交同时进行，不同于传统基因芯片的扩增后杂交检测。
S4充分洗涤去除PCR反应中相关的各种组分，保证基因芯片上只有探针及与探针连接的探针延长链，其他所有核酸及相关核苷酸均洗掉，与探针延伸链配对的模板链也通过变性后洗涤的方式去除；保证基因芯片最终的信号识别过程中只有延伸探针有检测标记且检测标记整合在探针延伸链中，有效提高信号检出时的信噪比。
S5由于PCR反应底物中dCTP为标记dCTP，该标记dCTP在探针延伸时进入探针的延伸链中，利用Click反应完成标记dCTP的最终修饰，将荧光基团cy3修饰到标记dCTP上，通过荧光信号识别及基因芯片上各探针的位置信息形成基因芯片检测结果。
实施例2
一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，包括以下步骤：
S1基于大数据进行探针设计与优化，保证与SNP位点互补配对的碱基为探针的3'末端碱基；将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端，利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性。
S2在一系列的探针的5'末端增加连接臂并固定到基片上，制作基因芯片；
S3提取样品中的DNA，将样品DNA与基因芯片杂交并组装PCR反应体系，利用pfuDNA聚合酶识别能够与样品DNA中SNP位点准确配对的探针并以探针为引物进行以靶标DNA为模板的PCR延伸，获得探针延伸链；
标记dNTP在聚合酶作用下整合到探针延长链中，直接对探针进行标记，不是杂交法标记，标记dNTP的标记是生物素标记的dUTP。
样品中目标序列的扩增与基因芯片杂交同时进行，不同于传统基因芯片的扩增后杂交检测。
S4充分洗涤去除PCR反应中相关的各种组分，保证基因芯片上只有探针及与探针连接的探针延长链，其他所有核酸及相关核苷酸均洗掉，与探针延伸链配对的模板链也通过变性后洗涤的方式去除；保证基因芯片最终的信号识别过程中只有延伸探针有检测标记且检测标记整合在探针延伸链中，有效提高信号检出时的信噪比。
S5由于PCR反应底物中有生物标记的dUTP，该标记dUTP在探针延伸时进入探针的延伸链中，通过生物素（Biotin）标记的dUTP与连接辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），进行信号识别及基因芯片上各探针的位置信息形成基因芯片检测结果。
实施例3
一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，包括以下步骤：
S1基于大数据进行探针设计与优化，保证与SNP位点互补配对的碱基为探针的3'末端碱基；将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端，利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性。
S2在一系列的探针的5'末端增加连接臂并固定到基片上，制作基因芯片；
S3提取样品中的DNA，将样品DNA与基因芯片杂交并组装PCR反应体系，利用pfuDNA聚合酶识别能够与样品DNA中SNP位点准确配对的探针并以探针为引物进行以靶标DNA为模板的PCR延伸，获得探针延伸链；
标记dNTP在聚合酶作用下整合到探针延长链中，直接对探针进行标记，不是杂交法标记，标记dNTP的标记是同位素标记。
样品中目标序列的扩增与基因芯片杂交同时进行，不同于传统基因芯片的扩增后杂交检测。
S4充分洗涤去除PCR反应中相关的各种组分，保证基因芯片上只有探针及与探针连接的探针延长链，其他所有核酸及相关核苷酸均洗掉，与探针延伸链配对的模板链也通过变性后洗涤的方式去除；保证基因芯片最终的信号识别过程中只有延伸探针有检测标记且检测标记整合在探针延伸链中，有效提高信号检出时的信噪比。
S5由于PCR反应底物中dATP带有同位素标记，该标记dATP在探针延伸时进入探针的延伸链中，基于标记dATP的同位素信号识别及基因芯片上各探针的位置信息形成基因芯片检测结果。
实施例4
一S1基于大数据进行探针设计与优化，保证与SNP位点互补配对的碱基为探针的3'末端碱基；将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端，利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性。
S2在一系列的探针的5'末端增加聚乙二醇连接臂并固定到玻璃基片上，制作基因芯片；
S3提取样品中的DNA，将样品DNA与基因芯片杂交并组装PCR反应体系，利用TaqDNA聚合酶识别能够与样品DNA中SNP位点准确配对的探针并以探针为引物进行以靶标DNA为模板的PCR延伸，获得探针延伸链；标记dCTP在聚合酶作用下整合到探针延长链中，直接对探针进行标记，不是杂交法标记，标记dCTP的标记是cy5荧光基团。
