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CN1277116C - 生物传感器用的生物酶电极及其制备方法 - Google Patents

生物传感器用的生物酶电极及其制备方法 Download PDF

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CN1277116C
CN1277116C CN 200410018772 CN200410018772A CN1277116C CN 1277116 C CN1277116 C CN 1277116C CN 200410018772 CN200410018772 CN 200410018772 CN 200410018772 A CN200410018772 A CN 200410018772A CN 1277116 C CN1277116 C CN 1277116C
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Abstract

本发明涉及一种生物传感器用的生物酶电极及其制备方法，在由有机绝缘材料做成的电极基片上，将导电材料用喷涂法印制形成工作电极和对电极的基体，它们的中间部分表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体，在工作电极基体下端部分涂覆一层综合应用高分子聚合物累积膜技术或二茂铁覆盖技术、包埋酶技术、纳米技术和扩散限制膜技术形成的反应层，即制成生物酶电极。本发明的生物酶电极从整体上提高了生物传感器的各项性能和实用性。

Description

生物传感器用的生物酶电极及其制备方法
技术领域
本发明的技术方案涉及通过测试电化学变量的方法分析材料所用的生物化学电极，具体说是一种生物传感器用的生物酶电极及其制备方法。
背景技术
生物传感器是近几十年内发展起来的一种新的传感器技术，已在临床诊断、工业控制、食品和药物分析、生物药物开发、环境分析、军事领域、生物技术和生物芯片诸多方面得到广泛的应用。但目前市售的葡萄糖、胆固醇等生物传感器用的生物酶电极都是单分子膜，存在着干扰电流因而抗干扰性能低、酶层易脱落因而使用寿命短、测试灵敏度低及测量线性范围窄的缺点。为了提高生物传感器的抗干扰性能，US 5,229,282介绍了一种生物传感器的制备方法，其主要特征是在电极的一个端面上涂覆一反应层，该反应层包含有酶、电子接受器和一个亲水聚合物；更多的方法是在电极的一个端面上形成高分子聚合物累积膜(亦称聚电解质复合膜，简称PEM膜)，例如Decher G.曾提出静电自组装形成高分子聚合物累积膜(Decher G.Makromol.Chem.Macromol.Symp.1991，46：321-327；Ber.Bunsen-Ges.Phys.Chem.1991，95(11)：1403-1434；Thin Solid Films.1992，210-211：831-835)，HoshiT等人利用聚烯丙胺(PAA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚磺化乙烯(PVS)、聚磺化苯乙烯(PSS)等形成PEM膜(Hoshi T，Saiki H，Kuwazawa S，TsuchiyaC，Chen Q，Anzai J.ANALYTICAL CHEMISTRY，73(21)：5310-5315 NOV 1 2001)，Ram MK等人则利用叠层技术制备胆固醇生物传感器，实验结果表明某些PEM膜对干扰物，如尿酸、抗坏血酸有显著的阻挡作用，克服了干扰电流的存在。为了提高生物传感器的测试灵敏度，有人设计了用于电化学生物传感器的纳米金电极(Gu HY.ANALYTICAL LETTERS.2002，35(4)：647-661；Kossek，Sebastian.Journal of the Electrochemical Society.1996，143(12)：3890-3895)。为了延长生物传感器的使用寿命，主要是采用固定酶或包埋酶的方法，例如，US 6,280,587披露了将催化酶固定在一个有机聚合物和一个渗透限制层上的方法，CN1186115、CN 1211620则公开了一种凝胶包埋酶制备生物传感器的方法。而对于扩大测量线性范围的改进方法尚未见到相关报道。上述方法仅限于提高生物传感器的单一方面的性能，没有综合改善的效果，实用性差。申请号为03257848.2的中国专利是本发明同一申请人及相同主要发明人较前期申请的实用新型专利，它披露了一种综合PEM膜技术、纳米技术、包埋酶技术和保护层技术的生物传感器用的生物酶电极的结构，改善了综合的效果，提高了实用性，但仍然有进一步改进其结构和制备方法的空间。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种抗干扰、使用寿命长、灵敏度高及测量线性范围宽的生物传感器用的生物酶电极及其制备方法，用该方法制得的生物酶电极从整体上提高了生物传感器的各项性能和实用性。
本发明解决该技术问题所采用的技术方案是：
