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CN1365389A - Meg－3蛋白 - Google Patents

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CN1365389A
CN1365389A CN00809434A CN00809434A CN1365389A CN 1365389 A CN1365389 A CN 1365389A CN 00809434 A CN00809434 A CN 00809434A CN 00809434 A CN00809434 A CN 00809434A CN 1365389 A CN1365389 A CN 1365389A
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CN
China
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meg
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leu
protein
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宫田敏男
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Hei Chuanqing
Miyata Kiyoshi
Tokai University Educational System
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Abstract

本发明提供一种在肾小球膜细胞中高频表达的DNA以及该DNA所编码的蛋白(Meg－3)。这些物质可用于鉴定肾小球膜细胞和检测肾小球膜细胞中的异常状况等。此外,预计肾小球膜细胞的功能可根据上述蛋白的功能来公开,并因此使与肾小球膜细胞相关的疾病的致病机理得以澄清。另预计上述物质可用于与肾小球膜细胞相关的疾病的治疗和诊断等。

Description

MEG-3蛋白
                       技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及对肾细胞的基因的分离。
                       背景技术
体内60万亿个各种细胞基本上包含相同的基因组DNA。就正常生理功能而言，这些基因的表达由细胞系和细胞所接受的信号来严格控制。因此，阐明每类细胞中所表达的基因是非常重要的。
肾小球膜细胞在维持肾小球的结构和功能时起关键作用，它们还是每种类型的肾炎的病理生理学关键因素。例如，肾小球膜细胞的增生以及肾小球膜细胞外基质的积累被认为是各类肾小球疾病(如慢性肾炎和糖尿病性肾炎)患者体内肾小球坏死的重要病理学表现。因此，对肾小球膜细胞中特异性表达的基因的鉴定以及对其功能的阐述有助于理解肾小球膜细胞的生物学功能和与肾小球膜细胞相关的疾病的病因，并因此可对与肾小球膜细胞相关的疾病进行治疗或诊断。
已知Thy1抗原是大鼠肾小球膜细胞的标志。但该基因并非肾小球膜细胞所特有，而且不在人类的肾小球膜细胞中表达(Miyata T.等，免疫学，1989，67：531-533；和Miyata T.等，免疫学，1990，69：391-395)。已知肾小球膜细胞被激活时表达平滑肌肌动蛋白，但该基因也不是肾小球膜细胞特有的。迄今未见任何肾小球膜细胞特征性基因的报道。
本发明人曾报道MEGSIN是肾小球膜细胞中特异性表达的蛋白(临床研究杂志(J.Clin.Invest)，1998年8月15日，120：4，828-36)。本发明涉及具有不同于MEGSIN的结构的新蛋白。
                       发明内容
本发明的目的是对肾小球膜细胞中高表达的基因进行分离。
本发明人从人类肾小球膜细胞的体外培养物中分离出mRNA用于构建3’侧cDNA文库。然后，随机选择cDNA文库中的多个克隆，测定它们的序列。接着，将所测序列与得自各种器官和细胞的3’侧cDNA克隆的已知核苷酸序列进行比较，以确定肾小球膜细胞中表达的克隆。再利用该克隆的插入片段作为探针筛选从肾小球膜细胞制备的λZIPLox cDNA文库，以确定阳性克隆的核苷酸序列(3768bp)，从而完成本发明。根据所测定的核苷酸序列，确定带有Kozak翻译起始密码子的最长开放读码框的氨基酸序列。本发明人将带有该推导的氨基酸序列的本发明蛋白命名为Meg-3。人类Meg-3 cDNA的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。除了EST序列与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中距3’端300-500个碱基的核苷酸序列有90％或更高同一性以外，未发现其它序列与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有同源性。
利用SwissProt数据库对该氨基酸序列进行的氨基酸序列同源性搜索证实Meg-3是一种新蛋白。此外，还对推导的Meg-3氨基酸序列进行了基元(motif)搜索，该搜索在从N末端数第500个氨基酸之后的区域中发现一个氨基酸序列十分类似于被称为富含组氨酸之蛋白的多种蛋白。包含从第621个氨基酸至第701个氨基酸的81个氨基酸残基的区域尤其富含脯氨酸(27.2％)，并在两个位点携有氨基酸序列(xPESPPPAxP)，该序列类似于能与SH3(Src同源物3)结构域结合的富含脯氨酸的肽(PR肽)的氨基酸序列(xPxxPPPFxP)。这些发现提示，Meg-3蛋白的C末端结构可能作为PR结构域与胞内信号传递物质的SH3结构域(如属于Src家族的那些，等等)结合，而且它可能涉及信号传递途径。具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白定位于胞浆的高度可能性(52.2％)还提示Meg-3可能涉及信号传递。未发现任何其它氨基酸序列具有高于上述的与其它区(从N末端开始的1-550位氨基酸)的同一性。
人类原代细胞培养的一个特征是，Meg-3基因以特别高的水平在肾小球膜细胞中表达。在另一种原代细胞培养物中，还观察到肾皮质上皮细胞以及成纤维细胞中的表达，人类脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞中也略有表达。此外，当通过Northern印迹检测Meg-3的组织分布时，在胎盘中观察到Meg-3的高表达，其次是在胰腺中的表达。另外，可在肾脏、肺和心脏中观察到弱表达，在肝脏和骨骼肌中几乎观察不到Meg-3的表达。在脑部未见Meg-3的表达。本发明是在这些发现的基础上完成的。
本发明具体包括以下蛋白质、DNA以及它们的应用。
(1)一种含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白，或一种含有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加、和/或插入，且与含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白功能等价的蛋白。
(2)如(1)所述的蛋白，其中该蛋白含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
(3)编码如(1)所述的蛋白的DNA。
(4)如(3)所述的DNA，其中该DNA包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
(5)编码如(1)所述的蛋白或这些蛋白的功能等价物的DNA，该DNA在严谨条件下与含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA杂交。
(6)一种DNA，其与如(4)所述的DNA特异性杂交并具有至少15个核苷酸的链长。
(7)针对如(4)所述的DNA或其一部分的反义DNA。
(8)一种载体，其包含如(3)、(4)和(5)中任一项所述的DNA。
(9)一种转化体，其携有并可表达如(3)、(4)和(5)中任一项所述的DNA。
(10)产生如(1)所述的蛋白的方法，该方法包括培养如(9)所述的转化体并收集如(3)、(4)和(5)中任一项所述的DNA的表达产物。
(11)一种试剂，其用于检测含有如(6)所述之DNA的肾小球膜细胞。
(12)与如(1)所述的蛋白结合的抗体。
(13)如(12)所述的抗体，其中该抗体识别含有选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白的一部分。
(14)如(13)所述的抗体，其中该抗体为单克隆抗体。
(15)一种测量如(2)所述的蛋白或其片段的免疫试验方法，其基于如(13)或(14)所述的抗体对如(2)所述的蛋白或其片段的免疫学结合。
(16)一种用于检测肾小球膜细胞的试剂，该试剂包含如(12)-(14)中任一项所述的抗体。
(17)一种检测肾小球膜增生性肾病的方法，该方法包括测量包含在生物学样品中的如(2)所述的蛋白或其片段并将该测量值与从正常样品获得的值进行比较。
(18)一种非人类转基因脊椎动物，其中编码Meg-3的基因的表达水平已得到修饰。
(19)如(18)所述的非人类转基因脊椎动物，其中该非人类脊椎动物是小鼠。