样品中目标序列的扩增与基因芯片杂交同时进行，不同于传统基因芯片的扩增后杂交检测。
S4充分洗涤去除PCR反应中相关的各种组分，保证基因芯片上只有探针及与探针连接的探针延长链，其他所有核酸及相关核苷酸均洗掉，与探针延伸链配对的模板链也通过变性后洗涤的方式去除；保证基因芯片最终的信号识别过程中只有延伸探针有检测标记且检测标记整合在探针延伸链中，有效提高信号检出时的信噪比。
S5由于PCR反应底物中dCTP为标记dCTP，该标记dCTP在探针延伸时进入探针的延伸链中，利用Click反应完成标记dCTP的最终修饰，将荧光基团cy5修饰到标记dCTP上，通过荧光信号识别及基因芯片上各探针的位置信息形成基因芯片检测结果。
以上所述，仅为本发明创造较佳的具体实施方式，但本发明创造的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明创造披露的技术范围内，根据本发明创造的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明创造的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1基于大数据进行探针设计与优化，保证与SNP位点互补配对的碱基为探针的3'末端碱基；
S2在一系列的探针的5'末端增加连接臂并固定到基片上，制作基因芯片；
S3提取样品中的DNA，将样品DNA与基因芯片杂交并组装PCR反应体系，利用DNA聚合酶识别能够与样品DNA中SNP位点准确配对的探针并以探针为引物进行以靶标DNA为模板的PCR延伸，获得探针延伸链；
S4充分洗涤去除PCR反应中相关的各种组分，保证基因芯片上只有探针及与探针连接的探针延长链，其他所有核酸及相关核苷酸均洗掉，与探针延伸链配对的模板链也通过变性后洗涤的方式去除；
S5由于PCR反应底物中一种dNTP为标记dNTP，该标记dNTP在探针延伸时进入探针的延伸链中，利用Click反应完成标记dNTP的最终修饰，基于标记dNTP的信号识别及基因芯片上各探针的位置信息形成基因芯片检测结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，利用DNA聚合酶完成探针与靶标序列配对的检测验证，提高检测准确性。
3.根据权利要求1所述的一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，将与SNP位点配对的碱基设置在基因芯片探针的3'末端。
4.根据权利要求1所述的一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，标记dNTP整合在探针延长链中，直接对探针进行标记，不是杂交法标记。
5.根据权利要求4所述的标记dNTP，其特征在于，标记dNTP的标记是荧光基团标记，或是同位素标记，或是酶标记。
6.根据权利要求1所述的一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，样品中目标序列的扩增与基因芯片杂交同时进行，不同于传统基因芯片的扩增后杂交检测。
7.根据权利要求1所述的一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，基因芯片最终的信号识别过程中只有延伸探针有检测标记且检测标记整合在探针延伸链中，信号检出时的信噪比更高。
8.根据权利要求1所述的一种检测SNP的基因芯片及其使用方法，其特征在于，利用Click反应完成标记dNTP的最终修饰并形成可检测信号。
9.保护一种检测SNP的基因芯片及其使用方法在生命科学与医疗健康领域的应用。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN116790724A (zh) * | 2023-06-27 | 2023-09-22 | 北京百奥纳芯生物科技有限公司 | 一种检测单个碱基差异的方法及基因芯片 |
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- 2020-12-28 CN CN202011575289.1A patent/CN114686567A/zh not_active Withdrawn
Cited By (2)
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| CN116790724A (zh) * | 2023-06-27 | 2023-09-22 | 北京百奥纳芯生物科技有限公司 | 一种检测单个碱基差异的方法及基因芯片 |
| CN116790724B (zh) * | 2023-06-27 | 2024-04-12 | 北京百奥纳芯生物科技有限公司 | 一种检测单个碱基差异的方法及基因芯片 |
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