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CN116732080A - 一种新型双抗原1型糖尿病疫苗及其制备方法 - Google Patents

一种新型双抗原1型糖尿病疫苗及其制备方法 Download PDF

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CN116732080A
CN116732080A CN202310448894.XA CN202310448894A CN116732080A CN 116732080 A CN116732080 A CN 116732080A CN 202310448894 A CN202310448894 A CN 202310448894A CN 116732080 A CN116732080 A CN 116732080A
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gad65
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diabetes
pnz8148
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CN202310448894.XA
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孙静
赵修涛
胡云章
李腾蛟
谢孟鑫
施建东
李建芳
李彦涵
乌美妮
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Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
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Abstract

本发明涉及一种新型双抗原1型糖尿病疫苗及其制备方法，将人源性GAD651‑585氨基酸序列与人源性INS1‑110氨基酸序列使用连接序列连接通过乳酸菌密码子偏好优化后5’端引入Nco I的酶切位点，3’端引入Xba I的酶切位点，合成插入pNZ8148载体，构建重组质粒GAD651‑585+INS1‑110‑pNZ8148；将阳性质粒电转化至NZ9000乳酸菌构建乳酸菌GAD65+INS疫苗菌株，用50ng/mL的Nisin诱导GAD65+INS乳酸菌表达融合蛋白。本发明将GAD651‑585+INS1‑110重组乳酸菌疫苗口服免疫BALB/c小鼠及非肥胖型糖尿病小鼠(NOD小鼠)，诱导小鼠产生GAD65+INS的特异性抗体，并促进调节性T细胞(Tregs)增殖诱导免疫耐受，抑制树突状细胞(DCs)分化，维持血糖水平，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的，弥补现阶段药物治疗存在的不足之处。

Description

一种新型双抗原1型糖尿病疫苗及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新型双抗原1型糖尿病疫苗及其制备方法
背景技术
1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus，T1DM)是活化的T淋巴细胞引起自身抗原耐受失衡而导致的一种胰岛β细胞受损的自身免疫性疾病，最终因体内胰岛素分泌不足而形成慢性高血糖。目前临床治疗主要为终生注射胰岛素，但可能会引发血糖波动，且容易因低血糖而使患者晕厥，另外，长期注射胰岛素会增加脂肪，加大心血管并发症的发生率，给患者的生活带来不便和痛苦。研究预防或治疗T1DM的最终目的是阻止机体自身免疫系统攻击胰岛细胞，减轻胰岛炎症浸润、保护现有功能，并促进胰岛再生和修复。但现有的治疗方法，都无法达到此目的。
机体免疫系统在接触一定量的抗原后会使特异性免疫无应答性和低应答性，利用这一免疫耐受(immunological tolerance)的机制，设计针对自身抗原的疫苗诱导保护性免疫耐受，重塑自身免疫系统的免疫耐受及免疫调节，改善病理性免疫，可能是预防并治疗1型糖尿病的新方向。
