CN102181423A

CN102181423A - 一种固定化活性益生菌及其生产方法

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Publication number: CN102181423A
Application number: CN2011100671248A
Authority: CN
Inventors: 孙永欣; 温志新; 李树英
Original assignee: DALIAN BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE OF LIAONING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Current assignee: DALIAN BIOTECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE OF LIAONING ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES
Priority date: 2011-03-18
Filing date: 2011-03-18
Publication date: 2011-09-14

Abstract

一种固定化活性益生菌的生产方法，包括将固定化载体与益生菌接触的步骤，其中所述的固定化载体是麦饭石。应用本发明的方法生产固定化活性益生菌，方法简便易行、设备要求较低、成本低、易于大规模生产。所得的产品具有如下突出优点：1)有效防止益生菌在水体中的散失造成益生菌无效或低效；2)增强水产动物免疫力和抗病力；3)有效降低水体氨氮和亚硝酸盐浓度；4)产生多种酶类，提高水产动物饲料利用率，提高动物增重率；5)协同发挥益生菌和麦饭石有益功能，补充饲料微量元素。此外，产品常温下可长期保存，益生菌不失活，细菌数不降低。产品添加到饲料中可以任意制粒、压片而不影响益生菌活性。

Description

一种固定化活性益生菌及其生产方法

技术领域

本发明涉及饲料和饲料添加剂领域，具体为一种固定化活性益生菌的生产方法。

技术背景

抗生素药物在水产养殖中的限制使用迫切需要其替代物，益生菌因为在促进动物健康方面的独特作用已引起研究者越来越多的关注。枯草芽孢杆菌是我国农业部正式批准使用的益生菌，具有菌种单一、对抗生素无耐药性及对水产动物无毒性等特点，枯草芽孢杆菌因能耐受饲料制备过程中高温(100℃)高压，因此非常适用于饲料添加剂。

枯草芽孢杆菌繁殖过程中分泌大量的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，提高宿主消化酶浓度，也能合成维生素和辅酶因子提高动物消化酶活性。并且其细胞的脂磷壁酸LTA和肽聚糖-磷壁酸复合物还具有很强的免疫佐剂活性作用，因此能提高动物免疫力。此外，枯草芽孢杆菌大量好氧，能形成肠道厌氧环境，有益于乳酸菌等有益菌增殖，完善肠道生物屏障的作用，抵抗病原菌的定植和侵害。在水产养殖中，其作为饲料添加剂能显著提高水产动物增重率、免疫力和抗病力，作为水体修复剂在降低水体氨氮、亚硝酸盐和COD等污染物中有明显作用。

麦饭石是一种高效无毒的药物矿石，在我国资源丰富。它含有多种对生物生长发育有益的常量、微量元素以及被称作动物生长调节剂的稀土元素和微量氨基酸，因其具有矿化性、吸附性，现已广泛用于矿化饮用水生产，并且可以有效捕获水体中重金属和细菌。麦饭石作为载体用于益生菌固定载体扩大了麦饭石的使用范围，该方法避免微生物在水体中悬浮流失并保证细胞酶活性不受影响，现已广泛用于水质净化。

当前，我国海参、鲍鱼等水产动物高密度养殖导致水体严重污染，极易产生致病菌大量滋生，一旦外界环境发生突变，就会爆发大规模病害。而饲料中添加益生菌能直接提高动物肠壁对病原菌的屏障能力、提高免疫力，并明显提高饲料利用率。因此，饲料中添加益生菌补充动物体内有益菌数量提高动物抗病力和增重率、降低残饵和粪便对水体污染十分必要。然而，实际应用中由于海参、鲍鱼等水产养殖动物摄食方式的特殊性(舔食和刮食)，造成饲料中添加益生菌大部分在水体中散失而造成浪费。因此，如何利用简便的工艺对益生菌固定化并保持益生菌活性，是解决益生菌在水产养殖实际应用的最佳途径。目前，已有用于水产饲料的益生菌固定方法，但工艺复杂且对设备要求较高。

