CN1321173C

CN1321173C - 枯草芽孢杆菌制剂

Info

Publication number: CN1321173C
Application number: CNB2004101010219A
Authority: CN
Inventors: 沈锦玉; 尹文林
Original assignee: Individual
Current assignee: Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries
Priority date: 2004-12-02
Filing date: 2004-12-02
Publication date: 2007-06-13
Anticipated expiration: 2024-12-02
Also published as: CN1632105A

Abstract

能有效改善养殖水质、降低水中有毒有害物质、对鱼类无毒性和致病性、提高养殖效益的枯草芽孢杆菌制剂，以其重量为基准含有1.4～4.0%下述的发酵培养基固形物、86～90%下述的填充料和余量的水，所述的制剂中枯草芽孢杆菌B115(Bacillus subtilis B115 CGMCC No 1210)含量为1～100×10⁸个/克；所述的发酵培养基固形物为豆饼粉、麸皮、玉米粉中的二种或三种的组合物；所述的填充料为矿粉、农作物秸杆籽粒粉或矿粉和农作物秸杆籽粒粉的组合物。本发明的制剂适合作水质改良剂。

Description

枯草芽孢杆菌制剂

技术领域

本发明涉及含枯草芽孢杆菌的制剂，特别是水质改良剂。

背景技术

近年来，水产养殖业发展极其迅速，大规模集约化过程中大量使用抗生素及其它化学药物，虽然达到了增产与抗病的目的，但长期滥用抗生素不仅会引起病原菌的抗药性，而且水产品和水环境中抗生素的化学残留直接威胁着人类的健康。抗生素的残留已成为我国的水产品国际贸易的技术壁垒，令我国的水产品出口蒙受巨大的损失。近年来国家严格限制抗生素的使用，并积极寻求其替代品。

微生态制剂(或称微生态调节剂microeclogical modulator)的使用已有百年的历史，从二十世纪初梅切尼科夫(Elie Metchnikoff)在欧洲提倡饮用酸牛奶可健康长寿以来，微生态制剂在世界各地发展迅猛，二十世纪七十年代德国Volkor Rusch在赫尔本建立了微生态学研究所，并从事对双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌等活菌作生态疗法的研究与应用。日本于80年代初已有26种微生态制品用于医疗和保健。其他各国亦有多种微生态制品投放市场，而且数量和品种亦在不断扩大。我国最早使用微生态制剂乳酶生(乳杆菌)来防治肠道疾病。80年代初研制成功促菌生(蜡杆芽孢杆菌)以来，各种活菌微生态制剂相继研制成功。如丽珠肠乐(双歧杆菌)、整肠生(地衣芽孢杆菌)、三株口服液(双歧杆菌、乳酸菌、DL菌活生物体及其代谢物)，并陆续投放市场。同时兽用微生态制剂如芽孢杆菌类、乳酸菌类和酵母菌类的微生态制剂研制成功并作为饲料添加剂被广泛使用，1999年农业部规定了枯草芽孢杆菌等12种饲料级微生物添加剂(中华人民共和国农业部公告第105号允许使用的饲料添加剂品种目录)。

水产生物生活的水体环境是一个微生物的动态平衡系统，有益菌群和病原菌群共同生存，但由于环境污染日益严重，养殖水体的水质恶化、致使病原菌大量繁殖，使得近年来水产养殖动物病害不断发生，并呈暴发流行趋势，危及鱼虾蟹贝藻鳖等几乎所有的养殖动物。与此同时由于水产食品中的渔用药物残留及渔用药物对水环境的影响，使得渔用药物的使用受到严格控制。因此在80年代开始用微生态制剂作为渔用水质改良剂。但使用的种类主要为光合细菌、乳杆菌、蜡样芽孢杆菌、噬菌蛭弧菌和复合EM菌群等(鲤微生态制剂及其制备方法专利公开号CN1100271；微胶囊益生净水复合菌修复水产养殖环境的方法专利公开号CN1461734A；一种池塘养虾的前期养水方法专利公开号CN1460414A)。但用枯草芽孢杆菌作为渔用水质改良剂则鲜有报道。目前生产的渔用微生态制剂主要采用常规的深层液体发酵法，该法存在着生产成本高，只能以水剂剂型为主，固化困难等缺点。