本发明的生物传感器用的生物酶电极是由工作电极、对电极、载体、覆盖电极表面的绝缘体和反应层构成，反应层是由在工作电极下端覆盖在电极基体上的抗干扰层、纳米颗粒、基质包埋酶层、氧化酶和扩散限制膜组成，抗干扰层是利用阳离子高分子聚合物聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种和阴离子高分子聚合物聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中的至少一种共同形成的2～15层聚电解质复合膜；纳米颗粒选用纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒中的一种或几种，其颗粒大小范围在8～50nm，纳米颗粒被包嵌在抗干扰层中、或被包嵌在基质包埋酶层中、或同时被包嵌在抗干扰层和基质包埋酶层中；基质包埋酶层选用壳聚糖1～12层、或聚乙烯吡咯烷酮1层、或明胶1层、或伴刀豆球蛋白A 1～12层；氧化酶选用葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆固醇氧化酶；基质包埋酶层和氧化酶是交替吸附的，氧化酶被包埋在基质包埋酶层中，当基质包埋酶层选用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A并多层包埋时，是一层挨一层的；扩散限制膜是用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液制成的薄膜，上述本发明生物传感器用的生物酶电极的特征在于：覆盖在电极基体上的抗干扰层或者是二茂铁电子媒介体层。
本发明生物传感器用的生物酶电极的工作电极下端的反应层是矩形或圆形的。
本发明的生物传感器用的生物酶电极的制备方法是：
在由有机绝缘材料做成的电极基片即载体上，将导电材料用喷涂法印制形成工作电极和对电极的基体，它们的中间部分表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体，在工作电极基体下端部分涂覆一层综合应用高分子聚合物累积膜技术或二茂铁覆盖技术、包埋酶技术、纳米技术和扩散限制膜技术形成的反应层，即制成生物酶电极，其反应层的具体制备方法选用以下四种方法中的任意一种：
a.第一步，用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；第二步，将镀上高分子聚合物累积膜的电极用混有5％纳米颗粒的包埋酶层基质进行酶的微包埋，包埋酶层基质选用明胶或聚乙烯吡咯烷酮进行酶的微包埋的方法是，用混有5％纳米颗粒的浓度5％的明胶或聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶或聚乙烯吡咯烷酮固定酶，包埋酶层基质用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A进行酶的微包埋的方法是，利用静电自组装技术，用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A分别与酶进行累积，其操作步骤是将电极浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液或伴刀豆球蛋白A溶液包埋酶层基质中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入浓度为2mg/mL的氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层；第三步，取出后，用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，
b.第一步，同a；第二步，将镀上高分子聚合物累积膜的电极用聚乙烯吡咯烷酮、明胶、壳聚糖、或伴刀豆球蛋白A进行酶的微包埋，包埋酶层基质选用明胶或聚乙烯吡咯烷酮进行酶的微包埋的方法是，用浓度5％的明胶或聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶或聚乙烯吡咯烷酮固定酶，包埋酶层基质用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A进行酶的微包埋的方法是，利用静电自组装技术，用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A分别与酶进行累积，其操作步骤是将电极浸入到浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液或伴刀豆球蛋白A溶液包埋酶层基质中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入浓度为2mg/mL的氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层；第三步，同a，
c.第一步，用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到浓度为2mg/mL的含聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；第二步，同a；第三步，同a，
d.第一步，依次用65％HNO3∶H2O＝1∶1的HNO3和丙酮擦拭工作电极下端裸露部分表面，然后用去离水清洗，自然晾干；第二步，再在工作电极下端部分表面加1μL浓度为1％的二茂铁的酒精溶液形成二茂铁电子媒介体层，自然晾干后再加5μL含5％纳米颗粒和2mg/mL氧化酶的5％明胶溶液，用2％戊二醛交联3分钟，用去离子水冲洗，晾干或在冰箱中6℃下保存；第三步，再在工作电极下端部分表面用滴加1μL～2μL含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，
上述方法中所用溶液的百分比浓度均为重量/体积比浓度，所用的纳米颗粒是纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒中的一种或几种，其颗粒大小范围在8～50nm，所用的氧化酶是葡萄糖氧化酶、或乳酸氧化酶、或胆固醇氧化酶，所用的缓冲液的配方是Na2HPO4 1.15克，KCl 0.2克，NaCl 8.0克，KH2PO4 0.2克，定容于1000mL的容量瓶中，pH＝7.4，用做工作电极和对电极的基体的导电材料是金、碳、铂、或银，用做电极基片的有机绝缘材料是聚碳酸酯。
