CN111363742B - 基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因突变技术领域，公开了一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；将upstream、IFDC2、downstream片段融合；将融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分；将扩增出的mutant‑upstream和mutant‑downstream片段融合；将融合片段mutant up‑down转入获得的阳性克隆菌株中，利用含p‑Cl‑Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证。本发明步骤简便，成本低，可重复性高。

Description

基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法

技术领域

本发明属于基因突变技术领域，尤其涉及一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法。

背景技术

目前，龋病是除冠心病、癌症之后，世界卫生组织列明的三大非传染性慢性病之一。第四次中国口腔健康流行病学调查报告显示，乳牙和年轻恒牙龋病患病水平呈明显上升趋势，防治龋病已成为加强我国人群口腔健康的重点项目。龋病本质是由微生物感染所致的牙体硬组织破坏性疾病，变异链球菌(Streptococcus mutans)是目前公认的主要致龋微生物之一，其致龋毒力机制主要包括对牙面的黏附、利用糖类产生多糖以及较强的产酸和耐酸能力。变异链球菌对牙面的黏附是其定植、致龋的基础，其中葡糖基转移酶(glucosyl transferase，GTF)是当前研究的热点之一。大多数变异链球菌含有至少3种GTF基因，即gtfB、gtfC、gtfD。gtfB编码的GTF-I合成水不溶性葡聚糖(insoluble glucans，IG)，gtfC编码的GTF-SI合成IG和水溶性葡聚糖(soluble glucans，SG)的混合物，gtfD编码的GTF-S合成SG。此外，与变异链球菌黏附素合成相关的表面蛋白P1和P1样蛋白，与产酸性相关的乳酸脱氢酶，与耐酸能性相关的ropA、brpA等毒力因子均是变异链球菌致龋性的重要物质基础。因此，如何通过降低这些毒力因子表达，进而抑制变异链球菌过度生长，减少胞外多糖产生，抑制生物膜形成及产酸耐酸能力，是防治龋病的有效措施。

众所周知，在生物体传递遗传信息的过程中，作为联结核酸和蛋白质的密码子扮演着重要的角色。在遗传密码中，mRNA上3个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子可编码一种氨基酸。在生物体中有61种密码子，20种氨基酸，这是由于遗传密码具有简并性，同一氨基酸对应的多个密码子被称为同义密码子。但这些同义密码子在翻译的过程中使用的频率并非一致，这种现象被称为“密码子偏好性”。密码子偏好性广泛存在于不同生物中，是物种在长期进化过程中受环境选择、碱基突变、基因漂变等因素共同作用的结果，其还受到基因组大小、tRNA丰度和基因表达水平等的影响。密码子偏好性对蛋白的表达有着直接的影响，能通过tRNA在翻译水平上改变蛋白的翻译速度。在同一生物中，携带同一种氨基酸的不同tRNA称为同功受体tRNA，tRNA的浓度通常与其读取的密码子的频率正相关。在高度表达的基因中，编码同种氨基酸的密码子中往往有一个密码子在频率上占主导地位，并且该密码子通常由最丰富的tRNA的同种受体读取。因此，将宿主基因中不同频率的同义密码子进行替换，将影响蛋白翻译水平，进而改变相关的表型。在龋病微生物研究中，尤其是变异链球菌的基因编辑中，该技术仍未见详细报道。

目前，抑制变异链球菌毒力的方法大多是通过外源性地加入某些药物和小分子化合物或通过引入拮抗菌，竞争性地抑制变异链球菌活性。尽管这些方法能在一定程度上抑制变异链球菌毒力，但它们仍有一些缺点：(1)药物筛选具有盲目性，不能高效准确的找到特异性强的药物，且具体作用成分难以确定；(2)某些小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；(3)药物及化合物作用的具体机制大多尚不清楚，毒副作用也不明确；(4)某些拮抗菌是否对机体具有潜在毒性未见报道等。此外，也有利用传统的基因敲除方法敲除毒力基因，从而达到抑制效果，但将目的基因敲除常常只是破坏部分外显子而不是整个编码区，残留的编码序列可能组合出新的未知的功能，给表型分析带来麻烦；并且，对于某些必须基因，完整敲除后将造成细胞死亡，也就无法研究这些基因的功能。因此，综合以上原因，亟需寻找一种新的策略来弥补当前技术的不足。

