CN101137759A

CN101137759A - 基因检测方法

Info

Publication number: CN101137759A
Application number: CNA200680005232XA
Authority: CN
Inventors: 后藤雅宏; 一濑博文; 北冈桃子; 冈村畅子
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2005-02-18
Filing date: 2006-02-17
Publication date: 2008-03-05
Also published as: JPWO2006088126A1; EP1862558A4; US7838269B2; AU2006215038B2; JP4937106B2; EP1862558A1; AU2006215038A1; WO2006088126A1; US20080274464A1

Abstract

本发明公开一种判定靶基因中的特定碱基的变异或存在与否的基因检测方法。该方法为，将靶基因样品和相对于该样品的具有野生型或标准型碱基序列的对照基因样品，各自(i)供于PCR反应，进行扩增，该PCR反应使用包含5’末端带有RNA聚合酶启动子序列的引物的引物对；(ii)将所述PCR反应中得到的双链DNA进行体外转录反应，形成单链RNA；(iii)将单链DNA上结合有荧光色素的荧光标记探针与所述单链RNA杂交，形成RNA/DNA杂交物，其中，单链DNA含有与所述对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列，(iv)将来源于靶基因样品的RNA/DNA杂交物与来源于对照基因样品的RNA/DNA杂交物的荧光强度进行比较。

Description

基因检测方法

技术领域

本发明涉及出于各种目的，判定基因中特定(位置的)碱基变异或碱基存在与否的基因检测方法。

背景技术

人类基因组计划结束后，确定了人的全部碱基序列，随着各种基因的存在和其功能的阐明，检测出各基因的变异或异常，来作为开发所谓后基因组的药剂和治疗诊断法等的手段，也愈加重要。期待着例如，检测出人体中一个碱基水平的变异，即单核苷酸多态性(SNP)，基于该SNP信息，使符合患者个人差别的定制(特制)医疗成为可能。

而且，近年来，从防止食品的伪装表示，确保消费者要求的农产品，水产品、畜产品的安全性的角度考虑，对这些食品原材料进行DNA分析的必要性也逐渐提高。

进而，作为确认应对于自然或人为的环境变化，而存在于地中、水中、大气中等的微生物等的有害性、无毒化的手段，知道该微生物基因的变化(例如，与有害性相关的特定碱基存在与否)也变得重要。

出于上述目的的基因检测中，过去主要采用的技术是用PCR反应扩增靶基因，将其用直接测序法或毛细管电泳法进行解析，来判别变异的存在。进而，还知道定量靶基因，解析多型·变异的实时定量PCR法(例如，特开2002-275号公报(专利文献1)，特开2002-119291号公报(专利文献2))，该方法采用荧光色素标记的核酸探针作为引物，来监测PCR反应。

但是，在这些技术中，通过PCR得到的DNA量有限，为了得到重现性和可信度高的结果，就需要高水平的知识和熟练的技术。而且，也有一些问题，如：需要DNA测序仪等昂贵的分析机器，需要长时间解析等。在进行电泳操作时就需要花费更长的时间用于分析。

专利文献1：日本特开2002-275号公报

专利文献2：日本特开2002-119291号公报

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的是提供一种新的基因检测技术，它可以用少量的样品就能够进行高精度的分析，并能够简便地判定基因中特定碱基的变异或特定碱基的存在与否(有无)。

解决问题的手段

本发明人经过不断研究后发现：通过将靶基因转录成RNA，将此RNA与荧光标记的探针杂交，进一步优选把得到的杂交物用核糖核酸酶进行处理，可以达到上述目的。

因此，本发明提供一种判定靶基因中的特定碱基的变异或特定碱基存在与否的基因检测方法，其特征为包含以下各工序：将所述靶基因的样品和相对于该样品的具有野生型或标准型碱基序列的对照基因的样品，各自(i)供给PCR反应，进行扩增，该PCR反应中使用包含5’末端带有RNA聚合酶启动子序列的引物的引物对；(ii)将所述PCR反应中得到的双链DNA进行体外转录反应，形成单链RNA；(iii)将单链DNA上结合有荧光色素的荧光标记探针与所述的单链RNA杂交，形成RNA/DNA杂交物，其中，单链DNA含有与所述对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列；(iv)将来源于靶基因样品的RNA/DNA杂交物与来源于对照基因样品的RNA/DNA杂交物的荧光强度进行比较。

