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CN1403452A - 具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙 - Google Patents

具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙 Download PDF

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CN1403452A
CN1403452A CN 01126608 CN01126608A CN1403452A CN 1403452 A CN1403452 A CN 1403452A CN 01126608 CN01126608 CN 01126608 CN 01126608 A CN01126608 A CN 01126608A CN 1403452 A CN1403452 A CN 1403452A
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胡之壁
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Abstract

本发明是具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙，涉及中药技术领域。本发明提供了中药黄芪中的有效成分毛蕊异黄酮及其糖甙。该有效成分具有很好的抗心肌缺血作用，可以开发抗心肌缺血缺氧药物。

Description

具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙
技术领域
本发明涉及中药技术领域。具体涉及具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙。
背景技术
黄芪(Astragalus membranaceus)属豆科植物，性味甘、微温，归脾、肺经，主要功效为补气固表，利尿托毒、排脓，敛疮生肌，是中药补气药中最重要的药物之一。现代医学研究证明黄芪具有调节免疫功能、延缓衰老、促进骨髓造血和血细胞生成。目前，对黄芪研究最多、最广泛和最深入的是在心血管效应方面。众多的临床观察和实验研究表明黄芪对心脏具有良好的保护作用，在临床上能用于治疗冠心病心绞痛、心力衰竭、高血压、低血压、病毒性心肌炎、心律失常等。黄芪的化学研究表明黄芪中主要的活性成分为黄酮类、皂甙类、多糖类以及氨基酸、磷脂及微量元素。黄芪中的主要黄酮有芒柄花素、毛蕊异黄酮、黄芪异黄烷甙等近20种。
尽管黄芪对心血管的作用是肯定的，但就目前的研究而言，黄芪对心血管效应方面的药效物质是不清楚的。因此，有必要在现有的研究基础上进行深入的研究，阐明黄芪在心血管疾病治疗方面的药效物质基础和作用机制，
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于对黄芪中的有效成分进一步研究，开发具有抗心肌缺血作用的药物。
本发明提供了一种具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮(Calycosin)及其糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucoside)。
具有下列结构式：
毛蕊异黄酮(calycosin)MW＝284毛蕊异黄酮糖甙HPCL图谱见图4。
Figure A0112660800042
毛蕊异黄酮糖甙(Calycosin-7-O-β-D-glucos ide)MW＝446
毛蕊异黄酮糖甙HPLC图谱见图5。
本发明的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙的药理作用如下：
毛蕊异黄酮糖甙对大鼠心肌缺血-再灌注损伤的保护作用：
Wistar种大鼠离体心脏的LVDP(左室发展压力)、LEDVP(左室舒张末压)、±dP/dtmax(左室内压的最大上升和下降速率)和冠脉灌注压(CPP)经压力换能器连接生理信号处理系统记录。实验结果见表1。结果表明10-4M的毛蕊异黄酮糖甙能够抑制LVDP、±dP/dtmax的下降，抑制LVDP和CPP的上升。该研究说明毛蕊异黄酮糖甙具有较明显的抗心肌缺血和缺血-再灌注损伤的作用，生化指标正在测试中。此外，对急性心肌缺血的作用和心肌梗塞后的心肌重构作用，已经开始。
          表1  毛蕊异黄酮糖甙(10-4M)对大鼠离体心脏缺血-再灌注损伤作
               用的血流动力学观察(x±s)
组别 n 时间       LVDP(mmHg)      LVEDP(mmHg)     +dp/dtmax(mmHg/s)       -dp/dtmax(mmHg/s)      CPP(mmHg)
对照组  8 缺血前 66.3±3.5 4.8±1.7 2650.1±173.2 1050.1±100.0 57.0±3.6
 8 再灌注5′ 9.0±2.3 66.3±6.3 187.5±47.9 137.5±75.1 73.8±4.8
 8 再灌注10′ 9.8±2.1 72.5±6.5 175.0±28.9 115.0±43.6 78.0±4.3
 8 再灌注15′ 12.5±2.9 73.8±10.3 186.5±25.1 115.6±43.6 76.3±4.7
 8 再灌注20′ 12.0±4.3 76.7±12.6 177.0±64.5 109.5±42.5 79.5±6.4
 8 再灌注25′ 14.5±5.2 77.8±14.2 162.5±45.9 97.5±45.0 80.8±8.1
 8 再灌注30′ 17.1±3.6 78.3±13.1 187.2±100.2 94.3±40.0 81.8±9.5
治疗组  8 缺血前 67.3±2.3 5.0±2.6 2766.2±115.5 1066.1±57.7 54.3±1.7
 8 再灌注5′ 21.7±5.8* 46.7±12.6* 900.3±264.6* 400.0±101.2* 65.7±4.1*
 8 再灌注10′ 30.0±8.7* 43.7±14.2* 1033.3±404.1* 433.3±152.8* 67.0±2.6*
 8 再灌注15′ 45.0±10.1* 36.7±7.6* 1066.7±152.8* 600.1±173.2* 65.3±2.2*
 8 再灌注20′ 46.7±10.4* 41.3±11.0* 1031.3±152.8* 633.2±152.8* 63.7±3.5*
 8 再灌注25′ 43.3±7.6* 44.7±13.8* 933.4±115.5* 600.2±173.2* 64.7±4.0*
 8 再灌注30′ 46.7±5.8* 45.2±12.1* 900.2±100.3* 533.0±152.8* 67.3±2.5*
与对照组比较*P＜0.05
毛蕊异黄酮对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)缺氧的保护作用：
血管内皮细胞经缺氧处理60-480分钟，HUVEC单层对分子量4,4000及77,000 FITC-右旋糖苷的通透性与对照值比较，明显增加(表2、3)。当内皮细胞在缺氧的同时，加入毛蕊异黄酮，HUVEC单层对右旋糖苷通透性明显减少，毛蕊异黄酮抑制HUVEC单层通透性增加是浓度依赖性的(表4)，说明毛蕊异黄酮具有保护内皮缺氧的作用。表2  毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层通透性(分子量＝4,4000
 FITC-右旋糖苷，P)作用(x±s)
  剂量                          P(cm·s-1)