上述方法中用包埋酶层基质进行酶的微包埋处理时，所镀上的包埋酶层是聚乙烯吡咯烷酮1层、明胶1层、伴刀豆球蛋白A 1～12层或壳聚糖1～12层。
上述方法中最好在工作电极下端部分表面是用含2％～2.5％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜。
本发明的有益效果是：
(1)利用高分子聚合物累积多层PEM膜或二茂铁电子媒介体层及醋酸纤维素扩散限制膜，对干扰物如尿酸、抗坏血酸及三氯乙酸都有显著的阻挡作用，克服了干扰电流的存在，抗干扰性能明显提高。
用生物传感器检测存在于血液中的葡萄糖、胆固醇、乳酸时，这三种物质经各自的氧化酶氧化后，全有H2O2产生，其化学反应式如下：
H2O2在电极表面发生氧化电化学反应产生电子，
Figure C20041001877200074
根据上述反应，H2O2通过氧化电化学反应产生电子，当产生的电子转移到电极表面即产生安培电流，根据电流的大小可以测定葡萄糖、胆固醇和乳酸的含量。由于很多酶传感器是利用常见的生化反应副产品H2O2在0.6V下产生的氧化电流来间接工作，而在0.6V时，尿酸(uric acid)、抗坏血酸(ascorbic acid)和三氯乙酸(acetaminophen)等干扰物质也会被氧化，产生干扰电流影响测定，即影响酶催化产生的电流与待测底物之间的比例关系。干扰物质和H2O2产生的两类氧化还原反应都发生在电极的表面。本发明方法制备的生物传感器用的生物酶电极利用聚烯丙胺(PAA)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)、聚磺化乙烯(PVS)、聚磺化苯乙烯(PSS)等形成PEM膜或醋酸纤维素扩散限制膜，只让产物H2O2通过而不让干扰物质通过，从而抗干扰，或覆盖二茂铁电子媒介体层，通过利用二茂铁较低的氧化还原电位降低干扰物质的响应电流。本发明的发明人利用283电化学工作站对附着有PEM膜的本发明的生物酶电极与裸生物酶电极进行了抗干扰的对比测试实验，结果如下表1所示，表1中的数据分别是5mMH2O2、5mM抗坏血酸和5mM尿酸产生的电流值，单位为微安培，可见本发明的生物酶电极的抗干扰性能明显提高；覆盖二茂铁电子媒介体层及醋酸纤维素扩散限制膜的抗干扰性能也有明显提高，实测结果可参见实施例46。
(2)在酶层中加入纳米颗粒使生物酶电极的灵敏度提高3～4倍(参见实施例48)。
(3)在本发明方法中采用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液在电极表面形成扩散限制膜，由此制得的生物酶电极的测量线性范围加宽，可测范围在0-30mM(参见实施例47)。
(4)在本发明方法中用壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、明胶或伴刀豆球蛋白A与氧化酶进行微包埋，增加了酶的吸附量并且延长了酶存活的时间，因而延长了生物酶电极使用寿命，提高了传感器的稳定性。其中特别是直接以壳聚糖和氧化酶采用静电自组装方法制备多层累积膜固定化酶，通过增加组装层数提高生物酶电极中被固定酶的量，延长了生物酶电极的使用寿命，酶膜置冰箱0-4℃应可保存一年以上，空气中使用的稳定性从1～2个月增至4～6个月。
(5)本发明比中国专利03257848.2有了进一步的改进、完善和成熟的制备方法，反应层中的抗干扰层除采用高分子累积膜外还采用了二茂铁电子媒介体层，可以简化制备工艺，提供更多的选择余地。
总之，使用本发明方法制得的生物传感器用的生物酶电极从整体上提高了生物传感器的各项性能和实用性，因而采用本发明的生物酶电极使生物传感器整体水平得到根本的改善。
                        表1抗干扰的对比测试实验结果
  电极类型   H2O2   抗坏血酸   尿酸
  裸电极   4.9   2.5   3.2
  PAA/PVS   4.0   0.2   0.9
  (PAA/PVS)PAA   4.0   0.1   0.08
  (PAA/PVS)2   3.7   0.02   0.02
  (PAA/PVS)2PAA   3.7   0.08   0.02
  PAA/PSS   4.5   1.8   1.7
  (PAA/PSS)PAA   4.5   1.0   0.7
  (PAA/PSS)2   4.2   0.2   0.2
  (PAA/PSS)2PAA   4.0   0.1   0.05
附图说明
图1-I和图1-II分别是反应层为矩形和圆形的本发明生物酶电极的正视图。
图2是本发明生物酶电极的反应层的立体透视示意图。
图3是本发明生物酶电极的反应层的横切面示意图。
图4-I和图4-II分别是反应层为矩形和圆形的本发明生物酶电极的工作电极和对电极的正视图。
图5是本发明生物酶电极进行测量时采用的三电极系统图。
图6-I和图6-II分别是扫描电压为600mV和400mV条件下未修饰的葡萄糖生物传感器在缓冲液、尿酸、抗坏血酸、二茂铁溶液中的循环伏安图。
图7-I和7-II分别是扫描电压为600mV和400mV条件下用醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器在缓冲液、尿酸、抗坏血酸、二茂铁溶液中的循环伏安图。
图8是以二茂铁为电子媒介体层制备的葡萄糖生物传感器测定葡萄糖的电流曲线。
图9-I和图9-II和图9-III分别是不同醋酸纤维素浓度的扩散限制膜修饰葡萄糖生物传感器的I-t曲线。
图10-I和图10-II分别是不同浓度的醋酸纤维素浓度制备的扩散限制膜修饰葡萄糖生物传感器的工作图线。
图11-I、11-II和11-III分别是不同浓度的醋酸纤维素扩散限制膜修饰的匍萄糖生物传感器的循环伏安图。
图12是本发明生物传感器用的生物酶电极中所含纳米金颗粒的透射电子显微镜扫描图谱。