发明内容

本发明要解决养殖水体水质因污染而日益恶化以及目前渔用微生态水质改良剂品种较单一或者生产成本高、存在二次污染、剂型固化困难等问题，为此提供本发明的一种枯草芽孢杆菌制剂，本改良剂能有效改良养殖水体水质，对鱼类无毒性和致病性。

为解决上述问题，本发明枯草芽孢杆菌制剂采用的技术方案其特殊之处是以其重量为基准含有1.4～4.0％下述的发酵培养基固形物、86～90％下述的填充料和余量的水，所述的制剂中枯草芽孢杆菌B115(Bacillus subtilis B115CGMCC No 1210)含量为1～100×10⁸个/克；

所述的发酵培养基固形物可以是豆饼粉、麸皮、玉米粉中的二种或三种的组合物；

所述的填充料可以是矿粉、农作物秸杆籽粒粉或矿粉和农作物秸杆籽粒粉的组合物。矿粉和农作物秸杆籽粒组合物，两者可以任何比例组合。

本发明所述的矿粉可以是沸石粉、膨润土、麦饭石粉、陶土、高岭土中的一种或二种以上的组合物，所述的农作物秸杆籽粒粉可以是砻糠粉、米糠、豆粕粉、麸皮、花生粕、菜粕、玉米芯粉中的一种或二种以上的组合物。

本发明中的枯草芽孢杆菌B115于2004年8月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为№ 1210。

枯草芽孢杆菌从池塘淤泥中分离得到。取池塘淤泥，加水稀释，搅拌混匀，煮沸后冷却，再用水稀释至，取稀释液均匀涂于按重量由胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，余量为水，组成的LB固体培养基(pH 7.0～7.2)上，挑取可疑菌落(菌落边缘不整齐)，再接种到另一上述组成的LB固体培养基上，纯培养后鉴定，得到枯草芽孢杆菌B115。

以下对本发明作进一步说明。

1、枯草芽孢杆菌B115的主要特征

枯草芽孢杆菌B115的主要特征为：革兰氏阳性，杆状，能形成芽孢，芽孢呈椭圆形，芽孢囊不膨大，触酶阳性，VP试验阳性，甲基红阴性，能利用葡萄糖不产气，能利用木糖、阿拉伯糖、甘露醇、淀粉、明胶、柠檬酸盐，硝酸盐还原阳性，50℃生长，pH5.7生长，7％NaCl生长。

2、枯草芽孢杆菌B115的保存与培养

菌种于4℃保存于胶状LB培养基中，此培养基配方(W/W)为：胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，余量为水，pH 7.0～7.2。细菌菌种的长期保存采用冰冷干燥方法。

用接种针挑枯草芽孢杆菌B115菌落，接种于含3～5ml液状培养基的试管内，此培养基配方(W/W)为：胰蛋白胨1％，牛肉膏0.25％，NaCl0.5％，余量为水，pH7.0～7.2；200转/分摇床培养，30℃，18～20小时；再将试管中的细菌接种于含上述液状培养基250mL的锥形瓶内，200转/分摇床培养，30℃，21～24h，得到菌液，其中枯草芽孢杆菌B115浓度不小于5×10⁹CFU/mL。

3、枯草芽孢杆菌B115固体发酵

固体发酵采用构造简单的浅盘式发酵器，由一个无菌温室和许多可移动的托盘组成，发酵培养基经灭菌、冷却、接种后装入托盘，料层厚度为1cm～2cm，托盘放在温室的架子上，通过加温增湿器调节温室空间的温度和湿度，温室的温度控制在28～35℃，同时不断通入低压无菌空气，使菌体处于最适生长状态。

发酵培养基的配方(W/W)为：3.5％豆饼粉，4％麸皮，5％玉米粉，余量为水。发酵培养基经120～125℃(0.1～0.15Mpa)高温消毒30分钟，冷却后接种。