在患者的发病进程中，胰岛素INS及谷氨酸脱羧酶GAD65是较为重要的自身抗原，在绝大多数的T1DM患者血清中可检测到胰岛素抗体及大量的GAD65抗体。胰岛素INS由110个氨基酸组成，胰岛素B链9-23肽段可能是T1DM动物模型NOD小鼠免疫损伤的重要靶点，NOD鼠发病早期时，胰岛素抗体的浓度与发生T1DM的风险正相关；谷氨酸脱羧酶GAD65由585个氨基酸残基组成，人类胰岛β细胞中谷氨酸脱羧酶GAD65表达量最高，GAD65肽段及质粒可以激活适应性免疫应答，故被认为是一种具有较强免疫原性的胰岛抗原。全长GAD65包含的6个抗原表位，分别为：GAD206-220、GAD286-300、GAD290-309、GAD509-528、GAD524-543、GAD546-554，或其特异性T细胞克隆能减缓自免性胰岛炎的发展，降低发病率，是预防1型糖尿病的保护性表位。建立机体对自身抗原的免疫耐受可能是预防或治疗T1DM等自身免疫性疾病的最佳策略。针对T1DM的疫苗，如何安全有效促进Treg细胞增殖，抑制DC细胞提高胰岛细胞存活率可能是疫苗成功的关键问题。
目前针对T1D的疫苗研究多为单抗原疫苗，对于血糖的控制并不理想，可能是由于单抗原短肽无法诱导足够的免疫原性或单个抗原并不能在T1DM不同时期发挥作用，因此选择多个自身抗原构建疫苗，能够拓宽疫苗保护谱，在不同时期保护患者，是糖尿病疫苗优化设计的一个新方向。
此外，为保证多抗原疫苗能够正确表达多个抗原表位，抗原活性位点不被遮盖，需要在疫苗设计时加入连接肽(Linker序列)。连接序列的加入能够分离抗原蛋白以确保融合蛋白的正确表达，Linker能更好的保证蛋白的生物学活性，还能提高融合蛋白的产量。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有短肽疫苗或单个抗原疫苗的不足，提供一种新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，且在免疫后，该疫苗能诱导机体产生针对GAD65+INS的特异性抗体，同时诱导机体产生免疫耐受，促进Treg细胞分化，抑制DC细胞增殖，降低血糖，最终预防或治疗1型糖尿病。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，包括如下步骤：
1)将通过乳酸菌密码子偏好优化后的人源性的谷氨酸脱羧酶65基因GAD65的第1-585氨基酸以及胰岛素INS基因的第1-110氨基酸的核苷酸序列，通过连接序列连接后，插入pNZ8148载体，构建成GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒；
2)将GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞中进行扩增，之后提取质粒，筛选出阳性质粒；
3)将筛选出的阳性质粒电转入NZ9000乳酸菌菌株，构建成GAD65+INS乳酸菌疫苗菌株；
4)将得到的GAD65+INS乳酸菌疫苗菌株进行扩增后，用Nisin进行诱导乳酸菌表达蛋白。
进一步，优选的是，所述步骤1)的通过乳酸菌密码子偏好优化后的人源性的谷氨酸脱羧酶65基因GAD65的第1-585氨基酸以及胰岛素INS基因的第1-110氨基酸的核苷酸序列，通过连接序列连接后，在末尾加上6HIS标签，最终表达形成GAD651-585+INS1-110氨基酸序列，其中：
所述GAD651-585+INS1-110氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述通过乳酸菌密码子偏好优化后的GAD651-585氨基酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；
所述通过乳酸菌密码子偏好优化后的INS1-110氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述6HIS标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，优选的是，所述步骤1)的将通过乳酸菌密码子偏好优化后的人源性的谷氨酸脱羧酶65基因GAD65的第1-585氨基酸以及胰岛素INS基因的第1-110氨基酸的核苷酸序列，通过连接序列连接后，插入pNZ8148载体的方法为：
将GAD651-585氨基酸的核苷酸序列5’端引入Nco I的酶切位点，将INS1-110氨基酸的核苷酸序列3’端引入Xba I的酶切位点，之后将引入Nco I的酶切位点和Xba I酶切位点的GAD651-585+INS1-110氨基酸的核苷酸序列与pNZ8148载体，采用Nco I酶、Xba I酶进行双酶切，之后T4酶连接过夜，构建重组质粒GAD651-585+INS1-110-pNZ8148；其中：
酶切体系为：1μL pNZ8148质粒、1μL Nco I酶、1μL Xba I酶、3μL10×Buffer、24μL水，共30μL，37℃酶切一小时，按胶回收试剂盒操作纯化DNA片段回收酶切产物；
插入方法为：将GAD651-585+INS1-110片段与Nco I和Xba I双酶切电泳后的胶回收所得的pNZ8148载体片段进行连接，其连接反应体系为：3μL GAD651-585+INS1-110片段、1μLpNZ8148载体片段、2μL 10×Buffer、1μL T4 DNA连接酶、3μL水，共10μL，16℃连接12小时。