图13-I是用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器和未用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器的I-t曲线。
图13-II是醋酸纤维素和纳米金颗粒共同修饰的葡萄糖生物传感器的电流曲线。
图14是本发明生物酶电极的稳定性实验测试曲线。
图中，1.工作电极，2.对电极，3.载体，4.覆盖电极表面的绝缘体，5.反应层，6.高分子累积膜抗干扰层或二茂铁电子媒介体层抗干扰层，7.纳米颗粒，8.基质包埋酶层，9.氧化酶，10.扩散限制膜。
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
具体实施方式
图1表明工作电极1和对电极2用喷涂法印制在由聚碳酸酯做成的载体3上，它们的中间部分面上涂有一层覆盖电极表面的聚碳酸酯绝缘体4。工作电极1和对电极2是一对可以互变的阴阳极。在工作电极1的下端有反应层5。图1-I表明反应层5为矩形，图1-II表明反应层5为圆形。
图2和图3表明紧贴工作电极1的基体的是反应层5中的2～15层高分子累积膜或二茂铁电子媒介体层6，紧接着是交替吸附的基质包埋酶层8和酶9，纳米颗粒7被同时被包嵌在高分子累积膜或二茂铁电子媒介体层6和基质包埋酶层8中。
图4表明工作电极1和对电极2的形状。图4-I表明工作电极1的反应层5为矩形，图4-II表明工作电极1的反应层5为圆形。
图5表明本发明生物酶电极进行测量时采用的三电极系统，其中，A为附着酶层的直径2.2mm的金工作电极，B为裸露的金对电极，C为Ag/AgCl参比电极。
图6-I得出当扫描电压为600mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为1495.2nA和922.8nA；图6-II得出当扫描电压为400mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为132.1nA和163.5nA。图6中，a.缓冲液、b.0.1mM抗坏血酸、c.0.1mM尿酸和0.1mM抗坏血酸、d.0.1mM尿酸、0.1mM抗坏血酸和1mM二茂铁。
图7-I得出当扫描电压为600mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为37.1nA和100.2nA；图7-II得出当扫描电压为400mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为9.4nA和11.1nA。图7中，a.缓冲液、b.0.1mM抗坏血酸、c.0.1mM尿酸和0.1mM抗坏血酸、d.0.1mM尿酸、0.1mM抗坏血酸和1mM二茂铁。
图8是以二茂铁为电子媒介体层制备的葡萄糖生物传感器测定葡萄糖的电流曲线，箭头分别表示葡萄糖的浓度，箭头1是滴加终浓度为0.3mM的尿酸，箭头2是再滴加终浓度为0.1mM的抗坏血酸。
图9中各条曲线对应的醋酸纤维素溶液浓度是a＝0％、b＝1％、c＝1.5％、d＝2％、e＝2％+1％、f＝2.5％、g＝3％，它们反映有不同浓度醋酸纤维素溶液制备的扩散限制膜修饰的葡萄糖生物传感器的响应电流。
图10中各条曲线对应的醋酸纤维素溶液浓度是a＝0％、b＝1％、c＝1.5％、d＝2％、f＝2.5％、g＝3％。
图11-I、11-II和11-III分别是浓度为0％、2％和2.5％的醋酸纤维素扩散限制膜修饰的葡萄糖生物传感器的循环伏安图。
图12为本发明生物传感器用的生物酶电极中所含直径为35nm的纳米金颗粒的透射电子显微镜扫描图谱。
图13-I表示用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器与未用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器的I-t曲线的对比，其中a是纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器的电流曲线，b未加纳米颗粒修饰的葡萄糖生物传感器电流曲线；图13-II为醋酸纤维素和纳米金颗粒共同修饰的葡萄糖生物传感器的电流曲线。
图14表明在本发明生物酶电极的稳定性实验测试曲线中，第一天的电流值为100％，到190天时电流值为80％。
实施例1
将金箔按图4所示的形状用喷涂法印制在由聚碳酸酯做成的载体上，形成工作电极和对电极的基体。载体的大小为长40mm、宽7mm、厚0.2mm。工作电极和对电极的外边长35mm、内边长32mm、上端1mm，工作电极下端为宽3.5mm、高3mm的矩形或直径为1～3mm的圆形，对电极下端矩形部分宽2mm、高3mm。工作电极和对电极上端与载体的一侧宽边相齐。用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到混有5％纳米金颗粒的浓度为2mg/mL的聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，取出后再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到混有5％纳米金颗粒的浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；再将镀上高分子聚合物累积膜的电极用混有5％纳米金颗粒的壳聚糖包埋酶层基质进行酶的微包埋，方法是利用静电自组装技术进行壳聚糖与酶进行累积，具体步骤是将电极浸入到混有5％纳米金颗粒的浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液包埋酶层基质中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，取出再浸入浓度为2mg/mL的葡萄糖氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层，取出后，用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，由此形成反应层，在距工作电极和对电极上端4mm和下端矩形或圆形以上的中间部分覆盖一层聚碳酸酯绝缘体，至此制成一个生物传感器用的生物酶电极。所用的缓冲液的配方是Na2HPO4 1.15克，KCl 0.2克，NaCl8.0克，KH2PO4 0.2克，定容于1000mL的容量瓶中，pH＝7.4。