发明内容

结合上述麦饭石的特征，本发明旨在提供一种以其为固定载体的活性益生菌饲料添加剂的生产方法。

为此目的，本发明首先提供如下固定化活性益生菌的生产方法，该方法包括将固定载体与益生菌接触的步骤，所述的固定化载体是麦饭石。

作为载体的麦饭石粉末，其粒径大小决定比表面积的大小，会影响对活性菌吸附的效果。本发明的技术方案中，优选使用粒度100～200目的麦饭石。

麦饭石与活性益生菌结合并不具有菌种的选择性，可以认为所有适宜浓度的在现有技术体系下的益生菌均可作为备选使用的菌种，本发明优选使用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

本发明提供的固定载体与益生菌接触的优选方式之一是将麦饭石粉末加入到益生菌发酵培养液中，均匀混合后静置足够长的时间至出现明显分层。其中麦饭石粉末和益生菌发酵培养液的用量比优选1～3g∶10ml。枯草芽孢杆菌发酵培养液的菌体浓度优选10⁸～10⁹个/ml。

针对本发明的优选菌种，枯草芽孢杆菌，其发酵液的制备方法是：将枯草芽孢杆菌菌粉以0.5g/100ml的接种量接入到培养基中，36℃培养14～16h；其中所用的培养基的制备方法是：将20g蔗糖、15g大豆蛋白胨和0.5g牛肉膏溶于1L海水中，调pH7.5，无需高压灭菌。

上述方法中，所述的枯草芽孢杆菌菌粉购自沧州华雨药业有限公司，活菌数≥200亿个/克，水份≤8％。

所述的海水盐度为33‰左右的天然海水，经过普通定性滤纸过滤即可使用。

上述本发明的方法中，麦饭石粉末与益生菌发酵培养液混合的方式有多种，目的是保证麦饭石粉末和活性益生菌的充分接触，本领域的普通技术人员可以根据已有的条件灵活选择混合方式。本发明人优选使用摇床振荡混合，摇床振荡频率150～200rpm，时间是1～5小时，优选1～3h。

上述本发明的固定化活性益生菌的生产方法中还包括产品的后处理步骤，即麦饭石粉末与益生菌发酵培养液接触后收集沉淀、烘干粉碎并过200目筛网的步骤。所述的烘干温度优选60～80℃。

本发明另一方面的目的则是提供使用麦饭石为载体、通过让麦饭石与益生菌接触的步骤来制备得到的固定化活性益生菌。本说明书所述及的任何一种方法所生产的麦饭石为载体的固定化活性益生菌均属于本发明保护的范畴。

进一步通过试验证明，作为饲料添加剂，麦饭石可提供微量元素、矿物质，枯草芽孢杆菌分泌胞外消化酶，在提高生物增重率和抗病力方面具有协同增效作用。进入养殖水体中，麦饭石吸附水体氨氮和亚硝酸盐，并为枯草芽孢杆菌提供氧气，枯草芽孢杆菌在有氧环境中可有效分解水体中氨氮和亚硝酸盐，二者在氨氮、亚硝酸盐清除作用中具有协同增效作用。

应用本发明的方法生产固定化活性益生菌，方法简便易行、设备要求较低、成本低、易于大规模生产。所得的产品具有如下突出优点：1)有效防止益生菌在水体中的散失造成益生菌无效或低效；2)增强水产动物免疫力和抗病力；3)有效降低水体氨氮和亚硝酸盐浓度；4)产生多种酶类，提高水产动物饲料利用率，提高动物增重率；5)协同发挥益生菌和麦饭石有益功能，补充饲料微量元素。此外，产品常温下可长期保存，益生菌不失活，细菌数不降低。产品添加到饲料中可以任意制粒、压片而不影响益生菌活性。

附图说明

本发明附图4幅：

图1是基础饲料中添加不同成分的刺参饲喂实验，60天后考查刺参增重率，图示数据显示各实验组相对于对照组的增重率。

图2是不同时间测试枯草芽孢杆菌、麦饭石和载菌麦饭石对养殖废水中氨氮清除效果，所用测试品用量为150ppm。

图3是不同时间测试枯草芽孢杆菌、麦饭石和载体麦饭石对养殖废水中亚硝酸盐的清除效果，所用测试品用量为150ppm。

图4是存放60d后，平板检测载菌麦饭石粉末中益生菌菌数和存活情况照片。

具体实施方式

下面的非限制性实施例用于进一步说明本发明的内容，但不以任何形式限制本发明。无特殊说明，本说明书中的枯草芽孢杆菌菌粉购自沧州华雨药业有限公司；麦饭石粉购自阜新麦饭石供销公司；海水为过滤后天然海水，盐度约为33‰；大豆蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司(批号：20060306)、牛肉膏购自北京奥博星生物技术有限公司(批号：20060112)；立式恒温摇床(SPH-2102C)，购自上海民仪电子有限公司；恒温干燥箱(DHG-9240A)，购自上海精宏实验设备有限公司。