综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术抑制变异链球菌毒力的方法存在的小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；作用机制不明确，基因敲除后功能未知或细胞死亡。

解决上述技术问题的难度：如何根据密码子频率选择突变位点及方向，从而实现表型变化。

解决上述技术问题的意义：可以在不敲除目的基因的前提下改变生物表型，通过抑制基因表达，降低蛋白翻译，减弱变异链球菌毒力，并且操作简便，表型易检测，能直观地反应基因编辑的结果。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法。

本发明是这样实现的，一种用于抑制变异链球菌毒力方法中进行PCR扩增基因的引物，所述PCR扩增的引物的序列为SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：10。

本发明的另一目的在于提供一种利用所述引物进行PCR扩增基因的方法，所述PCR扩增基因的方法包括：

第一步，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；

第二步，聚合酶链式反应PCR扩增靶基因上游序列作为upstream；

第三步，PCR扩增靶基因下游序列作为downstream；

第四步，PCR扩增红霉素抗性基因片段IFDC2；

第五步，PCR将第二步-第四步中的upstream、IFDC2、downstream片段融合；

第六步，将第五步中的融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；

第七步，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分，分别为mutant-upstream和mutant-downstream，二者共同拥有一段20个碱基大小的重叠序列；其中突变位点位于mutant-upstream片段R端重复序列之前；

第八步，利用聚合酶链式反应分别扩增出mutant-upstream和mutant-downstream，其中扩增mutant-upstream时，R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；

第九步，将第八步扩增出的mutant-upstream和mutant-downstream片段融合，称为mutant up-down；

第十步，将第九步中的融合片段mutant up-down转入第六步中获得的阳性克隆菌株中，利用含p-Cl-Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证，即可实现毒力基因的点突变。

进一步，所述PCR扩增基因的方法的R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；变异链球菌密码子使用频率表，每1000个密码子中；共581662个密码子。

进一步，所述PCR扩增基因的方法利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术完成点突变菌株的构建，IFDC2基因盒由启动子ldh、突变的pheS基因片段mpheS及ermAM基因片段三部分构成；基因盒中的ermAM基因片段使转化子带有红霉素抗性从而实现阳性筛选，pheS基因编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基，在发生突变并整合入受体菌基因组后，使转化子对苯丙氨酸类似物p-Cl-Phe产生获得性敏感，实现转化子的二次筛选获得无标记的基因突变株。

进一步，所述PCR扩增基因的方法选取一段包含突变位点在内的0.63kb长度的片段作为靶基因，其上游同源片段upstream长度为0.76kb，下游同源片段downstream为0.86kb，IFDC2基因长度为2.2kb；第二次转化中，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为两部分，分别为mutant-up和mutant-dn，mutant-up和mutant-dn含有一段重叠序列–GCCGTGATTGAAGGCA–。

进一步，所述PCR扩增基因的方法细菌培养及基因组gDNA提取，将变异链球菌UA159菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下培养48小时；用接种环挑取一个单菌落接种于3mL BHI液体培养基，37℃、10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下培养，取过夜培养菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌gDNA，测定纯度及浓度后-20℃保存。

进一步，所述PCR扩增基因的方法目的片段扩增及连接，以提取所得细菌gDNA及IFDC2基因盒为模板，利用KOD-Plus DNA聚合酶试剂盒PCR扩增靶基因上游同源片段upstream、下游同源片段downstream、IFDC2片段；其中引物ldhF和ermR为IFDC2片段的上下游引物，upF和upR-IFDC2为upstream的上下游引物，dnF-IFDC2和dnR为downstream的上下游引物；采用PCR分别扩增，获得片段upstream、IFDC2与downstream；反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃分别延伸1min、2min 15s、1min，35个循环，68℃再延伸4min，4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，胶回收并测定产物浓度和纯度，-20℃保存。

进一步，所述PCR扩增基因的方法以upstream、IFDC2、downstream三片段为模板，upF和dnR为引物，融合PCR连接上述三片段；反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸4min，35个循环；68℃再延伸4min；4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20℃保存；

以提取所得细菌gDNA为模板，upF和mutant upR为引物，扩增出mutant-up片段，mutant dnF和dnR为引物，扩增出mutant-down片段；反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃分别延伸1min、1min10 s，35个循环；68℃再延伸4min，4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20℃保存；

