CN117431200A

CN117431200A - 一种在芽孢表面展示新城疫病毒hn蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用

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Publication number: CN117431200A
Application number: CN202311396375.XA
Authority: CN
Inventors: 李建臻; 潘康成; 杨苗; 杨定勇; 曾燕; 王振华; 徐刚; 鲁志平; 邬旭龙
Original assignee: Sichuan Agricultural University; Chengdu Vocational College of Agricultural Science and Technology
Current assignee: Sichuan Agricultural University; Chengdu Vocational College of Agricultural Science and Technology
Priority date: 2023-10-25
Filing date: 2023-10-25
Publication date: 2024-01-23

Abstract

本发明实施例公开了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用。该重组枯草芽孢杆菌是通过基因工程方法在整合型质粒pDG364的基础上构建了一个以芽孢衣壳蛋白CotB为锚定蛋白表面展示NDV HN截短抗原蛋白的重组载体，通过化学转化方法将重组载体转化到野生型枯草芽孢杆菌168中而获得，其具有遗传稳定性，不会在传代的过程中丢失。该菌直接将抗原蛋白展示在芽孢表面，无需破碎，可直接拌料或通过饮水免疫动物，免去了大规模注射的繁琐流程。且得益于芽孢良好的抗逆性，该菌易于保存及运输，大大降低成本。该菌可以诱导特异性的免疫反应，这为新城疫病毒的防治提供了一种新的途径，可以用于开发商品化疫苗。

Description

一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用

技术领域

本发明涉及基因工程相关技术领域，具体地说是涉及一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一种高度接触性传染病，是危害养禽业发展最为严重的疫病之一，被世界动物卫生组织列为动物A类传染病及法定报告的动物疫病，我国农业部规定为二类动物传染病。新城疫病毒宿主范围广泛，在自然或实验条件下可感染NDV鸟类已超过250种，给世界养殖业带来巨大的经济损失，研究表明，NDV感染谱有进一步扩大的趋势，本病除沿海和海洋区域外，广泛分布于世界各地。

新城疫HN蛋白能诱导家禽机体产生中和抗体，是重要的保护性抗原，为研究ND基因工程疫苗的理想目的基因。随着分子生物学和分子免疫学理论和技术的发展，使得ND基因工程苗的研制成为目前研究的热点，主要有核酸疫苗、亚单位苗、活载体疫苗等。动物早期抵抗新城疫感染的机制主要依靠的是呼吸道和消化道的局部免疫作用。此外由于新城疫病毒是副粘病毒，对粘膜有特殊的亲嗜性，极易经呼吸道和消化道感染，黏膜免疫产生的SIgA对机体呼吸道、消化道等局部免疫具有相当重要的作用，是机体免疫的一道“屏障”，在新城疫的预防接种中，局部免疫作用利于封锁入侵门户，是防制的最好措施。因此，黏膜免疫研究对新城疫的防治有着十分积极的意义。

几乎所有免疫系统成分都会受到肠道微生物直接或间接的调控，因此肠道微生物菌群影响着免疫系统发育、成熟及平衡，被称为机体免疫的“训练场”。肠道免疫系统功能完善和巩固对预防感染是必不可少的。研究发现，益生菌既可以通过调节局部免疫维持肠黏膜屏障的完整，也可以通过影响系统免疫提高机体特异性和非特异性免疫作用而保障机体健康。益生菌作为动物体内正常生理性细菌，在体内正常发挥代谢活性，促进营养成分的分解，吸收，能直接为宿主提供可利用的必需氨基酸和各种维生素，还可提高矿物元素的生物学活性，进而达到为宿主提供必需营养物质，增强动物的营养代谢，达到调节免疫系统功能，改善动物消化道微生态平衡，提高消化道黏膜免疫功能等功能。近年来，利用益生菌的生物学功能和外源功能抗原基因的特异性免疫相结合，将益生菌作为表达工程菌，生产具有基因工程疫苗，符合新型疫苗的口服安全、方便、廉价等特点，这类疫苗的研制成功将为新型疫苗的发展探索一条新路。具有表达异源蛋白作用的动物益生菌报道研究较多主要为枯草芽孢杆菌。

目前，在ND免疫预防中使用的常规疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗。常规疫苗的应用取决于疫苗毒株类型、疫苗状态及应用程序、免疫动物的状态等方面。接种灭活疫苗的机体能产生针对病毒的特异性抗体，但不能有效刺激细胞免疫，干扰临床检测和流行病学调查，成为灭活疫苗发展的障碍。常用的活疫苗有各种不同毒力，主要有Ⅰ系(中等毒力)、Ⅱ系、Ⅲ系(毒力较弱)、IV系(LaSota株)等几种。弱毒疫苗能刺激机体产生局部免疫，免疫后可较快得到保护，在防控NDV的大规模流行中发挥了重大作用。但随着对不同细胞的适应增殖和传代次数的增加，疫苗毒株或发生基因重组、抗原变异。中等毒力毒株传播常诱导高水平的免疫保护，预防、控制强毒株的流行有困难，并且有毒力返强的危险。所以，迫切需要研制新型疫苗来更好地控制NDV流行。