(20)如(19)所述的非人类转基因脊椎动物，其中该非人类脊椎动物是一种基因敲除小鼠，该小鼠中编码Meg-3的基因的表达已被抑制。
为了实现以上所述，本发明人使用了一种3’-导向的(directed) cDNA文库。该方法避免了由于DNA大小的差异所致的克隆效力的差异。3’区的序列是每种基因特征性的，近200-300bp的序列就足以证实该基因的特征(Yasuda Y.，Miyata T.等，Kidney Int，1998 Jan，53：1，154-8)。
编码本发明的人类Meg-3的DNA可以通过制备肾小球膜细胞的mRNA并用已知方法将它们转化为双链cDNA来获得。mRNA可通过例如异硫氰酸胍-氯化铯法(Chirwin等，生物化学18，5294，1979)，和在有脱氧核糖核酸酶存在的情况下用一种表面活性剂以及酚处理(Berger&Birkenmeier，生物化学18，5143，1979)等来获得。从总RNA制备poly(A)+RNA可通过，例如用结合于oligo(dT)的Sepharose、纤维素、乳胶颗粒等载体进行亲和层析来买现。cDNA(第一链)可通过将上述所获的mRNA作为模板，将互补于poly(A)链3’端的寡聚(dT)和对应于Meg-3之氨基酸序列部分的随机引物或合成寡核苷酸作为引物，经逆转录酶的处理来获得。杂合子中的由mRNA及其互补cDNA组成的mRNA用大肠杆菌RNA酶H进行部分消化。以消化后的mRNA为引物，利用大肠杆菌DNA聚合酶I可合成cDNA(第二链)。最后，双链DNA可通过用大肠杆菌DNA连接酶进行处理来获得。
可将肾小球膜细胞的poly(A)+RNA作为模板，用根据人类Meg-3基因的核苷酸序列合成的引物经RT-PCR来克隆DNA。或者，不利用PCR，而是利用根据人类Meg-3基因的核苷酸序列合成的探针筛选cDNA文库而获得靶cDNA。通过在由这些方法获得的多种基因中证实本发明基因的核苷酸序列而选出本发明的基因。除人类以外的其它物种，如小鼠或大鼠中的Meg-3 cDNA同系物可利用类似方法获得。
另外，Meg-3 cDNA同系物可如下分离。用上述人类Meg-3 cDNA的核苷酸序列作探针，通过菌落杂交和空斑杂交来筛选cDNA文库，从而分离出编码Meg-3同系物的cDNA。可将分离自小鼠或大鼠组织、培养的肾小球膜细胞、等的mRNA作为模板合成所述cDNA文库。也可使用市售cDNA文库(Funakoshi，等)。参照本发明的人类Meg-3的cDNA，设计位于ORF之前和之后的简并引物来进行PCR，这是另一种扩增同系物的cDNA的可能方法。
人类Meg-3基因组可通过筛选基因组文库来获得。可通过，例如制备人类B淋巴母细胞的基因组，将用Sau3部分消化的DNA插入噬菌体载体EMBL3，从而获得基因组文库(血液(Blood)，第83卷，第11期，1994：第3126-3131页)。可通过对所述基因组文库进行空斑杂交来获得含有所需基因组的克隆(新细胞工程实验方案，秀润社，第79-92页)。Meg-3 cDNA的完整开放阅读框区(2202bp)，或利用所述cDNA的一部分作为引物经PCR扩增人类基因组DNA所得的每一外显子-内含子部分都可作为探针使用。可将培养的人类肾小球膜细胞的mRNA或人类的肾mRNA(购自Clontech)作为模板，通过5’RACE法(5’-Full RACE Core Set，参照宝酒造公司的方案)测定控制区的5’UTR序列。
本发明的基因还可利用标准的核酸化学合成法来产生，如亚磷酰胺(phosphoamidite)法(Mattencci，M.D.& Caruthers，M.H.美国化学协会杂志(J.Am.Chem.Soc.)103，3185，1981)、亚磷酸三酯法(Hunkapiller，M.等，自然310，105，1984)。
真核基因常表现出多形性，如人类干扰素基因，可利用这种多形性取代一或多个氨基酸但总体上维持蛋白的活性。一般情况下，即使有一或多个氨基酸已被修饰，也可维持蛋白的活性。因此，通过利用编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的人工修饰性基因获得的蛋白，只要该蛋白具有本发明基因的典型功能，就可将该蛋白的基因包括在本发明中。当蛋白中SEQ ID NO：2的氨基酸序列已被人为修饰时，只要该蛋白仍具有本发明蛋白的特征，就可包括在本发明中。
本发明的蛋白包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或其中已有一或多个氨基酸被取代、缺失、添加、和/或插入且功能等价于本发明的Meg-3蛋白的氨基酸序列。本发明中“功能等价”指具有与Meg-3相同的生物学特性。例如，本发明人已发现Meg-3的以下生物学特性。
Meg-3由于具有PR结构域(假定其可与SH3结构域结合)而可能与信号传递途径有关。SH3结构域是多种细胞内信号传递物质如Src家族等所具有的一种结构域。此外，由于该蛋白的胞浆部分很可能含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列(可能性为52.2％)，因此认为Meg-3很可能参与信号传递。
此外，Meg-3具有以下表达特征。首先，在人类原代细胞培养中的一个特征是，Meg-3在肾小球膜细胞中以特别高的水平表达。在其它原代细胞培养中，可观察到在肾皮质上皮细胞和成纤维细胞中的表达，以及在人类脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞中的较弱表达。此外，当通过Northern印迹检测Meg-3的组织分布时，在胎盘中观察到Meg-3的高表达，其次是在胰腺中的表达。另外，可在肾脏、肺和心脏中观察到弱表达，在肝脏和骨骼肌中几乎观察不到Meg-3的表达。在脑部未见Meg-3的表达。可利用所述每种组织的样品所制备的mRNA，并利用，例如选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列为探针，通过Northern印迹试验了解每种组织中的Meg-3表达。
在上述生物学特性方面功能等价的所有蛋白组成本发明的Meg-3。因此，本发明不仅包括结构已了解清楚的人类Meg-3，还包括在结构或功能方面等价的其它同系物。
本发明的DNA包括编码这些功能等价蛋白的DNA。编码这些蛋白的DNA可以是cDNA、基因组DNA、或合成的DNA。
目标氨基酸的密码子本身是已知的，可任选，也可根据标准方法，例如根据所用宿主中密码子的使用频率来确定(Grantham，R.等，核酸研究9，r43，1981)。因此，本发明包括已经利用密码子的简并性进行了适当修饰的DNA。利用定点诱变法等(Mark，D.F.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1984，81：5662)对这些核苷酸序列的密码子进行部分改变是可能的，这些方法以化学合成的编码所需修饰的寡核苷酸作为引物。
与包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA杂交并能编码具有本发明Meg-3的典型功能的蛋白的DNA，也包括在本发明的DNA中。能与特定序列在严谨条件下杂交的序列被认为与该特定序列所编码的蛋白具有相似的活性。严谨条件通常指以下条件。即，在4X SSC中于65℃进行杂交，然后在0.1X SSC中于65℃洗涤1小时。杂交和洗涤的温度可大大影响严谨度，它们可根据解链温度(Tm)来调整。Tm根据将要杂交的碱基对中碱基组成的比例，以及杂交溶液的组成(盐浓度、甲酰胺浓度和十二烷基硫酸钠浓度)来改变。因此，本领域技术人员可根据经验来考虑上述条件，以便设定能产生类似严谨度的相应条件。
本发明的DNA，包括突变体的核苷酸序列可用于各种基于已知技术的目的。
可将如上述克隆的Meg-3编码基因插入适当的表达载体DNA，然后转化其它原核或真核宿主。此外，可通过在所述表达载体中导入适当启动子以及与表型表达相关的序列，使该基因在每个宿主细胞中表达。可使用的表达载体有用于大肠杆菌的pET-3(Studier & Moffatt，分子生物学杂志189，113，1986)等，用于COS细胞的pEF-BOS(核酸研究18，5322，1990)，pSV2-gpt(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78，2072，1981)等，以及用于CHO细胞的pVY1(WO89/03874)等。目标蛋白可表达为靶基因与编码另一种多肽的基因的融合基因所衍生的融合蛋白。可较方便地对这类融合蛋白进行纯化并分离出所需蛋白。组氨酸标签、c-myc标签、MBP标签、GST标签等是已知可用于融合的蛋白。能表达融合了这些标签的插入子的载体已有商品。
例如，大肠杆菌(Escherichia coli)可在本发明的表达系统中作为原核宿主细胞使用。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等是可作为微生物宿主细胞使用的真核生物。哺乳动物宿主细胞有COS细胞、CHO细胞、BHK细胞等。本发明的转化体可在适当选择的适于培养宿主细胞的条件下进行培养。
如上述，可通过对编码靶Meg-3的基因所转化的转化体进行培养，从细胞或培养上清中回收得到Meg-3。可将其纯化成基本纯的蛋白。Meg-3作为本发明的目标蛋白，可通过常用的蛋白分离和纯化方法进行分离和纯化，对所用方法无特别限制。例如，可通过适当选择并组合各种层析法来分离并纯化Meg-3。