实施例2-4
分别用碳、铂、或银形成工作电极和对电极的基体，其它与实施例1相同。
实施例5-10
分别用纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒和纳米铜颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒和纳米铜颗粒和纳米银颗粒，替换纳米金颗粒，其它与实施例1相同。
实施例11
除用混有5％纳米金颗粒的5％的聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行固定酶，形成1层聚乙烯吡咯烷酮基质包埋酶层之外，其它与
实施例1相同。
实施例12
除用混有5％纳米金颗粒的5％的明胶1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶固定酶，形成1层明胶基质包埋酶层之外，其它与实施例1相同。
实施例13
除基质包埋酶层换用伴刀豆球蛋白A 1～12层之外，其它与实施例1相同。
实施例14-15
除将葡萄糖氧化酶换用为乳酸氧化酶、或胆固醇氧化酶之外，其它与实施例1相同。
实施例16
将金箔按图4所示的形状用喷涂法印制在由聚碳酸酯做成的载体上，形成工作电极和对电极的基体。载体的大小为长40mm、宽7mm、厚0.2mm。工作电极和对电极的外边长35mm、内边长32mm、上端1mm，工作电极下端为宽3.5mm、高3mm的矩形或直径为1～2mm的圆，对电极下端矩形部分宽2mm、高3mm。工作电极和对电极上端与载体的一侧宽边相齐。用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到混有含5％纳米金颗粒的浓度为2mg/mL聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，取出后再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到混有5％纳米金颗粒的浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；再将镀上高分子聚合物累积膜的电极用壳聚糖包埋酶层基质进行酶的微包埋，方法是利用静电自组装技术进行壳聚糖与酶进行累积，将电极浸入到浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液包埋酶层基质中20分钟，取出浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入浓度为2mg/mL的葡萄糖氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层，取出后，用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，由此形成反应层，在距工作电极和对电极上端4mm和下端矩形或圆形以上的中间部分覆盖一层聚碳酸酯绝缘体，至此制成一个生物传感器用的生物酶电极。所用的缓冲液的配方是Na2HPO4 1.15克，KCl 0.2克，NaCl 8.0克，KH2PO4 0.2克，定容于1000mL的容量瓶中，pH＝7.4。
实施例17-19
分别用碳、铂、或银形成工作电极和对电极的基体，其它与实施例16相同。
实施例20-25
分别用纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒和纳米铜颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒和纳米铜颗粒和纳米银颗粒，替换纳米金颗粒，其它与实施例16相同。
实施例26
除用5％的聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行固定酶，形成1层聚乙烯吡咯烷酮基质包埋酶层之外，其它与实施例16相同。
实施例27
除用5％的明胶1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶固定酶，形成1层明胶基质包埋酶层之外，其它与实施例16相同。
实施例28
除基质包埋酶层换用伴刀豆球蛋白A 1～12层之外，其它与实施例16相同。
实施例29-30
除将葡萄糖氧化酶换用为乳酸氧化酶、或胆固醇氧化酶之外，其它与实施例16相同。
实施例31
