CN1286303A - 抗人龋齿致病菌蛋白基因及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及遗传工程及突变,包括构建编码人龋齿致病菌－变异链球菌葡糖基转移酶(GTF)的酶活性区域(Cat)、底物接合区域(Glu)、Cat－Glu的基因及其与人乙型肝炎病毒核心蛋白的基因融合的三种融合基因,基因的酵母、植物表达载体,融合基因形成的颗粒结构同时具有人龋齿致病菌－变异链球菌葡萄糖基转移酶(GTF)的Gat、Glu、Cat－Glu抗原表位和乙肝核心抗原的双重抗原性和免疫原性。为人龋齿基因工程亚单位疫苗提供了一种新的方法。

Description

抗人龋齿致病菌蛋白基因及其制备方法

本发明涉及突变或遗传工程。

龋齿被人们认为是人类最普遍的感染性疾病。关于免疫防龋的研究已有近30年的历史。早在60年代末期，国外学者即开始了对防龋疫苗的探索，期望通过接种防龋疫苗，能有效阻止致龋菌在宿主口内的粘附与定殖，达到预防龋齿的目的。近年来，运用免疫学手段控制龋齿病更为其研究的热点，主要有以下几个方面：

一、主动免疫防龋

主动免疫是用人工接种的方法给机体输入抗原性物质，刺激机体免疫系统产生免疫应答，从而提高机体抗病能力。在主动免疫防龋研究过程中，存在着一些障碍，主要包括三个方面：(1)变形链球茵(简称变链菌)等致龋茵一般定殖在宿主组织表面，而在这些部位是难以激发有效的免疫反应的；(2)抗变链菌抗体能与机体组织蛋白特别是心脏组织发生交叉反应，产生免疫复合物介导的疾病，如细菌性心内膜炎；(3)变链菌与口腔内其它链球茵具有交叉反应性抗原，防龋疫苗介导的免疫反应可能破坏口腔内正常菌群的生态平衡，因此多年来学者们一直致力于通过改变免疫原、免疫途径、免疫佐剂和免疫频率等手段，企求寻找一种安全有效的防龋疫苗。

1．全面疫苗：早期的防龋疫苗研究，主要是利用变链菌全细胞制备灭活死疫苗和减毒活疫苗。这一时期的研究充分表明，利用变链菌全细胞多价疫苗的确可防止龋病的发生，但进一步研究却显示，与其它链球菌相似，变链菌某些抗龋成分可诱发与人心脏组织发生交叉反应的抗体。

2．抗原亚单位疫苗：80年代开始，随着对变链菌细胞壁各种抗原性多聚物的逐渐认识，免疫防齿转入以变链菌单一抗原成分制备亚单位防龋疫苗的研究。研究的焦点集中于两种候选疫苗，即变链菌主要蛋白抗原(PAc或AGⅠ/Ⅱ、PⅠ、SpaA等)和葡糖基转移酶(GTase)，它们在介导变链菌对牙面的粘附和定殖过程中起着重要的作用。近10年的大量研究证实，用PAc和GTase主动免疫能明显抑制实验动物和自愿受试者牙面变链菌的粘附和龋病发生率，但纯化的抗原不会介导心脏交叉反应，学者们尝试了经口服鼻内注射、皮下注射和腹腔注射等多种途径加以佐剂进行免疫，纯抗亚单位疫苗的一个很大不足在于很难获得足够量的这些纯抗原。

3．多肽疫苗：自90年代以来，随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的飞速发展，从分子水平对变链菌PAc和GTase的认识逐步深入，目前，碥码这两种抗原的Pac和gtf已被克隆，核甘酸序列已基本清楚。用PAc和GTase分子中与某特定功能相关并具有免疫原性的核酸序列制备多肽防龋疫苗，已成为免疫防龋研究的热门。目前研究证实，PAc分子N末端唾液结合区(SBR)，粘附功能区(8516-1213位残基)、A区T细胞和B细胞抗原决定簇等；GTase分子的氨基末端的酶促区(CAT)、羧基末端的葡聚糖结合区(GLU)和高度保守的酶活性片段(GGY和AND)等是理想的候选多肽。

由于多肽疫苗仅为病原体的单一保护性抗原或某一抗原决定簇，单纯以游离的多肽免疫动物，常不能产生理想的免疫效果，还需将其结合至大分子载体上以增强其免疫原性。将PAc和SBR与CT-B嵌合并以CT为佐剂，经鼻内免疫大鼠、可激发高水平的唾液抗PAc IGA抗体，并导致实验动物龋活性下降。以SBR与CTA/B嵌合口服免疫小鼠，也能激发高水平的特异性唾液SIGA和血清IgG抗体，另外大肠杆菌的热不稳定毒素B亚单位(LT-B)也被证实能增加连接SPaA多肽的免疫原性和生物学活性。

另外改变多肽结构也是增强其免疫原性的有效手段，Senpuku等(1996)发现将PAc分子的两个肽段联接后免疫动物，比分别用单一肽段所激发的抗rPAc抗体明显升高，因此认为，将多肽偶联成束能显著增强其免疫原性，Smith等(1997)将GTF酶活性片段GGY和AND以赖氯酸为核心分别构建有8条支链结构的多肽疫苗，经唾液周围免疫大鼠，结果显示，将抗原决定簇设计成这种结构具有高度的免疫原性，能诱发高水平的特异性唾液IgA抗体，并使动物龋齿发生率显著降低。