进一步，优选的是，所述步骤2)的将GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞中进行扩增、提取质粒、筛选出阳性质粒的的步骤为：
21)将GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞，涂布于含氯霉素的LB固体培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑取含氯霉素的LB固体培养基平板中的单菌落进行阳性克隆鉴定；
22)将阳性克隆加入至装有5ml含氯霉素的LB液体培养基的试管中，于37℃、转速为150rpm/min的恒温摇床过夜培养，次日将该5mL菌液接种至400mL含氯霉素的LB液体培养基，于37℃、转速为150rpm/min的恒温摇床过夜培养，次日用质粒抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒。
进一步，优选的是，所述步骤3)提取的质粒电转入NZ9000感受态细胞的步骤为：
31、将40μL感受态细胞NZ9000与1μL质粒均匀混合，转入预冷的0.2cm电转化杯中；
32、设置电击参数2000V、25μF、200Ω，然后将转化杯置于电击槽中电击；
33、电击后加入1mL GMMC恢复培养基，冰浴5min后转入1.5mL Enpendof管中，放于30℃温箱中恢复培养2h，得恢复菌液；
34、将恢复菌液涂布于含氯霉素的GM固体培养平板上，待菌液吸收完全后倒置，于30℃下静置培养36h，待转化子出现，进行阳性克隆鉴定后挑取阳性克隆；
35、将挑取的阳性克隆接种于5mL含氯霉素的GM液体培养基中扩增，用250μL甘油+750μL菌液进行保存，该菌液即为GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗菌株，冻存于-20℃保存待用。
进一步，优选的是，所述步骤4)的用Nisin诱导表达融合蛋白的步骤为：
41)将GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗菌株，按菌液:含10μg/mL氯霉素GM17液体培养基＝1:25的体积比接种，30℃静置培养至菌体OD600为0.4-0.6，得培养物；
42)向培养物中加入Nisin至终浓度为50ng/mL，30℃静置培养4h，诱导融合蛋白表达；
43)将诱导表达成功的GAD65+INS乳酸菌疫苗菌液于4℃、8000rpm离心30min，收集沉淀并稀释到1×1010cfu/mL，得新型双抗原1型糖尿病乳酸菌疫苗，于-20℃储存待用。
本发明同时提供用上述新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法制得的口服1型糖尿病疫苗。
本发明还提供用上述新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法制得的GAD65+INS重组乳酸菌疫苗。
本发明再提供上述GAD65+INS重组乳酸菌疫苗在制备新型双抗原1型糖尿病疫苗中的应用。
本发明使用乳酸菌作为重组疫苗载体，构建GAD65+INS全表位疫苗有多种优势：(1)培养操作简单，构建技术成熟，成本低廉；(2)乳酸菌可选择口服免疫，患者依从性高，相较于减毒载体更具有安全性，同时无需蛋白体外提纯等后续处理；(3)可在细胞质内或细胞表面表达，还可分泌蛋白到胞外；(4)乳酸菌对机体黏膜有极强的粘附作用，能在进入肠道后在黏膜处存活，不断向机体释放特异性的目的抗原蛋白；(5)能直接激发黏膜免疫和系统免疫；(6)乳酸菌作为益生菌，可以增加肠道菌群结构稳定性，避免T1DM患者肠道菌群紊乱，调节肠道菌群，有利于阻止T1DM的病情发展，弥补其他疫苗肌肉注射和基因工程蛋白纯化复杂等不足，对新疫苗的开发具有重要意义。
本发明提出：将人源性的INS1-110与GAD651-585氨基酸的核苷酸序列进行乳酸菌密码子偏好优化，通过连接序列连接，在GAD65的5’端引入Nco I的酶切位点CCATGG，在INS的3’端引入Xba I酶切位点TCTAGA，之后插入pNZ8148载体，构建重组质粒GAD651-585+INS1-110-pNZ8148；将阳性质粒转化进入NZ9000乳酸菌菌株，用50ng/mL的Nisin进行诱导表达融合蛋白。