将金箔按图4所示的形状用喷涂法印制在由聚碳酸酯做成的载体上，形成工作电极和对电极的基体。载体的大小为长40mm、宽7mm、厚0.2mm。工作电极和对电极的外边长35mm、内边长32mm、上端1mm，工作电极下端为宽3.5mm、高3mm的矩形或直径为1～2mm的圆，对电极下端矩形部分宽2mm、高3mm。工作电极和对电极上端与载体的一侧宽边相齐。用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到浓度为2mg/mL的聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；再将镀上高分子聚合物累积膜的电极用混有5％纳米金颗粒的壳聚糖包埋酶层基质进行酶的微包埋，方法是利用静电自组装技术进行壳聚糖与酶进行累积，将电极浸入到混有5％纳米金颗粒的浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液包埋酶层基质中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入浓度为2mg/mL的葡萄糖氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层，取出后，用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，由此形成反应层，在距工作电极和对电极上端4mm和下端矩形或圆形以上的中间部分覆盖一层聚碳酸酯绝缘体，至此制成一个生物传感器用的生物酶电极。所用的缓冲液的配方是Na2HPO4 1.15克，KCl 0.2克，NaCl 8.0克，KH2PO4 0.2克，定容于1000mL的容量瓶中，pH＝7.4。
实施例32-34
分别用碳、铂、或银形成工作电极和对电极的基体，其它与实施例31相同。
实施例35-40
分别用纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒和纳米铜颗粒、混合的纳米金颗粒和纳米二氧化硅颗粒和纳米铜颗粒和纳米银颗粒，替换纳米金颗粒，其它与实施例31相同。
实施例41
除用混有5％纳米金颗粒的5％的聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行固定酶，形成1层聚乙烯吡咯烷酮基质包埋酶层之外，其它与
实施例31相同
实施例42
除用混有5％纳米金颗粒的5％的明胶1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶固定酶，形成1层明胶基质包埋酶层之外，其它与实施例31相同。
实施例43
除基质包埋酶层换用伴刀豆球蛋白A 1～12层之外，其它与实施例1相同。
实施例44-45
除将葡萄糖氧化酶换用为乳酸氧化酶、或胆固醇氧化酶之外，其它与实施例31相同。
实施例46
抗干扰层覆盖二茂铁电子媒介体层的葡萄糖生物传感器的抗干扰能力对比试验：
依次用65％HNO3∶H2O＝1∶1的HNO3和丙酮擦拭电极下端裸露部分表面，然后用去离水清洗，自然晾干，然后在电极表面加1μL浓度为1％的二茂铁的酒精溶液形成二茂铁电子媒介体层，自然晾干后再加5μL含5％纳米金颗粒和葡萄糖氧化酶2mg/mL的5％明胶溶液，用2％戊二醛交联3分钟，用去离子水冲洗，晾干，后再滴加2μL含2％醋酸纤维素的丙酮溶液，自然晾干，形成扩散限制膜，制成生物传感器用的生物酶电极，隔夜进行测量。测量所用装置、条件和结果如下：装置是在283型电化学工作站上进行测量，采用的三电极系统如图5所示，其中，A为附着酶层的直径2.2mm的金工作电极，B为裸露的金对电极，C为Ag/AgCl参比电极；测量条件是磷酸缓冲液的pH＝6.8，扫描速率为50mV/s，电压为O.25V，实验温度25℃；结果如图6所示，图6是不同扫描电压条件下未修饰的电极下端部分覆盖有二茂铁电子媒介体的葡萄糖生物传感器在缓冲液、尿酸、抗坏血酸、二茂铁溶液中的循环伏安图，图中a.缓冲液、b.0.1mM抗坏血酸、c.0.1mM尿酸和0.1mM抗坏血酸、d.0.1mM尿酸、0.1mM抗坏血酸和1mM二茂铁。从图6-I得出当扫描电压为600mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为1495.2nA和922.8nA；从图6-II得出当扫描电压为400mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为132.1nA和163.5nA。通过降低工作电极扫描电压200mV，则电流分别降低91.2％和82.3％，进一步证实通过降低工作电压可以有效降低尿酸、抗坏血酸的干扰。从图6得出二茂铁在不同的扫描电压下，氧化峰与还原峰电位差小于60mV，呈现一对可逆的氧化还原峰，其氧化峰电位为250mV。可见利用二茂铁电子媒介体层作为抗干扰层的葡萄糖生物传感器具有抗干扰的能力。图7是不同扫描电压条件下用醋酸纤维素修饰的、电极下端部分覆盖有二茂铁电子媒介体层的葡萄糖生物传感器分别在缓冲液、尿酸、抗坏血酸及二茂铁溶液中的循环伏安图，图中a.缓冲液、b.0.1mM抗坏血酸、c.0.1mM尿酸和0.1mM抗坏血酸。从图7-I得出当扫描电压为600mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为37.1nA和100.2nA。从图7-II得出当扫描电压为400mV时，尿酸和抗坏血酸产生的电流分别为9.4nA和11.1nA。分别与图6-I比较得出，醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器当扫描电压为600mV时，尿酸电流降低97.5％，抗坏血酸电流降低89.2％，当扫描电压为400mV时，尿酸电流降低99.4％，抗坏血酸电流降低98.8％。因此得出醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器抗干扰能力强。醋酸纤维素表面带有大量的负电荷，对溶液中带负电荷的尿酸和抗坏血酸有很强的排斥作用，使它们不能到达电极表面，因而不能产生干扰电流。图8是以二茂铁为电子媒介体层制备的葡萄糖生物传感器测定葡萄糖的电流曲线，箭头分别表示表示葡萄糖的浓度，箭头1是滴加终浓度为0.3mM的尿酸，箭头2是再滴加终浓度为0.1mM的抗坏血酸。从图8得出葡萄糖的检测上限达到30mM，达到95％最大影响电流的时间小于10秒，其灵敏度为32.3nA/mM，尿酸和抗坏血酸没有产生明显的电流，因此以二茂铁为电子媒介体层的葡萄糖生物传感器抗干扰能力强，电化学特性良好。由此可见，以二茂铁为电子媒介体层、以明胶为载体、利用戊二醛交联制备的醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器抗干扰性能力强，检测上限达到30mM，达到95％最大影响电流的时间小于10秒，其灵敏度32.3nA/mM。因此用本发明方法制备的以二茂铁电子媒介体层为抗干扰层的葡萄糖生物传感器可直接应用于临床检测，能够满足临床应用的要求。