发明内容

有鉴于此，本发明的一个方面公开了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌。

所述重组枯草芽孢杆菌是利用整合载体pDG364将芽孢衣壳蛋白CotB与新城疫病毒截短HN蛋白基因进行融合，并将获得的融合基序CotB-HNjd转入枯草芽孢杆菌168中而获得。

其中，所述融合基序CotB-HNjd的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

本发明还提供了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其主要包括如下步骤：

(1)以新城疫病毒疫苗弱毒株(LaSota)为模板扩增编码截短HN蛋白基因序列，所述截短HN蛋白基因序列的扩增引物1如下所示：

HNjd-F1:CGCGGATCCATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC BamHⅠ；

HNjd-R1:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

所述截短HN蛋白基因的更换酶切位点后扩增引物2如下所示：

HNjd-F2:CCCAAGCTTATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC HindⅢ；

HNjd-R2:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

(2)将按照HNjd-F1，HNjd-R1扩增得到的截短HN蛋白基因进行密码子的优化以去除其中的酶切位点序列，获得优化后的HNjd序列；优化后的HNjd序列经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-HNjd；

(3)将步骤(2)得到的重组质粒pUCm-T-HNjd与大肠杆菌表达质粒pET-32a经BamHⅠ，EcoRI双酶切后分别胶回收HNjd片段与线性化质粒pET-32a，再经DNA连接酶将其连接并转化入大肠杆菌BL21菌株感受态细胞中，获得重组表达质粒pET-32a-HNjd；

(4)以步骤(3)得到的重组表达质粒pET-32a-HNjd为模板，用HNjd-F2，HNjd-R2引物进行PCR以更换酶切位点，获得的产物经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-HNjd2；重组质粒pUCm-T-HNjd2与重组整合质粒pDG364-CotB经HindⅢ、EcoRI双酶切后分别胶回收HNjd片段与pDG364-CotB，再经DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α获得重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2；

(5)将步骤(4)中得到的重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2通过化学转化方法转入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，通过筛选，得到在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白基因抗原蛋白的重组枯草芽孢杆菌。

其中，在所述步骤(2)中，优化后的HNjd序列如Seq ID No.2所示。

其中，在所述步骤(5)中，通过氯霉素平板、淀粉酶活性试验和/或免疫荧光试验进行筛选。

本发明的另一个方面公开了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗猪圆环病毒感染的生物制品中的应用。

本发明的再一个方面公开了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗新城疫感染的疫苗中的应用。

与现有技术相比，本发明实施例的在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白基因的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用具有如下有益效果：

本发明实施例的在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌是通过基因工程方法在整合型质粒pDG364的基础上构建了一个以芽孢衣壳蛋白CotB为锚定蛋白表面展示猪NDV截短HN抗原蛋白的重组载体，通过化学转化方法将重组载体转化到野生型枯草芽孢杆菌168中，得到可以在芽孢表面展示NDV截短新城疫病毒HN抗原蛋白的基因工程枯草芽孢杆菌。即本发明通过基因工程手段将截短基因与芽孢衣壳蛋白CotB编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌168菌株中，从而得到了可以在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的基因工程枯草芽孢杆菌。经过小鼠上的动物试验表明该重组枯草芽孢杆菌可以诱导小鼠产生特异性的免疫应答，血清中的IgG含量及肠内容物中sIgA较空白对照均极显著的升高，而商品化疫苗组虽然在血清中IgG含量高于重组枯草芽孢杆菌组，但并没有有效的诱导sIgA的分泌。这为新城疫病毒的防治提供了新的途径。

另外，本发明的重组枯草芽孢杆菌直接将抗原蛋白展示在芽孢表面，无需破碎，可直接拌料或通过饮水免疫动物，免去了大规模注射的繁琐流程。且得益于芽孢良好的抗逆性，该菌易于保存及运输，大大降低成本。所采用的枯草芽孢杆菌是国际公认的可食用益生菌，其遗传背景清楚，无侵入性，可以用于开发商品化疫苗。并且，本发明采用整合型重组质粒在芽孢表面展示抗原蛋白，可以直接将目的基因整合入枯草芽孢杆菌168菌株的基因组中，使其具有遗传稳定性，不会在传代的过程中丢失。

本申请的一部分附加特性可以在下面的描述中进行说明。通过对以下描述和相应附图的检查或者对实施例的生产或操作的了解，本申请的一部分附加特性对于本领域技术人员是明显的。本申请披露的特性可以通过对以下描述的具体实施例的各种方法、手段和组合的实践或使用得以实现和达到。