以mutant-up和mutant-down为模板，upF和dnR为引物，融合PCR连接上述两片段；反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸2min 10s，35个循环；68℃再延伸4min；4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20℃保存。

进一步，所述PCR扩增基因的方法第一步转化及筛选，从平板上挑取变异链球菌单克隆接种于BHI液体培养基中，取过夜培养菌液按1：20稀释于BHI培养基后培养2～3h，直到菌液OD600＝0.2～0.3，取500μL菌液+5μL up-IFDC2-dn+0.5μL细菌感受态刺激肽CSP；加样混合后培养2h，取菌液200μL于含有12.5μg/mL红霉素的BHI琼脂平板涂板培养48h；随机挑取平板上部分阳性单克隆接种于含12.5μg·mL-1红霉素的BHI液体培养基中，以过夜培养菌液为模板，加入引物checkF/checkR，PCR扩增后1％琼脂糖凝胶电泳检验第一步转化结果，将阳性克隆-80℃保种；

所述PCR扩增基因的方法第二步转化及筛选，将第一步转化成功的阳性克隆接种至含12.5μg/mL红霉素的BHI液体培养基过夜培养后，于含12.5μg/mL红霉素的BHI琼脂平板上划线培养48h，挑取单克隆接种于含12.5μg/mL红霉素的BHI液体培养基，取过夜培养菌液按1：20稀释于不含红霉素的BHI液体培养基培养2～3h，直至菌液OD600＝0.2～0.3；取500μL菌液+5μL mutant up-down+0.5μL CSP，加样混合后培养2h，取菌液各200μL于含有4mg/mLp-Cl-Phe的BHI琼脂平板涂板培养48h；随机挑取平板上10个单克隆接种于BHI液体培养基中，以过夜培养菌液为模板，加入引物checkF/checkR，PCR扩增后1％琼脂糖凝胶电泳检验第二步转化结果，并将琼脂糖凝胶电泳观察到的阳性克隆送DNA测序，将正确测序结果对应的阳性克隆-80℃保种，并命名为>gtfB。

本发明的另一目的在于提供一种所述PCR扩增基因的方法在PCR扩增基因的方法中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明采用点突变技术，可以在不敲除目的基因的情况下实现蛋白翻译水平下降，最大程度抑制变异链球菌各毒力因子表达，且突变体表型易检测，能够直观准确的反应基因编辑的结果。此外，相对于表观遗传学中的DNA修饰，蛋白修饰等改变表型的方法，本发明步骤更为简便，材料易获得，成本低，可重复性高。

附图说明

图1是本发明实施例提供的基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法实现流程图。

图3是本发明实施例提供的变异链球菌生物膜扫描电镜图；

图中：(a)WT；(b)>gtfB。

图4是本发明实施例提供的变异链球菌产胞外多糖示意图。

图5是本发明实施例提供的点突变菌株>gtfB相比于野生型菌株示意图。

图6是本发明实施例提供的在分子量为150Kd处，野生型菌株及点突变菌株>gtfB的Gtf蛋白成功出现分离示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法包括以下步骤：

S101：选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因(序列位于毒力基因框架内)；

S102：聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)扩增靶基因上游序列作为upstream；

S103：PCR扩增靶基因下游序列作为downstream；

S104：PCR扩增红霉素抗性基因片段IFDC2；

S105：PCR将步骤S102-步骤S104中的upstream、IFDC2、downstream片段融合；

S106：将步骤S105中的融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；

S107：将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分，分别为mutant-upstream和mutant-downstream，二者共同拥有一段约20个碱基大小的重叠序列；其中突变位点位于mutant-upstream片段R端重复序列之前；

S108：利用聚合酶链式反应分别扩增出mutant-upstream和mutant-downstream，其中扩增mutant-upstream时，R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；

S109：将步骤S108扩增出的mutant-upstream和mutant-downstream片段融合，称为mutant up-down；

S110：将步骤S109中的融合片段mutant up-down转入步骤S106中获得的阳性克隆菌株中，利用含p-Cl-Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证，即可实现毒力基因的点突变。

在本发明的优选实施例中，R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基(参照变异链球菌密码子使用频率表，如表1所示)。

表1变异链球菌密码子使用频率表(每1000个密码子中；共581662个密码子)