二、被动免疫防龋

被动免疫是直接应用特异性抗体以中和及对抗特异性致病菌的致病作用。由于可能避免主动免疫某些不能预料的副作用，如不会激发系统免疫反应，不会像系统运用防龋疫苗那样引起心脏交叉反应，因此易为人们所接受并日益受到关注。

1．多克隆抗体和单克隆抗体：从80年代末至今已有大量研究资料证明运用多克隆抗体(简称多抗)和单克隆抗体(简称单抗)被动免疫防龋的有效性。Michalek等(1987)首先尝试了用牛奶中的多抗免疫防龋研究。用变连菌4种血清型全菌抗原免疫牛奶，将获得含特异性抗变链菌抗体的牛奶喂养定菌鼠，结果显示，实验组动物变链菌粘附水平、菌斑指数及龋活性均显著降低。Loimaranta等(1997)研究也证实用变链菌和茸毛链球菌的葡萄糖代谢和胞外多糖的合成。

日本学者则尝试用鸡蛋黄抗体(YIgG或IgY)被动免疫防龋。Otake等(1991)用灭活的变链菌免疫母鸡，将从鸡蛋黄中提取的YIgG饲养定菌鼠，使鼠菌斑中变链菌数量显著降低，并有效地控制了龋齿的发生，Hamada等(1991)动物实验则显示，抗细胞结合型葡萄糖基转移酶(CAGTase)的YigG能有效地阻止致龋菌对大鼠牙面的粘附，抑制龋病的发生，Hatta等(1997)将在蔗糖培养基上生长的变链菌免疫母鸡获得的IgY与10％蔗糖同时用于自愿受试者漱口，发现短时间内(4h)受试者唾液中变链菌占总链球菌百分率显著下降。

单抗用于被动免疫具有高度探索性，自单抗技术诞生以来，已成功地用于解决许多具有重大理论意义和应用价值的生物学问题。用抗变链球菌PAc的单抗免疫实验动物和人类，能有效地抑制宿主口内固有变链菌的再粘附，以及外源性变链菌在宿主口内的粘附与定殖。用单抗被动免疫，引人注目的一点是其具有长效作用，即尽管在牙面短期应用，其防龋作用却可持续2年左右。Ma等(1990)推测，这可能由于在口腔微生物间发生了菌群的生态转移，导致对变链菌粘附的抵抗性。

关于被动免疫的防龋机制，目前推测单抗和多抗可能是通过影响细菌表面的理化特性，如电荷、表面自由能、疏水性等，在体内可能起调理作用并对细菌的粘附产生影响。但Van Raamsdonk等(1996)研究发现，单抗对变链菌表面特性的影响不及多抗，且体外研究表明，单抗作用于变链菌，不能像多抗那样刺激多形核白细胞对其吞噬和杀伤作用。

另外，对利用基因工程技术构建的各种新型免疫动物所获得的特异性抗体被动免疫防龋，是近来免疫防龋的新趋势，Chia等(1993)用变链菌的含19个苷酸片段GTF435-453与牛血清白蛋白连接免疫小鼠获得GTF多肽的单抗，体外实验显示，能明显抑制GTFC合成不溶性葡萄糖，并进一步抑制变链菌的蔗糖依赖性粘附。

2．新型单抗：随着基因工程技术的不断完善和发展国外学者已开展将杂交瘤技术与基因工程技术相结合，制备新型单抗的研究，包括双特异性单抗、嵌合单抗、具有其它活性功能区的单抗及单域抗体等，这些新型单抗可以从不同侧面，不同程度克服原有单抗因其自身分子组成特点所致的某些缺陷与不足，其中单域抗体(singleantibodies)具有抗体分子小，易于穿透组织，且抗原性弱的特点，很适宜人体内应用，其制备通过从免疫动物的用于脾细胞和外周血淋巴细胞中提取DNA或mRNA，然后用PCR技术对已重排的VH基因进行扩增，将扩增后的目的基因克隆至能分泌的表达性载体中，最后转入大肠杆菌，检测细菌培养上清液便可分离纯化单域抗体。

单域抗体，使利用细菌生产特异性抗原的小分子抗体成为可能，另外，其制备简便，无需组织培养，获得的转化细菌比杂交瘤稳定，因此对它的基础研究与应用研究已越来越受到重视，但在口服医学领域尚未见报导。

3．转基因植物：植物具有合成和组装各类抗体分子的能力，包括很小的抗原结合区域片段到整个抗体，植物又具有经济，易于规模化的特点，因此为一理想的表达系统，运用基因工程技术将特异性抗体分子整合至植物基因中，用转基因植物进行局部免疫治疗，是近期备受关注的研究课题，英国科学家Ma等(1995)将抗变链菌表面蛋白单抗的重链与轻链基因克隆并表达于Nicotiana烟草植物中，发现转基因植物能高水平地表达单抗全长抗体分子，近期报导(1998)，他们已将这种转基因烟草浸汁被动免疫自愿受试者，显示受试对象龋活性的明显下降，引起举世瞩目。

随着生物学、免疫学、分子生物学和生物工程技术等的发展，人们对有关各种微生物病原体的致病基因、致病机理、宿主的免疫反应等知识越来越丰富，许多能够激发宿主产生保护性免疫反应的抗原决定簇(保护性表位)序列被确定。保护性表位一般分子量较小，过去常与高分子量的载体化学偶联或与佐剂一起使用来增加其免疫原性。