附图说明

在此所述的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的限定。在各图中，相同标号表示相同部件。其中：

图1是HNjd的琼脂糖凝胶电泳示意图；

图2是原核表达新城疫病毒HN SDS-PAGE试验及WB试验结果示意图；

图3是整合质粒pDG364-CotB-NDVHNjd2的示意图；

图4是整合质粒pDG364-CotB-NDVHNjd2的双酶切验证结果示意图；

图5是重组基因工程菌的淀粉酶活性筛选试验示意图；

图6是重组基因工程菌的免疫荧光试验示意图；

图7是重组基因工程菌的基因组PCR鉴定结果示意图；

图8-10是对比例1中新城疫HN亚单位疫苗产生的血清IgG、中和抗体、攻毒保护实验水平示意图；

图11是对比例2中新城疫HN亚单位疫苗产生的血清IgG水平示意图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明实施例的一个方面公开了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌。

该重组枯草芽孢杆菌是利用整合载体pDG364将芽孢衣壳蛋白CotB与新城疫病毒截短HN基因进行融合，并将获得的融合基序CotB-HNjd转入枯草芽孢杆菌168中而获得。

其中，该融合基序CotB-HNjd的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

本发明实施例的另一个方面公开了一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

该构建方法主要包括如下步骤：

HNjd-F1:CGCGGATCCATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC BamHⅠ；

HNjd-R1:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

所述截短HN蛋白基因的更换酶切位点后扩增引物2如下所示：

HNjd-F2:CCCAAGCTTATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC HindⅢ；

HNjd-R2:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

其中，在所述步骤(2)中，优化后的HNjd序列如Seq ID No.2所示。

示例性的，在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下：

(1)以NDV基因组为模板PCR扩增HN基因片段并进行密码子的优化，优化后的HN基因片段命名为HNjd。

所述HNjd基因的扩增引物如下所示：

HNjd-F1:CGCGGATCCATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC BamHⅠ；

HNjd-R1:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

所述HNjd基因更换酶切位点后的扩增引物如下所示：

HNjd-F2:CCCAAGCTTATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC HindⅢ；

HNjd-R2:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

(2)将按照HNjd-F1，HNjd-R1扩增得到的截短HN蛋白基因HNjd经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-HNjd。

(3)将pUCm-T-HNjd与大肠杆菌表达质粒pET-32a经BamHⅠ，EcoRI双酶切后分别胶回收HNjd片段与线性化质粒pET-32a。再经DNA连接酶将其连接并转化入大肠杆菌BL21菌株感受态细胞中，验证成功后获得重组表达质粒pET-32a-HNjd。

(4)重组BL21菌株培养后使用IPTG进行诱导表达，超声破碎细胞后离心取上清液进行SDS-PAGE及Western-Blotting试验验证HN蛋白是否表达正确。重组HN蛋白理论大小约为20KDa。

(5)以重组表达质粒pET-32a-HNjd为模板，用HNjd-F2，HNjd-R2引物进行PCR以更换酶切位点。获得的产物经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-HNjd2。重组质粒pUCm-T-HNjd2与重组整合质粒pDG364-CotB经HindⅢ、EcoRI双酶切后分别胶回收HNjd2片段与pDG364-CotB，再经DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α获得重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2。

(6)将重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2通过化学转化方法转化入制备好的枯草芽孢杆菌168菌株的感受态细胞中，通过氯霉素平板、淀粉酶活性试验、免疫荧光试验筛选后，制得芽孢表面展示城疫病毒HN蛋白的枯草芽孢杆菌。