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明以变异链球菌的gtfB基因点突变为例，选取位于该基因第953223个碱基“T”，其对应的密码子为编码苏氨酸的ACU，根据变异链球菌密码子使用频率表，在每1000个密码子中其使用频率为19.3，本发明拟将其替换为使用频率7的同义密码子ACG，即将第953223个碱基“T”替换为“G”，实现点突变。

本发明利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术完成点突变菌株的构建。IFDC2基因盒由启动子ldh、突变的pheS基因片段(mpheS)及ermAM基因片段三部分构成。本基因盒中的ermAM基因片段使转化子带有红霉素抗性从而实现阳性筛选。pheS基因编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基，在其发生突变并整合入受体菌基因组后，可使转化子对苯丙氨酸类似物p-chloro-phenylalanine(p-Cl-Phe)产生获得性敏感，利用此原理可以实现转化子的二次筛选从而获得无标记的基因突变株。

本发明所用引物序列如表2所示，选取一段包含突变位点在内的0.63kb长度的片段作为靶基因，其上游同源片段upstream长度为0.76kb，下游同源片段downstream为0.86kb，IFDC2基因长度为2.2kb；第二次转化中，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为两部分，分别为mutant-up(约1kb)and mutant-dn(约1.2kb)，二者含有一段重叠序列–GCCGTGATTGAAGGCA–。

表2点突变菌株构建所需引物

一、菌株的培养

(1)供试菌株的准备：

本发明所有实施例的供试菌株为变异链球菌野生型UA159(菌株编号：32401；四川大学华西口腔医学院提供)。

(2)培养基的组分及制备：

牛心脑浸液(以下简称BHI)液体培养基的组分及其配制方法：将14.8g商购的BHI粉末(OXOID，美国，货号：CM1135，以下类同)加入400mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该液体培养基是针对变异链球菌浮游培养的典型液体培养基。

BHI蔗糖液体培养基的组分及其配制方法：分别将14.8g商购BHI粉末和4g蔗糖(Thermo Fisher Scientific，美国，货号：S3-500)加入400mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后待用；该液体培养基是针对变异链球菌生物膜培养的典型液体培养基。

含红霉素的BHI固体培养基的组分及其配制方法：将14.8g商购BHI粉末和5g商购琼脂粉末(北京索莱宝科技有限公司，中国，货号：A8190，以下类同)加入400mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后加入红霉素(Amreso公司，美国，货号：359681)，使其终浓度为12.5μg/mL，待用；该固体培养基是针对变异链球菌红霉素抗性阳性克隆菌株分离培养的典型固体培养基。

含p-Cl-Phe的BHI固体培养基的组分及其配制方法：将14.8g商购BHI粉末和5g商购琼脂粉末(北京索莱宝科技有限公司，中国，货号：A8190，以下类同)加入400mL蒸馏水中，高温高压(121℃，103.4kPa)灭菌15分钟，冷却后加入p-Cl-Phe(Sigma公司，美国，货号：C6506)，使其终浓度为4mg/mL，待用；该固体培养基是针对变异链球菌p-Cl-Phe敏感阴性克隆菌株分离培养的典型固体培养基。

(3)细菌培养及基因组(gDNA)提取，将变异链球菌UA159菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下培养48小时。用接种环挑取一个单菌落接种于3mL BHI液体培养基，37℃、10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下培养，取过夜培养菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司，中国，货号：DP302)说明提取细菌gDNA，测定纯度及浓度后-20℃保存。

(4)目的片段扩增及连接，以提取所得细菌gDNA及IFDC2基因盒(俄克拉荷马大学健康科学中心口腔生物学专业，美国)为模板，利用KOD-Plus DNA聚合酶试剂盒(Toyobo公司，日本，货号：KOD201)PCR扩增靶基因上游同源片段upstream、下游同源片段downstream、IFDC2片段。其中引物ldhF和ermR为IFDC2片段的上下游引物，upF和upR-IFDC2为upstream的上下游引物，dnF-IFDC2和dnR为downstream的上下游引物。采用PCR分别扩增，获得片段upstream、IFDC2与downstream。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃分别延伸1min、2min 15s、1min，35个循环，68℃再延伸4min。4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，胶回收并测定产物浓度和纯度，-20℃保存。