实施例47
不同浓度醋酸纤维素扩散限制膜修饰的葡萄糖生物传感器的性能对比试验。
依次用65％HNO3∶H2O＝1∶1的HNO3和丙酮擦拭裸电极下端部分表面，然后用去离水清洗，自然晾干，然后在电极表面加1μL浓度为1％的二茂铁的酒精溶液形成二茂铁电子媒介体层，自然晾干后再加5μL含5％纳米银颗粒、纳米铜颗粒、或纳米银和铜颗粒及葡萄糖氧化酶2mg/mL的5％明胶溶液，用2％戊二醛交联3分钟，用去离子水冲洗，晾干，后再滴加1μL含1～3％醋酸纤维素的丙酮溶液，自然晾干，形成扩散限制膜，制成生物传感器用的生物酶电极，隔夜进行测量。测量所用装置、条件和结果如下：装置是在283型电化学工作站上进行测量，采用的三电极系统如图5所示，其中，A为附着酶层的直径2.2mm的金工作电极，B为裸露的金对电极，C为Ag/AgCl参比电极。测量条件是磷酸缓冲液的pH＝6.8，扫描速率为50mV/s，电压为0.25V，实验温度25℃。结果如图9所示，图9是不同浓度的醋酸纤维素扩散限制膜修饰葡萄糖生物传感器的I-t曲线，其中各条曲线对应的醋酸纤维素溶液浓度是a＝0％、b＝1％、c＝1.5％、d＝2％、e＝2％+1％、f＝2.5％、g＝3％，它们反映有不同浓度醋酸纤维素溶液制备的扩散限制膜修饰的葡萄糖生物传感器的响应电流，可以看到醋酸纤维素扩散限制膜对葡萄糖的扩散起到了一定的阻挡作用。当醋酸纤维素浓度低时形成的膜薄的阻挡作用弱，因此葡萄糖浓度低时就达到了最大响应电流如图9-I中的a，b，c曲线所示。当醋酸纤维素浓度过高时形成的膜厚，扩散限制作用强，只有高浓度的葡萄糖才能扩散透过，如图9-II中的g曲线所示。只有醋酸纤维素浓度适当制备的醋酸纤维素扩散限制膜扩散限制作用才适中，不同浓度的葡萄糖都可以按比例扩散透过，如图9-II中的d曲线和图9-III中的f曲线所示。图9-II中的e曲线对应的醋酸纤维素浓度为2％+1％，表示先在葡萄糖氧化酶修饰的电极表面滴1μL 2％的醋酸纤维素，自然风干后再滴1μL 1％的醋酸纤维素，它不符合上述结果，这可能是因为两层醋酸纤维素扩散限制膜不能很好的结合，尚需进一步研究。从图9还可以得出葡萄糖生物传感器的响应时间分别为a＝5秒，b＝7秒，c＝10秒，d＝10秒，e＝12秒，f＝15秒，g＝20秒，说明醋酸纤维素扩散限制膜对响应时间有一定影响，但只有醋酸纤维素浓度达到2.5％时影响才较大，低浓度时影响较小。图10-I和图10-II分别是不同醋酸纤维素浓度制备的扩散限制膜修饰葡萄糖生物传感器的工作曲线。图10中各条曲线对应的醋酸纤维素溶液浓度是a＝0％、b＝1％、c＝1.5％、d＝2％、f＝2.5％、g＝3％，从图10中的曲线a、b、c、d、f、g可以得出不同醋酸纤维素浓度制备的扩散限制膜修饰的葡萄糖生物传感器的检测范围分别为0～4mM，0～4mM，0～13mM，0～30mM，0～30mM和6～30mM。随着醋酸纤维素浓度的提高，醋酸纤维素扩散限制膜修饰葡萄糖生物传感器的检测范围增加，但醋酸纤维素增加到一定浓度后，扩散限制膜修饰葡萄糖传感器的检测下限开始提高。通过比较得出浓度为2％和2.5％的醋酸纤维素扩散限制膜比较理想，能够满足临床检测需要，灵敏度分别为32.3nA/mM和13.7nA/mM，相关系数分别为0.99733和0.99781。实验结果表明只有在合适的醋酸纤维素浓度范围内，才能够有效地发挥醋酸纤维素的扩散限制作用，有效地拓宽葡萄糖生物传感器的检测范围。图11-I、11-II和11-III分别是浓度为0％、2％和2.5％的醋酸纤维素扩散限制膜修饰的葡萄糖生物传感器的循环伏安图。结果表明，未用醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器在葡萄糖浓度大于8mM时，氧化峰峰值相互重叠不再按比例上升，表明此时反应先表现为混和级反应，然后逐渐变为0级反应，而用浓度为2％和2.5％的醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器的检测范围在葡萄糖0mM～30mM范围内，氧化峰峰值是按比例上升的，说明反应一直是1级反应。总之，合适的醋酸纤维素浓度范围内，随着葡萄糖浓度的增加醋酸纤维素扩散限制膜的扩散控制作用加强，即葡萄糖扩散透过阻力随之增加，检测范围增加，米氏常数增加但响应电流减小。未用醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器的检测范围0-4mM，而用醋酸纤维素修饰的葡萄糖生物传感器的检测范围可以达到0-30mM，这说明醋酸纤维素扩散限制膜能很好的调控葡萄糖生物传感器的性能。
实施例48