上述芽孢表面展示城疫病毒HN蛋白的枯草芽孢杆菌工程菌在试验动物上的应用。

上述应用步骤如下：

先利用浅盘培养法小批量制备重组芽孢发酵原粉。

将原粉梯度稀释至10^-8平板后平板涂布进行活菌计数，芽孢计数前需80℃水浴10min。

将重组芽孢发酵原粉经口免疫试验小鼠进行动物试验，同时设置空白对照组及商品化疫苗阳性对照组。

观察小鼠胸腺、脾脏切片是否出现病理变化。

采用血凝与血凝抑制试验、Elisa方法检测待检血清及小肠内容物中抗NDV中IgG与sIgA。

将固定于4％多聚甲醛中的回肠样本送出至公司进行石蜡切片的制作，测量肠绒毛的高度和肠上皮内淋巴细胞。

下面结合实例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

生物材料来源：

枯草芽孢杆菌168菌株由四川农业大学动物医学院微生态研究中心发酵工程实验室保存；

重组整合型质粒pDG364-CotB由四川农业大学动物医学院微生态研究中心发酵工程实验室构建；

NDV疫苗弱毒株(LaSota)疫苗购自中牧实业股份有限公司；

本发明实施例中，通过以下方式构建原核表达质粒：

(1)克隆得到NDV HN蛋白基因片段。

使用TrizolReagent抽提Ⅳ系疫苗病毒的总RNA:用灭菌双蒸水1:1稀释Ⅳ系弱毒疫苗，取250μL病毒液，移入1.5ml无菌的离心管内，加入1000μL Trizol，充分混匀至呈溶浆态，室温静置5min，加入200μL氯仿(每1ml Trizol试剂加入0.2ml氯仿)，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃、12000r/min离心15min；将上层无色液相转移到另一无菌离心管内，加入500μL异丙醇(每1ml Trizol试剂加入0.5ml异丙醇，充分混匀，室温静置10min，4℃、12000r/min离心弃10min，弃上清液，加入1ml 75％无水乙醇(每1ml Trizol试剂至少加入1ml 75％无水乙醇)洗涤，涡旋混匀，4℃、7500r/min离心5min；再次弃净上清液，37℃温箱内风干10-20min，加入15μL无菌RNase-free双蒸水溶解，55-60℃静置。溶液即为疫苗病毒的总RNA样品，用于cDNA合成，-80℃保存。

提取的RNA模板5μl，加入到PCR管中，75℃变性8min，冰浴5min，以仪器说明书中的步骤进行。置于PCR仪上，42℃45min，后95℃灭酶5min，最后置于4℃保存,逆转录体系见表1。

表1逆转录体系

反转录产物作为模板反应，反应体系见表3，程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。反应结束后取出样品，进行琼脂糖凝胶电泳PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

(2)按照HNjd-F1，HNjd-R1扩增得到的截短HN蛋白基因HNjd送至北京擎科生物科技有限公司进行密码子的优化。优化后的片段经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR及测序验证后获得重组质粒pUCm-T-HNjd。优化后的HNjd片段基因序列如Seq ID No.2所示。

(3)将重组质粒pUCm-T-HNjd与大肠杆菌表达质粒pET-32a经过BamHⅠ、EcoRI双酶切后使用Takara DNA Ligation连接酶进行连接，并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。PCR及测序验证后获得重组质粒pET-32a-HNjd。

(4)将重组质粒pET-32a-HNjd转入大肠杆菌BL21感受态细胞中，转化成功后将重组表达菌E.coli BL21/pET-32a-Cap在LB固体琼脂培养基(含氨苄青霉素100μg/mL)上划线培养过夜。次日挑选单菌落接种于LB培养基(含氨苄青霉素50μg/mL)中，37℃180r/min培养过夜。按1％转接于10mL新鲜LB培养基中，37℃，250r/min振荡培养至OD600＝0.6-1.0(约培养3h)，取1mL菌液保存备用。加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，37℃诱导培养，分别于诱导后6h收集1mL菌液，破碎后离心取沉淀用于SDS-PAGE电泳分析及Western-blotting试验。结果如图2所示，重组融合蛋白大小约为42KDa，与理论值相符。图2中，(A)表示的是对表达产物进行12％SDS-PAGE分析；(B)表示蛋白质转膜后进行Western blot试验，其中，泳道M：蛋白Marker(15-150kDa)、泳道1-2：加入IPTG诱导6h后的表达产物、泳道3-4：空白对照。

本发明实施例中，通过以下方式制备枯草芽孢杆菌168菌株化学转化感受态细胞：

首先制备如下溶液：

(1)10×最低盐溶液：在蒸馏水中依次溶解KH2PO4 30g，K2HPO4 70g，NaC6H5O7·3H2O5g，(NH4)2SO4 10g，MgSO4·7H2O 1g，最后定容至500mL。

(2)10mg/mL色氨酸溶液：称取10mg色氨酸粉末溶于1mL蒸馏水中，过滤除菌，现配现用。

(3)GMⅠ溶液：100μL 10mg/mL色氨酸溶液，200μL 50％葡萄糖溶液，80μL 5％酪蛋白胨，200μL 10％酵母浸出液，19.42mL 1×最低盐溶液。

(4)GMⅡ溶液：500μL 0.1M CaCl2，2.5mL 0.1M MgCl2，1mL 50％葡萄糖溶液，100μL 10mg/mL色氨酸溶液，80μL 5％酪蛋白胨，40μL 10％酵母浸出液，95.78mL 1×最低盐溶液。

将保存于甘油中的枯草芽孢杆菌168划线接种LB培养基，培养至可见菌落。

将一单菌落转接于5mL GMⅠ溶液，30℃，100r/min振荡培养过夜。

取2mL培养物转接到18mL预热的GMⅠ溶液，37℃，200r/min振荡培养3.5h。

再取10mL培养物转接到90mL预热的GMⅠⅠ溶液，30℃，100r/min振荡培养1.5h。5000g，10min，收集菌体。

用10mL离心上清液轻轻重悬菌体，此时的菌体即成为感受态细胞。

本发明实施例中，通过以下方式将重组质粒转化入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中：

以得到的重组表达质粒pET-32a-HNjd为模板，用HNjd-F2，HNjd-R2引物进行PCR以更换酶切位点。

所述HNjd基因更换酶切位点后的扩增引物如下所示：

HNjd-F2:CCCAAGCTTATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC HindⅢ

HNjd-R2:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

PCR反应体系如下：

2×PCR Hero Mix(Dye)10μL,10μmol/L上游引物HNjd-F2 0.5μL，10μmol/L下游引物HNjd-R2 0.5μL，质粒pET-32a-HNjd 1μL，用DNase/RNase-Free H2O补足至20μL。