以upstream、IFDC2、downstream三片段为模板，upF和dnR为引物，融合PCR连接上述三片段(记为up-IFDC2-dn，大小约3.8kb)。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸4min，35个循环；68℃再延伸4min。4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20℃保存。

以提取所得细菌gDNA为模板，upF和mutant upR为引物，扩增出mutant-up片段，mutant dnF和dnR为引物，扩增出mutant-down片段。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃分别延伸1min、1min10 s，35个循环；68℃再延伸4min。4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20℃保存。

以mutant-up和mutant-down为模板，upF和dnR为引物，融合PCR连接上述两片段(记为mutant up-down，大小约2.2kb)。反应条件为94℃预变性2min；94℃变性15s，55℃退火30s，68℃延伸2min 10s，35个循环；68℃再延伸4min。4℃结束反应后，采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，-20℃保存。

(5)第一步转化及筛选，从平板上挑取变异链球菌单克隆接种于BHI液体培养基中，取过夜培养菌液按1︰20稀释于BHI培养基后培养2～3h，直到菌液OD600＝0.2～0.3。取500μL菌液+5μL up-IFDC2-dn+0.5μL细菌感受态刺激肽CSP(1μg/μL，四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供)。加样混合后培养2h，取菌液200μL于含有12.5μg/mL红霉素的BHI琼脂平板涂板培养48h。随机挑取平板上部分阳性单克隆接种于含12.5μg·mL-1红霉素的BHI液体培养基中，以过夜培养菌液为模板，加入引物checkF/checkR，PCR扩增后1％琼脂糖凝胶电泳检验第一步转化结果，将阳性克隆-80℃保种。

(6)第二步转化及筛选，将第一步转化成功的阳性克隆接种至含12.5μg/mL红霉素的BHI液体培养基过夜培养后，于含12.5μg/mL红霉素的BHI琼脂平板上划线培养48h，挑取单克隆接种于含12.5μg/mL红霉素的BHI液体培养基，取过夜培养菌液按1︰20稀释于不含红霉素的BHI液体培养基培养2～3h，直至菌液OD600＝0.2～0.3。取500μL菌液+5μL mutantup-down+0.5μL CSP(1μg/μL)，加样混合后培养2h，取菌液各200μL于含有4mg/mL p-Cl-Phe的BHI琼脂平板涂板培养48h。随机挑取平板上10个单克隆接种于BHI液体培养基中，以过夜培养菌液为模板，加入引物checkF/checkR，PCR扩增后1％琼脂糖凝胶电泳检验第二步转化结果，并将琼脂糖凝胶电泳观察到的阳性克隆送DNA测序，将正确测序结果对应的阳性克隆-80℃保种，并命名为>gtfB。

下面结合突变株表型验证对本发明的技术效果作详细的描述。

一、变异链球菌生物膜扫描电镜检测：本实验是通过培养变异链球菌生物膜，观察细菌结构及表面胞外基质的含量变化。

(1)在10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下，BHI培养基中接种UA159及点突变菌株>gtfB，37℃过夜培养。

(2)用新鲜的BHI培养基1:100稀释复苏的菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD600为0.5。

(3)用含1％蔗糖的BHI培养基将上一步细菌按1:100稀释，取1mL菌液至24孔板中，放置无菌玻璃片，在10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下，37℃培养24h。每个样本至少三个重复。

(4)去除孔板内培养基，用无菌PBS漂洗生物膜表面物质3次，然后向每孔中加入1mL2.5％戊二醛溶液固定生物膜，4℃静置过夜。

(5)除去戊二醛溶液，无菌PBS漂洗2次。依次使用不同浓度梯度(30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％)乙醇溶液对玻片表明生物膜进行脱水，每个梯度脱水15min。

(6)将脱水干燥后的生物膜玻璃片放入100％乙酸正戊酯溶液中做置换处理5min，然后在二氧化碳临界点干燥仪中进行干燥，最后进行喷金处理，上机观察。

结果如图3所示，野生型菌株UA159与点突变菌株>gtfB细胞形态无明显差别，但UA159生物膜完整，细胞表面包裹大量胞外基质且集聚在一起，而>gtfB几乎没有胞外基质存在，未见生物膜结构，细菌分散排列。因此，本实施例也同样证明了该技术能抑制变异链球菌生物膜形成。