这种构建方法的优势在于：(1)在全长GAD65肽的基础上增加了全长INS肽，与短肽GAD65、全长GAD65单价疫苗相比，GAD651-585+INS1-110含多种抗原表位，拓宽了疫苗保护谱；(2)以乳酸菌为载体，一定程度上避免了抗原肽口服后在胃肠道被酶降解的问题，因抗原肽能被乳酸菌直接递送至肠道黏膜，激发黏膜免疫，诱导免疫耐受；(3)乳酸菌表达系统具有构建简单、基因修饰接受性强、能实现抗原在机体内的特异性表达的优点，是安全性较高的疫苗载体；本发明采用GAD65+INS重组乳酸菌疫苗口服免疫BALB/c小鼠及非肥胖糖尿病小鼠(NOD)，刺激产生GAD65、INS的特异性IgG抗体，同时可促进体内Treg细胞分化增殖从而诱导免疫耐受，抑制DC细胞减轻炎症浸润，并维持血糖水平，从而达到预防和治疗1型糖尿病的目的。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
(1)与现有单价疫苗相比，同时携带GAD65和INS的全长基因，拓宽了疫苗的保护谱；
(2)使用连接序列连接GAD65与INS蛋白，通过连接序列以间隔两侧的蛋白允许完成各自独立的功能，保证了GAD65、INS蛋白正确翻译折叠及活性位点的暴露。
(3)通过乳酸菌直接将抗原表达在肠道黏膜，能够直接被黏膜免疫系统中的抗原提呈细胞提取，一定程度上避免了抗原在通过肠道时被降解。将本发明提供的GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗，口服免疫BALB/c小鼠及NOD小鼠(6-8周龄)后，BALB/c小鼠末次免疫后2周，产生了滴度为1：4的GAD65、INS的特异性IgG抗体。
(4)通过测量NOD小鼠血糖发现28周龄时，较空白组75％小鼠发病，免疫GAD651-585+INS1-110双抗原疫苗仅有近25％小鼠血糖升高，发病时间推迟了4周左右；
(5)GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗能显著地诱导Treg细胞生成，抑制DC细胞成熟，建立对两种自身抗原的免疫耐受，从而缓解1型糖尿病。
本发明提供的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法简单，并利用乳酸菌口服免疫的特点，依从性高，能弥补现有疫苗保护谱单一、蛋白纯化过程复杂、无法更好诱导Treg细胞，具有广阔的发展应用前景。
附图说明
图1为GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒构建示意图；
图2为GAD65、INS特异性IgG抗体检测图，其中：A为小鼠血清GAD65特异性IgG抗体检测，B为小鼠血清INS特异性IgG抗体检测；
图3为8-28周龄NOD小鼠体重变化图；
图4为16周龄至28周龄NOD小鼠发病率结果图；
图5为各组脾脏淋巴细胞调节性T细胞(Treg)占比图；
图6为各组肠道固有层淋巴细胞调节性T细胞(Treg)占比图；
图7为各组肠道固有层淋巴细胞树突状细胞(DC)占比图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所用培养基配方如下：
含氯霉素的GM液体培养基：GM17肉汤+5g/L葡萄糖+10μg/mL氯霉素
含氯霉素的GM固体培养基平板：GM17琼脂粉+5g/L葡萄糖+10μg/mL氯霉素；
GMMC恢复培养基：M17培养基+5g/L葡萄糖+20mM MgCl2+2mM CaCl2；
含氯霉素的LB固体培养基平板：2g胰蛋白胨+1g酵母粉+2g NaCl+4g琼脂溶于200mL超纯水中高温灭菌冷却加入10μg/mL氯霉素；
含氯霉素的LB液体培养基：2g胰蛋白胨+1g酵母粉+2g NaCl溶于200mL超纯水中高温灭菌冷却加入10μg/mL氯霉素；
注：本发明中所有含氯霉素的培养基中的氯霉素浓度均为：10μg/mL。
实施例1
一种新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)将表达INS和GAD65的人源性的全长氨基酸的核苷酸序列，通过乳酸菌密码子偏好优化后，构建表达的GAD651-585+INS1-110的全长氨基酸系列包含：
GAD65206-220(Thr Tyr Glu Ile Ala Pro Val Phe Val Leu Leu Glu Tyr ValThr)，
GAD65217-236(Glu Tyr Val Thr Leu Lys Lys Met Arg Glu Ile Ile Gly TrpPro Gly Gly Ser Gly Asp)，
GAD65286-300(Lys Lys Gly Ala Ala Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser ValIle)，
GAD65290-309(Ala Leu Gly Ile Gly Thr Asp Ser Val Ile Leu Ile Lys CysAsp Glu Arg Gly Lys)，