PCR反应程序如下：

94℃预变性3min；94℃变性15s，56℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

获得的产物经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，经PCR及测序验证成功后获得重组质粒pUCm-T-HNjd2。重组质粒pUCm-T-HNjd2与重组整合质粒pDG364-CotB经HindⅢ、EcoRI双酶切后分别胶回收HNjd片段与pDG364-CotB，再经TakaraDNA Ligation DNA连接酶连接后转入大肠杆菌DH5α。经PCR、双酶切及测序验证成功后获得重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2，其结构如图3所示。所述融合基因序列CotB-HNjd2如SeqID No.1所示。

所述双酶切体系为：

pUCm-T-HNjd2/pDG364-CotB 43μL，HindⅢ、EcoRI各1μL，10×QuickCut Buffer 5μL。

反应条件为：

37℃反应5min。

所述连接酶连接体系为：

胶回收HNjd片段2μL，pDG364-CotB 3μL，DNA Ligation Mix 5μL。

反应条件为：

25℃反应15min。

pDG364-CotB-HNjd2的双酶切验证结果如图4所示。图4中，泳道M：DNA Marker(250-15000bp)；泳道1：未酶切；泳道2：BamH I+EcoR I；泳道3：Hind III+EcoR I；泳道4：BamH I+Hind III。

扩大培养携带pDG364-CotB-HNjd2的E.coli DH5α，使用SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒提取整合质粒载体pDG364-CotB-HNjd2，用限制性内切酶XbaⅠ进行单酶切处理，37℃15min。然后使用琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，胶回收试剂盒回收线性化质粒片段。在500μL枯草芽孢杆菌感受态细胞中加入适量线性化质粒DNA片段，轻轻混匀，于37℃缓慢震荡(80r/min)1h。取100μL转化产物涂布于LB琼脂培养基(含氯霉素5μg/mL)上，于恒温培养箱37℃恒温培养18h。挑取阳性克隆子接种于LB液体培养基(含氯霉素5μg/mL)中，37℃160r/min培养18h。

选氯霉素抗性平板上的阳性转化子进行扩大培养，同时将阳性转化子和枯草杆菌168菌液分别滴种于含1％可溶性淀粉营养琼脂培养基上，37℃培养24h，用碘液滴加在平板内，进行重组菌的淀粉酶活性分析，其结果如图5所示。图5中，A：枯草芽孢杆菌168与枯草芽孢杆菌滴种于1％可溶性淀粉营养琼脂培养基上；B：碘液染色。

将淀粉酶鉴定正确的重组菌扩大培养，参照细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA，并以此为模板，枯草芽孢杆菌168基因组为对照，分别以HNjd F2/R2、amyE F/R、HNjdF2/amyE R、CotB F/HNjd R2四对引物进行PCR鉴定。

所述CotB蛋白基因的扩增引物如下所示：

CotB-F:CGGGATCCACGGATTAGGCCGTTTGTCC BamHⅠ；

CotB-R:GGGAAGCTTGGATGATTGATCATCTGAAG HindⅢ；

所述枯草芽孢杆菌168菌株淀粉酶基因amyE扩增引物如下所示：

amy E-F：CCAATGAGGTTAAGAGTATTCC

amy E-R：CGAGAAGCTATCACCGCCCAGC

PCR鉴定结果如图6所示。图6中，M:DNA Marker(250bp-15000bp)，1、2、3泳道引物为amyE-F、amyE-R，1泳道为野生168，2泳道为其他枯草菌，3泳道为重组菌；4、5泳道引物为amyE-F、HNjd-R2，4泳道为野生168，5泳道为重组菌；6、7泳道引物为CotB-F/HNjd-R2，6泳道为野生168，7泳道为重组菌；8、9泳道引物为HNjd-F2、HNjd-R2、6泳道为野生168，7泳道为重组菌。

使用营养耗尽法诱导基因工程菌形成芽孢，然后对芽孢进行固定和免疫荧光显微镜观察，一抗为鼠源抗PCV2阳性血清(工作浓度为1：100)，二抗为荧光素Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(工作浓度为1：100)。具体操作步骤如下：