根据本发明的优选实施方式，在上述(iii)的形成RNA/DNA杂交物的工序中，将单链DNA上结合消光色素的荧光消光探针与所述的单链RNA杂交，其中，所述单链DNA含有与所述对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列，所述消光色素具有将所述荧光色素消光的功能。

根据本发明其他的优选实施方式，将在所述工序(iii)中得到的RNA/DNA杂交物用核糖核酸酶(RNase)进行RNA分解反应后，再进行工序(iv)的荧光强度的比较。

发明效果

根据本发明，通过将基因样品的PCR产物进行体外转录反应，可以制造出浓度是以往方法的100倍以上的作为单链RNA的基因样品。即，克服了只利用PCR的以往方法中，由于样品量的限制导致可靠性下降的问题。而且，发明方法的技术避免了电泳操作，与以往的方法相比可以大幅度的缩短分析时间。在本发明方法中的一系列操作，不特别需要专业知识和熟练技术就能够简便而迅速地进行。进而，从不需要基因测序仪等特殊的分析仪器方面来看，本发明的技术是适用于多种研究设备的分析技术。

附图说明

图1表示构成本发明的基因检测方法的各工序。

图2表示作为本发明的适用例，HBV的基因序列(A)和RNA/DNA杂交物(实施例1)。

图3表示根据本发明，用荧光消光率检测出HBV的基因变异(实施例1)。

图4表示作为本发明的适用例，醛氢化酶(aldehyde hydrogenase)基因序列和用于检测其变异的荧光标记探针(实施例2)。

图5表示根据本发明，通过荧光消光率同时检测出HBV基因及ADRB2基因的变异(实施例3)。

图6表示作为本发明的适用例，在HBV基因中，除荧光标记探针之外，还并存有荧光消光探针时的杂交物(实施例1)。

图7表示根据本发明，在检测出HBV基因变异时，通过使荧光标记探针和荧光消光探针并存，使消光率变大，能够以更高的灵敏度来进行变异检测(实施例1)。

图8表示本发明的判别金枪鱼品种的实施例中，各种金枪鱼的基因序列和使用的荧光标记探针与消光标记探针(实施例4)。

图9表示根据本发明，通过测定荧光消光率来进行金枪鱼品种判别的结果(实施例4)。

具体实施方式

以下，按照图1中所示的构成本发明的基因检测方法的各工序，来详细说明本发明的实施方式。

PCR反应

在依照本发明的基因检测中，靶基因的样品(被检测基因的样品)和对照基因的样品(相对于上述靶基因而具有野生型或标准型碱基序列的基因样品)，首先是供于PCR(聚合酶链反应)反应，而本发明的特征是，在随后的工序中，以PCR产物为模板，大量地合成单链RNA，使样品量得到飞跃性的增长。因此，各基因样品通过PCR反应扩增时，除了像通常的PCR反应那样使用各基因的特异性引物之外，还使用5’末端具有RNA聚合酶启动子序列的引物作为引物。

本发明中的PCR反应，除了使用具有RNA聚合酶启动子序列的引物之外，并无特别之处，在由双链DNA构成的靶基因样品或对照基因的样品中，除了如上的引物之外，还各自添加dNTP、耐热性DNA聚合酶，然后如本领域中熟知地，反复进行双链DNA的热变性、引物的退火和利用聚合酶的延伸反应(通常，30～40个循环)。