除了上述方法，本发明的基因，包含该基因的重组载体，携有该载体的转化体，以及利用基因操作产生Meg-3，都可通过“分子克隆-实验室手册”(冷泉港实验室，纽约)所述的标准方法进行。
此外，可根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列设计用于检测Meg-3基因的探针。还可设计用于扩增含这些核苷酸序列的DNA和RNA的引物。根据给定序列设计探针和引物是本领域技术人员常规可完成的。包含设计的核苷酸序列的寡核苷酸可化学合成。这些寡核苷酸可用于各种形式的杂交试验，或用于核酸的合成反应，如PCR(如果已经有适当标记)。用作探针或引物的寡核苷酸有至少15个碱基，优选25-50个碱基。
根据原位杂交的结果，本发明的Meg-3基因在肾组织中的表达被特别限制在肾小球膜细胞中。因此，本发明中能与Meg-3基因特异性杂交的寡核苷酸都可作为能特异性检测肾小球膜细胞的探针和引物使用。由于肾小球膜细胞与肾小球的功能密切相关，因此本发明的寡核苷酸可作为肾脏病理学分析中使用的有效工具。
此外，能调节Meg-3表达的反义核酸可根据本发明所公开的Meg-3编码基因的核苷酸序列来提供。本发明的反义核酸是用于证实Meg-3在肾小球膜细胞中的功能的重要工具。它还可用于调节因Meg-3基因的加速表达所致的疾病状况。反义核酸对靶基因表达的抑制效应如下。通过形成三链而抑制转录起始，通过与RNA聚合酶所致局部开环结构的位点形成杂合体而抑制转录，通过与合成的RNA形成杂合体而抑制转录，通过在内含子与外显子的连接处形成杂合体而抑制剪接，通过与剪接体形成区形成杂合体而抑制剪接，通过与mRNA形成杂合体而抑制mRNA从细胞核向细胞质的转移，通过与加帽区及poly(A)附着区形成杂合体而抑制剪接，通过与翻译起始因子结合区形成杂合体而抑制翻译的起始，通过与起始密码子附近的核糖体结合位点形成杂合体而抑制翻译，通过与mRNA的翻译区以及多体结合区形成杂合体而中断蛋白质链的延伸，通过与核酸-蛋白相互作用区形成杂合体而抑制基因表达，等等。这些通过抑制转录、剪接、或翻译过程而抑制靶基因的表达(平岛(Hirashima)和井上(Inoue)，新生物化学实验讲座2核酸IV基因的复制和表达，日本生物化学会编，东京化学同人，第319-347页，1993)。
本发明所用的反义序列可通过上述任何一种效应抑制靶基因的表达。在一个实施方案中，如果设计了与该基因mRNA 5’端附近的非翻译区互补的反义序列，它可有效抑制该基因的转录。但也可使用与编码区或与非翻译区3’端互补的序列。在这种方式下，本发明所利用的反义DNA包括含有该基因翻译区以及非翻译区的反义序列的DNA。可将所用反义DNA插入适当启动子下游，并优选在3’端插入含有转录终止信号的序列。可将如此制备的DNA用已知方法转化至所需宿主。优选地，该反义DNA序列应包含与待转化之宿主的内源基因(或其同源基因)或其一部分互补的序列。但只要基因表达被有效抑制，不必完全互补。
可将以反义DNA为模板转录的RNA设计为与靶基因的转录产物具有优选90％，更优选95％的互补性。用于有效抑制靶基因表达的反义DNA的长度为至少15个核苷酸或更多，优选100个核苷酸或更多，更优选500个核苷酸或更多。通常，所用反义RNA的长度小于2.5kb。
基因组中Meg-3基因的启动子区和增强子区可根据本发明Meg-3cDNA的核苷酸序列来获得。具体是，可如特开平6-181767；免疫学杂志，1995，155，2477-2486；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1995，92，3561-3565等所述获得这些控制区。本文中，启动子区指位于转录起始位点上游、能控制基因表达的DNA区，增强子区指位于内含子或3’UTR中、能控制基因表达的DNA区。
具体地，可用如下方法获得启动子区。
1)可用Meg-3 cDNA的5’端位点作为探针从人类基因组文库中克隆Meg-3的启动子区。
2)用限制酶消化Meg-3基因以获得含有启动子区的DNA并测定核苷酸序列，其中所述启动子位于含Meg-3基因翻译起始密码子的上游区(2-5kbp)。用人类肾小球膜细胞的poly(A)+RNA为模板，通过利用选自Meg-3基因5’端位点的cDNA序列的引物DNA经引物延伸法测定转录起始位点(+1)。可能含有启动子活性的位点通过搜寻核苷酸序列中的转录因子结合序列而预测。
3)将已从2)所得DNA中排除了Meg-3基因编码区的DNA片段再克隆至一种质粒，并在该DNA片段下游2-5kbp处连接一个报道基因，如氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因或萤光素酶基因，从而构建报道质粒。类似地，对应于Meg-3基因上游各种位点，且5’和3’端位点已经逐个除去的DNA片段可通过用限制酶消化，或通过PCR来制备，以便包括可能的启动子区。将CAT基因或萤光素酶基因作为报道基因连接在这些DNA片段的下游，以构建报道质粒。
4)可通过测量用3)所制备的报道质粒转化的动物细胞中CAT或萤光素酶的活性，从而获得位于Meg-3基因上游的启动子区。
可用Meg-3 cDNA作探针，以相同于上述对启动子的方式，从人类基因组文库中克隆出人类Meg-3的基因组基因，从而获得3’UTR以及内含子中的增强子区。
控制Meg-3基因表达的转录因子可用已知方法获得，如“新细胞工程实验方案，秀润社”，“生物手册系列(Biomanual series)5关于转录因子的研究，羊土社”，“DNA及细胞生物学13，731-742，1994”所述的亲和层析法，South-western法，指纹分析法，凝胶滞后法，或一步杂交法。本文中，转录因子指控制Meg-3基因转录的因子，其包括诱导转录起始反应的转录起始因子和上调或下调转录的转录控制因子。
亲和层析是，将核提取物上样至亲和层析柱(其中将如上述获得的启动子和增强子区固定在Sepharose或乳胶颗粒上)，然后洗柱，用含有与层析柱固相相同序列的DNA洗脱所结合的转录因子，回收能控制Meg-3基因表达的转录因子。
如果利用South-Western法，可用每种标记探针筛选已插入大肠杆菌表达载体(如λgt11)的cDNA的表达产物。例如，待筛选的cDNA被表达为与β-半乳糖苷酶的融合蛋白，并吸附至硝酸纤维素膜上。然后，通过以启动子区或增强子区的放射性同位素标记之DNA片段作为探针，筛选能合成具有结合活性的融合蛋白的噬菌体，可获得能调节Meg-3基因表达的转录因子。
凝胶滞后法是基于DNA在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳迁移性因与蛋白质的结合而发生改变。启动子区和增强子区的DNA片段可作为探针使用，通过与含有转录因子的样品(如核蛋白提取物)混合，可在低离子强度下利用电泳对它们进行分析。对转录因子的结合可检测为迁移性不同于游离DNA的带。凝胶滞后法允许以较高敏感性从蛋白质混合物中分离出转录因子。
经凝胶滞后法获得的DNA-转录因子复合物通过进一步的指纹分析能测定出转录因子结合位点。指纹分析法利用了以下现象：蛋白质当与DNA结合时不被DNA酶I消化。即，末端带有32p标记的启动子区和增强子区DNA，在有转录因子存在时，仅被DNA酶I部分消化，然后可利用测定核苷酸序列所用的变性聚丙烯酰胺凝胶进行分离。与没有转录因子时相同处理的结果进行比较，发现由于转录因子的结合使一条带消失了，因此可估计结合区。
本发明还提供识别Meg-3的抗体。本发明的抗体包括，例如针对含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白的抗体。抗本发明的Meg-3或其部分肽的抗体(例如，多克隆抗体，单克隆抗体)或抗血清可利用已知用于产生抗体和抗血清的方法制备，所用抗原有本发明的Meg-3，本发明Meg-3的部分肽，或融合蛋白如本发明的c-myc-(His)6-Tag-Meg-3或MBP-Meg-3。
本发明的Meg-3或其部分肽可与已知载体或稀释剂一起给药于温血动物体内能产生抗体的部位。为了增加抗体产量，可将完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂与抗原一起给药。免疫接种每1-6周进行一次，共进行约2-10次。温血动物可使用如猴子、家兔、狗、豚鼠、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、和小鸡，优选小鼠和大鼠。
选择已免疫的温血动物如小鼠，测定其体内的抗体滴度，末次免疫的2-5天后获得所述动物的脾脏或淋巴结，将这些组织中所含抗体生成细胞与骨髓瘤细胞融合，获得能产生单克隆抗体的杂交瘤，从而可制备单克隆抗体生成细胞。通过，例如，使下述标记性Meg-3与抗血清反应，并测量与该抗体结合的标记的活性，便可测定抗血清中的抗体滴度。细胞融合可用已知方法实施，如Kohler和Milstein(自然，256，495，1975)所述。聚乙二醇(PEG)，仙台病毒等可作为融合增强剂使用，优选PEG。
骨髓瘤细胞实例有X-63Ag8，NS-1，P3U1，SP2/0，AP-1等，优选X-63Ag8。抗体生成细胞(脾细胞)与骨髓瘤细胞的比例为1∶20-20∶1。可加入约10％-80％的PEG(优选PEG1000-PEG6000)，并在20-40℃，优选30-37℃保温1-10分钟，使细胞有效融合。能产生抗Meg-3抗体的杂交瘤可用各种方法筛选，例如一种方法是，将杂交瘤培养上清加样至已直接或通过载体间接吸附了Meg-3抗原的固相(例如微滴板)，然后加入已用放射性物质、酶等标记的抗免疫球蛋白抗体(当用于细胞融合的细胞来自小鼠时，用抗小鼠免疫球蛋白抗体)或蛋白A，检测与固相结合的抗Meg-3单克隆抗体；另一种方法是，将杂交瘤培养上清加样至已吸附了抗免疫球蛋白抗体或蛋白A的固相，然后加入已标记了放射性物质、酶等的Meg-3，检测与固相结合的抗Meg-3单克隆抗体。