取纯化芽孢菌液于干净的载玻片上，热风吹干固定。将3％ BSA封闭液滴加到载玻片上，完全覆盖芽孢，室温下封闭30min，PBS洗涤10次。滴加鼠源抗PCV2阳性血清(1％ BSA1：100稀释)，室温孵育1h，洗涤。滴加Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(1％ BSA 1:100稀释)，室温避光孵育45min，洗涤。免疫显微镜下观察、成像。其结果如图7所示。图7中，A、B、C为40×显微镜明视野下野生168及重组菌的芽孢；D、E、F为40×显微镜荧光视野下野生168及重组菌的芽孢；A、D组野生168芽孢使用兔源NDV高免血清作一抗免疫荧光检测；B、E组为重组芽孢使用兔源无NDV血清作一抗免疫荧光检测；C、F组为重组芽孢使用兔源NDV高免血清作一抗免疫荧光检测。

以上试验结果证明重组质粒pDG364-CotB-HNjd2转入枯草芽孢杆菌168中并成功发生双交叉重组，基因工程菌构建成功。

本发明实施例中，通过基因工程菌的浅盘发酵制备芽孢原粉：

将基因工程菌在NA液体培养基中37℃160r/min扩大培养16h。在不锈钢锅中倒入蒸馏水并加入黄豆粉1.3％、玉米粉1.3％、麸皮0.5％、蛋白胨0.3％、葡萄糖0.2％、牛肉干0.1％、氯化钠0.5％、可食用琼脂1.2％。除琼脂外，所有原料在锅中混匀后煮沸3h，随时观察水量，保证水量不变。最后加入可食用琼脂并充分溶解混匀，调节PH至7.0。然后倒入无菌带盖瓷盘中，培养基厚度约为1cm。待培养基凝固后将扩大培养的液体菌种倾倒于浅盘培养基上，37℃发酵培养127h～153h。每日用芽孢染色法观察芽孢形成率，当芽孢形成率达到90％以上时，结束发酵。

用灭菌玻片轻轻刮取培养基表面菌苔，以适量玉米粉为载体混合，65℃烘干2～3h，保证颗粒细小且均匀。

使用破碎机将烘干后的混合物粉碎，过120目筛网，即得芽孢原粉。4℃保存备用。

将原粉梯度稀释至10^-8平板后平板土布进行活菌计数，芽孢计数前需80℃水浴10min。

本发明实施例中，通过重组芽孢饲喂试验小鼠检测其免疫性能：

将所购的100只雄性小鼠预饲喂7d，随机分为5组，每组4笼，每笼5只，并对每组小鼠进行标记和称重。按照表免疫程序对小鼠进行免疫。A组为空白对照组，B、D组分别以拌料饲喂的方式给予小鼠B.subtilis 168及重组B.subtilis RH芽孢，每克饲料中芽孢量为2.0×106CFU，E在试验第1，2，3、14，15，16和28，29，30d分别灌服重组B.subtilis RH芽孢，每次每只小鼠灌服剂量为100μL，含芽孢2.0×109CFU,C组于1、14、28d免疫商品化灭活新城疫(LaSota株)，每只腹腔注射100μL，上述各组小鼠每只每天喂食3-5g饲料。

免疫程序如下：

*用灭菌生理盐水将菌液浓度调整为2.0×10¹⁰CFU/mL。在第1-3天、第14-16天和第28-30天，每天给每只小鼠灌胃0.1mL，连续3天。

于试验0、14、28、42d，每组随机选取5只小鼠，通过眼后眶静脉丛采集小鼠血液，将采得的血液置于2mL离心管中，37℃静置1h后，4℃静置过夜，4℃，3000g离心10min，收集血清于另一新的离心管中，每管分装20μL，-80℃保存备用。采集血液后，小鼠脱臼处死，无菌剖取小肠，采集小肠内容物，并称取0.5g小肠内容物于离心管中，加入4.5mL预冷的PBS，充分混和均匀，4℃，3000g离心10min，取上清于一新离心管中，每管分装50μL，-70℃保存备用。然后将去除小肠内容物的小肠组织放入离心管中，-80℃保存备用。另在42d时，对各组小鼠进行空腹称重(停食8h，停水2h)，采取小肠内容物后对小鼠胸腺与脾脏进行采样和称重，然后保存于4％多聚甲醛固定液中。无菌采取小鼠盲肠内容物，备用。同时取一小段回肠样本置于4％多聚甲醛固定液中，用于切片制备观察小鼠胸腺、脾脏切片是否出现病理变化。

采用血凝与血凝抑制试验、阻断Elisa方法检测待检血清及小肠内容物中抗NDVIgG与sIgA。

将固定4％多聚甲醛中的回肠样本送出至公司进行石蜡切片的制作，测量肠绒毛生长情况。

试验结果如下表所示，数据均采用平均值±标准差表示：

表2肠绒毛长度(mm)

表3隐窝深度(mm)

表4口服重组芽孢前后小鼠血清IgG水平(log2)

表5口服重组芽孢前后小鼠血清IgG水平(S/N)