制备实施例1

一种固定化活性益生菌的生产方法，具体包括以下步骤：

1、枯草芽孢杆菌菌粉以0.5g/100ml接种量接入到培养基中。培养基配制方法如下：20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、0.5g牛肉膏溶于1L海水中，pH7.5。无需高压灭菌，于36℃培养14h后，得到发酵培养益生菌，菌浓度1.0×10⁸～1.0×10⁹个/ml，此培养液为发酵培养液。

2、将粒度为100～200目麦饭石粉末作为吸附载体按1∶10重量体积比(g/ml)加入到益生菌发酵培养液中，摇床高速振荡混合，振荡频率为170rpm，振荡时间为2h。

3、室温静置30min至出现明显分层后收集沉淀，于70℃烘干后超微粉碎，过200目筛网制成。

制备实施例2

一种固定化活性益生菌的生产方法，具体包括以下步骤：

1、枯草芽孢杆菌菌粉，以0.5g/100ml接种量接入到培养基中。培养基配制方法如下：20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、0.5g牛肉膏溶于1L海水中，pH7.5。无需高压灭菌，于36℃培养14h后，得到发酵培养益生菌，菌浓度1.0×10⁸～1.0×10⁹个/ml，此培养液为发酵培养液。

2、将粒度为100～200目麦饭石粉末作为吸附载体按2∶10重量体积比(g/ml)加入到益生菌发酵培养液中，摇床高速振荡混合，振荡频率为170rpm，振荡时间为2h。

制备实施例3

一种固定化活性益生菌的生产方法，具体包括以下步骤：

2、将粒度为100～200目麦饭石粉末作为吸附载体按3∶10重量体积比(g/ml)加入到益生菌发酵培养液中，摇床高速振荡混合，振荡频率为170rpm，振荡时间为2h。

麦饭石对益生菌吸附率实验、载菌麦饭石饲喂和净化水质实验以及饲料中益生菌存活情况如下：

实施例4

麦饭石对益生菌吸附率试验

将粒度为100～200目麦饭石粉末作为吸附载体按2∶10重量体积比(g/ml)加入到益生菌发酵培养液中，摇床高速振荡混合，振荡频率为170rpm，振荡时间为分别设置为0、30、60和120min共4组，除对照组外，每组设2个重复。振荡停止后于室温静置30min至出现明显分层后，取上清液0.1ml至枯草芽孢杆菌平板(20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、15g琼脂、0.5g牛肉膏溶于1L过滤海水中，pH7.5，高压灭菌后倒板，冷却凝固后使用)。用涂布器将菌液均匀涂布在平板表面，36℃培养12h后计数菌落。

按照下述方法计算吸附率：

(对照组上清液菌落数-实验组上清液菌落数)/对照组上清液菌落数×100％

所得实验组平均吸附率如表1所示：

从试验结果可以看出：麦饭石粉末对益生菌的吸附率在0～120min内随振荡时间延长而增加，在60min时，吸附率明显增加，120min达到最大值。

表1

注：表中麦饭石和益生菌培养液重量体积比为2∶10

实施例5

海刺参饲喂试验

本实施例所用刺参为大连瓦房店某大型刺参育苗场同批刺参幼体(小白点)，于养殖场室内育苗池(体积为25m³)内工厂化养殖，每天更换1/3体积海水，每周全换水一次，每天下午投喂饲料，水温在13-16℃间，盐度保持在28-31‰。

养殖试验分4组，分别是对照组、枯草芽孢杆菌组、麦饭石组和载菌麦饭石组，其中载菌麦饭石按制备实施例2制得。每个试验组为一个育苗池的全部幼体(约上亿个体，初始体重≈0)，养殖试验共60d，试验结束称量体重，计算增重率。增重率计算公式为：(实验组体重-对照组体重)/对照组体重×100％