随着重组DNA技术的迅速发展，将保护性表位基因与某些编码天然大颗粒物质(如病毒粒子、病毒外壳蛋白等)的基因融合，在这些天然可聚合的颗粒载体表面递呈多拷贝(高密度)的外原保护性肽，即以颗粒物质为免疫载体，提高保护性表位免疫原性，这是基因工程合成肽苗研制的一个新方向。

自1986年冷泉港疫苗会议首次提出″HBcAg融合蛋白″概念以来，乙肝核心抗原(HBcAg)以其独特的结构和免疫性质，已成为极具潜力的免疫载体蛋白。

HBcAg是由核心蛋白亚基构成的，呈正二十面体对称的颗粒结构。单个核心蛋白亚基(包含183-185个氨基酸的多肽链)先组装成同型二聚体(homodimer)，二聚体再进一步多聚化形成HBcAg颗粒，在核心蛋白的一级结构中，N端的1-114位氨基酸是真正的颗粒装配区。

A．Zlotnick等人通过冷冻电镜成像技术发现，HBcAg存在两种排列形式的颗粒：T=3型由180个分子量21Ku的相同蛋白质亚基即90个同型二聚体构成；T-4型由240个分子量21Ku的相同蛋白质亚基即120个同型二聚体构成。

随着冷冻电镜成像技术的发展，对HBcAg颗粒结构有了更精细的研究，Peter A kratz总结各家研究结果指出，每个二聚体都能在HBcAg颗粒表面形成一突起的峰，分辨率10A的电子密度图谱显示二聚体界面包含一个4螺旋束，从而使主链大约在N端140位氨基酸处折叠，C端氨基酸残基延伸在颗粒之外，即每个核心蛋白亚基通过两个长α螺旋形成二聚体界面，在79位氨基酸附近的c/e1表位构成的短连接loop则位于二聚体界面突出峰的最尖端。

1998年，J.Salfeld等人结合分子生物学和免疫学技术，确定了HBcAg B细胞特异性抗原决定簇位于80位氨基酸附近，是一高度构象决定簇，由于其一级结构序列与HBcAg中的e1位表位重叠，故HBcAg主要免疫优势抗原决定簇称c/el表位。

1996年，Galina Borisova在总结前人工作的基础上，明确提出HBcAg的主要免疫优势区(Major Immunodominant Region)中78-83位氨基酸位于颗粒表面。

颗粒结构是HBcAg作为免疫载体的重要物质基础，在此基础上衍生的免疫学性质同样是HBcAg充当免疫载体的重要因素。T细胞非依赖性B细胞激活作用及有效的T细胞识别作用是HBcAg高免疫原性的主要原因。

此外，与非颗粒性HBcAg或单体乙肝核心蛋白相比，颗粒性HBcAg被抗原递呈给特异性T细胞的效率要高1000倍。特异性B细胞在抗原递呈过程中也起重要作用。

HBcAg可以通过致敏B细胞、抗原递呈和Th细胞激活功能来增强弱免疫原的免疫反应。

早在1987年，英国的B.E.clarke等人首先将FMDV的VPl(142-160aa)抗原决定簇以preC的六个氨基酸为接头，与HBcAg N端融合，在痘苗病毒中得到表达。产物能够形成近似天然状态下的颗粒状结构，且外原抗原决定簇暴露在颗粒表面，比较VPl-HBcAg融合蛋白、VPl-半乳糖苷酶融合蛋白、VPl(142-160aa)合成肽三者的免疫原性，VPl-HBcAg免疫原性与灭活的FMDV相似，比VPl-半乳糖苷酶融合蛋白、VPl(142-160aa)合成肽分别高30-40倍和500倍，用VPl-HBcAg融合蛋白免疫豚鼠，可产生保护性抗体。

国内在HBcAg免疫载体蛋白方面的工作开展得还不多，1991年，李光地研究小组34首先以综述的形式报导了该方面的一些研究进展，此后，国内研究机构的研究重点一直放在乙肝病毒PreS/S抗原决定簇与HBcAg融合表达的方向上。

1996年李光地研究小组又报导其研究结果″HCC抗原决定簇与乙肝病毒核心抗原的融合表达″，文章提到，利用PCR方法获得编码人绒毛膜促性腺激素β链羧端37肽基因片段，分别与的氨基酸(第1位)，羧端(154位)，中间(第75-83位)，中间及羧端同时融合，构建4个重组融合蛋白，在大肠杆菌中实现了表达，其中中间部位融合蛋白能形成颗粒，免疫小鼠能产生高滴度的抗HCG抗体。

1998年，武湘兵等人曾报导PDGF受体结合域与乙肝病毒核心抗原的融合表达的研究结果。1999年，杨莉等构建了丙肝病毒核心蛋白(1-191)及其N端(1-69)和(1-40)与乙肝病毒核心抗原(1-144)羧端的融合克隆，在大肠杆菌中进行了表达，其表达产物B144C191，B144C69和B144C40同时具有乙肝核心抗原(HBC)和丙肝核心蛋白(HCc)的双重原性和免疫原性。CsCl密度梯度超过离心和电镜观察表明，融合蛋白能组装成颗粒。

比较等量的融合蛋白的抗原性和免疫原性后发现，融合的HCc长度对HBc的抗原性和免疫原性影响不大。而B144C69和B144C40比B144C191免疫小鼠能产生更高的HCc抗体。利用表达的融合蛋白建立了ELISA法，对人血清中抗HBc抗体和抗HBc抗体进行了检测。