以重量计，按发酵培养基1％的量，将上述菌液分别接种到准备好的发酵培养基，混合均匀，混匀后平铺在搪瓷盆或不锈钢浅盘上进行好氧发酵，时间1～2d，得到含菌糊浆。

4、枯草芽孢杆菌B115制剂的配制

将上述含菌糊浆与等重量的本发明所述的填充料混匀后，于40±1℃鼓风式干燥箱中烘干，过18～20目筛，拌匀，制成粉末状的制剂。

按本发明制备的枯草芽孢杆菌B115株的芽孢含量≥20×10⁸CFU/mL。

5、对水质改良作用

(1)不同浓度的枯草芽孢杆菌B115制剂对室内静态水体改良效果

枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，对室内池水的溶氧、pH无明显的影响。

室内池水在使用枯草芽孢杆菌B115制剂后，0.1ppm组氨氮降低5.62～28.51％，最大降解峰值出现在第4d，亚硝酸盐氮降低1.52～10.61％，最大降解峰值出现在第3-4d；硫化物降低2.17～20.65％，最大降解峰值出现在第4d，COD降低0.00～13.83％；0.5ppm组氨氮降低6.93～40.26％，最大降解峰值出现在第4d，亚硝酸盐氮降低7.01～21.66％，最大降解峰值出现在第3d；硫化物降低17.19～31.25％，最大降解峰值出现在第4d，COD降低-0.380～15.22％；1.0ppm组氨氮降低6.28～47.83％，最大降解峰值出现在第5-7d，亚硝酸盐氮降低5.11～24.82％，最大降解峰值出现在第4d；硫化物降低2.91～43.69％，最大降解峰值出现在第4d，COD降低3.98～20.15％。而未使用枯草芽孢杆菌B115制剂的对照池氨氮的变化量为-2.43～13.11％，亚硝酸盐氮的变化量为-5.08～8.47％，硫化物的变化量为-6.41～12.82％，无明显的降解峰出现，COD变化量为-1.95～-7.06％。表明枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，可明显降低池水的氨氮浓度、亚硝酸盐氮、硫化物浓度。由于本次实验在静态水环境中进行，因此对照组的COD也呈下降的趋势，但与试验组相比，第7d时，下降幅度仅为使用芽孢杆菌制剂组的50％以下，结果表明，枯草芽孢杆菌B115对有机质有降低作用。

0.1ppm、0.5ppm、1.0ppm的枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，均对池塘水质有不同的改良作用，在该浓度范围内改良效果与浓度呈正相关，但0.1ppm枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，池水中氨氮降解率为28.51％、亚硝酸盐氮为10.61％、硫化物为20.65％，而0.5ppm和1.0ppm的枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，氨氮降解率＞40％、亚硝酸盐氮＞20％、硫化物＞30％。虽然1.0ppm使用后效果要优于0.5ppm的使用效果，但两者相比，效果差别不是非常大，因此从使用成本和使用效果等方面的综合考虑，作为微生态水质改良剂，当枯草芽孢杆菌B115浓度为20亿/克时，0.5ppm的使用剂量比较合理的。

(2)枯草芽孢杆菌B115制剂对养殖鱼池的水质改良效果测定

试验在湖州市金泰水产养殖有限公司的3号、4号和5号池进行，其中3号和4号池为试验池，5号池为对照池，池塘相邻，面积均为8亩，水深1.5米，3号和5号池塘主要养殖太湖白鱼、4号池塘主要养殖鳜鱼。3号和4号池按枯草芽孢杆菌B115制剂使用说明，每池用枯草芽孢杆菌B115制剂4000g全池泼洒，使用后的第3、第7及第15天采集水样分析测定。第15天时试验池塘第二次使用枯草芽孢杆菌B115制剂4000g全池泼洒。

在试验期间，两试验鱼池pH的变化量分别为-0.26～0.40％和-0.39～0.66％，而对照鱼池pH变化量为-0.39～0.13％；两试验鱼池溶氧的变化率为-0.53～5.20％和-0.239～0.13％；对照鱼池溶氧变化率为0.51～5.68％，表明枯草芽孢杆制剂使用后对养殖鱼池溶氧和pH无明显的影响。试验鱼池在使用枯草芽孢杆菌B115制剂后最大降解峰出现在第3d，氨氮分别降低49.45％和48.57％，亚硝酸盐氮分别降低13.86％和13.22％，硫化物分别降低25.81％和16.49％，之后各项水化指标逐渐升高，至第15d时，两试验鱼池氨氮仅降低3.3％和11.43％；亚硝酸盐氮降低4.95％和4.13％，硫化物降低14.52％和2.06％。因此在第15d时继续用0.5ppm的枯草芽孢杆菌B115制剂全池泼洒，第二次使用后的最大降解峰仍出现在第3d，氨氮分别降低45.60％和50.29％，亚硝酸盐氮降低18.81％和11.57％，硫化物降低30.65％和19.59％，至30天时各项水化指标又逐渐升至使用前水平。对照鱼池氨氮变化范围为-3.09％～13.58％，亚硝酸态氮-46.65％～11.63％，硫化物能降低-3.95％～11.63％，无明显的降解峰出现。4号和3号试验池塘的COD分别为降低0.59～6.00％和0.28～3.92％，而对照池塘的COD增加0.00～4.09％。结果表明枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，对池塘氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和有机物具有明显的降解作用，降解高峰出现用后第3d左右，在池塘中的维持时间在15d左右，追加使用后的第3d能再次出现氨氮，亚硝酸态氮和硫化物降解高峰。因此建议在生产中，枯草芽孢杆菌B115制剂一次使用后，在15天以内应继续使用，以有效地改善养殖池塘的环境，降低池塘中有毒有害物质的量，提高养殖效益。