GAD65515-528(Thr Leu Glu Asp Asn Glu Glu Arg Met Ser Arg Leu Ser Lys)等有效表位的GAD65全表位序列；
以及INS9-23(Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu ArgGly)有效表位的INS全表位序列；
通过连接序列连接后，在末尾加上6HIS标签，插入pNZ8148载体，最终表达形成的GAD651-585+INS1-110氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
通过乳酸菌密码子偏好优化后的GAD651-585氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；
通过乳酸菌密码子偏好优化后的INS1-110氨基酸的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；
连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
6HIS标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
原始GAD65基因序列如SEQ ID NO.7所示；
原始INS基因序列如SEQ ID NO.8所示；
蛋白大小理论分子量为：79.29kd；
插入pNZ8148载体的方法为：
将GAD651-585氨基酸的核苷酸序列5’端引入Nco I的酶切位点，将INS1-110氨基酸的核苷酸序列3’端引入Xba I的酶切位点，之后将引入Nco I的酶切位点和Xba I酶切位点的GAD651-585+INS1-110氨基酸的核苷酸序列与pNZ8148载体，采用Nco I酶、Xba I酶进行双酶切，之后T4酶连接过夜，构建重组质粒GAD651-585+INS1-110-pNZ8148；其中：
双酶切体系为：1μL pNZ8148质粒、1μL Nco I酶、1μL Xba I酶、3μL 10×Buffer、24μL水，共30μL，37℃酶切一小时，按胶回收试剂盒操作纯化DNA片段回收酶切产物；
插入方法为：GAD651-585+INS1-110片段与Nco I、Xba I双酶切电泳后的胶回收所得的PNZ8148载体片段进行连接时，其连接反应体系为：3μL GAD651-585+INS1-110片段、1μLpNZ8148载体片段、2μL 10×Buffer、1μL T4 DNA连接酶、3μL水，共10μL，16℃连接12小时；
(2)将构建得到的重组质粒GAD651-585+INS1-110-pNZ8148转化至MC1061感受态细胞，克隆扩增，提取质粒，具体步骤如下：
21)将GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞，涂布在含氯霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜，挑取该含氯霉素的LB固体培养基平板上的单菌落进行阳性克隆鉴定，之后挑取阳性克隆；
22)将挑取的阳性克隆加入至装有5ml含氯霉素的LB液体培养基的试管中，于恒温摇床过夜培养，次日将该菌液接种到400mL含氯霉素的LB液体培养基，于恒温摇床过夜培养，次日用质粒抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取质粒；
所述恒温摇床的温度为37℃，转速为150rpm/min；
(3)将步骤22)提取的质粒10μg，电转入NZ9000感受态细胞，具体步骤为：
31)、将1μL步骤22)提取的质粒与40μL感受态细胞NZ9000均匀混合，转入冰浴的0.2cm电转化杯中；
32)、设置电击参数2000V、25μF、200Ω，然后将转化杯置于电击槽中电击；
33)、电击后加入1mL GMMC恢复培养基，冰浴5min后转入1.5mL Enpend of管中，置于30℃恢复培养2h，得恢复菌液；
34)、将恢复菌液涂布于含氯霉素的GM固体培养基平板上，待菌液吸收完全后倒置，于30℃下静置培养36h，待转化子出现，进行阳性克隆鉴定后挑取阳性克隆；
35)、将挑取的阳性克隆接种于5m含氯霉素的GM液体培养基中扩增，用250μL甘油+750μL菌液进行保存，该菌液即为GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗，于-20℃保存待用；
阳性克隆鉴定如下：
A)挑取克隆于5mL GM液体培养液中，30℃培养过夜。
B)使用试剂盒提取质粒，设计引物