抗-Meg-3单克隆抗体可用已知方法或其改良法，并通常在添加了HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、和胸腺嘧啶核苷)的动物细胞培养基中进行选择和克隆。可使用任何用于选择、克隆、和培养的培养基，只要杂交瘤可在其中生长。例如，可使用含1-20％，优选10-20％胎牛血清的RPMI 1640培养基(大日本制药株式会社)，含1-10％胎牛血清的GIT培养基(和光纯药工业株式会社)，或用于杂交瘤培养的无血清培养基(SFM-101，日水制药株式会社)。保温温度通常为20-40℃，优选约37℃。保温时间通常为5天至3周，优选1-2周。保温通常在5％CO2环境中进行。可按上文对抗血清中抗Meg-3抗体滴度的测量所述相同的方法测定杂交瘤培养上清中的抗体滴度。克隆通常用已知方法进行，如半固体琼脂法，或有限稀释法。已克隆的杂交瘤优选在无血清培养基中培养，以便在上清中产生最佳量的抗体。目标单克隆抗体可在腹水中获得。
通过选择能识别Meg-3特异性表位的单克隆抗体而使本发明的单克隆抗体不与除Meg-3以外的其它蛋白发生交叉反应。蛋白质特异性表位通常由该蛋白的氨基酸序列中至少7个或更多个，优选10-20个连续氨基酸残基组成。因此，能识别由具有选自SEQ ID NO：2所示氨基酸序列且包含至少7个连续氨基酸残基的肽组成的表位的单克隆抗体可以是本发明的Meg-3特异性单克隆抗体。
可用通常用于分离和纯化多克隆抗体的免疫球蛋白分离和纯化方法来分离和纯化抗-Meg-3单克隆抗体。已知的纯化方法包括，例如，盐析、醇沉淀、等电点沉淀、电泳、应用离子交换剂(如DEAE)进行的吸附和脱附、超速离心、凝胶过滤、或特异性纯化方法(其中通过一种抗原结合固相或诸如蛋白A或蛋白G等活性吸附剂排他性收集抗体，然后解除结合作用，获得该抗体)。
如此所得的识别本发明Meg-3的单克隆抗体和多克隆抗体可用于诊断和治疗与肾小球膜细胞相关的疾病。用这些抗体测量Meg-3的方法有夹心试验(使Meg-3与结合至不溶性载体的抗体和标记抗体反应，检测该反应产生的夹心复合物中的Meg-3)或竞争试验(使标记的人类Meg-3与样品中的人类Meg-3与抗体竞争性反应，根据与该抗体反应的标记抗原的量测定样品中的人Meg-3)。
利用夹心法测量人类Meg-3，可以分两步进行：使固相抗体与Meg-3反应，通过洗涤彻底除去未反应的物质，加入标记的抗体，形成固相抗体Meg-3标记抗体的复合物；也可一步完成：将固相抗体、标记的抗体、及Meg-3同时混合。
测量中所用的不溶性载体的实例有，聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯，聚酯，聚丙烯酸酯，尼龙，聚缩醛，合成树脂如氟化物树脂等，多糖如纤维素，琼脂糖，等，玻璃，金属等。不溶性载体的形式多样，包括盘，球，颗粒，纤维，杆，板，容器，小室，试管等。吸附了抗体的载体应在加有适当防腐剂如叠氮钠的情况下低温保存。
抗体可用已知的化学结合或物理吸附法固定。化学结合法包括，如利用了戊二醛的方法，利用了N-琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸酯、N-琥珀酰亚氨基-2-马来酰亚氨基乙酸酯等的马来酰亚胺法，利用了1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺氢氯化物的碳二亚胺法。此外，马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚氨酯法，N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯法，双重氮化(bisdiazolated)联苯胺法，及二棕榈基赖氨酸(dipalmityllysine)法。备选地，可使针对待检物质和表位的两种不同抗体反应以形成复合物，然后由经上述方法固定的第三抗体来捕获。
对免疫分析所用标记无限制。具体可使用酶、荧光物质、发光物质、放射性物质、金属螯合物等。优选的标记性酶有，过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-D-半乳糖苷酶，苹果酸脱氢酶，葡萄球菌核酸酶，δ-5-类固醇异构酶，α-甘油磷酸脱氢酶，三糖磷酸异构酶，辣根过氧化物酶，天冬酰胺酶，葡萄糖氧化酶，核糖核酸酶，尿素酶，过氧化氢酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，葡糖淀粉酶，以及乙酰胆碱酯酶等。优选的荧光物质有，异硫氰酸荧光素，藻胆蛋白，罗丹明，藻红蛋白，藻蓝蛋白，别藻蓝蛋白，以及邻苯二醛。优选的发光物质有异鲁米诺，光泽精(lucigenin)，鲁米诺，芳香族吖啶鎓酯，咪唑，吖啶鎓盐及其修饰型酯，萤光素，萤光素酶，和水母发光蛋白。优选的放射性物质有125I，127I，131I，14C，3H，32P，35S等。
与上述标记物结合的方法是已知的。具体可使用直接和间接标记法。常用的直接标记法是，将抗体或抗体片段与标记物通过一种交联剂以化学共价键结合。交联剂有N，N’-邻亚苯基二马来酰亚胺，4-(N-马来酰亚氨甲基)环己酸N-琥珀酰亚氨酯，6-马来酰亚氨己酸N-琥珀酰亚氨酯，4，4’-二硫代吡啶，及其它已知的交联剂。交联剂可通过已知方法与酶和抗体反应，这取决于交联剂的不同特性。间接标记法的实例有，将抗体与低分子量半抗原如生物素、二硝基苯、吡哆醛、或荧光胺结合，以及将抗体用半抗原的结合配对物间接标记。抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白可作为生物素的识别配体使用，此种情况下，可将识别这些半抗原的抗体用二硝基苯、吡哆醛、或荧光胺标记。辣根过氧化物酶可用于标记抗体。此酶十分有效，因为它能与多种底物反应，且能通过过碘酸盐法很容易地与抗体结合。有时也使用抗体的片段，如Fab’，Fab，F(ab’)2作为抗体。多克隆和单克隆抗体都可通过相同的方法用酶标记。用上述交联剂获得的酶标抗体可用已知方法，如亲和层析等来纯化，以便在更敏感的免疫分析系统中使用。可将纯化的酶标抗体与防腐剂如硫柳汞和稳定剂如甘油一起保存。标记的抗体可冻干并在低温避光保存很长时间。
当标记物为酶时，其底物和(必要时)显色剂可用于测定其活性。当使用过氧化物酶时，以H2O2作为底物溶液，并以2，2’-连氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]铵盐(ABTS)、5-氨基水杨酸、邻苯二胺、4-氨基氨替比林(aminoantipyrine)、或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺等作为显色剂。当使用碱性磷酸酶时，可用邻硝基苯磷酸、对硝基苯磷酸等作为底物。当使用β-D-半乳糖苷酶时，可使用荧光素-二-(β-D-半乳吡喃糖苷)、4-甲基伞形基(umbelliferyl)-β-D-半乳吡喃糖苷等作为底物。本发明还包括针对Meg-3的免疫分析试剂，其包含标记的或固相化的单克隆或多克隆抗体，本发明还包括含有该试剂、用于检测标记物的指示剂以及对照样品等的试剂盒。
任何生物学样品，如血浆、血清、血液、尿液、组织液、或脑脊液等体液，只要它们含有Meg-3或其前体或片段，就可作为测量本发明Meg-3的样品。
此外，本发明涉及已改变了Meg-3的表达水平的非人类转基因动物。本文中，Meg-3基因包括编码Meg-3的cDNA、基因组DNA，、或合成DNA。基因表达包括转录和翻译的步骤。本发明的转基因动物可有效用于研究Meg-3的功能和表达控制，阐明与人类肾小球膜细胞相关的疾病的致病机制，和开发能用于筛选并检验药物安全性的疾病动物模型。
在本发明中，可通过修饰Meg-3而人为增加或减少其表达水平(相对于原始基因)，方法是在控制Meg-3基因正常表达的某些重要位点(增强子、启动子、内含子等)导入诸如缺失、取代、插入等突变。这些修饰改变了Meg-3基因的转录。另一方面，可通过缺失某个外显子的一部分，或用终止密码子取代特定密码子而修饰蛋白质的翻译，方法是在编码区导入点突变。这些突变可利用已知获得转基因动物的方法导入。
转基因动物，在狭义上指通过基因重组在生殖细胞中人为导入了外源基因的动物，在广义上指在发育早期将外源基因稳定地导入了染色体的动物，其中所述基因可作为基因型传给后代，所述动物包括特定基因的功能已被反义RNA抑制了的反义转基因动物，特定基因已经利用胚胎干细胞(ES细胞)完成基因敲除的动物，和已在DNA中导入了点突变的动物。本文所用转基因动物包括除人类以外的所有脊椎动物。
转基因动物的制备方法有，将基因与卵(egg)混合并用磷酸钙处理该混合物的方法，显微注射法(在相差显微镜下用显微移液管将基因直接注射至前核期卵的核中(显微注射法，美国专利4,873,191))，以及利用胚胎干细胞(ES细胞)的方法。其它方法包括，将基因插入逆转录病毒以感染卵的方法，将基因通过精子导入卵的精子载体法等。精子载体法是通过使外源基因附着于精子或经电穿孔等掺入精细胞中并与卵受精，从而导入外源基因的遗传重组方法(M.Lavitranoet等，细胞，57，717，1989).