二、变异链球菌产胞外多糖检测(蒽酮法)：蒽酮法实验原理为糖在较高温度下可被浓硫酸作用而脱水生成糠醛或者羟甲基糠醛，后与蒽酮脱水缩合，形成糠醛衍生物，呈蓝绿色，该物质在625nm处有最大吸收，其颜色深浅与与糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

(1)在10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下，BHI培养基中接种UA159及点突变菌株>gtfB，37℃过夜培养；

(2)用新鲜的BHI培养基1:100稀释复苏菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD600为0.5；

(3)用含1％蔗糖的BHI培养基将上一步细菌按1:100稀释，然后取2mL菌液于24孔板中，相同条件下培养24h。每个样本至少三个重复；

(4)去除上清液，2mL PBS重悬生物膜，取1mL加入到1.5mL无菌离心管，6000r/min离心10min，弃上清；

(5)1mL PBS分别漂洗沉淀3次，去除所有水溶性糖。向沉淀中加入0.4mol/L NaOH溶液500μL，反应数分钟；

(6)上一步中的液体与蒽酮试剂(200mg蒽酮溶解于100mL浓硫酸)按照体积比1：3混匀，95℃，水浴6min；

(7)待上一步溶液冷却至室温，取100μL于96孔板中，酶标仪读取OD₆₂₅。

结果如图4所示，点突变菌株>gtfB相比于野生型菌株，其光吸收值明显降低，且存在显著性差异，说明前者胞外多糖含量明显少于后者，进而证明了该技术能够抑制变异链球菌胞外多糖的合成。

三、变异链球菌gtf基因表达水平检测(RT-qPCR)：

(1)在10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下，BHI培养基中接种UA159及点突变菌株>gtfB，37℃过夜培养；

(2)用新鲜的BHI培养基1:100稀释复苏菌种，相同条件下继续培养2-3h，使OD600为0.5；

(3)用含1％蔗糖的BHI培养基将上一步细菌按1:100稀释，然后取2mL菌液于24孔板中，相同条件下培养24h。每个样本至少三个重复；

(4)去除上清液，2mL PBS重悬生物膜，4000g离心10min，弃上清，1mL Trizol重悬沉淀，使用液氮破壁法裂解细菌；

(5)使用Qiagen RNeasy Min Kit试剂盒提取总RNA，逆转录合成cDNA第一链。按照Takara q-PCR说明书进行操作，进行实时定量PCR反应。引物设计见表3。

表3：引物核酸序列

结果如图5所示，点突变菌株>gtfB相比于野生型菌株，其gtfB基因表达明显下调，且存在显著性差异，此外，gtfC及gtfD表达水平也出现明显降低，说明由于密码子偏好导致基因表达水平出现变化，进而证明了该技术能够抑制变异链球菌毒力相关基因的表达。

四、变异链球菌Gtf蛋白检测(RT-qPCR)：

(1)在10％H₂、5％CO₂和85％N₂厌氧条件下，BHI培养基中接种UA159及点突变菌株>gtfB，37℃过夜培养；

(2)用50mL新鲜的BHI培养基接种复苏菌种，相同条件下过夜培养；

(3)13000rpm转速，4℃离心10min，收集上清液，与无水乙醇以3:1比例混合，-80℃冻存30min；

(4)室温融化上清液，25000rpm转速，4℃离心15min，去除上清液，PBS重悬收集沉淀；

(4)使用Bradford法进行样本蛋白定量，将含有等量蛋白的两组样本进行SDS-PAGE变性梯度凝胶电泳。

结果如图6所示，在分子量为150Kd处，野生型菌株及点突变菌株>gtfB的Gtf蛋白成功出现分离，可见两条条带，分别为上面的GtfB/D与下面的GtfC；而>gtfB的上下两条条带相对于野生型，其颜色深浅亮度均降低，说明其Gtf蛋白分泌量减少，进一步说明基于密码子偏好的点突变将从基因表达水平影响至蛋白翻译水平，进而抑制变异链球菌毒力表型，实现一条完整的作用过程。