p8148-F:5'-ACGCGAGCATAATAAACGG-3'；(SEQ ID NO.9)
p8148-R:5'-CGAAAGCGAAATCAAACGA-3'；(SEQ ID NO.10)
进行PCR验证
PCR反应体系如表1；
PCR反应程序如表2；
表1
表2
(4)将得到的GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗进行扩增后，用50ng/mlL Nisin诱导表达融合蛋白，具体步骤为：
41)将步骤35)的GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗，按菌液:含氯霉素GM液体培养基＝1:25的体积比接种，30℃培养至菌体OD600为0.4-0.6，得培养物；
42)向培养物中加入Nisin至终浓度为50ng/mL，30℃培养4h，收集上清、沉淀，沉淀用200μL PBS重悬，超声破碎菌体，取沉淀上清液，经验证诱导融合蛋白表达成功；
43)将诱导表达成功的GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗于4℃、8000rpm离心30min，收集沉淀，加入PBS调整浓度至1×1010cfu/mL，得新型双抗原1型糖尿病乳酸菌疫苗，于-20℃保存待用。
GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗滴度测定如下：
取100μL GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗原液加入900μL PBS稀释，此为10-1，再吸取100μL 10-1稀释液加入900μL PBS稀释为10-2，依次类推；每个梯度取100μL稀释液涂布在含氯霉素GM固体培养基平板，无氧，30℃过夜静置培养，计算菌落数。GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗滴度等于“菌落数×稀释倍数×10”。例如：如果稀释倍数为10-8的平板上有20个菌落，滴度为20×108×10＝2×1010cfu/mL。
新型双抗原1型糖尿病乳酸菌疫苗对NOD小鼠的免疫实验如下：
A、免疫方案
将BALB/c小鼠分为3组，每组三只，分别为空白组(PBS)组，NZ9000组(免疫含pNZ8148质粒的NZ9000)、GI组(免疫GAD65+INS乳酸菌疫苗)，剂量采用灌胃免疫100μL 1×1010cfu/mL/只、空白组PBS灌胃100μL/只。在免疫前6小时进行断食处理，100μL只6.6％NaHCO3灌胃处理15min中和胃酸，所有乳酸菌疫苗初次免疫连续免疫7天，间隔14天后以同样剂量加强免疫。
将6-8周龄、16-20g的清洁级NOD小鼠分为4组，每组五只，分别为空白(PBS)组，INS组(免疫INS乳酸菌疫苗)、GAD65组(免疫GAD65乳酸菌疫苗)、GI组(免疫GAD65+INS乳酸菌疫苗)。采用与BALB/c小鼠相同免疫剂量、免疫程序进行免疫。
B、检测方法
1、BALB/c小鼠末次免疫后2周取小鼠眼血，37℃温箱放置1h，4℃过夜，250rpm/min离心15min取血清。分别用GAD65、INS肽包板，按KPL ELISA Kit Anti-Mouse ABTS System试剂盒说明进行操作，血清稀释比为1:4、1:8。
2、免疫后观察NOD小鼠至28周龄，每周自鼠尾静脉测量小鼠血糖；同时称量小鼠体重。
3、28周龄后取眼血处死NOD小鼠，取小鼠脾脏研磨分离脾脏细胞，取小鼠肠道组织提取肠固有层淋巴细胞，使用INS肽和GAD65肽刺激细胞48小时，加入抗小鼠CD4-FITC(克隆号GK1.5)，抗小鼠CD25-APC(克隆号PC61.5)，抗小鼠Foxp3-PE(克隆号FJK-16s)检测INS和GAD65特异性Treg细胞，用流式细胞计数仪检测细胞分化结果。
4、使用上述刺激后的肠固有层淋巴细胞，加入抗小鼠CD80(克隆号16-10A1)、CD11c(克隆号N418)抗体检测INS和GAD65特异性DC细胞，用流式细胞计数仪检测细胞分化结果。
C、实验结果
实验数据使用Graphpad prism9.0统计软件进行t检验，以P<0.05为差异的统计学意义。
(1)BALB/c小鼠末次免疫2周后，空白组与NZ9000组均未产生GAD65、INS特异性IgG抗体，GI组产生了1:4滴度的GAD65、INS特异性IgG抗体。结果如图2所示。
(2)实验过程中各组小鼠活动状态正常，体温正常，颗粒状粪便。截止NOD小鼠28周龄，空白组体重有明显下降，其余各组剩余小鼠体重变化不明显。体重结果如图3所示。