由于多数学者认为外源表位和HBcAg的c/e1融合后，能大幅度增加插入的外源表位的免疫原性，免疫蛋白的免疫效果要比N端和C端的免疫效果好，免疫剂量和免疫次数都要少，因此，我们尝试将人龋齿致病菌--变异链球葡萄糖基转移酶(GTF)的酶活性区域(Cat)、底物接合区域(Glu)、Cat-Glu抗原表位和我们克隆到的Adr亚型的HBcAg基因的c/e1区融合，融合蛋白表达后，能够形成颗粒，这对于研制人龋齿致病菌基因工程疫苗具有重要的意义。

本发明的目的在于要提供一种能防治人龋齿的免疫基因及其制备方法本发明是这样实现的：一种抗人龋齿致病菌蛋白的融合基因，该基因编码的蛋白具有序列号2列的氨基酸序列。

所述的抗人龋齿致病菌的蛋白融合基因制备方法是：

(1)将人龋齿致病菌-变异链球菌葡糖基转移(GTF)的酶活性片段(Cat区的19肽，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Asp-Val-Asp-Asn-Ser-Asn-Pro-Val-Val-Gln-Ala-Glu-Gln-Leu-Asn-Trp-Leu)、底物结合部位(Glu区的22肽，其氨基酸序列为：Thr-Gly-Ala-Arg-Thr-Ile-Asn-Gly-Gln-Leu-Leu-Tyr-Phe-Arg-Ala-Asn-Gly-Val-Gln-Val-Lys-Gly)、Cat--Glu融合区(19-22肽，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Asp-Val-Asp-Asn-Ser-Asn-Pro-Val-Val-Gln-Ala-Glu-Gln-Leu-Asn-Trp-Leu-Thr-Gly-Ala-Arg-Thr-Ile-Asn-Gly-Gln-Leu-Leu-Tyr-Phe-Arg-Ala-Asn-Gly-Val-Gln-Val-Lys-Gly)的基因分别和人乙型肝炎核心抗原等等具有形成颗粒能力的基因进行融合。

(2)将这些融合基因在细菌酵母、植物等生物体中进行表达。

所述的具有形成病毒颗粒的基因包括人乙型肝炎的核心抗原、表面抗原、TMV病毒等，具有形成颗粒结构的基因或蛋白。

载体包括：(1)所述的任体一项的基因的氨基酸序列及其编码的核苷酸序列和基因段上的多核苷酸载体。

所述的细菌包括大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌。

所述的酵母包括嗜甲醇酵母、酿酒酵母、食用酵母、饲料酵母等酵母。

所述的植物包括马铃薯、番茄、黄瓜、土豆、烟草等双子叶和单子叶植物。

所述的“等生物体”包括哺乳动物细胞、昆虫动物细胞等。

这些生物体中提取的重复组蛋白或者编码这些蛋白的多核苷酸，通过主动或被动免疫方法，用于防治人龋齿。

本发明的优点是：所得的融合基因形成的颗粒结构同时具有人龋齿致病菌--变异链球菌葡萄糖基转移酶(GTF)的Cat、Glu、Cat-Glu抗原表位和乙肝核心抗原的双重抗原性和免疫原性。为人龋齿基因工程亚单位疫苗提供了一种新的方法。

以下附图和实施例将对本发明的技术特征作进一步说明：

图1，是HBcAg(1-183aa)全长基因片段(549)

    重组质粒1.5％琼脂糖电泳鉴定图

    1，HBcAg基因的扩增

    2，重组质粒的酶切鉴定

图2，是全长HBcAg基因的核苷酸顺序及推测的氨基酸顺序

    L：全长HBcAg基因

图3，融合基因表达载体示意图

    A，酵母表达载体构建示意图

    B，植物表达载体构建示意图

图4，融合蛋白初纯化后电镜照片

    A，19肽和HBcAg的融合蛋白

    B，22肽和HBcAg的融合蛋白

    C，19-22肽和HBcAg的融合蛋白

图5，本发明序列号2氨基酸序列。

实施例：本发明的内容包括：

1．将人龋齿致病茵一变异链球菌葡糖基转移酶(GTF)的酶活性区Cat区、底物接合Glu、Cat-Glu的基因与人乙型肝炎核心抗原、表面抗原等具有形成颗粒能力的蛋白的基因进行融合。

2．将这些融合基因在细菌酵母、植物等生物体中进行表达。

3．权利3中“这些生物体中提取的重组蛋白或者多核苷酸”用于防治人龋齿。

4．含有1-3中的任何一项所说的基因或包括基因段上的多核酸载体。

5．用1-3中的任何一项所说的基因或包括基因段上的多核酸转化的细菌、酵母和植物。

6．通过6中所说的转化的细菌、酵母和植物而产生的细菌、酵母和植物的株系。

7．用1-3中的任何一项所说的基因或包括基因的多核酸转化的细菌、酵母和植物生产人龋齿疫苗。

实验过程一、实验材料

1．菌株与质粒

大肠杆菌由上海农科院生物中心基因工成实验室保存。

克隆载体pBluescriptSK(+)由上海农科院生物中心基因工程实验室保存，pGEM-T购自Promega公司。

2．酶与试剂

限制性内切酶、pwo耐高温DNA聚合酶、DNA连接酶、核糖核酸酶等购自皓嘉、生工、华美、Promega、Boehringer等公司。

人抗HBcAg抗血清(龙华医院检验科)；兔抗HBcAg多抗(华美公司)

羊抗兔IgG-AP(Promega)；羊抗豚鼠IgG-AP(Sigma公司)

生色底物NBT、CIP、PP(华美公司)

标准分子量蛋白(上海丽珠东风生物技术试剂公司)

PCR模板病人血清由上海龙华医院检验科提供；PCR引物由皓嘉生物公司合成，序列详见实验结果部分。

其它生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

3．实验仪器

PTC-100型PCR扩增仪(MJ Research Inc.)