            n
 (mol/L)           60min       120min        240min        480min对照    -       6    10.3±0.60  10.6±0.70    10.9±0.70     15.5±0.80缺氧    -       7    13.6±0.90  18.3±0.80    23.3±1.30     28.9±1.00
  3×10-4  3    13.8±0.70  15.6±0.42**  17.4±0.58**   29.2±0.60毛    1×10-4  3    13.9±0.32  16.5±1.30*   19.9±0.56*    29.2±0.60蕊    3×10-5  3    14.2±0.91  17.2±0.55    19.9±1.04*    30.6±0.47异
  3×10-6  4    13.5±1.01  17.2±1.25    20.4±0.81*    10.8±0.89黄
  3×10-7  4    14.1±0.59  17.9±0.59    21.8±1.36     11.7±1.14酮
  3×10-8  4    13.7±0.84  18.6±0.98    24.5±1.81     10.±0.59
与缺氧比较：*p＜0.05、**p＜0.01表3  毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层通透性(分子量＝77,000
 FITC-右旋糖苷，P)作用(x±s)
    剂量                         P(cm·s-1)
             n
   (mol/L)              60min       120min       240min        480min对照      -      6        3.8±0.50    3.8±0.41    4.6±0.55     6.5±0.57缺氧      -      7        4.4±0.60    6.4±0.36    8.7±0.33     11.2±0.99毛     3×10-4  3        4.2±0.32    5.2±0.21*   6.1±0.31**   10.1±0.25蕊     1×10-4  3        4.2±0.40    5.4±0.20*   6.8±0.21**   10.4±0.46异     3×10-5  3        4.1±0.47    5.8±0.15*   7.0±0.22*    10.8±0.93黄     3×10-6  4        4.3±0.59    5.8±0.20    7.2±0.49*    10.8±0.89酮     3×10-7  4        4.5±0.97    6.1±0.38    7.6±0.47     11.7±1.14
   3×10-8  4        4.3±1.03    6.6±0.41    8.4±0.55     10.5±0.59
与缺氧比较：*p＜0.05、**p＜0.01
LDH含量的测定表明HUVEC单层缺氧240分钟，引起内皮细胞LDH大量释放，LDH大量释放证明了细胞的损伤程度，而毛蕊异黄酮能够显著地抑制内皮细胞LDH释放，其抑制是浓度依赖性的(表4、图6)。
表4  毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层LDH释放的抑制作
     用(x±s)
        剂量         n          LDH(IU/μl)
       (mol/L)缺氧         -           8        3827.63±721.46
       3×10-4      8        698.75±201.43**
       1×10-4      8        650.50±177.78**毛         3×10-5      8        706.50±244.59**蕊         1×10-5      8        764.25±248.71**异         1×10-6      8        778.75±243.46**黄         3×10-7      8        1244.25±341.15**酮         1×10-7      8        1856.37±428.63*
       1×10-8      8        2641.75±641.04*
       3×10-8      8        3021.00±548.28与缺氧比较：*p＜0.05、**p＜0.01
ELISA法测定HUVEC单层细胞内cAMP含量表明毛蕊异黄酮能够明显地抑制缺氧引起的HUVEC单层细胞内cAMP含量的降低(表5)。表5  毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层细胞内cAMP含量的
 影响(x±s)
 组别               n          cAMP(pmol/mg)
 对照               8           590±72.8
 缺氧               8           407±34.410-4M毛蕊异黄酮        6           549±59.8**
与缺氧比较：**p＜0.01
HUVEC单层细胞的F-肌球钙蛋白(F-actin)的荧光显微镜观察表明在正常对照的单层融合细胞，F-actin纤维是彼此平行地围绕整个细胞，其纤维的染色较深；这些纤维束通常延伸至邻近的细胞。在细胞间隙处的纤维荧光强度很强，表明这些纤维是连接纤维的接头，它们起源于细胞的外周端，通常能够分叉或再聚合(n＝6)。当血管内皮细胞经缺氧240分钟后，F-actin纤维收缩，某些地方呈断裂状，细胞间隙增宽和细胞旁路开放(n＝6)。当内皮细胞在缺氧情况下，经10-4M毛蕊异黄酮孵育240分钟，F-actin纤维出现轻微的收缩，但其形态基本正常(n＝6)。说明毛蕊异黄酮具有很强的抑制缺氧引起的F-actin纤维的收缩和细胞骨架的变化。
以上研究结果说明毛蕊异黄酮及其糖甙具有较明显的抗心肌缺血和缺血一再灌注损伤的作用，以往的文献中未见报道，因此毛蕊异黄酮及其糖甙是前景很好的抗心肌缺血缺氧的药物，具有很大市场开发前景。
附图说明图1  正常内皮细胞骨架图2  缺氧4小时后内皮细胞骨架图3  毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞骨架的影响图4  毛蕊异黄酮HPLC图谱图5  毛蕊异黄酮糖甙HPLC图谱图6  毛蕊异黄酮对缺氧引起的HUVEC单层LDH释放的抑制作用
具体实施例抗心肌缺血的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙(细胞缺氧)一、毛蕊异黄酮糖甙对心肌缺血再灌注损伤的作用毛蕊异黄酮糖甙对心肌缺血再灌注损伤的作用
                                                  毛蕊异黄酮指标         时间(分钟)       缺血模型
                                            10μM      30μM      100μM
          给药前             67              60          65         65左室发展压
          给药后             67              60          65         65(mmHg)