分别在基础饲料中添加3种饲料添加剂，按照质量百分比，添加剂量为：枯草芽孢杆菌5％；麦饭石5％；载菌麦饭石5％。

各组饲料配方见表2(质量份)。

表2

实验结果如附图1所示。

可见：饲料中单独添加枯草芽孢杆菌对海刺参幼体生长有抑制作用，饲料中添加麦饭石粉末明显提高幼体增重率，按本发明方法将益生菌固定得到载菌麦饭石添加到饲料中饲喂刺参幼体，其增重效果最佳。

实施例6

养殖废水中氨氮和亚硝酸盐清除效果试验

于30L刺参养殖废水中分别投入150ppm枯草芽孢杆菌粉、麦饭石粉和载菌麦饭石，其中载菌麦饭石按制备实施例2制得，并设空白对照组，每组3个重复。分别于试验0、1、3、7d取样测定氨氮和亚硝酸盐，取平均值。期间不充气，添加的剂量参考麦饭石净化海参圈的常用量。

采用奈氏试剂法测定水中氨氮含量；用重氮-偶氮比色法测定亚硝酸盐含量。

实验结果如附图2和附图3所示，分别显示不同时间水体氨氮浓度和亚硝酸盐浓度。

由该实验结果可见，经过7d的4次测定，对照组、芽孢杆菌组和麦饭石组水体氨氮值不断上升，芽孢杆菌组始终高于对照组，麦饭石组始终低于对照组；按本发明方法将芽孢杆菌用麦饭石固定后，其对水体氨氮去除效果虽然在前3次略差于麦饭石，但仍优于对照组和芽孢杆菌组，而在第4次测定中，呈现最佳氨氮清除作用，且氨氮值呈现出与其它3组不同的下降趋势。单独使用枯草芽孢杆菌对水体氨氮没有表现出去除能力，反而造成氨氮值升高。

麦饭石在1d时对水体中亚硝酸盐去除效果最好，在第3d和7d时，本发明制备的载菌麦饭石对水体亚硝酸盐去除效果最佳。单独使用枯草芽孢杆菌在前期会造成亚硝酸盐值升高，在7d测定时才表现出降解能力。

实施例7

本发明制备固定化枯草芽孢杆菌长期有效性检测

取室温存放60d的按实施例2制得的载菌麦饭石粉末少量(约1接种环)，溶于1ml灭菌去离子水中后，取0.1ml悬浊液，用涂布器均匀涂在枯草芽孢杆菌平板(20g蔗糖、15g大豆蛋白胨、15g琼脂、0.5g牛肉膏，溶于1L过滤海水中，pH7.5，高压灭菌后倒板，冷却凝固后使用)上，36℃培养12h后计数菌落数。

实验结果见附图4，可见：本发明制备的载菌麦饭石经过60d室温(约20℃)存放后，用平板法检测，芽孢杆菌仍可存活。

Claims

1.一种固定化活性益生菌的生产方法，包括将固定载体与益生菌接触的步骤，其特征在于所述的固定载体是麦饭石。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述的麦饭石粒度100～200目。

3.权利要求2所述的方法，其特征在于所述的益生菌是枯草芽孢杆菌。

4.权利要求3所述的方法，其特征在于固定载体与益生菌接触的具体方式是将麦饭石粉末按照质量体积比1～3g∶10ml加入到枯草芽孢杆菌发酵培养液中，均匀混合后静置至出现明显分层。

5.权利要求4所述的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌发酵培养液的菌体浓度为10⁸～10⁹个/ml。

6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌发酵培养液的制备方法是：将枯草芽孢杆菌菌粉以0.5g/100ml的接种量接入到培养基中，36℃培养14～16h。

7.权利要求4所述的方法，其特征在于麦饭石粉末加入到益生菌发酵培养液后，摇床振荡混合，摇床振荡频率150～200rpm，时间是1～3h。

8.权利要求4所述的方法，还包括静置后收集沉淀、烘干粉碎并过200目筛网的步骤。

9.权利要求8所述的方法，其特征在于所述的烘干温度是60～80℃。

10.按照权利要求1～9中任一项的方法生产出来的固定化活性益生菌。