本发明旨在基于密码子偏好性利用点突变技术抑制变异链球菌毒力，该技术克服了原有基因敲除方法的的难点与不足，具有高效性、特异性强、可重复性、周期短、克服药物筛选的盲目性的特点，且表型检测容易；本发明证实其能有效抑制变异链球菌毒力，降低gtf基因表达水平，减少Gtf蛋白分泌，抑制胞外多糖的产生和生物膜的形成，并且可以扩展至其他毒力因子的突变中，进而为龋病的预防或治疗提供新的策略；进一步的，除了变异链球菌，本发明还可以应用于其他微生物以及真核生物如人体细胞中。本发明所使用点突变方法为传统的同源交换技术，目前分子生物学领域已出现一些新的基因编辑方法，例如以CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)为代表的技术，可以通过特异靶向切割实现特定碱基的同义突变，这类能够完成基因同义点突变的方法均符合本发明基于密码子偏好性影响蛋白翻译水平，进而改变细胞表型的理念，进一步的任何基于该理念来改变基因表达翻译水平及细胞表型的技术均属于本发明专利保护范畴内。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 四川大学

<120>基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法

<160> 14

<210> 1

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

GGAGCAGTGCTTTACG

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

GAGTGTTATTGTTGCTCGG GTGTGTGTATTTCTTCTC

<210> 3

<211> 41

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>3

GGTATACTACTGACAGCTTCCTAGCACGGCCCCATCAACAG

<210>4

<211>18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>4

CACCTTCGCTGATGAAAG

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>5

CCGAGCAACAATAACACTC

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>6

GAAGCTGTCAGTAGTATACC

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>7

TGCCTTCAATCACGGCCACTCCTGACGTTCGTGTGG

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>8

GCCGTGATTGAAGGCAATAACCCTTCTTTACGT

<210> 9

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>9

GCAGCTGCAACTATTC

<210> 10

<211> 16

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>10

CATCTCTGAGCTGTAG

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>11

AGCGTTGTCCGGATTTATTG

CTACGCATTTCACCGCTACA

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>12

CACTATCGGCGGTTACGAAT

CAATTTGGAGCAAGTCAGCA

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>13

GATGCTGCAAACTTCGAACA

TATTGACGCTGCGTTTCTTG

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>14

TTGACGGTGTTCGTGTTGAT

AAAGCGATAGGCGCAGTTTA

Claims (10)

1.一种用于抑制变异链球菌毒力方法中进行PCR扩增基因的引物，其特征在于，所述PCR扩增的引物的序列为SEQ ID NO：1~ SEQ ID NO：10。

2.一种利用权利要求1所述引物进行PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法包括：

第一步，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；

第二步，聚合酶链式反应PCR扩增靶基因上游序列作为upstream；扩增所述upstream的引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2；

第三步，PCR扩增靶基因下游序列作为downstream；扩增所述downstream的引物的序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

第四步，PCR扩增红霉素抗性基因片段IFDC2；扩增IFDC2片段的序列为SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6；

第五步，PCR将第二步-第四步中的upstream、IFDC2、downstream片段融合；

第六步，将第五步中的融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；

第七步，将包含上述upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分，分别为mutant-upstream和mutant-downstream，二者共同拥有一段20个碱基大小的重叠序列；其中突变位点位于mutant-upstream片段R端重复序列之前；

扩增所述mutant-upstream的引物序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7；扩增所述mutant-downstream的引物序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：8；

第八步，利用聚合酶链式反应分别扩增出mutant-upstream和mutant-downstream，其中扩增mutant-upstream时，R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；

第九步，将第八步扩增出的mutant-upstream和mutant-downstream片段融合，称为mutant up-down；

第十步，将第九步中的融合片段mutant up-down转入第六步中获得的阳性克隆菌株中，利用含p-Cl-Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证，即可实现毒力基因的点突变。

3.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法的R端引物序列中，与突变位点对应的碱基替换为所需突变的互补碱基；变异链球菌密码子使用频率表，每1000个密码子中，共581662个密码子。

4.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法利用IFDC2基因盒及等位同源交换技术完成点突变菌株的构建，IFDC2基因盒由启动子ldh、突变的pheS基因片段mpheS及ermAM基因片段三部分构成；基因盒中的ermAM基因片段使转化子带有红霉素抗性从而实现阳性筛选，pheS基因编码苯丙氨酸-tRNA合成酶α亚基，在发生突变并整合入受体菌基因组后，使转化子对苯丙氨酸类似物p-Cl-Phe产生获得性敏感，实现转化子的二次筛选获得无标记的基因突变株。