在本发明的基因检测方法的PCR工序中，添加于引物5’末端的RNA聚合酶启动子序列是依赖于DNA的RNA聚合酶(转录酶)的启动子序列。作为优选的RNA聚合酶启动子序列的例子，可以例举出T7RNA聚合酶识别序列[5’-TAATACGACTCACTATAGGG(序列号：1)-3’]，但不限于此，还可以使用除此之外的SP3RNA聚合酶等。

在本发明方法的PCR工序中所使用的耐热性DNA聚合酶，可以使用在该领域常用的酶，例如有宝酒造(株)在市场上销售的商品名为Pyrobest的酶，但并不仅限于此。

体外转录反应

根据本发明，将通过如上的PCR反应得到的双链DNA用于体外转录反应。此处，因为作为PCR产物的双链DNA在5’末端一侧具有RNA聚合酶启动子序列，所以可以通过RNA聚合酶的作用进行转录反应，得到以PCR产物为模板的单链RNA。

该体外转录反应，可以用市售的体外转录反应试剂盒来进行。作为适用于本发明使用的体外转录反应试剂盒，可以例举出，“T7RiboMAXTM大规模RNA直达生产系统(T7RiboMAXTM Express Large Scale RNA ProductionSystem)”(Promega公司)，但并不只限于此。

只利用PCR反应扩增的DNA有限，得到微量的DNA，但在本发明中，通过将PCR产物用于体外转录反应，可以使基因样品(靶基因样品和对照基因样品)的量以单链RNA的形式大量增加(通常是100倍以上的浓度)。

杂交

在依照本发明的基因检测方法中，将用如上体外转录反应得到的单链RNA与荧光标记探针进行杂交，形成RNA/DNA杂交物(双链体)。荧光标记探针是在单链DNA上结合有荧光色素的DNA，该单链DNA含有与对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列。这里，荧光色素与该探针的末端(5’末端或3’末端)的碱基共价结合，并且，优选设计的荧光标记探针是这样的：作为检测对象的碱基尽可能接近结合有该荧光色素的碱基，即，存在于该末端或在离末端碱基3个碱基以内的位置上。

图2显示了以上的靶基因的碱基序列和荧光标记探针的关系。图2中的(A)是以定制治疗为目标的单核苷酸多态性的例子，显示出拉米夫定疗法有效的野生型人肝炎病毒(HBV)基因的碱基序列(序列号：2)和拉米夫定疗法无效的变异型人HBV基因的碱基序列(序列号：3)，认为是由于野生型中的碱基G突变成碱基T使得野生型中的氨基酸M(赖氨酸)突变成I(异亮氨酸)，从而具有了拉米夫定耐性。图2中的(B)表示的是为了依照本发明检测出这样的单核苷酸多态性而设计的荧光标记探针。被标记(标签化)的探针(5’-CAT ATAACT GAAAGC CAAAC-3’)(序列号：4)在5’末端的碱基上结合有荧光色素，在图的例子中，对应该末端碱基的部位上，存在靶基因(作为单链RNA)中作为检测对象的碱基。

因此，通过比较来源于被检测靶基因样品的RNA/DNA杂交物(图2(B)中下方显示)和来源于对照基因样品的RNA/DNA杂交物(图2(B)中上方显示)的荧光强度，可以检测出基因的变异。在图2的例子中，来源于检测对象的碱基为G的野生型(对照基因)的RNA/DNA杂交物，与来源于该位点变异的(用X表示)变异型的RNA/DNA杂交物相比，荧光的消光程度大(参照后面的实施例)。

在本发明中，作为单链DNA共价结合的荧光色素，可以使用已知的各种荧光色素。优选的荧光色素如FITC(异硫氰酸荧光素)，TAMRA(5-羧基四甲基若丹明)，FAM(5-羧基荧光素)，HEX(6-羧基-2’，4，4’，5’，7，7’-六氯荧光素)，若丹明(Rhodamine)，Cy3(吲哚二碳菁-3-1-O-(2-氰乙基)-(N，N’-二异丙烷))等，但并不只限于此。