(3)在NOD小鼠的血糖监测过程中，空白组、INS组、GAD65组、GI组发病时间分别为19周、20周、21周、23周，GI组发病率显著降低，且发病时间较空白组、INS组、GAD65组延后了4周、3周、2周；同时GI组小鼠在观察期内没有死亡，而空白组、INS组、GAD65组在观察期内分别有1只、3只、3只小鼠死亡。证明了该新型双1型糖尿病疫苗较单抗原INS、GAD65能更有效延缓或预防1型糖尿病的发病。16周龄至28周龄发病情况如图4所示。
(4)28周龄取NOD小鼠脾淋巴细胞、肠固有层淋巴细胞进行流式细胞分选实验，发现免疫INS乳酸菌疫苗、GAD65乳酸菌疫苗、GI乳酸菌疫苗的小鼠脾淋巴细胞和肠固有层淋巴细胞中Treg(CD4+CD25+Fxop3+)细胞与空白组相比均有明显增殖(P<0.05)，说明自身抗原经乳酸菌载体表达并口服后，在肠道和脾脏能诱导Tregs的表达，而诱导Treg细胞增殖分化是利用自身抗原诱导机体重建对该抗原免疫耐受的关键因素之一。本研究中携带GAD65和INS基因的双抗原疫苗也能显著地促进免疫细胞向Treg方向分化，与单抗原疫苗相比，能够很好的诱导同时针对GAD65和INS基因的免疫耐受。脾脏细胞Treg流式结果如图5所示，肠道固有层淋巴细胞Treg流式结果如图6所示。
(5)28周龄取NOD小鼠肠固有层淋巴细胞进行流式细胞分选实验，发现免疫INS乳酸菌疫苗、GAD65乳酸菌疫苗、GI乳酸菌疫苗的小鼠肠道固有层淋巴细胞中DC(CD80+CD11c+)细胞与空白组相比均被明显抑制(P<0.05)。说明重组乳酸菌疫苗在肠道固有层淋巴结中显著地抑制DC细胞增殖，DC细胞是T1D发病进程中被发现最早浸润胰岛的细胞之一，抑制DC细胞增殖能有效保护胰岛β细胞的功能，减轻T1D的发展。与单抗原疫苗相比，本研究中的新型双抗原疫苗能显著地抑制DC细胞的成熟，能够很好的诱导同时针对GAD65和INS基因的免疫耐受，保护胰岛细胞。肠道固有层淋巴细胞DC流式结果如图7所示。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
SEQ ID NO.1(GAD651-585+INS1-110氨基酸序列)：
SEQ ID NO.2(通过乳酸菌密码子偏好优化后的GAD651-585氨基酸的核苷酸序列)：
SEQ ID NO.3(通过乳酸菌密码子偏好优化后的INS1-110氨基酸的核苷酸序列)：
SEQ ID NO.4(连接序列核苷酸序列)：
gcagaggctg cggcaaagga ggctgcagcg aaggca 36SEQ ID NO.5(连接序列氨基酸序列)：
AEAAAKEAAA KA 12SEQ ID NO.6(6HIS标签核苷酸序列)：
catcaccatc atcatcat 18SEQ ID NO.7(原始GAD65基因序列)：
SEQ ID NO.8(原始INS基因序列)

Claims (10)

1.一种新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将通过乳酸菌密码子偏好优化后的人源性的谷氨酸脱羧酶65基因GAD65的第1-585氨基酸以及胰岛素INS基因的第1-110氨基酸的核苷酸序列，通过连接序列连接后，插入pNZ8148载体，构建成GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒；
2)将构建成的GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞，克隆扩增，提取质粒；
3)将提取的质粒电转入NZ9000感受态细胞，构建成GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗；
4)将得到的GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗进行扩增后，用Nisin诱导表达融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)的通过乳酸菌密码子偏好优化后的人源性的谷氨酸脱羧酶65基因GAD65的第1-585氨基酸以及胰岛素INS基因的第1-110氨基酸的核苷酸序列，通过连接序列连接后，在末尾加上6HIS标签，最终表达形成GAD651-585+INS1-110氨基酸序列，其中：
所述GAD651-585+INS1-110氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述通过乳酸菌密码子偏好优化后的GAD651-585氨基酸的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；