表6口服重组芽孢前后小鼠小肠内容物SIgA抗体水平(P/N)

表7回肠上皮单位长度淋巴细胞数量(微米μm)

结果表明，本发明所构建的重组枯草芽孢杆菌能够诱导试验动物产生特异性的免疫反应。虽然其在血清中诱导产生的IgG含量虽然低于商品化疫苗，但是所构建的重组枯草芽孢杆菌可以有效的在肠黏膜处诱导产生sIgA，而商品化疫苗则不能够产生sIgA。此外对回肠上皮淋巴细胞统计试验表明，所构建的重组枯草芽孢杆菌具有优秀的黏膜免疫佐剂效果，这是商品化疫苗所不具备的优势。因此本发明所构建的重组枯草芽孢杆菌具有广泛的应用前景。

对比例1

利用昆虫杆状病毒表达系统高效表达HN蛋白，制备成亚单位疫苗，并对疫苗免疫效果进行初步评估，该亚单位疫苗能够在流行毒株攻击后可得到一定保护率，同时可以有效降低鸡群排毒和病毒载量，但该亚单位疫苗不能诱导一黏膜免疫，该亚单位疫苗产生的血清IgG、中和抗体、攻毒保护实验水平如图8-图10所示。其中，图8是免疫后SPF鸡的HI抗体检测结果；图9是免疫后SPF鸡的中和抗体检测结果；图10是攻毒保护试验中SPF鸡的存活率。该类亚单位疫苗单独表达HN蛋白，免疫效果、动物攻毒实验效果较差，需联合使用，未见报道杆状病毒的表面展示系统可以经口免疫在胃肠道诱导有效的黏膜免疫。

对比例2

以新城疫病毒Lasota株的F及HN为目的基因，将二者分别插入带有CMV启动子及VSV GED,WPRE,ITRs等不同调控元件的杆状病毒与未经改造的杆状病毒基因转移载体中，通过Bac-to-Bac表达系统获得重组Bacmid DNA，将其转染于昆虫细胞，获得重组杆状病毒；利用高滴度重组杆状病毒侵染鸡胚成纤维细胞，通过SDS-PAGE和Western blotting比较不同抗原基因在禽类细胞中的表达水平；同时利用获得的重组杆状病毒直接作为疫苗进行免疫，比较分析带有不同调控元件及不同抗原基因的重组杆状病毒表达效果及免疫效果的差异，结果为血清IgG抗体水平依次为:Lasota弱毒苗组>F系列疫苗组、F与HN共免疫组>HN系列疫苗组>对照组，血清中抗体水平见图11，该报道未见报道杆状病毒的表面展示系统可以经口免疫在胃肠道诱导有效的黏膜免疫。

对比例3

将去除了N端的胞质区、跨膜区和细颈区、C末端的几个氨基酸及躯干上的部分区域，保留了大部分抗原位点及所有与三级结构相关的半胱氨酸残基截短新城疫HN蛋白基因与pET32c质粒构建pET32c-HN重组质粒。经筛选验证后转化感受态大肠杆菌BL21中，诱导并表达，经SDS-PAGE电泳与Western-blotting分析，实验证明截短新城疫HN蛋白具备所选的HN片段表达的蛋白表达量较高，且具有针对NDV阳性血清的免疫反应性，但该试验中未进行相关的免疫原性研究，此中方式获取蛋白需提纯并添加佐剂，不能经口服在胃肠道诱导有效的黏膜免疫。

结果分析

如实施例与对比例1-3的免疫效果可以看出，本发明所构建的重组枯草芽孢杆菌口服免疫后诱导产生的血清中IgG含量更高，其抗体滴度在28d可以达到值6.8log2，并且不许要其他佐剂，不许要表达蛋白提纯，而本发明所构建的重组菌能够诱导产生的sIgA水平。此外，本发明所利用的活载体为枯草芽孢杆菌，这是国际公认的可食用益生菌，试验结果也表明口服该重组菌后有效的促进免疫器官发育，并且对肠绒毛的生长具有显著的促进效果，而隐窝深度越浅分泌细胞的成熟度越好，分泌能力越强。这些都是重杆状病毒所不具备的优势。

综上所述，本发明实施例的在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌是通过基因工程方法在整合型质粒pDG364的基础上构建了一个以芽孢衣壳蛋白CotB为锚定蛋白表面展示新城疫病毒HN蛋截短抗原蛋白的重组载体，通过化学转化方法将重组载体转化到野生型枯草芽孢杆菌168中，得到可以在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋抗原蛋白的重组枯草芽孢杆菌。即本发明通过基因工程手段将截短新城疫病毒HN蛋基因与芽孢衣壳蛋白CotB编码基因融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体，转化到枯草芽孢杆菌168菌株中，从而得到了一种可以在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌。也即本发明首次利用芽孢衣壳蛋白作为分子载体将新城疫病毒HN蛋白展示到枯草芽孢杆菌的芽孢表面上，通过基因工程手段将截短新城疫病毒HN蛋白基因与芽孢衣壳蛋白CotB编码基因进行融合，利用枯草芽孢杆菌整合型质粒作为载体转化到枯草芽孢杆菌中，从而得到可以在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌，可以诱导特异性的免疫反应，这为新城疫病毒的防治提供了一种新的途径。