(3)枯草芽孢杆菌B115制剂对养殖蟹池的水质改良效果测定

试验在湖州市青山乡张新江河蟹养殖场的东1和东2池塘进行，池塘相邻，面积分别为15亩和7亩，平均水深为0.6m。东1池塘为试验池，主要以饲养成蟹为主。试验时用3000g枯草芽孢杆菌B115制剂全池泼洒。东2池塘为对照池。

在试验期间，试验蟹池pH的变化量分别为0.57％～1.58％，溶氧的变化率为-1.22％～2.91％，对照蟹池pH变化量为0.14％～0.42％；溶氧变化率为0.63％～3.30％，表明枯草芽孢杆菌B115制剂使用后对养殖蟹池溶氧和pH无明显的影响。试验蟹池在使用枯草芽孢杆菌B115制剂后第3天出现降解高峰，氨氮降低38.25％；亚硝酸盐氮降低17.05％，硫化物降低14.29％；之后各项水化指标逐渐升高。而总大肠菌群则在第7天出现最大降低值为33.90％，在3-15天内均保持了较低的值。

总之，三种不同水体枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，对溶氧和pH均无明显的影响。而对氨氮最大降解峰值出现在用后的3～4d，最大平均降低率为45.40±5.06％，亚硝酸盐氮的最大降解峰值出现在使用后3d，最大平均降低率为16.03±3.82％，硫化物的最大降解峰值出现在使用后3～4d，最大平均降低率为23.01±7.27％；而各对照组的氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物呈波动变化，且出现时间也不固定，统计分析两者有明显差异(P＜0.1)。因此可以判断枯草芽孢杆菌B115剂使用后，对水体中氨氮、亚硝酸盐氮及硫化物有明显的改良作用。

6、枯草芽孢杆菌B115微生态制剂对常见致病微生物的影响

筛选出抗菌活性较强的菌株B115。B115菌液培养并经离心后，其培养滤液对常见的鱼类病原菌具有抑菌活性，能较强地抑制细菌性败血症病原(BSK-10)、金黄色葡萄球菌、大黄鱼致病菌(副溶血弧菌、哈维氏弧菌)，但不能抑制中华鳖致病菌(TL970424)。对BSK-10的抑菌圈为14mm，对大黄鱼哈维氏弧菌的抑菌圈为15mm，对大黄鱼副溶血弧菌的抑菌圈为13mm，对河蟹致病菌C199920的抑菌圈为13mm，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈为10mm。说明B115菌在培养过程中可分泌出一种抗菌物质，其抑菌范围是相当广泛的包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌，但并不是所有的细菌。

(1)对BSK-10的作用

B115与BSK-10混合培养时，BSK-10的初始浓度与B115一致均为5000CFU/ml时BSK-10的生长不受B115的抑制，24h培养产物中BSK-10的含量与BSK-10纯培养浓度一致，BSK-10的初始浓度为B115的1/10和1/100时，6h时计数结果表明：BSK-10的生长基本不受B115的影响，但至24h时未检测到BSK-10(最低检出值为100CFU/ml)，说明B115对中、低浓度的BSK-10具有明显的杀灭作用；但高浓度的BSK-10对B115的生长具有抑制作用，24h时B115的增殖倍数为对照的1/1200，中、低浓度的BSK-10对B115的生长基本无影响。