DNA测序仪(Applied Biosystem377型全自动荧光序列分析仪)

DNA电泳分析系统包括暗箱、数码照相机、计算机、扫描仪、喷墨打印机、光敏打印机、Tanon UV-2000紫外分析仪、Gis凝胶图象分析软件(上海天能公司)

高速离心机(HITACHI 20PR-5)、超速离心机(HITACHI SCP85H)

JY98-3D型超声波破碎仪(宁波新芝科器研究所)

JEN-1200EX透射电子显微镜(日本电气)、

真空冷冻干燥机(Sweden Savant)

4．其它

实验动物豚鼠购自上海医科实验动物中心。

乙肝HBeAG及乙肝HBcAb药盒(上海科华生物公司)

硝酸纤维素膜(英国Amersham公司)

5．实验中所用的溶液、缓冲液、培养基的配方参见附录。二、实验方法及过程

1．PCR扩增基因片段

在新的无菌的Eppendorf管中建立如下反应体系：10×扩增buffe，1.5mmol/L MGC12，0.2mmol/L 4 dNTP，20μmol/L上游及下游引物各1μl，模板2μg，2U耐高温的pwo DNA聚合酶，加适量ddH20补足体积至60μl，再加60μl石蜡油封住液面以防蒸发。混匀后通过PCR扩增仪进行30次循环反应：94℃ 50sec，56℃ 50sec，72℃ 60sec(根据不同引物及模板时间有所改变)，最后于72℃延伸10min。反应结果通过琼脂糖凝胶电泳回收扩增产物。

2．TBE-agorose电泳和DNA片段的回收(透析袋电洗脱法)

按J.萨姆布鲁克方法进行TBA-agorose电泳，胶内含10ng/ml EB，电泳结束后在紫外分析仪下切取含目的DNA片段的凝胶条放入一端封闭的透析袋，保持凝胶始终与袋内缓冲中液(可用煮沸的蒸馏水代替)接触，夹紧袋的另一端，不留气泡，电泳30min，使DNA从凝胶直入缓冲液中，将透析袋中的缓冲液转移至新的Eppendort中，加1/10体积3mol/L(pH5.8)NaAc，2倍体积乙醇沉淀DNA，真空干燥后溶于适量无菌水中。

3．DNA的限制性酶切反应和DNA片段连接反应

反应均参考限制性内切酶和T4DNA连接酶的供应商所述条件进行。

4．E.coli感受态细胞的制备和转化

从新鲜的SOB-Mg固体平板上挑取几个DH5α单菌落于100mlSOB-Mg液体培养液中，30℃，275r/min，培养至OD550=0.3时，菌液置预冷的离心管中，冰上放10min，500r/min，4℃，离心6min，弃上清；倒入1/3原培养体积的CCMB80溶液悬浮菌体；冰上放20min；5000r/min，4℃，离心6min，小心倒去上清液，1/12原培养体积的CCMB80重新悬浮菌体，用液氮速冻后，储存在-70℃或现用于质粒转化。

在无菌Eppendof加入DH5α感受态细胞悬浮液和质粒DNA(或连接产物)，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激45Sec，立即冰置1-2min，加入等体积LB培养基，37℃摇床培养45min，如需通过α-互补筛选，可加40μl x-gal后再涂布适量细胞于选择性培养基上，37℃倒置培养12-16h至出现菌落。

5．质粒DNA的小量制备

从平板上挑取含目的质粒DNA的单菌落，接种于3ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃，250r/min，过夜培养，12.000r/min，4℃，离心1min，收集菌体于1.5ml Eppendorf中，加100μl预冷溶液Ⅰ，剧烈震荡，悬浮菌体，加200μl新配制的溶液Ⅱ，轻轻摇匀，裂解菌体，加150μl溶液Ⅲ，充分混匀后，冰置5min，12000r/min，4℃，离心10min，上清用酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提后，吸取上清加入1/10体积3mol/LNaAc(pH5.8)，2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃ 10min，4℃，离心10min，沉淀用75％乙醇洗涤，真空干燥后，质粒DNA溶于含RNase(20μg/ml)的TE溶液，37℃温育30min，-20℃备用。

6．DNA序列测定

DNA序列由皓嘉生物公司Applied Biosystem型全自动荧光序列分析仪测定。序列分析用PCGENE软件系统完成。

测定质粒应纯化并通过分光光度计测A260来定量。

7．酵母感受态细胞的制备和质粒的转化

开始实验前1天，接种待转化的酵母菌EGY48的单菌落于5mlYPD中，30℃过夜培养。次日以1％接种量转入100ml EGY48，培养至OD600=0.7，5000r/min，4℃，离心5min，收集酵母细胞，悬浮于1.5ml无菌水。相同条件离心，收集酵母细胞，悬浮于1.5ml的1*TE/LiAc溶液。重复此步骤。取100μl经LiAc处理的EGY48，加1μg质粒DNA，10μl的变性的单链小牛胸腺DNA(4μg/μl)，混匀，再加入300μl灭菌的40％PEG3350溶液，30℃摇荡温育40-50分钟。42℃热激5分钟后，4000r/min，4℃，离心4-5min，沉淀悬浮于200μl-1ml的1*TE，并取其中200μl涂布在缺乏Trp的基础培养基平板上(SD-Trp)，30℃培养2-5天，直到平板上出现转化子。