根据本发明的优选实施方式，对于用已述的体外转录反应得到的单链RNA，除荧光标记探针之外，还与消光标记探针杂交。消光标记探针，是在含有与对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列的单链DNA上，结合有具有使荧光色素消光功能的消光色素(包含具有与荧光色素的荧光放射范围重叠的吸收带的分子)的探针。

通常，荧光色素和消光色素各自结合在荧光标记探针和消光标记探针的末端。将荧光色素结合在荧光标记探针的5’末端时，就让消光色素结合在消光探针的3’末端；或者与此相反。无论哪种情况，作为检测对象的碱基，都要尽可能的接近结合有荧光色素和消光色素的碱基，即，存在于该末端或者在离末端碱基3个碱基以内的位置上(参照图6和图9)。

可以使用的荧光色素和消光色素的组合并无特别限制，但作为优选的例子，可以例举如相对于荧光色素FITC的消光色素BHQ-1[4’-(2-硝基-4-甲苯酰基重氮基)-2’-甲氧基-5’-甲基-偶氮苯-4”-(N-乙基)-N-乙基-2-氰基乙基-(N，N’-二异丙烷)]。此外，相对于荧光色素若丹明、TAMRA或Cy3等，可以使用消光色素BHQ-2[4’(4-硝基-苯基重氮基)-2’-甲氧基-5’-甲氧基-偶氮苯-4”-(N-乙基-2-O-(4，4’-二甲氧基三苯甲基))-N-乙基-2-O-乙醇酸]等。

如上所述，在使用将荧光标记探针和消光标记探针杂交于RNA上的杂交物的荧光测定体系中，可以得到非常大的消光率，能够以高精度检测出靶基因中特定碱基的变异和存在与否。

在单链DNA上结合有荧光色素的荧光标记探针，如前所述，以往被用作监测PCR反应的实时定量PCR法的引物(专利文献1和2)，但是，像本发明这样，将基因样品制成单链RNA，使其与荧光标记探针进行杂交，进而优选也进行消光标记探针的杂交，为了检测基因而比较荧光强度，这样使用的例子以往是没有的。

本发明的基因检测方法，适用于检测出1碱基水平的基因变异，即单核苷酸多态性。图1和图2例示了存在单个的1碱基变异的情况，但本发明的方法对存在多个1碱基变异的靶基因样品也同样适用。此时，作为检测对象的1碱基之间优选至少相隔约30个碱基，这些作为检测对象的碱基各自要尽可能接近地与荧光色素结合，并且该荧光色素最好是互相有别的物质。进而，对于具有1碱基变异的多个靶基因，本发明也适用于同时检测出这些变异的情况。

RNA分解

依照本发明，通过比较按照上述方法得到的由靶基因样品而得的RNA/DNA杂交物和由对照基因样品而得的RNA/DNA杂交物的荧光强度，可以检测出基因变异，但在本发明特别优选的实施方式中，将这些RNA/DNA杂交物用RNase(核糖核酸酶)进行RNA分解反应后，再进行荧光强度的比较。通过此种手段，将没有和荧光标记探针杂交的RNA部分分解除去后，荧光强度(荧光消光率)的差变得更显著，利用这种比较，可以变得简便且精确地进行检测变异。进而，如上所述，将荧光消光探针与并存的荧光标记探针尽可能的接近，能够得到显著大的消光率，可以以更高的精度检测出变异，其中，荧光消光探针结合的分子具有与荧光标记探针的荧光发光范围相重叠的吸收带。

下面，将展示实施例，以对本发明的特征做更加具体的说明，但本发明不只限于这些实施例。

实施例1

<检测B型肝炎病毒基因中的变异>

1.1制作DNA样品(PCR)