(2)对C199920的作用

B115与C199920混合培养的抑杀菌效果，试验结果表明B115(浓度为5000CFU/ml)对中高浓度(5000和500CFU/ml)的C199920具有明显的抑制作用，且在6h时就已表现出来，中高浓度的C199920在6h时其增殖量分别为对照的1/5和1/12，至24h时为对照的1/600和1/300；B115对低浓度(50CFU/ml)的C199920有明显的杀灭作用，6h和24h时均未检出C199920的存在，即起始浓度为50CFU/ml的C199920没有增殖到100CFU/ml，可见5000 CFU/ml的B115对50CFU/ml的C199920具有杀灭作用；而C199920对B115的生长基本无影响，三个浓度的C199920与B115混合培养至24h后，B115的含量与对照无明显差异。

气单胞菌广泛分布于水体环境中，能够引起鲫、鳊、鲢、鳙等普通养殖鱼类及虾、蟹、鳖、蛙等特种水产动物的严重疾病。B115与致病性气单胞菌混合培养的结果显示，5000CFU/ml的B115能杀灭500CFU/ml、50CFU/ml的鱼类气单胞菌败血症病原菌BSK-10以及50CFU/ml的河蟹气单胞菌致病菌C199920，能抑制5000 CFU/ml和500CFU/ml的C199920的生长。但B115对甲鱼致病性气单胞菌TL97424无抑制作用。因此，在养殖水体中施用B115制剂对防治某些致病性气单胞菌引起的疾病具有一定的效果。

7、枯草芽孢杆菌B115微生态制剂的毒性及致病性

(1)芽孢杆菌的毒性试验

A、对鲫鱼的急性毒性试验

10ppm、100ppm枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，试验鱼摄食、活动正常，成活率为100％；1000ppm使用后，池水稍变浑浊，但鲫鱼摄食、活动正常，成活率为100％；4000ppm使用24h后，水质浑浊，试验鱼缺氧浮头，96h内平均死亡率为35％。枯草芽孢杆菌B115株对鲫鱼的96小时LD₅₀＞4000ppm。

B、对淡水青虾的急性毒性试验

10ppm、100ppm枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，试验虾摄食、活动正常，成活率为100％；1000ppm枯草芽孢杆菌B115制剂使用后，池水稍变浑浊，淡水青虾出现浮头，96h内平均成活率为60％；2000ppm使用后，池水变浑，24h后，淡水青虾严重缺氧浮头，48h内全部死亡。用直线内插法计算枯草芽孢杆菌B115制剂对淡水青虾的96hLD₅₀为1350ppm。

C、对小白鼠毒性试验

小白鼠随机分组，每组10只，雌雄各半，每笼10只，给药前称重。试验分口灌给药、拌饵给药两组，各组按高、中、低三个剂量给药，其中高剂量组分别口灌和拌饵给菌5×10¹⁰CFU/只，中剂量组口灌和拌饵给菌1×10¹⁰CFU/只，低剂量口灌和拌饵给菌0.5×10¹⁰CFU/只每天给药一次。同时设试验对照组和空白对照组。

各组小鼠用枯草芽孢杆菌B115制剂投喂后，每天观察小白鼠的外表、行为、饮食等情况。30天试验结束于末次给药后24h，采血测定血液学、血液生化学指标，各组小白鼠采血后断颈处死，迅速解剖，仔细观察心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、子宫、卵巢、睾丸病变。

30天试验结束于末次给药后24h，眼眶取血，用全自动血液分析仪测定红细胞总数、血红蛋白、白细胞和淋巴细胞；用BackMan全自生化分析仪测定谷草转氨酶、谷丙转氨酶、AST和ALK，对测定的数据作方差检验

30天试验结束后，各试验组和对照组小白鼠的活动、颜色光泽、呼吸均正常，鼻腔末见分泌物外溢，粪便成形，成活率为100％。30天饲料消耗及小白鼠体重均无差异(P＞0.1)，心、肝、脾、肺、肾、胃、脑、子宫、卵巢、睾丸均正常。试验组和对照组小白鼠的血液学和血液生化学指标经t检验结果表明小白鼠口灌和拌饵投饲枯草芽孢杆菌B115制剂后，t值均＞0.1，两者无差异，表明枯草芽孢杆菌B115株对小白鼠无毒性。