          再灌30             10              18          25         45左室舒张末    给药前             4               8           5          5
压        给药后             4               8           5          5(mmHg)        再灌30             79              80          65         60
          给药前             56              55          58         60冠脉压        给药后             56              55          58         60(mmHg)        再灌30             81              74          75         70最大收缩速    给药前             1600            2000        1900       1800
率        给药后             1700            2000        1900       1800(mmHg/s)      再灌30             150             300         600        1000最大舒张速    给药前             900             800         700        1000
率        给药后             900             800         700        1000(mmHg/s)      再灌30             100             100         400        600
二、毛蕊异黄酮对内皮细胞缺氧的作用
正常细胞
1.跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性
荧光物质分            通透系数(cm/s)
   子量       1小时    2小时    4小时    8小时
MW＝4400      10.4     10.7     11.6     15.6
MW＝77000     3.5      3.8      4.3      6.9
2.正常内皮细胞胞浆内cAMP含量645×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)
3.正常内皮细胞细胞骨架见图1。
缺氧细胞
1.跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性
荧光物质分                通透系数(cm/s)
   子量        缺氧1小时  缺氧2小时  缺氧4小时  缺氧8小时
MW＝4400         13.4       18.5       23.7       28.4
MW＝77000        4.8        6.6        9.0        12.6
2.缺氧4小时后内皮细胞胞浆内cAMP含量423×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)
3.缺氧4小时后内皮细胞骨架见图2。
4.缺氧4小时后内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量4625单位/毫升(IU/l)
应用毛蕊异黄酮处理后的细胞
1.毛蕊异黄酮对跨单层内皮细胞(人脐静脉内皮细胞)通透性的影
  响荧光物质分     毛蕊异黄酮                通透系数(cm/s)子量         (mmol/L)      缺氧1小时  缺氧2小时  缺氧4小时  缺氧8小时MW＝4400        3×104         13.9       16.1       17.2       29.4
            1×105         13.6       15.9       19.3       28.6
            3×105         13.4       16.0       18.7       30.5
            3×106         13.8       16.8       20.1       32.3
            3×107         14.3       18.1       21.6       31.6
            3×108         13.7       18.4       24.9       29.8MW＝77000       3×104         4.3        5.1        6.2        10.1
            1×105         4.1        5.8        6.8        10.7
            3×105         4.0        5.5        7.0        10.5
            3×106         4.6        5.7        7.2        10.9
            3×107         4.0        6.1        7.5        11.9
            3×108         4.9        6.7        8.6        10.9
2.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞胞浆内cAMP含量的作用523×10-12摩尔/毫克蛋白(pmol/mg)
3.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞骨架的影响见图3。
4.毛蕊异黄酮对缺氧4小时后内皮细胞乳酸脱氢酶(LDH)的释放量
  药物剂量(mmol/L)            LDH(IU/l)
      3×104                   642
      1×104                   955
      3×104                   686
      1×105                   759
      1×106                   1071
      1×107                   2375
      3×107                   3271
      1×108                   2119
      3×108                   3014

Claims (2)

1.一种具有抗心肌缺血作用的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙，其特征在于具有下列结构式：
Figure A0112660800021
毛蕊异黄酮MW＝284
Figure A0112660800022
毛蕊异黄酮糖甙MW＝446
2.一种如权利要求1所述的黄芪毛蕊异黄酮及其糖甙在制备抗心肌缺血缺氧药物中的应用。
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