8．转化酵母菌的鉴定

挑取SD-Trp平板上单菌落，接种于5ml SD-TRP液体，30℃，275r/min，过夜培养，次日离心(12，000r/min，4℃，1min)收集菌体，加入酵母破冲缓冲液、等体积的酚∶氯仿(25∶24)和石英砂，剧烈振荡，离心(12，000r/min，4℃，10min)，取1-2μl水相作为PCR模板，利用转化质粒的特异性引物，通过Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，鉴定出含目的质粒的阳性酵母克隆。

9．表达菌的培养及表达产物的抽提

分别接种含目的质粒的EGY48及对照EGY48于5mlSD-Trp液体中培养过夜，以1％接种量转入200ml同样培养溶液，次日离心(5，000r/min，4℃，min)收集菌体，用来菌的蒸馏水洗涤3次，再悬浮于10ml酵母破菌缓冲液，在冰浴中用JY98-3D型超声破碎仪间断破碎菌体30min(超声1秒，间隙5秒，5min/次)，离心(15000r/min，4℃，30min)，取上清为酵母蛋白粗提液，200ml培养物可做成10ml酵母粗提液。

10．融合蛋白的初步提纯

上述酵母蛋白粗提液用35％硫酸铵沉淀后，离心(15000r/min，4℃，30min)，上清经真空冷冻抽干浓缩后上蔗糖密度梯度超离心。

11．蔗糖密度梯度超离心

每管依次加入浓度为60％、50％、40％、30％、20％、10％各1.3ml的蔗糖溶液(用10mmol/L Tris-Cl，pH7.4；1mmol/LEDTA，pH8.0；0.2％Trition X-100配制)，加1.2ml样品，35000r/min，4℃离心22h。以每管800μl收集样品，利用乙肝HBeAg试剂盒，测定具HBcAg活性部分并合并，对5mmol/L Tris-Cl(pH7.4)透析除去蔗糖等杂质后，真空冷冻抽干作其它分析之用。

12．SDS-聚丙烯酰胺凝胺电泳

按J.萨姆布鲁克方法灌制SDS-PAGE，凝胶含15％丙烯酰胺，缓冲液为不连续Tris-甘氨酸系统，电压80-120V，凝胶经考马斯亮兰溶液(含90％甲醇，10％冰乙酸)染色后，用脱色液脱色至背景清亮，经计算机扫描，通过凝胶图象分析系统估算目的蛋白的实际浓度。

13．目的蛋白抗原性的ELISA检测

目的蛋白中HBcAg抗原性测定参考科华公司HBeAg药盒使用方法：

融合蛋白22肽、19肽、19-22肽抗原性检测：

(1)抗原包被：抗原(19肽：1ug/ml in PBS，pH7.4；22肽：0.1ug/ml in PBS；19-22肽：0.1ug/ml in PBS)IPWKGF 0.1M磷酸盐buffer中(pH9.6)，包被聚苯乙烯微量酶标板，4℃过夜(19肽、22肽、19-22肽由我们构建的菌株表达、制备)。

(2)含0.05％Tween-20的磷酸盐buffer(PBST；pH7.4)洗涤三次，温室

(3)3％BSA封闭90min或者150ul 0.5％BSA封闭2h 37℃洗涤。

(4)分别加血清样本(1∶50稀释)和唾液样本(1∶20稀释)，37℃ 1h，PSBTxi洗涤，[或者可以梯度稀释，唾液样本1∶2，1∶4，1∶8稀释，可能达不到1∶20稀释度]

(5)分别加入辣根过氧化物霉的标记的羊抗小鼠IgG(或者AP标记的羊抗小鼠IgG)和磷霉标记的羊抗小鼠IgA，

(6)PBST洗涤后分别加OPD和pNPP显色。

(7)分别用酸硷终止反应后用霉标仪测定OD490和OD405。

[样品作三个重复]

NPP溶液(0.1M glycine/1mM ZnCl2pH10.4)。

NPP现配现用：取5mgNPP，取50ul用NPP溶液稀释至1.5ml，每孔加50ul。

14．目的蛋白的Western-Blotting分析

初步纯化的总蛋白抽提液经SDS-PAGE(15％分离胶)后，按J.萨母布鲁克将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，经封闭液封闭后，分别用HBcAg多抗(1∶100)(华美公司)，抗19-22肽抗体(1∶50)反应(19肽、20肽、19-22肽多克隆抗体由我们制备)，然后用羊抗兔IgG-AP(1∶1000，Promega)反应，加生色底物NBT、BCIP后，观察显色结果。

基本步骤包括电转移和免疫印迹两步。

电转移：将制备的蛋白样品进行SDS-PAGE。蒸馏水淋洗半干燥转膜装置的电极板。截手套，切6张Whatman3M滤纸和一张与胶大小一致的硝酸纤维素膜。将膜浮在去离子或转移缓冲液面上，使之通过毛细作用自下而上浸湿，然后浸泡几分钟，同时用转移buffer浸湿滤纸。在电极的底部(阳极)放三张湿的滤纸。把NC膜置于滤纸上对齐，用软铅笔在膜上作标记。将经去离子水漂洗过的胶置于NC膜上。在胶上放三张滤纸用戴手套的手或一根滚动管轻轻除去气泡。加上上槽电极，接通电路。电流0.65-0.8mA/cm2，电泳1.5-2h。