(2)枯草芽孢杆菌B115制剂的致病性试验

(1)鲫鱼口灌枯草芽孢杆菌B115株的致病性试验

将枯草芽孢杆菌B115制剂稀释至50×10⁸cfu/mL及用4℃，6000rpm离心10min，取菌泥，用生理盐水稀释至200×10⁸cfu/mL后，用自制的口灌器，分别灌入1ml、0.5ml和0.1ml的枯草芽孢杆菌B115培养物和菌泥稀释液，每两天口灌一次，连续口灌三次，同时设口灌1ml灭菌LB培养基对照组，口灌结束后连续观察15天，各组试验组和对照组鲫鱼口灌枯草芽孢杆菌B115制剂后均未出现死亡，成活率为100％，与对照组相比体重未有明显下降，体表和脏器解剖观察未出现异常，表明口灌枯草芽孢杆菌B115株对鲫鱼无致病性。

(2)注射枯草芽孢杆菌B115株的致病性试验

枯草芽孢杆菌B115离心后菌泥用生理盐水稀释成200×10⁸cfu/mL后，腹腔注射鲫鱼10尾/组，每尾分别注射0.5和0.1ml。对照组鲫鱼注射灭菌生理盐水，每尾注射0.5ml。中华绒螯蟹于第三步足基部注射10只，每只注射0.1ml，对照组每只注射生理盐水0.1ml；南美白对虾注射10尾，每尾注射0.1ml，对照组每尾注射0.1ml生理盐水；小白鼠腹腔注射10只/组，皮下注射10只/组，每只分别注射0.5ml和0.1ml，每2d注射一次，连续注射3次，对照组每只注射生理盐水0.5ml。连续观察15天。试验期间水温为25±1℃，池水溶氧在5mg/L以上，pH7.35，气温为30±3℃。各试验组和对照组鲫鱼、中华绒螯蟹和南美白对虾注射枯草芽孢杆菌B115后的15天内，均未出现死亡，成活率为100％，与对照组相比体重未有明显下降，体表和脏器解剖观察未出现异常。各试验组和对照组小白鼠的活动、皮毛颜色光泽、呼吸均正常，鼻腔末见分泌物外溢。皮下注射部分有结块，腹腔注射的小白鼠腹水增多，肝、脾、肾、肠、性腺等脏器解剖观察正常。因此初步判断本实验室从池塘淤泥中分离的枯草芽孢杆菌B115株对常见水产动物及小白鼠无致病性。

试用表明，本发明的水质改良剂，对池塘氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和有机物具有明显的降解作用，能有效改善养殖池塘的环境，降低池塘中有毒有害物质的量，并且对鱼类无毒性和致病性，能有效提高养殖效益。本发明的制剂，可以是固体剂型，有利于储存、包装、运输。

具体实施方式

实施例1

取池塘淤泥，加10倍重量的无菌水稀释，搅拌混匀，煮沸8分钟，冷却，再分份用无菌水分别稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，取不同稀释度的液体0.1ml，均匀涂于按重量由胰蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，余量为水，组成的LB固体培养基(pH 7.0～7.2)上，挑取可疑菌落(菌落边缘不整齐)，再接种到另一上述组成的LB固体培养基上，纯培养后鉴定，得到枯草芽孢杆菌B115。

将枯芽孢杆菌B115接种于含4ml按重量由胰蛋白胨1％，牛肉膏0.25％，NaCl0.5％，余量为水，组成的液状培养基(pH7.0～7.2)的试管内，再将试管中的细菌接种于含上述液状培养基250mL的锥形瓶内，200转/分摇床培养，30℃，21小时，得到菌液，此菌液中枯草芽孢杆菌B115浓度不小于5×10⁹CFU/mL。

按重量将麸皮4％、豆饼粉3.5％、玉米粉5％和余量的水混匀后，高压灭菌，冷却后制成发酵培养基。将发酵培养基重量1％的上述菌液加入发酵培养基，混匀后平铺于搪瓷托盆，料层厚度为1.5cm，托盘放在温室的架子上，通过加温增湿器调节温室空间的温度和湿度，同时不断通入低压无菌空气，使菌体进行好氧发酵，时间24小时，得含菌糊浆。