质粒基因(pUC18的Sma I位点上连接有B型肝炎病毒的基因)含有图2的(A)中作为探测基因而例示的B型肝炎病毒的基因[野生型(对照基因)和变异型(靶基因)]，用此质粒基因作为模板，进行各自的PCR反应，得到含有解析对象(检测对象)部位的基因片断。在PCR引物中使用5’末端上添加有T7RNA聚合酶启动子序列的引物1(序列号：5)和基因的特异性引物2(序列号：6)，通过Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶(TaKaRa)进行反应。反应条件如下所示。

PCR反应组成(100μl)：模板DNA(<1μg)，Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶(2.5unit)，引物1(1μM)，引物2(1μM)，dNTP(200μM)，1×Pyrobest缓冲液II。

PCR条件：进行热变性(95℃，5分钟)1个循环后，进行[热变性(95℃，15秒)-退火(55℃，30秒)-延伸反应(72℃，30秒)]35个循环。

引物1：

5’-ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGC-3’

引物2：

5’-GGTACCCCAACTTCCAATTACATAT-3’

1.2制作RNA样品(体外转录反应)

将通过1.1中所示的工序而得到的PCR产物用于体外转录反应，制作出单链RNA。转录反应是由T7RiboMAX^TM大规模RNA直达生产系统(Promega)来进行的。RNA产物通过乙醇沉淀进行回收，将其再溶解于灭菌水中，制成RNA样品。反应条件如下所示。

反应组成(20μl)：PCR反应液(2μl)，酶混合物(Enzyme Mix)，T7Express(2μl)，1×RiboMAX^TMExpress T7缓冲液

反应条件：合成反应(30℃，30分钟)后，利用Dr.GenTLE^TM沉淀载体(Dr.GenTLE^TMPrecipitation Carrier)(TaKaRa)，回收RNA样品。

1.3.1杂交及RNA分解

如图2(B)中所示，将在5’末端结合有各种荧光色素的寡DNA(oligo DNA)(5’-CATATAACTGAAAGCCAAAC-3’)作为荧光标记探针使用。

将荧光标记探针(40pmol)溶解于1mL的杂交缓冲液(10mMTris-HCl，10mM MgCl₂，pH7.0)中来测定荧光强度。以得到的荧光强度值为F0。将RNA样品(15μl)添加其中，得到RNA/DNA的杂交物。用核糖核酸酶A(0.5μg)对其作用后，测定其荧光强度值，以此值为F1。通过下面的计算式1进行修正计算，算出消光率(Qr)。

结果如图3所示。从一系列的结果中可以看出，在RNA样品与荧光标记探针完全互补时(即，在由检测对象部位的碱基是G的对照(野生型)基因样品得到的RNA/DNA的杂交物中)，有高消光率，在末端部位没有互补性时(即，在由检测对象部位的碱基不是G的靶(变异型)基因样品来得到的RNA/DNA的杂交物中)，消光率显著减少。综上，通过测定杂交前后的荧光强度值，对其计算修正，可以检测出基因的变异。

1.3.2荧光标记探针和荧光消光探针并存时的变异检测

另外，如图6中所示，将5’末端结合有荧光色素(FITC)的寡DNA(5’-CCATATAACTGAAAGCCAAA-3’)和3’末端结合有消光色素(BHQ-1)的寡DNA(5’-GGCCCCCAATACCACATCAT-3’)分别作为荧光标记探针和荧光消光探针来使用。

将荧光标记探针(20pmol)和荧光消光探针(100pmol)溶解在1mL的杂交缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，pH7.0)中，测定出荧光强度。以得到的荧光强度值为F0。将RNA样品(15μl)添加其中，得到RNA/DNA的杂交物。用核糖核酸酶A(0.5μg)对其作用后，测定其荧光强度值，以此值为F1。通过下面的计算式1进行修正计算，算出消光率(Qr)。