5.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述第一步选取一段包含突变位点在内的0.63kb长度的片段作为靶基因，其上游同源片段upstream长度为0.76kb，下游同源片段downstream为0.86kb，IFDC2基因长度为2.2kb；所述第七步中，将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为两部分，分别为mutant-upstream和mutant-downstream，mutant-upstream和mutant-downstream含有一段重叠序列–GCCGTGATTGAAGGCA–。

6.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法细菌培养及基因组gDNA提取，将变异链球菌UA159菌液接种于BHI固体培养基上，37℃、10% H₂、5% CO₂和85% N₂厌氧条件下培养48小时；用接种环挑取一个单菌落接种于3mL BHI液体培养基，37℃、10% H₂、5% CO₂和85% N₂厌氧条件下培养，取过夜培养菌液按细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌gDNA，测定纯度及浓度后-20 ℃保存。

7.如权利要求6所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法目的片段扩增及连接，以提取所得细菌gDNA及IFDC2基因盒为模板，利用KOD-Plus DNA聚合酶试剂盒PCR扩增靶基因上游同源片段upstream、下游同源片段downstream、IFDC2片段；其中引物SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6为扩增IFDC2基因片段的上下游引物，SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2为扩增upstream的上下游引物，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为扩增downstream的上下游引物；采用 PCR分别扩增，获得片段upstream、IFDC2与downstream；反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃分别延伸1 min、2 min 15 s、1 min，35个循环，68 ℃再延伸4 min，4 ℃结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，胶回收并测定产物浓度和纯度，-20 ℃保存。

8.如权利要求7所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法以upstream、IFDC2、downstream三片段为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4为引物，融合PCR连接上述三片段，即为up-IFDC2-dn；反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸4 min，35个循环；68 ℃再延伸4 min；4 ℃结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 扩增产物，-20 ℃保存；

以提取所得细菌gDNA为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：7为引物，扩增出mutant-upstream片段， SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4为引物，扩增出mutant-downstream片段；反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃分别延伸1 min、1min10s，35个循环；68 ℃再延伸4 min，4 ℃结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 扩增产物，-20 ℃保存；

以mutant-upstream和mutant-downstream为模板，SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4为引物，融合PCR连接上述的两片段；反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 10 s，35个循环；68 ℃再延伸4 min；4 ℃结束反应后，采用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 扩增产物，-20 ℃保存。

9.如权利要求2所述的PCR扩增基因的方法，其特征在于，所述PCR扩增基因的方法第一次转化及筛选，从平板上挑取变异链球菌单克隆接种于BHI液体培养基中，取过夜培养菌液按1：20稀释于BHI培养基后培养2~3h，直到菌液OD600=0.2~0.3，取500 µL菌液+5 µL up-IFDC2-dn+0.5 µL 细菌感受态刺激肽CSP；加样混合后培养2 h，取菌液200 µL于含有12.5µg/mL红霉素的BHI琼脂平板涂板培养48 h；随机挑取平板上部分阳性单克隆接种于含12.5µg·mL-1红霉素的BHI液体培养基中，以过夜培养菌液为模板，加入引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检验第一次转化结果，将阳性克隆-80 ℃保种；

所述PCR扩增基因的方法第二次转化及筛选，将第一次转化成功的阳性克隆接种至含12.5 µg/mL红霉素的BHI液体培养基过夜培养后，于含12.5 µg/mL红霉素的BHI琼脂平板上划线培养48 h，挑取单克隆接种于含12.5 µg/mL红霉素的BHI液体培养基，取过夜培养菌液按1：20稀释于不含红霉素的BHI液体培养基培养2~3h，直至菌液OD600=0.2~0.3；取500 µL菌液+5 µL mutant up-down+0.5 µL CSP，加样混合后培养2 h，取菌液各200 µL于含有4mg/mL p-Cl-Phe的BHI琼脂平板涂板培养48 h；随机挑取平板上10个单克隆接种于BHI液体培养基中，以过夜培养菌液为模板，加入引物SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10，PCR扩增后1%琼脂糖凝胶电泳检验第二次转化结果，并将琼脂糖凝胶电泳观察到的阳性克隆送DNA测序，将正确测序结果对应的阳性克隆-80 ℃保种，并命名为>gtfB。

10.一种如权利要求2~9任意一项所述PCR扩增基因的方法在PCR扩增基因的方法中的应用。

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