按重量由沸石粉和砻糠粉按1∶1的比例混合，得填充料。将等重量的所述填充料和含菌糊浆混匀后，于40±1℃鼓风式干燥箱中烘干，过18～20目筛，拌匀，制成粉末状的制剂。经测定该制剂的枯草芽胞杆菌B115为8.2×10⁹个/g；再加所含填充料3倍重量的所述填充料，制成枯草芽孢杆菌B115制剂，其中含枯草芽孢杆菌B115 21×10⁸个/g。

实施例2

区别于例1的是，本例发酵培养基按其重量计组成为豆饼粉4％，麸皮5％，玉米粉5％和余量的水；填充料按重量由沸石粉∶米糠为2∶1混合组成，填充料与含菌糊浆混合后41℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为9.8×10⁹个/g，再加所含填充料3倍重量所述的填充料，制成菌含量为24×10⁸个/g的制剂。其它步骤与例的相同。

实施例3

本例发酵培养基按其重量计组成为豆饼粉4％，麸皮4％，玉米粉3％和余量的水，发酵培养24小时；填充料按重量由高岭土∶玉米芯粉为2∶1混合组成，测定粉末状制剂其活菌含量为9.2×10⁹个/g，再加所含填充料3倍重量所述的填充料，制成菌含量为22×10⁸个/g的制剂。

实施例4

本例发酵培养基按其重量计组成豆饼粉4％，麸皮2％，玉米粉4％和余量的水；填充料按重量由膨润土∶麸皮为4∶1混合，填充料与含菌糊浆混合后40℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为7.8×10⁹个/g，再加所含填充料2.5倍重量所述的填充料，制成菌含量为21×10⁸个/g的制剂。

实施例5

本例发酵培养基按其重量计组成为豆饼粉3％，麸皮5％，玉米粉3％和余量的水；填充料按重量由陶土∶豆粕粉为3∶1混合，填充料与含菌糊浆混合后41℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为7.6×10⁹个/g，再加所含填充料2.5倍重量所述的填充料，制成菌含量为20×10⁸个/g的制剂。

实施例6

本例发酵培养基按其重量计组成为豆饼粉2％，麸皮3％和余量的水；填充料按重量由麦饭石粉∶花生粕为3∶1混合，填充料与含菌糊浆混合后40℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为6.8×10⁹个/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，制成菌含量为22×10⁸个/g的制剂。

实施例7

本例发酵培养基按其重量计组成为麸皮5％，玉米粉4％和余量的水；填充料按重量由沸石粉∶菜粕为3∶1混合，填充料与含菌糊浆混合后41℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为6.6×10⁹个/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，制成菌含量为21×10⁸个/g的制剂。

实施例8

本例发酵培养基按其重量计组成为豆饼粉3％，麸皮4％和余量的水；填充料为沸石粉混合，填充料与含菌糊浆混合后40℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为6.3×10⁹个/g，再加所含填充料2倍重量的沸石粉，制成菌含量为20×10⁸个/g的制剂。

实施例9

本例发酵培养基按重量计组成为豆饼粉3％，玉米粉4％和余量的水；填充料为砻糠粉，填充料与含菌糊浆混合后41℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为9.8×10⁸个/g，再加所含填充料3倍重量的大糠，制成菌含量为3×10⁸个/g的制剂。

实施例10

本例发酵培养基按重量计组成为豆饼粉2％，麸皮5％，玉米粉1.5％和余量的水；填充料为玉米芯粉，填充料与含菌糊浆混合后41℃烘干，测定粉末状制剂其活菌含量为168×10⁸个/g的制剂，再加所含填充料1倍重量的砻糠粉，制成菌含量为84×10⁸个/g的制剂。

Claims

1、枯草芽孢杆菌制剂，其特征是以其重量为基准含有1.4～4.0％下述的发酵培养基固形物、86～90％下述的填充料和余量的水，所述的制剂中枯草芽孢杆菌B115(Bacillus subtilis)B115 CGMCC N o 1210含量为1～100×10⁸个/克；

所述的发酵培养基固形物为豆饼粉、麸皮、玉米粉中的二种或三种的组合物；

所述的填充料为矿粉、农作物秸杆籽粒粉或者为矿粉和农作物秸杆籽粒粉的组合物。

2、如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌制剂，其特征是所述的矿粉为沸石粉、膨润土、麦饭石粉、陶土、高岭土中的一种或多种，所述的农作物秸杆籽粒粉为砻糠粉、米糠、豆粕粉、麸皮、花生粕、菜粕、玉米芯粉中的一种或多种。