结果如图7所示。从一系列的结果中可以看出，在RNA样品与荧光标记探针完全互补时(即，在由检测对象部位的碱基是G的正常(野生型)靶基因样品来得到的RNA/DNA的杂交物中)，有高消光率，在末端部位没有互补性时(即，在由检测对象部位的碱基不是G的被检(变异型)靶基因样品来得到的RNA/DNA的杂交物中)，消光率显著减少。综上，通过测定杂交前后的荧光强度值，对其计算修正，可以检测出基因的变异。

[数1]

计算式1 Qr＝(F0-F1)/F0×100(％)

实施例2

<检测醛氢化酶中的变异>

2.1DNA样品的制作(PCR)

质粒基因(pUC18的Sma I位点上连接有醛氢化酶基因)含有图4中所示的作为检测基因的人醛氢化酶(野生型和变异型)基因，以质粒作为模板进行各自的PCR反应，得到含有检测对象部位的基因片断。在PCR引物中，使用的是5’末端添加T7RNA聚合酶启动子序列的引物1(序列号：7)和基因特异性引物2(序列号：8)，通过Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶(TaKaRa)进行反应。反应条件如下所示。

PCR条件：热变性(95℃，5分钟)进行1个循环后，进行[热变性(95℃，15秒)-退火(55℃，30秒)-延伸反应(72℃，30秒)]35个循环。

引物1：

5’-ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGTCAACTGCTATGATGTG-3’

引物2：

5’-CCACACTCACAGTTTTCACTT-3’

2.2RNA样品的制作(体外转录反应)

将通过2.1中所示的工序得到的PCR产物进行体外转录反应，制作出单链RNA。转录反应通过T7RiboMAX^TM大规模RNA直达生产系统(Promega)进行。RNA产物经过乙醇沉淀进行回收，将其再溶解于灭菌水中制成RNA样品。反应条件如下所示。

反应组成(20μL)：PCR反应液(1μL)，酶混合物，T7Express(2μL)，1×RiboMAX^TM Express T7缓冲液

反应条件：合成反应(30℃，30分钟)后，用Dr.GenTLE^TM沉淀载体(TaKaRa)回收RNA样品。

2.3杂交及RNA分解

如图4所示，将3’末端结合有荧光色素TAMRA的寡DNA(5’-ACACTCACAGTTTTCACTTC-3’)(序列号9)作为荧光标记探针使用。

将荧光标记探针(40pmol)溶解在1mL的杂交缓冲液(10mMTris-HCl，10mM MgCl₂，pH7.0)中，测定出荧光强度。以得到的荧光强度值为F0。将RNA样品(15μl)添加其中，得到RNA/DNA的杂交物。用核糖核酸酶A(0.5μg)对其作用后，测定其荧光强度值，以此值为F1。通过已述的计算式1进行修正计算，算出消光率(Qr)。结果如图4所示。从图中可以看出，在只含有野生型的RNA样品(野生型纯合子)中，有高消光率(55％)。另一方面，在只含有变异型的RNA样品(变异型纯合子)中，消光率显著减少(2％)。另外，在含有野生型和变异型的杂合子中，消光率为28％。综上，通过测定杂交前后的荧光强度值，对其计算修正，可以检测出各等位基因的变异。

实施例3

<同时检测ADRB2和HBV基因中的变异>

3.1DNA样品的制作(PCR)

质粒基因含有作为检测基因的人β2-肾上腺素能受体(β2-AdrenergicReceptor：ADRB2)基因(野生型和变异型)，以此质粒基因为模板进行各自的PCR反应，得到含有检测对象部位的基因片断。在PCR引物中，使用的是5’末端添加T7RNA聚合酶启动子序列的引物1(序列号：9)和基因特异性引物2(序列号：10)，通过Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶(TaKaRa)进行反应。反应条件如下所示。

引物1：

5’-ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGCAACCCGGGAACGGCAG-3’

引物2：

5’-ATTGCCAAACACGATGGCCA-3’

对于HBV基因，使用和已述的实施例1中1.1同样的条件进行PCR反应。

3.2RNA样品的制作(体外转录反应)

将通过3.1中所示的工序得到的2种PCR产物进行体外转录反应，制作出单链RNA。转录反应通过T7RiboMAX^TM大规模RNA直达生产系统(Promega)进行。RNA产物经过乙醇沉淀进行回收，将其再溶解于灭菌水中制成RNA样品。反应条件如下所示。

反应组成(20μL)：PCR反应液(1μL)，酶混合物，T7Express(2μL)，1RiboMAX^TM Express T7缓冲液

3.3杂交及RNA分解

将5’末端结合有荧光色素FITC的用于HBV的寡DNA(5’-CCATATAACTGAAAGCCAAAC-3’)(序列号11)和将3’末端结合有荧光色素TAMRA的用于ADBR2的寡DNA(5’-ACCCACACCTCGTCCCTTTC-3’)(序列号12)作为荧光标记探针使用。

将各荧光标记探针(40pmol)溶解在1mL的杂交缓冲液(10mMTris-HCl，10mM MgCl₂，pH7.0)中，测定来源于FITC和TAMRA的荧光的强度。以得到的荧光强度值为F0。将RNA样品(15μl)添加其中，得到RNA/DNA的杂交物。用核糖核酸酶A(0.5μg)对其作用后，测定其荧光强度值，以此值为F1。通过已述的计算式1进行修正计算，算出消光率(Qr)，将其进行计算修正。结果如图5所示。各自的Qr给出对应于各荧光探针互补性的值，可以同时检测出不同的多个SNPs部位。这些结果显示出，根据本发明，可以同时检测出不同基因链或同一基因链内存在的多处SNPs。

实施例4

<根据基因变异判别金枪鱼品种>

4.1DNA样品的制作(PCR)

以作为检测样品的不同品种金枪鱼的线粒体DNA为模板，进行各自的PCR反应，得到含有解析对象(检测对象)部位的基因片断。在PCR引物中，使用的是5’末端添加T7RNA聚合酶启动子序列的引物1(序列号：13)和基因特异性引物2(序列号：14)，通过Pyrobest(注册商标)DNA聚合酶(TaKaRa)进行反应。反应条件如下所示。

引物1：

5’-ATGATCACTAATACGACTCACTATAGGGACTTGCATTCCCTCTCTG-3’

引物2：

5’-TTAGAAGGAAAAGTAGGGTTGCTGTTAG-3’

4.2RNA样品的制作(体外转录反应)

将通过4.1中所示的工序得到的PCR产物进行体外转录反应，制作出单链RNA。转录反应通过T7RiboMAX^TM大规模RNA直达生产系统(Promega)进行。RNA产物经过乙醇沉淀进行回收，将其再溶解于灭菌水中制成RNA样品。反应条件如下所示。

反应组成(20μL)：PCR反应液(2μL)，酶混合物，T7Express(2μL)，1×RiboMAX^TM Express T7缓冲液

4.3荧光标记探针和荧光消光探针并存时的变异检测

如图8中所示，将5’末端结合有荧光色素(FITC)的寡DNA(5’-GAAGGACAGTTGCTGCTGTA-3’)(序列号：15)和3’末端结合有消光色素(BHQ-1)的寡DNA(5’-TACAGTTGGCATTAGTGGTA-3’)(序列号：16)分别作为荧光标记探针和荧光消光探针来使用。

将荧光标记探针(20pmol)和荧光消光探针(100pmol)溶解在1mL的杂交缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgCl₂，pH7.0)中，测定出荧光强度。以得到的荧光强度值为F0。将RNA样品(15μl)添加其中，得到RNA/DNA的杂交物。用核糖核酸酶A(0.5μg)对其作用后，测定其荧光强度值，以此值为F1。通过已述的计算式1进行修正计算，算出消光率(Qr)。在该例子中，以判断太平洋产蓝鳍金枪鱼为目的，以它的基因作为靶基因(序列号：17)。