可使用体外定点基因重组如噬菌体P1的cre/loxP重组系统，酿酒酵母的FLP重组系统等。还报道了利用逆转录病毒将靶蛋白的转基因导入非人类动物的方法。
经显微注射制备转基因动物的方法可如下实施。提供基本由调节表达的启动子、编码特定蛋白的基因、以及poly(A)信号组成的转基因。应证实所有谱系的表达模式和水平，因为特定分子的表达模式和水平取决于启动子活性，所制备的转基因动物在各种谱系之间不同，这取决于拷贝数和转基因在染色体上的导入位点。当表达水平因非编码区和剪接而不同时，可在poly(A)信号的上游导入待剪接的内含子序列。导入受精卵时所用的基因尽可能纯，这是非常重要的。可使用的动物有，用于收获受精卵的小鼠(5-6周龄)，用于交配的雄性小鼠，假孕的雌性小鼠，已结扎的雄性小鼠等。
为了有效获得受精卵，可利用促性腺激素等诱导排卵。收获受精卵，用注射管经显微注射方式将基因注射至卵的雄性前核中。准备好能将已处理过的卵重新放回输卵管中的动物(假孕的雌性小鼠等)，每只小鼠植入约10-15个卵。转基因导入新生小鼠的结果可如下证实：从尾尖部提取基因组DNA并通过Southern杂交或PCR法检测转基因，或利用阳性克隆法，其中插入只能通过同源重组而活化的标记基因。转基因的表达可通过经Northern杂交或RT-PCR法检测转基因的转录子而证实。也可用蛋白特异性抗体经Western印迹法进行检测。
本发明的基因敲除小鼠可制备成丧失了小鼠Meg-3基因的功能。基因敲除小鼠指一种转基因小鼠，其中通过同源重组技术使某个基因的功能丧失。基因敲除小鼠可通过用ES细胞进行同源重组，然后筛选其中一种等位基因已被修饰并被破坏的那些ES细胞而制备。例如，可将已遗传改造的ES细胞注射至胚泡细胞或8-细胞胚胎期的受精卵中，以便获得具有来自ES细胞和来自胚的两种细胞的嵌合小鼠。其中一种等位基因的所有形式已经得到修饰并被破坏的那些杂合子小鼠可通过使嵌合小鼠(嵌合指由来自两个或更多个受精卵的体细胞组成的个体)与正常小鼠杂交而产生。杂合子小鼠相互交配可产生纯合子小鼠。本发明的转基因动物包括杂合子和纯合子。
同源重组指核苷酸序列相同或十分相似的两种基因之间利用基因重组机制发生的重组。发生了同源重组的细胞可通过PCR来筛选。利用待导入基因的一部分序列和该基因预期将插入的染色体区的一部分序列作为引物，进行PCR，然后检测产生了扩增产物的细胞，便可证实同源重组。ES细胞中所表达的基因的同源重组可通过已知方法或它们的改良法轻易地筛选，所述方法如将新霉素抗性基因与待导入的基因结合，使细胞在导入完成后具有新霉素抗性。
                   附图简述
图1的照片显示用抗Meg-3抗体进行Western印迹分析的结果。每条泳道对应于以下抗原：
泳道1：MBP
泳道2：MBP-Meg-3
泳道3：利用家兔网织红细胞(Promega)经体外转录和翻译所表达的萤光素酶蛋白
泳道4：3’末端带有c-myc标记的Meg-3
图2的显微照片显示用共焦激光显微镜检查CHO细胞的结果，该细胞中3’端c-myc标记的Meg-3过表达。中心的核染成蓝色，Meg-3位于其周围，被荧光染成绿色。
               实施本发明的最佳模式
本发明参照以下实施详细例举例说明，但并非限制。
实施例1：人类肾小球膜细胞的原代培养
从58岁男性切除的正常人类肾脏分离人的肾小球膜细胞。将肾皮质无菌分离，切碎，通过多个筛网。所用筛网的孔径逐步减小，将75-200μm孔径的筛网所捕获的肾小球洗涤后，与100μg/ml胶原蛋白酶(WashingtonBiochemical)37℃保温20分钟。洗涤后，将肾小球重悬于含25mM Hepes，10％Nu-血清(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)，和抗生素(10μg/ml青霉素，链霉素和两性霉素)的199培养基(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中，在5％CO2培养箱中培养。培养至第三代后，根据一系列标准鉴定肾小球膜细胞，这些标准有典型的形态学特征，对胰蛋白酶、嘌呤霉素、和D-缬氨酸的抗性，对肌动蛋白(Zymed Laboratories，SanFrancisco，CA)、抗极迟抗原(VLA)-1，3，5(Immunotech)的免疫染色阳性，以及对VIII因子(Dako，CA)的免疫染色阴性。
实施例2：从培养的人类肾小球膜细胞中分离mRNA
用异硫氰酸胍(GTC)法从培养至第6代的人肾小球膜细胞中分离总RNA。在实施例1所述细胞的含血清培养基中已经长满的肾小球膜细胞培养物用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，然后溶于5.5mM GTC溶液中。使溶液通过18号针头以除去DNA。核以及其它细胞碎片通过在5,000×g离心90秒而沉淀。小心将上清上样至三氟乙酸铯(CsTFA)的上层，在15℃以125,000×g离心24小时。将RNA沉淀溶于TE缓冲液中。用oligo dT纤维素层析柱(Pharmacia)分离Poly(A)+RNA。
实施例3：构建3’导向的-cDNA文库
以poly(A)+RNA为模板，用基于pUC19(Norrander J.等，Gene，26，101-106，1983)的载体引物合成cDNA。该载体引物DNA包含HincII末端及带一个T tale的PstI末端，并在MboI位点(GATC)发生dam-甲基化。合成了第二链后，该cDNA序列以及载体上LacZ基因中的单个BamHI位点分别用MboI和BamHI消化，在较低DNA浓度下进行环化和连接。用连接混合物的一部分转化大肠杆菌。随机选择所得转化体，仅通过加热使它们分别解体。cDNA插入序列用侧翼于pUC19克隆位点的引物(5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’/ SEQ ID NO：3和5’-ACCATGATTACGCCAAGCTTG-3’/SEQ ID NO：4)经成对PCR进行扩增。用所得较短的双链DNA进行循环测序反应并通过自动测序仪进行分析。
实施例4：分离在肾小球膜细胞中特异性表达的基因
为了鉴定在肾小球膜细胞中特异性表达的基因，本发明人用计算机进行了大批量DNA测序及数据处理。各种不同细胞和器官中的转录子可同时比较(Y.Yasuda等，Kidney International 53：154-158，1998；K.Matsubara等，Gene.135，265(1993)；K.Okubo等，Nat.Gen.2，173(1992))。对培养的人类肾小球膜细胞3’-结构域cDNA文库进行大批量DNA测序，测出随机选取的1836个克隆的部分序列。用FASTA程序比较这些克隆之间的序列同源性，并进一步与DNA数据库GeneBank中的序列比较。来自各种器官和细胞的mRNA用斑点印迹进行分析，以选出在肾小球膜细胞中特异性表达的克隆。结果获得在肾小球膜细胞cDNA文库中以极高频率检测到的一些克隆。
实施例5：筛选人的肾小球膜细胞λZIPLox cDNA文库
用oligo(dT)引物和随机引物，从实施例2所制备的完整mRNA合成λZIPLox cDNA文库。用市售λZIPLox (Gibco BRL，λZIPLox EcoRI Arms)合成该文库。在该λZIPLox cDNA文库中，用实施例4所得、可在肾小球膜细胞cDNA文库中较频繁测到的特定克隆的插入子作为探针，对该克隆进行筛选。用双脱氧终止法测定阳性克隆中插入的基因片段的核苷酸序列。
测序结果显示，起始密码子ATG的推导位置与共有序列中的一致，并给出了最长的开放读码框(符合“第一ATG原则”)。Meg-3 cDNA的核苷酸序列示于SEQ ID NO：1，Meg-3的推导的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。
实施例6：肾小球膜特异性基因的功能分析(1)
用FASTA程序在SwissProt数据库中进行的氨基酸同源性搜索证实，与Meg-3蛋白有高度同源性的已知氨基酸序列不存在，Meg-3是一种新的蛋白质。
然后，对Meg-3的氨基酸序列进行基序搜索。用PSORT WWW服务器(http：//psort.nibb.ac.jp：8800/)进行搜索。在从N-末端起第500个氨基酸之后的区域中，发现了一个与多种蛋白质十分类似的氨基酸，它被称为富含脯氨酸的蛋白。其中含有从第621个氨基酸至第701个氨基酸的81个氨基酸残基的区域尤其富含脯氨酸(27.2％)，并在两个位点具有氨基酸序列(xPESPPPAxP)，此序列与结合SH3(Src同源物3)结构域的富含脯氨酸的肽(PR肽)中氨基酸序列(xPxxPPPFxP)相似。此外还证实了如下磷酸化酶的磷酸化基序的存在。还发现了两个N-肉豆蔻酰化位点。预计定位于细胞质中的百分率为52.2％。这些发现强烈显示，Meg-3是一种信号传递因子。
酪蛋白激酶II磷酸化位点：14
蛋白激酶C磷酸化位点：9
酪氨酸激酶磷酸化位点：1
此外，根据以上事实，可证实上文预测的具有733个氨基酸残基的序列对应于Meg-3的氨基酸序列。具有该氨基酸序列的蛋白所计算出的分子量和理论pI分别为约83kDa和5.72。
实施例7：Meg-3的功能分析(2)-组织分布
对Meg-3如下进行Northern印迹分析。3’导向的cDNA文库(实施例3)中阳性克隆插入子用RI经随机DNA标记法标记，并作为探针。从用作样品的下述细胞中获得Poly(A)+RNA(2μg)，在含2.2M甲酰胺的1％琼脂糖凝胶上分离，并转移至硝酸纤维素膜上。将此膜在Rapid Hyb溶液(Amersham，Arlington Heights，IL)中杂交。然后，用0.1X SSPE/0.1％SDS，60℃的最终严谨度洗涤。
用于多种(multiple)人类原代细胞培养和组织培养的Northern印迹分析，以及用于人类癌细胞系的Northern印迹分析的样品购自Clontech(PaloAlto，CA)。原代细胞培养的样品可以是来自人类肾小球膜细胞、人类真皮成纤维细胞、人类肾皮质上皮细胞、人类脐静脉内皮细胞、及人类平滑肌细胞的原代培养细胞的poly(A)+RNA 2μg。在人类癌细胞系的Northern印迹分析中，可使用来自前髓细胞白血病HL-60、HeLa细胞S3、慢性髓细胞性白血病K-562、淋巴母细胞白血病MOLT-4、Burkitt淋巴瘤Raji、大肠腺癌SW480，肺癌A549、及黑素瘤G361的poly(A)+RNA 2μg作为样品。在组织的Northern印迹分析中，可使用来自心脏、脑、胎盘、肺、肝脏、骨骼肌、肾脏和胰腺的poly(A)+RNA 2μg作为样品。杂交和洗涤如上述进行。结果示于表1-3。表1
原代培养细胞
人类肾小球膜细胞 +++
人类真皮成纤维细胞 ++
人类肾皮质上皮细胞 ++
人类脐静脉内皮细胞   ±
人类平滑肌细胞   ±
表2
人类癌细胞系
前髓细胞白血病HL-60 -
 HeLa细胞S3 +++
慢性髓细胞性白血病K-562 +
淋巴母细胞白血病MOLT-4 -
 Burkitt淋巴瘤Raji -
大肠腺癌SW480 +++
肺癌A549 ++
黑素瘤G361 +
表3
人类组织
心脏 +
脑 -
胎盘 +++
肺 +
肝脏 ±
骨骼肌 ±
肾脏 +
胰腺 ++
在利用Meg-3 cDNA作为探针进行的Northem印迹分析中，在培养的肾小球膜细胞中发现了单一转录产物(约4.0kb)。人类原代细胞培养物的特征之一是，Meg-3在肾小球膜细胞中以非常高的水平表达。在其它原代细胞培养物中，在肾皮质上皮细胞和真皮成纤维细胞中均有表达，在人类脐静脉内皮细胞和平滑肌细胞中可见弱表达。此外，当比较组织中的表达时，人类胎盘中的Meg-3高表达，其次是在胰腺中。此外，还在诸如心脏、肺、和肾脏中观察到表达。肝脏和骨骼肌中的表达较弱，脑中未发现表达。除了在HeLa细胞S3和大肠腺癌SW480中有强表达，在肺癌A549中有表达外，在其它培养的癌细胞系中未发现明显的表达。
实施例8：Meg-3的功能分析(3)-原位杂交
通过原位杂交(本文中缩写为ISH)评估正常人肾组织中的Meg-3 mRNA表达。ISH按已知方法(Kidney Int.52：111(1997))实施。用对应于人类Meg-3cDNA(SEQ ID NO：5)中404-433位的核苷酸序列作为探针。Meg-3转录产物被定位在肾小球的肾小球膜细胞中。在杂交前用RNA酶预处理该组织，以便评估将Meg-3探针检测到的大多数信号消除后所得检测信号的特异性。此外，根据用100倍过量的、具有相同核苷酸序列或无关序列的未标记寡核苷酸进行的竞争性检查发现，使用具有相同核苷酸序列的寡核苷酸可消除Meg-3探针所检测的信号，而用具有无关序列的寡核苷酸时来自Meg-3探针的信号仍然保留。这些结果证实，具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的Meg-3基因在肾小球膜细胞中特异性表达。
实施例9：Meg-3蛋白的表达
用1.0μl培养的人肾小球膜细胞poly(A)+RNA(0.5μg/μl)为模板，以设计用于编码翻译区的以下引物进行PCR，获得含Meg-3翻译区的基因。所用引物为：(1)包含起始密码子以及附加在5’末端的EcoRI限制酶位点的引物(5’-CGGAATTCATGGGGTGGATGGG-3’/SEQ ID NO：6)，和(2)包括终止密码子以及EcoRI识别位点的引物(5’-GCGAATTCTAGAACTCAGTCTGCACCCCTGC-3’/SEQ ID NO：7)。反应混合物包含5μl 10X Ex Taq缓冲液，8μl dNTP混合物(2.5mM)，0.5μl PCR引物(SEQ ID NO：6，20pmol/μl)，0.5μl第一(primary)PCR A1引物(SEQ IDNO：7，20pmol/μl)，和0.5μl TaKaRa Ex TaqTM(10U/μl)，用无菌水补足总体积50μl。将该混合物置于“Takara PCR热循环仪”中，以94℃1分钟、60℃2分钟和72℃2分钟反应30个循环。在0.75％琼脂糖凝胶上电泳以观察泳带。利用1μl反应混合物经“Original TA克隆试剂盒”(Invitrogen)亚克隆所述DNA，将所得质粒命名为meg3/pCR2。用EcoRI消化该质粒，然后用T4连接酶与已用EcoRI消化的麦芽糖结合蛋白融合蛋白表达载体pMAL-c2(New England Biolab)连接，将所得质粒转化至大肠杆菌JM109。18小时后，将氨苄青霉素抗性菌株接种至3ml LB培养基中并培养18小时。按照小量制备法提取表达载体pMALc2/meg3，并用限制酶证实。