经过小鼠上的动物试验表明该重组枯草芽孢杆菌可以诱导小鼠产生特异性的免疫应答，血清中的IgG含量及肠内容物中sIgA较空白对照均极显著的升高，而商品化疫苗组虽然在血清中IgG含量高于重组枯草芽孢杆菌组，但并没有有效的诱导sIgA的分泌。

另外，本发明采用整合型重组质粒在芽孢表面展示抗原蛋白，可以直接将目的基因整合入枯草芽孢杆菌168菌株的基因组中，使其具有遗传稳定性，不会在传代的过程中丢失。另外，得益于枯草芽孢杆菌芽孢的特殊结构，展示在芽孢表面的异源抗原对恶劣的外界环境具有独特的抵抗能力，且枯草芽孢杆菌芽孢自身具有优秀的免疫佐剂作用，用之制成的非注射式的、口服的疫苗可以顺利通过胃肠道而不被其中的极端条件破坏，从而可以顺利在肠道诱导特异性的黏膜免疫。

并且，本发明的重组枯草芽孢杆菌直接将抗原蛋白展示在芽孢表面，无需破碎，可直接拌料或通过饮水免疫动物，免去了大规模注射的繁琐流程。且得益于芽孢良好的抗逆性，该菌易于保存及运输，大大降低成本。所采用的枯草芽孢杆菌是国际公认的可食用益生菌，其遗传背景清楚，无侵入性，可以用于开发商品化疫苗。

本发明实施例还提供了一种在芽孢表面展示新城疫HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗新城疫病毒感染的生物制品中的应用。

本发明实施例还提供了一种在芽孢表面展示新城疫HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗新城疫病毒感染的疫苗中的应用。

需要注意的是，本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和或步骤以外，均可以以任何方式组合。

另外，上述具体实施例是示例性的，本领域技术人员可以在本发明公开内容的启发下想出各种解决方案，而这些解决方案也都属于本发明的公开范围并落入本发明的保护范围之内。本领域技术人员应该明白，本发明说明书及其附图均为说明性而并非构成对权利要求的限制。

本发明的保护范围由权利要求及其等同物限定。

Claims

1.一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述重组枯草芽孢杆菌是利用整合载体pDG364将芽孢衣壳蛋白CotB与新城疫病毒截短HN基因进行融合，并将获得的融合基序CotB-HNjd转入枯草芽孢杆菌168中而获得。

2.根据权利要求1所述的一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述融合基序CotB-HNjd的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

3.一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，其包括如下步骤：

(1)以新城疫病毒疫苗弱毒株为模板扩增编码截短HN蛋白基因序列，所述HN蛋白截短基因序列的扩增引物1如下所示：

HNjd-F1:CGCGGATCCATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC BamHⅠ；

HNjd-R1:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

所述HN蛋白截短基因的更换酶切位点后扩增引物2如下所示：

HNjd-F2:CCCAAGCTTATGGTGATATACAAGCGATACAATGAC HindⅢ；

HNjd-R2:CCGGAATTCTTAAGCAATGCTGAGACAATAGGT EcoRI；

(4)以步骤(3)得到的重组表达质粒pET-32a-HNjd为模板，用HNjd-F2，HNjd-R2引物进行PCR以更换酶切位点，获得的产物经T-A克隆连接至pUCm-T载体并转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得重组质粒pUCm-T-HNjd2；重组质粒pUCm-T-HNjd2与重组整合质粒pDG364-CotB经HindⅢ、EcoRI双酶切后分别胶回收HNjd2片段与pDG364-CotB，再经DNA连接酶连接，转入大肠杆菌DH5α获得重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2；

(5)将步骤(4)中得到的重组整合质粒pDG364-CotB-HNjd2通过化学转化方法转入枯草芽孢杆菌168感受态细胞中，通过筛选，得到在芽孢表面展示新城疫病毒HN抗原蛋白的重组枯草芽孢杆菌。

4.根据权利要求3所述的一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，

在所述步骤(2)中，优化后的HNjd序列如Seq ID No.2所示。

5.根据权利要求3所述的一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，

在所述步骤(5)中，通过氯霉素平板、淀粉酶活性试验和/或免疫荧光试验进行筛选。

6.一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗新城疫病毒的生物制品中的应用。

7.一种在芽孢表面展示新城疫病毒HN蛋白的重组枯草芽孢杆菌在制备预防和治疗猪圆环病毒感染的疫苗中的应用。