结果如图9所示。从一系列的结果中可以看出，在RNA样品与荧光标记探针完全互补时(即，在由检测对象部位的碱基是T的对照基因样品得到的RNA/DNA的杂交物中)，有高消光率，在末端部位没有互补性时(即，在由检测对象部位的碱基不是T的靶基因样品得到的RNA/DNA的杂交物中)，消光率显著减少。综上，通过测定杂交前后的荧光强度值，对其计算修正，可以判断出太平洋金枪鱼的品种。

工业上的应用性

本发明的方法可以通过少量的样品，在不需要特殊分析仪器的情况下，简便地判断出基因中特定碱基的变异或存在与否，因而可以期望用于以基因解析为基础来开发用于疾病诊断、预防或治疗的手段和药剂，或者农、水、畜产品品种的确定和品种改良，环境变化的评价等产业的众多领域。

序列表

<110> 独立行政法人科学技术振兴机构

<120> 基因检测方法

<160> 17

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人类

<400> 1

taatacgact cactataggg

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> B型肝炎病毒

<400> 2

cccactgttt ggctttcagt tatatggatg atgtggtatt gggggccaag tc

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> B型肝炎病毒

<400> 3

cccactgttt ggctttcagt tatattgatg atgtggtatt gggggccaag tc

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catataactg aaagccaaac

<210>5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgatcacta atacgactca ctatagggct ttcccccact gtttggc

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggtaccccaa cttccaatta catat

<210> 7

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

atgatcacta atacgactca ctatagggtc aactgctatg atgtg

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

ccacactcac agttttcact t

<210> 9

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

atgatcacta atacgactca ctatagggca acccgggaac ggcag

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

attgccaaac acgatggcca

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

ccatataact gaaagccaaa c

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

acccacacct cgtccctttc

<210> 13

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

atgatcacta atacgactca ctatagggac ttgcattccc tctctg

<210> 14

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

ttagaaggaa aagtagggtt gctgttag

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

gaaggacagt tgctgctgta

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400>

tacagttggc attagtggta

<210> 17

<211> 57

<212> DNA

<213> 蓝鳍金枪鱼

<400>

aactaatcgc tacagcagca actgtcctcc taccactaat gccaactgta gctatcc

Claims

1.一种基因检测方法，其为判定靶基因中的特定碱基的变异或特定碱基存在与否的基因检测方法，其特征在于，包含如下各工序：将所述靶基因的样品和相对于该靶基因的具有野生型或标准型碱基序列的对照基因的样品，各自(i)供给PCR反应，进行扩增，该PCR反应中使用包含5’末端带有RNA聚合酶启动子序列的引物的引物对，(ii)将所述PCR反应中得到的双链DNA进行体外转录反应，形成单链RNA，(iii)将单链DNA上结合有荧光色素的荧光标记探针与所述单链RNA杂交，形成RNA/DNA杂交物，其中，所述单链DNA含有与所述对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列，然后，(iv)将由靶基因样品得到的RNA/DNA杂交物与由对照基因样品得到的RNA/DNA杂交物的荧光强度进行比较。

2.根据权利要求1中所述的方法，其中，在所述(iii)的形成RNA/DNA杂交物的工序中，使在单链DNA上结合了具有将所述荧光色素消光功能的消光色素的荧光消光探针与所述的单链RNA杂交，其中所述单链DNA含有与所述对照基因碱基序列的至少一部分互补的序列。

3.根据权利要求1或2中所述的方法，其中，将在所述工序(iii)中得到的RNA/DNA杂交物用核糖核酸酶进行RNA分解反应后，再进行工序(iv)的荧光强度的比较。