免疫印迹：取出NC膜入新培养皿，加适量封闭液Ⅰ室温摇1-2h。换培养皿，10ml封闭液Ⅰ中按1∶300量加入一抗，4℃温育2hr<可置于冰盒上摇床温育>。洗涤液Ⅰ清洗3次，每次10分钟。NC膜转移至另一培养皿，加适量洗涤液Ⅱ。室温动摇10分钟。洗膜一次膜转至另一皿中，9ml无磷酸盐、无叠氮纳封闭液Ⅱ中1∶5000量加二抗，温室摇动1h。膜转移另一皿，加洗涤液Ⅱ，室温摇动10分钟，洗膜1次。膜转至另一皿中加洗涤液Ⅱ温室摇动，育温10分钟，重复3次。取66ulNBT与10ml碱性磷酸霉缓冲液混匀，加入33ulBCIP，30分钟内用，RT摇动，温育。蛋白带颜色达到要求即把膜转至另一皿中，用40ul 0.5M EDTA、10ml PBS缓冲液终止反应。

NBT：10ml 70％的二甲基甲酰胺中溶解0.5gNBT。

BCIP：10ml 100％的二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP。

封闭液Ⅰ5％(W/V)脱脂奶粉溶于1×PBS

封闭液Ⅱ5％(W/V)脱脂奶粉溶；150mM NaCl；50mM Tris-Cl(pH7.5)

洗涤液Ⅰ1×PBS

洗涤液Ⅱ150mM NaCl；50mM Tris·cl(pH7.5)

15．动物实验

选四周龄左右的老鼠10只，分成两组，试验组经肌肉注射0.2mg初纯步纯化的粗蛋白抽提液(并与法国白油、硬脂酸铝混匀)，对照组注射初纯0.2mg初蛋白提取液与法国白油、硬脂酸铝混匀)。第4周用相同剂量上述混合液加强免疫1次，分别在每次免疫前心脏采血制被血清。收集唾液、血清：

(1)小老鼠腹腔注射毛果芸香硷(0.75mg/100g体重)，Eppendorf管收集全唾液300ul，离心，唾液标本-20℃保存。

(2)摘除小鼠眼球收集血清，全血600ul，室温凝固，4℃过液，离心，血清样本-20℃保存。

分组：抗体组，PBS处理组

大白鼠23天断奶，给予普通饲料和含抗生素(氨苄青霉素200ug/ml)的无菌水，计录体重。于24、27、31、33、37、47天6次免疫。方法：在切牙唇面和磨牙颌面接种处理液，每颗牙5ul。免疫时将大白鼠用2％戊巴妥钠盐水作腹腔麻醉，并于皮下注射阿托品以抑制唾液分泌。第3次免疫后，接种S.Sobrinus于口中，接种量1×109cfu/ml，于30-60min内接种2次，并在24小时内在饮水中加入5％的细菌培养液。立即给大白鼠喂致龋食物2000#。细菌接种前及1周后，采集鼠口内细菌样本分析，大白鼠处死前，再次取样分别接种于含链霉素(50ug/ml的MS平皿及BHI平皿，以判断S.Sobrinus菌数和总菌数。将大白鼠于麻醉处死前，收集刺激性唾液及血清。间接ELISA检测IgG，IgA。

龋齿计分：分离大白鼠颌骨，0.4％紫脲酸铵染色后切片，体视显微镜下观察各组磨牙患龋情况。

16．免疫血清特异性抗体的检测

抗乙肝HBcAg抗体测定用HBcAb抗体药盒。

抗抗体测定，用于19-22肽(1∶50)包被，加制备的豚鼠血清反应，再加羊抗豚鼠IgG-AP(1∶10000)反应，最后加底物NPP生物反应，测A405。具体部骤如下：

抗原经PBSN(含0.05％NaN3的PBS)释稀至浓度为0.2-10μg/ml，以50μl/孔加入96孔板，25℃过夜或37℃，2h。无菌水洗涤3次，加入300μl封闭缓冲液，25℃，30min，重蒸水洗涤3次，加入50μl用封闭缓冲液稀释的第一抗体(1∶50)，室温2小时，重蒸水洗涤3次，加入封闭缓冲液封闭10min，再用重蒸水洗涤，加入50μl用封闭缓冲液稀释的第二抗体(羊抗兔1∶3000)，室温2小时，重蒸水洗涤3次，加入75μl NPP溶液，室温显色1小时后加入25μl 0.5N NaOH终止反应，测定各孔的A405。

ELISA封闭缓冲液：0.05％Tween-20/0.05％NaN3/1mM EDTA/0.25％BSA/0.17M H3B04/0.12M NaCl，pH8.5

17．电镜观察

初步纯化的样品，滴在铜网上，2％醋酸铀负染，在透射电镜的观察下拍照，由上海农业科学院生物中心电镜室完成。

18．植物表达载体的构建及植物转基因

将三种融合基因经霉切、回收后，克隆到植物表达载体中，经三亲杂交法转入根癌农杆菌LBA4404中。利用标准方法将这三种基因转入烟草(革新一号)和马铃薯(克新四号)。