将已被pMALc2/meg3转化的大肠杆菌XL1-Blue在添加了100μg/ml氨苄青霉素的10ml LB培养基中37℃振荡培养18小时。将该培养液加入1L营养培养基(Rich medium)(含10g蛋白胨，5g酵母提取物，5g NaCl，2g/L葡萄糖，100μg/ml氨苄青霉素)中，进一步37℃振荡培养。当浊度计测得OD约为0.8(A600)时，添加3ml 0.1 MIPTG(1.41g异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，溶于50ml水中)，进一步将该混合物于37℃振荡培养。2小时后离心(4,000g，20分钟)收获菌体，添加50ml裂解缓冲液(10mMNa2HPO4，30mM NaCl，0.25％吐温20，pH7.0)。将菌体在该缓冲液中充分悬浮，于-80C冷冻18小时后，用SONIFIER250(BRANSON)进行超声处理以破碎细胞。将NaCl加至0.5M，离心(10,000g，30分钟)收集上清。将200ml 0.25％吐温20/柱层析缓冲液加入该上清中，然后将溶液上样至填充了30ml直链淀粉树脂、并已用0.25％吐温20/柱层析缓冲液(0.25％吐温20，10mM磷酸，0.5M NaCl，pH7.2)预平衡的层析柱。将流速定为1ml/分钟，在用100ml 0.25％吐温20/柱层析缓冲液并随后用150ml柱层析缓冲液洗柱后，与直链淀粉树脂结合的融合蛋白用含10mM麦芽糖的50ml柱层析缓冲液洗脱。用超滤膜(Amicon stirred-cell concentrator)将洗脱级分浓缩至约1mg/ml，成为浓缩的融合蛋白MBP-Meg-3。
该融合蛋白的麦芽糖结合蛋白部分可根据以下方法用酶切割下来。将蛋白溶液置于透析管(级分分子量：3,500)中，对Xa因子缓冲液(20mMTris-HCl，100mM NaCl，2mM CaCl2，1mM叠氮钠)透析。将10μl Xa因子(200μg/ml)添加至200μl(1mg/ml)已透析的溶液中，通过在室温反应24小时可特异性切割麦芽糖结合蛋白与目标蛋白之间的结合位点。切割后，目标蛋白可利用凝胶过滤层析、离子交换柱层析等纯化方法来获得。
实施例10：抗MBP-Meg-3多克隆抗体的产生
将实施例9所获浓缩的融合蛋白MBP-Meg-3(10mM磷酸钠，0.5MNaCl，10mM麦芽糖)与等体积弗氏完全佐剂混合，彻底乳化。取0.5ml该乳液皮下给药至新英格兰白兔(雌性，约4,000g)(20μg/动物)。用与弗氏不完全佐剂混合的MBP-Meg-3于3周后(50μg/动物)、5周后(50μg/动物)、7周后(50μg/动物)、9周后(100μg/动物)、及11周后(200μg/动物)进行加强免疫。第三次免疫的1周后，取血测定抗体滴度。经证实该滴度升高了204,800倍。抗体滴度用包被了50ng/孔抗原的96孔板经EIA测定。将100μl成功稀释的抗血清添加至每孔以进行第一步反应，弃去上清，洗板后，加入抗兔IgG Fab’-HRP(IBL，日本)进行反应。洗板后，用OPD(Sigma，USA)显色以便测量。此外，所得抗血清经Westem印迹证实可与MBP-Meg-3特异性反应。
实施例11：兔多克隆抗-MBP-Meg-3IgG的反应性检查
用MBP-Meg-3，3’-末端c-myc标记的Meg-3，及仅表达MBP的大肠杆菌细胞破碎液作为抗原，证实免疫原为MBP-Meg-3的兔IgG的反应性。
将pMALc2/meg3所转化的大肠杆菌JM109的细胞破碎液用作MBP-Meg-3。用已除去终止密码子并添加了EcoRI识别位点的引物(5’-GCGAATTCGAACTCAGTCTGCACCCCTGC-3’/SEQ ID NO：8)取代PCR A1引物作为反义引物，并用如实施例9所述合成的片段表达3’-末端c-myc标记的Meg-3。将该片段插入用EcoRI消化的哺乳动物表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中，利用该质粒及兔网织红细胞进行c-myc标记的Meg-3的体外转录和翻译(Promega)以便表达。
用等量样品缓冲液(0.25％Tris-HCl，2％SDS，30％甘油，10％β-巯基乙醇，0.025％溴酚蓝)(第一化学药品)处理每种蛋白溶液，并将它们于95℃加热5分钟，获得样品。使所得样品在4-20％的梯度胶(第一化学药品)上进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(Laemmli，U.K.，自然，1970，227：680-685)。
将SDS-PAGE所分离的蛋白，通过在印迹液(25mM Tris-HCl，192mM甘氨酸，20％甲醇，pH8.3)中以100V的恒定电压处理1小时，而印迹至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(BioRad)上。已印迹的PVDF膜用蒸馏水洗后，在5％Block Ace的TTBS溶液中封闭3小时。然后，用TTBS(20mM Tris，500mM NaCl，0.05％吐温20，pH7.5)洗涤PVDF膜，使其与兔多克隆抗-MBP-Meg-3 IgG溶液(作为第一抗体，用TTBS稀释)在4℃反应过夜。然后，用扩增的碱性磷酸酶免疫印迹试剂盒(Amplified Alkaline Phosphatase ImmuneBlot Kit)(Biorad)检测。换而言之，在室温下与生物素标记的山羊抗IgG的TTBS稀释液反应1小时，接着与预先制备好的链霉抗生物素蛋白-生物素-标记的碱性磷酸酶复合物在室温下反应1小时。用TTBS洗涤PVDF膜，然后将膜与底物(氮蓝四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸，p-甲苯胺盐溶液)室温保温约30分钟，使与第一抗体结合的抗体显色。向反应混合物中添加蒸馏水以终止反应。
结果示于表1。对应于MBP-Meg-3的带，用实施例10所得本发明多克隆抗-MBP-Meg-3抗体证实。可见，这种多克隆抗体是特异性识别Meg-3的抗体。
实施例12：Meg-3的细胞内定位
将已插入了Meg-3中EcoRI消化片段的ORF片段的上述pcDNA3.1转化至CHO细胞，3’-末端c-myc标记型Meg-3被过表达。2天后，细胞用4％多聚甲醛和0.5％Triton X-100固定，与抗小鼠c-myc抗体反应，并与FITC标记的抗小鼠抗体反应。或者，将细胞核用Hoechst 33341染色，并用共焦激光显微镜观察。
结果示于图2。如在氨基酸序列分析中所预测，Meg-3经证实定位于细胞质中。
                           工业应用性
本发明提供了以高频率表达于肾小球膜细胞中的DNA，该DNA编码的蛋白质等。它们被认为与肾小球膜细胞的特异性生物学活性密切相关，并可用于，例如鉴定肾小球膜细胞，和检测肾小球膜细胞中的异常。此外，该蛋白还可用于阐明肾小球膜细胞的功能，并因此研究与肾小球膜细胞相关的疾病的病因。预计本发明可用于对与肾小球膜细胞相关的疾病进行治疗和诊断等。
具体地，肾小球肾炎的发生或进展可能能通过，例如人为调节Meg-3而得到调节。或者，对体液及肾小球膜细胞中Meg-3的mRNA或蛋白的定量可能能诊断诸如肾小球肾炎之类的肾脏疾病。在肾小球肾炎中，功能性异常可见于肾小球膜区，导致肾小球膜细胞增生或加速从这些细胞产生基质。Meg-3参与这些疾病的可能性很大。
本发明的Meg-3，以及由本发明人以前报道的MEGSIN在肾小球膜细胞中高表达方面具有共同特征。但本发明的Meg-3可能是含有丰富脯氨酸结构域的细胞内信号传递物质，而MEGSIN是与SERPIN超家族(一种蛋白酶抑制剂)同源的蛋白质。此外，本发明的Meg-3可在各种组织中表达，这与MEGSIN的特征不同，其特异性表达于肾小球膜细胞中。因此，本发明的Meg-3可能是支持肾小球膜细胞的功能的一种重要蛋白质。阐述了这种重要蛋白质的本发明因此具有重要意义。
                   序列表<110>宫田敏男(MIYATA，Toshio)
 黑川  清(KUROKAWA，Kiyoshi)<120>Meg-3蛋白<130>KRK-103PCT<140><141><150>JP 1999-123561<151>1999-04-30<160>8<170>PatentIn 2.1版<210>1<211>3768<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><221>CDS<222>(53)..(2251)<400>1caggaactgg gccagctccg gtcccttcct tttggggctc tcactctgga gg atg ggg 58
                                                      Met Gly
                                                        1tgg atg gga gaa aaa acc ggg aag atc ctg acg gag ttc ctc cag ttc   106Trp Met Gly Glu Lys Thr Gly Lys Ile Leu Thr Glu Phe Leu Gln Phe
      5                  10                  15tat gaa gac cag tat ggc gtg gct ctc ttc aac agc atg cgc cat gag   154Tyr Glu Asp Gln Tyr Gly Val Ala Leu Phe Asn Ser Met Arg His Glu
 20                  25                  30att gag ggc acg ggg ctg ccg cag gcc cag ctg ctc tgg cgc aag gtg    202Ile Glu Gly Thr Gly Leu Pro Gln Ala Gln Leu Leu Trp Arg Lys Val35                  40                  45                  50cca ctg gac gag cgc atc gtc ttc tcg ggg aac ctc ttc cag cac cag     250Pro Leu Asp Glu Arg Ile Val Phe Ser Gly Asn Leu Phe Gln His Gln
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         70                  75                  80tac ggg ctg gtg ctc tac gaa aac aaa gcg gcc tat gag cgg cag gtc     346Tyr Gly Leu Val Leu Tyr Glu Asn Lys Ala Ala Tyr Glu Arg Gln Val
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        150                 155                 160aca gaa gcc gag cag gac aag tgg cag gct gtg ctg cag gac tgc atc     586Thr Glu Ala Glu Gln Asp Lys Trp Gln Ala Val Leu Gln Asp Cys Ile
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    245                 250                 255tcg gac gcc gtg tac cac atg gtg tac gag cag gcc aag gcg cgc ttc     874Ser Asp Ala Val Tyr His Met Val Tyr Glu Gln Ala Lys Ala Arg Phe
260                 265                 270gag gag gtg ctg tcc aag gtg cag cag gtg cag ccg gcc atg cag gcc     922Glu Glu Val Leu Ser Lys Val Gln Gln Val Gln Pro Ala Met Gln Ala275                 280                 285                 290gtc atc cga act gac atg gac caa att atc acc tcc aag gag ctc ctt     970Val Ile Arg Thr Asp Met Asp Gln Ile Ile Thr Ser Lys Glu Leu Leu
            295                 300                 305gcc agc aag atc cga gcc ttc atc ctc ccc aag gca gag gtg tgc gtg     1018Ala Ser Lys Ile Arg Ala Phe Ile Leu Pro Lys Ala Glu Val Cys Val