所述通过乳酸菌密码子偏好优化后的INS1-110氨基酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述连接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示、氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述6HIS标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
3.根据权利要求1所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤1)的将通过乳酸菌密码子偏好优化后的人源性的谷氨酸脱羧酶65基因GAD65的第1-585氨基酸以及胰岛素INS基因的第1-110氨基酸的核苷酸序列，通过连接序列连接后，插入pNZ8148载体的方法为：
将GAD651-585氨基酸的核苷酸序列5’端引入Nco I的酶切位点，将INS1-110氨基酸的核苷酸序列3’端引入Xba I的酶切位点，之后将引入Nco I的酶切位点和Xba I酶切位点的GAD651-585+INS1-110氨基酸的核苷酸序列与pNZ8148载体，采用Nco I酶、Xba I酶进行双酶切，之后T4酶连接过夜，构建重组质粒GAD651-585+INS1-110-pNZ8148。
4.根据权利要求1所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤2)的将GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞，克隆扩增、提取质粒的步骤为：
21)将GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒转化至MC1061感受态细胞，涂布在含氯霉素的LB固体培养基平板，37℃倒置培养过夜，挑取含氯霉素的LB固体培养基平板中的单菌落进行阳性克隆鉴定；
22)将阳性克隆加入至装有5ml含氯霉素的LB液体培养基的试管中，于恒温摇床过夜培养，次日将该菌液接种400mL含氯霉素的LB液体培养基，于恒温摇床过夜培养，次日用质粒抽提试剂盒从克隆扩增收获的菌液中提取GAD651-585+INS1-110-pNZ8148重组质粒。
5.根据权利要求4所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，所述恒温摇床的温度为37℃，转速为150rpm/min。
6.根据权利要求1所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤3)提取的质粒电转入NZ9000感受态细胞的步骤为：
31)、将1μL质粒与40μL感受态细胞NZ9000均匀混合，转入冰浴的0.2cm电转化杯中；
32)、设置电击参数2000V、25μF、200Ω，然后将转化杯置于电击槽中电击；
33)、电击后加入1mL GMMC恢复培养基，冰浴5min后转入1.5mL Enpendof管中，置于30℃恢复培养2h，得恢复菌液；
34)、将恢复菌液涂布于含氯霉素的GM固体培养平板上，待菌液吸收完全后倒置，于30℃下静置培养36h，待转化子出现，进行阳性克隆鉴定后挑取阳性克隆；
35)、将步骤34)挑取的阳性克隆接种于5mL含氯霉素的GM液体培养基中扩增，用250μL甘油+750μL菌液进行保存，该菌液即为GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗菌株，于-20℃保存待用。
7.根据权利要求1所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤4)的用Nisin诱导表达融合蛋白的步骤为：
41)将GAD651-585+INS1-110重组乳酸菌疫苗菌株，按菌液:含氯霉素的GM液体培养基＝1:25的体积比接种，30℃培养至菌体OD600为0.4-0.6，得培养物；
42)向培养物中加入Nisin至终浓度为50ng/mL，30℃培养4h，诱导融合蛋白表达；
43)将诱导表达成功的GAD65+INS乳酸菌疫苗菌液于4℃、8000rpm离心30min，收集沉淀并稀释到1×1010cfu/mL，得新型双抗原1型糖尿病乳酸菌疫苗，于-20℃储存待用。
8.权利要求1-7任意一项所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法制得的口服1型糖尿病疫苗。
9.权利要求1-7任意一项所述的新型双抗原1型糖尿病疫苗的制备方法制得的GAD65+INS重组乳酸菌疫苗。
10.权利要求9所述的GAD65+INS重组乳酸菌疫苗在制备新型双抗原1型糖尿病疫苗中的应用。
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