19．转基因植物中重组蛋白的鉴定及免疫学分析

利用同上方法制备重组蛋白，并分析其免疫学特征。三、实验结果

1．HBcAg基因的克隆

根据甘人宝等报道的HBadr病毒基因序列，设计一对特征性引物NC1：5′端含EcoRⅠ、NcoⅠ切点，3′端含SacⅠ切点的HBcAg(1-183aa)全长基因片段(549bp)(图1)。此PCR产物经EcoRⅠ、SacⅠ双霉切后插入载体pBSK(+)相应位点，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑菌提质粒经PCR、霉切和测定等方法鉴定，得到含HBcAg基因的阳性转化子pBSKHBC，该基因的序列测定表明该基因属于典型的Adr亚型(图2)。

根据文献报道设计引物，跟据合成PCR22肽、19肽、19-22肽基因，并在两端引入SalⅠ，XhoⅠ切点。将经(SalⅠ，XhoⅠ)双霉切的22肽、19肽、19-22肽基因与HBcAg基因分别与经SalⅠ单霉切分两步对HBcAg基因进行改造p8081T连接，利用同尾霉效应筛选正向插入的转化子。

3．融合基因的表达将融合基因分别效母表达载体、植物表达载体连接，得到酵木和植物表达载体，利用Ito等入醋酸锂方法转化酵母菌，得相应表达菌；利用农杆菌感染方法将这些基因转入烟草和马铃薯；表达菌和转基因植物经破碎、高速离心、硫酸铵沉淀、透析等方法，得到含融合蛋白的粗提液。

4．融合蛋白特性的鉴定

颗粒性：以初纯的含重组蛋白的抽提液经醋酸铀负染，电镜观察融合蛋白能形成病毒样颗粒。颗粒直径为30nm左右(图4)。

抗原性：取4μg/μl的初步纯化的重组蛋白用ELISA测定表达产物中各个产蛋白的抗原性。可以看出，融合蛋白22肽-HBcAg、19肽-HBcAg、19-22肽-HBcAg融合基因在酵母细胞、烟草和马铃薯中有表达，表达产物兼具22肽-HBcAg、19肽-HBcAg、19-22肽-HBcAg抗原性，同时具有HBcAg的免疫原性。

5．融合蛋白的免疫原性

分别用含重组蛋白的粗提液免疫豚鼠，3周后以同等剂量加强1次，观察血清中抗19、22、19-22肽抗体、抗HBcAg抗体形成情况。结过县示第一次免疫后，即能检测到抗19、22、19-22肽抗体和抗HBcAg抗体，第2次加强免疫后两种抗体均有不同程度的升高。表明融合蛋白具有良好的针对19、22、19-22肽的免疫原性。

Claims (9)

1，抗人龋齿致病菌蛋白的蛋白融合基因，其特征在于，该基因编码的蛋白具有序列号2所列的氨基酸序列。

2，根据权利要求1所述的抗人龋齿致病菌的蛋白融合基因制备方法，其特征在于：

(1)将人龋齿致病菌-变异链球菌葡糖基转移(GTF)的酶活性片段(Cat区的19肽，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Asp-Val-Asp-Asn-Ser-Asn-Pro-Val-Val-Gln-Ala-Glu-Gln-Leu-Asn-Trp-Leu)、底物结合部位(Glu区的22肽，其氨基酸序列为：Thr-Gly-Ala-Arg-Thr-Ile-Asn-Gly-Gln-Leu-Leu-Tyr-Phe-Arg-Ala-Asn-Gly-Val-Gln-Val-Lys-Gly)、Cat--Glu融合区19-22肽，其氨基酸序列为：Ala-Asn-Asp-Val-Asp-Asn-Ser-Asn-Pro-Val-Val-Gln-Ala-Glu-Gln-Leu-Asn-Trp-Leu-Thr-Gly-Ala-Arg-Thr-Ile-Asn-Gly-Gln-Leu-Leu-Tyr-Phe-Arg-Ala-Asn-Gly-Val-Gln-Val-Lys-Gly)的基因分别和人乙型肝炎核心抗原等等具有形成颗粒能力的基因进行融合。

(2)将这些融合基因在细菌酵母、植物等生物体中进行表达。

3，根据权利要求2所述的抗人龋齿致病菌蛋白融合基因的制备方法，其特征在于，所述的具有形成病毒颗粒的基因包括人乙型肝炎的核心抗原、表面抗原、TMV病毒等，具有形成颗粒结构的基因或蛋白。

4，根据权利要求2、3所述的抗人龋齿致病菌蛋白融合基因的制备方法，其特征在于，载体包括：(1)所述的任体一项的基因的氨基酸序列及其编码的核苷酸序列和基因段上的多核苷酸载体。

5，根据权利要求2所述的抗人龋齿致病菌蛋白基因的制备方法，其特征在于，所述的细菌包括大肠杆菌、乳酸菌、枯草杆菌。

6，根据权利要求2所述的抗人龋齿致病菌蛋白基因的制备方法，其特征在于，所述的酵母包括嗜甲醇酵母、酿酒酵母、食用酵母、饲料酵母等酵母。

7，根据权利要求2所述的抗人龋齿致病菌蛋白基因的制备方法，其特征在于，所述的植物包括马铃薯、番茄、黄瓜、土豆、烟草等双子叶和单子叶植物。

8，根据权利要求2所述的抗人龋齿致病菌蛋白基因的制备方法，其特征在于，所述的“等生物体”包括哺乳动物细胞、昆虫动物细胞等。

9，根据权利要求2所述的抗人龋齿致病菌蛋白基因的制备方法，其特征在于，这些生物体中提取的重复组蛋白或者编码这些蛋白的多核苷酸，可用于防治人龋齿。

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