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    325                 330                 335gtc ccc acc agc cag ggc ttc act gag gtg cga gat gtc ttc ttc aag     1114Val Pro Thr Ser Gln Gly Phe Thr Glu Val Arg Asp Val Phe Phe Lys
340                 345                 350gag gtc acg gac atg aac ctg aac gtc atc aac gag ggc ggc att gac     1162Glu Val Thr Asp Met Asn Leu Asn Val Ile Asn Glu Gly Gly Ile Asp355                 360                 365                 370aag ctg ggc gag tac atg gag aag ctg tcc cgg ctg gcg tac cac ccc     1210Lys Leu Gly Glu Tyr Met Glu Lys Leu Ser Arg Leu Ala Tyr His Pro
            375                 380                 385ctg aag atg cag agc tgc tat gag aag atg gag tcg ctg cga ctg gac     1258Leu Lys Met Gln Ser Cys Tyr Glu Lys Met Glu Ser Leu Arg Leu Asp
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420                 425                 430ttc gag acc ctc ctg cac cag gag ctg ggg aag ggg ccc acc aag gag    1402Phe Glu Thr Leu Leu His Gln Glu Leu Gly Lys Gly Pro Thr Lys Glu435                 440                 445                 450gag ctg tgc aag tcc atc cag cgg gtc ctg gag cgg gtg ctg aaa aaa    1450Glu Leu Cys Lys Ser Ile Gln Arg Val Leu Glu Arg Val Leu Lys Lys
            455                 460                 465tac gac tac gac agc agc tct gtg cgg aag agg ttc ttc cgg gag gcg    1498Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Ser Val Arg Lys Arg Phe Phe Arg Glu Ala
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            535                 540                 545agg aag cac aac ctc tac cgg gac agc atg gtc atg cac aac agc gac    1738Arg Lys His Asn Leu Tyr Arg Asp Ser Met Val Met His Asn Ser Asp
        550                 555                 560ccc aac ctg cac ctg ctg gcc gag ggc gcc ccc atc gac tgg ggc gag    1786Pro Asn Leu His Leu Leu Ala Glu Gly Ala Pro Ile Asp Trp Gly Glu
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            615                 620                 625gag tca cca cca cct gcg tcc ccg gac ggt gtc act gag atc cga ggc    1978Glu Ser Pro Pro Pro Ala Ser Pro Asp Gly Val Thr Glu Ile Arg Gly
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660                 665                 670ccc gag gcc tcc tcg ccg cct gcc tca ccc ctc cag cat ctc ctg cct    2122Pro Glu Ala Ser Ser Pro Pro Ala Ser Pro Leu Gln His Leu Leu Pro675                 680                 685                 690gga aag gct gtg gac ctt ggg ccc ccc aag ccc agc gac cag gag act    2170Gly Lys Ala Val Asp Leu Gly Pro Pro Lys Pro Ser Asp Gln Glu Thr
            695                 700                 705gga gag cag gtg tcc agc ccc agc agc cac ccc gcc ctc cac acc acc    2218Gly Glu Gln Val Ser Ser Pro Ser Ser His Pro Ala Leu His Thr Thr
        710                 715                 720acc gag gac agt gca ggg gtg cag act gag ttc taggccagtg ggtccctgac  2271Thr Glu Asp Ser Ala Gly Val Gln Thr Glu Phe
    725                 730tgctgcacat ggcacaggcc gttcccttcc ggacccaggc aggctcagct ctggggaggg  2331caccctggtc tgtgccttgt gggtggaggc ggggcagggc tgtgtggcac cgccagggag  2391cgggcccacc tgagtcactt tattgggttc agtcaacact ttcttgctcc ctgttttctc 2451ttctgtggga tgatctcaga tgcaggggct ggttttgggg ttttcctgct tgtgccaagg 2511gctggacact gctggggggc tggaaagccc ctcccttcct gtccttctgt ggcctccatc 2571ccctcatggg tgctgccatc cttcctggag agagggaggt gaaagctggt gtgagcccag 2631tgggttcccg cccactcacc caggagctgg ctgggccagg accgggagag ggagcactgc 2691tgccctcctg gccctgctcc ttccgcagtt aggggtggac cgagcctcgc tttccccact 2751gttctggagg gaaggggaag gagggggtct tcaggctgga gccaggctgg gggtgctggg 2811tggagagatg agatttaggg ggtgcctcat ggggtgggca ggcctggggt gaaatgagaa 2871aggcccagaa cgtgcaggtc tgcggagggg aagtgtcctg agtgaaggag gggaccccat 2931cctggggatg ctgggagtga gtgagtgaga tggctgagtg agggttatgg ggagcctgag 2991gttttatggg cctgtgtatc cccttctccc ggccccagcc tgcctccctc ctgcccgcct 3051ggcccacagg tctccctctg gtccctgtcc ctctggtggt tggggatgga gcggcagcaa 3111ggggtgtaat ggggctgggt tctgtcttct acaggccacc ccgaggtcct cagtggttgc 3171ctggggagcc ggacggggct cctgaggggt acaggttggg tgggccctcc ctgagggtct 3231ggggtcaggc tttggcctct gctgcctctc agtcaccaag tcacctccct ctgaaaatcc 3291agtcccttct ttggatgtcc ttgtgagtca ctctgggcct ggctgtcgtc cctcctcagc 3351ttcttgttcc tgggacaagg gtcaagccag gatgggccca ggcntgggat cccccacccc 3411aggaccccac aggccccctc ccctgntgnt ttgcgggggg cagggcagaa atggactcct 3471tttgggtccc cgaggtgggg tcccctccca gccctgcatc ctccgtgccc tagacctgct 3531ccccagagga ggggccttga cccacaggaa gtgtggtggc gcctggcaat cagggacccc 3591cagctgccgc agccctggtt tttggcgcat cttttccctc ttgtcccgaa gatttgcgcc 3651tttagtgcct tttgaggggt tcccatcatc cctccctgat attgtattga aaatattatg 3711cacactgttc atgcttttac taatcaataa acgctttatt taaaaaaaaa aaaaaaa   3768<210>2<211>733<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2Met Gly Trp Met Gly Glu Lys Thr Gly Lys Ile Leu Thr Glu Phe Leu1               5                  10                  15Gln Phe Tyr Glu Asp Gln Tyr Gly Val Ala Leu Phe Asn Ser Met Arg
         20                  25                  30His Glu Ile Glu Gly Thr Gly Leu Pro Gln Ala Gln Leu Leu Trp Arg
     35                  40                  45Lys Val Pro Leu Asp Glu Arg Ile Val Phe Ser Gly Asn Leu Phe Gln
 50                  55                  60His Gln Glu Asp Ser Lys Lys Trp Arg Asn Arg Phe Ser Leu Val Pro65                  70                  75                  80His Asn Tyr Gly Leu Val Leu Tyr Glu Asn Lys Ala Ala Tyr Glu Arg
             85                  90                  95Gln Val Pro Pro Arg Ala Val Ile Asn Ser Ala Gly Tyr Lys Ile Leu
        100                 105                 110Thr Ser Val Asp Gln Tyr Leu Glu Leu Ile Gly Asn Ser Leu Pro Gly
    115                 120                 125Thr Thr Ala Lys Ser Gly Ser Ala Pro Ile Leu Lys Cys Pro Thr Gln
130                 135                 140Phe Pro Leu Ile Leu Trp His Pro Tyr Ala Arg His Tyr Tyr Phe Cys145                 150                 155                 160Met Met Thr Glu Ala Glu Gln Asp Lys Trp Gln Ala Val Leu Gln Asp
            165                 170                 175Cys Ile Arg His Cys Asn Asn Gly Ile Pro Glu Asp Ser Lys Val Glu
        180                 185                 190Gly Pro Ala Phe Thr Asp Ala Ile Arg Met Tyr Arg Gln Ser Lys Glu
    195                 200                 205Leu Tyr Gly Thr Trp Glu Met Leu Cys Gly Asn Glu Val Gln Ile Leu
210                 215                 220Ser Asn Leu Val Met Glu Glu Leu Gly Pro Glu Leu Lys Ala Glu Leu225                 230                 235                 240Gly Pro Arg Leu Lys Gly Lys Pro Gln Glu Arg Gln Arg Gln Trp Ile
            245                 250                 255Gln Ile Ser Asp Ala Val Tyr His Met Val Tyr Glu Gln Ala Lys Ala
        260                 265                 270Arg Phe Glu Glu Val Leu Ser Lys Val Gln Gln Val Gln Pro Ala Met
    275                 280                 285Gln Ala Val Ile Arg Thr Asp Met Asp Gln Ile Ile Thr Ser Lys Glu
290                 295                 300Leu Leu Ala Ser Lys Ile Arg Ala Phe Ile Leu Pro Lys Ala Glu Val305                 310                 315                 320Cys Val Arg Asn His Val Gln Pro Tyr Ile Pro Ser Ile Leu Glu Ala
            325                 330                 335Leu Met Val Pro Thr Ser Gln Gly Phe Thr Glu Val Arg Asp Val Phe
        340                 345                 350Phe Lys Glu Val Thr Asp Met Asn Leu Asn Val Ile Asn Glu Gly Gly
    355                 360                 365Ile Asp Lys Leu Gly Glu Tyr Met Glu Lys Leu Ser Arg Leu Ala Tyr
370                 375                 380His Pro Leu Lys Met Gln Ser Cys Tyr Glu Lys Met Glu Ser Leu Arg385                 390                 395                 400Leu Asp Gly Leu Gln Gln Arg Phe Asp Val Ser Ser Thr Ser Val Phe
            405                 410                 415Lys Gln Arg Ala Gln Ile His Met Arg Glu Gln Met Asp Asn Ala Val
        420                 425                 430Tyr Thr Phe Glu Thr Leu Leu His Gln Glu Leu Gly Lys Gly Pro Thr
    435                 440                 445Lys Glu Glu Leu Cys Lys Ser Ile Gln Arg Val Leu Glu Arg Val Leu
450                 455                 460Lys Lys Tyr Asp Tyr Asp Ser Ser Ser Val Arg Lys Arg Phe Phe Arg465                 470                 475                 480Glu Ala Leu Leu Gln Ile Ser Ile Pro Phe Leu Leu Lys Lys Leu Ala
            485                 490                 495Pro Thr Cys Lys Ser Glu Leu Pro Arg Phe Gln Glu Leu Ile Phe Glu
        500                 505                 510Asp Phe Ala Arg Phe Ile Leu Val Glu Asn Thr Tyr Glu Glu Val Val
    515                 520                 525Leu Gln Thr Val Met Lys Asp Ile Leu Gln Ala Val Lys Glu Ala Ala
530                 535                 540Val Gln Arg Lys His Asn Leu Tyr Arg Asp Ser Met Val Met His Asn545                 550                 555                 560Ser Asp Pro Asn Leu His Leu Leu Ala Glu Gly Ala Pro Ile Asp Trp
            565                 570                 575Gly Glu Glu Tyr Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ser Pro Ser
        580                 585                 590Thr Pro Glu Ser Ala Thr Leu Ser Glu Lys Arg Arg Arg Ala Lys Gln
    595                 600                 605Val Val Ser Val Val Gln Asp Glu Glu Val Gly Leu Pro Phe Glu Ala
610                 615                 620Ser Pro Glu Ser Pro Pro Pro Ala Ser Pro Asp Gly Val Thr Glu Ile625                 630                 635                 640Arg Gly Leu Leu Ala Gln Gly Leu Arg Pro Glu Ser Pro Pro Pro Ala
            645                 650                 655Gly Pro Leu Leu Asn Gly Ala Pro Ala Gly Glu Ser Pro Gln Pro Lys
        660                 665                 670Ala Ala Pro Glu Ala Ser Ser Pro Pro Ala Ser Pro Leu Gln His Leu
    675                 680                 685Leu Pro Gly Lys Ala Val Asp Leu Gly Pro Pro Lys Pro Ser Asp Gln
690                 695                 700Glu Thr Gly Glu Gln Val Ser Ser Pro Ser Ser His Pro Ala Leu His705                 710                 715                 720Thr Thr Thr Glu Asp Ser Ala Gly Val Gln Thr Glu Phe
            725                 730<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>3tgtaaaacga cggccagt                                          18<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>4accatgatta cgccaagctt g                                      21<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>5tacctggagc tcattggcaa ctccttacca                              30<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>6cggaattcat ggggtggatg gg                                      22<210>7<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>7gcgaattcta gaactcagtc tgcacccctg c                            31<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：人工合成的引物序列<400>8gcgaattcga actcagtctg cacccctgc                               29

Claims (20)

1.一种含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白，或一种含有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加、和/或插入，且与含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白功能等价的蛋白。
2.权利要求1的蛋白，其中该蛋白含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
3.编码权利要求1的蛋白的DNA。
4.权利要求3的DNA，其中该DNA包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
5.编码权利要求1的蛋白或这些蛋白的功能等价物的DNA，该DNA在严谨条件下与含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的DNA杂交。
6.一种DNA，其与权利要求4的DNA特异性杂交并具有至少15个核苷酸的链长。
7.针对权利要求4的DNA或其一部分的反义DNA。
8.一种载体，其包含权利要求3、4和5中任一项的DNA。
9.一种转化体，其携有并可表达权利要求3、4和5中任一项的DNA。
10.产生权利要求1的蛋白的方法，该方法包括培养权利要求9的转化体并收集权利要求3、4和5中任一项的DNA的表达产物。
11.一种试剂，其用于检测含有权利要求6之DNA的肾小球膜细胞。
12.与权利要求1的蛋白结合的抗体。
13.权利要求12的抗体，其中该抗体识别含有选自SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白的一部分。
14.权利要求13的抗体，其中该抗体为单克隆抗体。
15.一种测量权利要求2的蛋白或其片段的免疫试验方法，其基于权利要求13或14的抗体对权利要求2的蛋白或其片段的免疫学结合。
16.一种用于检测肾小球膜细胞的试剂，该试剂包含权利要求12-14中任一项的抗体。
17.一种检测肾小球膜增生性肾病的方法，该方法包括测量包含在生物学样品中的权利要求2的蛋白或其片段并将该测量值与从正常样品获得的值进行比较。
18.一种非人类转基因脊椎动物，其中编码Meg-3的基因的表达水平已得到修饰。
19.权利要求18的非人类转基因脊椎动物，其中该非人类脊椎动物是小鼠。
20.权利要求19的非人类转基因脊椎动物，其中该非人类脊椎动物是一种基因敲除小鼠，该小鼠中编码Meg-3的基因的表达已被抑制。
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