选用已知技术(Stober W.Controlled growth of monodisperse silica in the microsize rang.Journal of colloid and interface science，1968，26：62-69；张志梅等.纳米级铜粉的制备.精细化工.2002，17(2)：69-71；段春英等，银纳米颗粒的制备及表征，化学研究，2003，14(3)：18-21；唐芳琼等，亲水金和憎水二氧化硅纳米颗粒对葡萄糖生物传感器响应灵敏度的增强作用，高等学校化学学报，2001，21(1)：91-94)制备纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒或纳米铜颗粒，测定纳米颗粒增强葡萄糖生物传感器电流的效果。图12为本发明生物传感器用的生物酶电极中所含直径为35nm的纳米金颗粒的透射电子显微镜扫描图谱。图13-I表示用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器与未用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器的I-t曲线的对比和图13--II为纳米金颗粒和醋酸纤维素共同修饰的葡萄糖生物传感器的I-t曲线。图13-I中a是用纳米金颗粒修饰的葡萄糖生物传感器的电流曲线，b是未加纳米金颗粒的葡萄糖生物传感器电流曲线。两者对照可以得出，纳米金颗粒修饰的葡萄糖传感器灵敏度增高，响应电流大；图13-II是纳米金颗粒和醋酸纤维素共同修饰的葡萄糖的电流曲线，可见由此方法制备的酶电极可以满足临床需要。
上述实施例中的％浓度均为重量/体积百分比浓度。

Claims (5)

1.一种生物传感器用的生物酶电极，是由工作电极、对电极、载体、覆盖电极表面的绝缘体和反应层构成，其特征在于：反应层是由在工作电极下端覆盖在电极基体上的抗干扰层、纳米颗粒、基质包埋酶层、氧化酶和扩散限制膜组成，抗干扰层是利用阳离子高分子聚合物聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种和阴离子高分子聚合物聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中的至少一种共同形成的2～15层聚电解质复合膜或者是二茂铁电子媒介体层；纳米颗粒选用纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒中的一种或几种，其颗粒大小范围在8～50nm，纳米颗粒被包嵌在抗干扰层中、或被包嵌在基质包埋酶层中、或同时被包嵌在抗干扰层和基质包埋酶层中；基质包埋酶层选用壳聚糖1～12层、或聚乙烯吡咯烷酮1层、或明胶1层、或伴刀豆球蛋白A1～12层；氧化酶选用葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶或胆固醇氧化酶；基质包埋酶层和氧化酶是交替吸附的，氧化酶被包埋在基质包埋酶层中，当基质包埋酶层选用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A并多层包埋时，是一层挨一层的；扩散限制膜是用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液制成的薄膜。
2.根据权利要求1所述的生物传感器用的生物酶电极，其特征在于：工作电极下端的反应层是矩形或圆形的。
3.一种权利要求1所述的生物传感器用的生物酶电极的制备方法，其特征在于：在由有机绝缘材料做成的电极基片即载体上，将导电材料用喷涂法印制形成工作电极和对电极的基体，它们的中间部分表面上涂覆一层聚碳酸酯绝缘体，在工作电极基体下端部分涂覆一层综合应用高分子聚合物累积膜技术或二茂铁覆盖技术、包埋酶技术、纳米技术和扩散限制膜技术形成的反应层，即制成生物酶电极，其反应层的具体制备方法选用以下四种方法中的任意一种：
a.第一步，用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液5mL中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；第二步，将镀上高分子聚合物累积膜的电极用混有5％纳米颗粒的包埋酶层基质进行酶的微包埋，包埋酶层基质选用明胶或聚乙烯吡咯烷酮进行酶的微包埋的方法是，用混有5％纳米颗粒的浓度5％的明胶或聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶或聚乙烯吡咯烷酮固定酶，包埋酶层基质用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A进行酶的微包埋的方法是，利用静电自组装技术，用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A分别与酶进行累积，其操作步骤是将电极浸入到混有5％纳米颗粒的浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液或伴刀豆球蛋白A溶液包埋酶层基质中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入浓度为2mg/mL的氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层；第三步，取出后，用含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，
b.第一步，同a；第二步，将镀上高分子聚合物累积膜的电极用聚乙烯吡咯烷酮、明胶、壳聚糖、或伴刀豆球蛋白A进行酶的微包埋，包埋酶层基质选用明胶或聚乙烯吡咯烷酮进行酶的微包埋的方法是，用浓度5％的明胶或聚乙烯吡咯烷酮1mL溶解2mg氧化酶，得到2mg/mL的酶溶液，再在电极表面进行明胶或聚乙烯吡咯烷酮固定酶，包埋酶层基质用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A进行酶的微包埋的方法是，利用静电自组装技术，用壳聚糖或伴刀豆球蛋白A分别与酶进行累积，其操作步骤是将电极浸入到浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液或伴刀豆球蛋白A溶液包埋酶层基质中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入浓度为2mg/mL的氧化酶中20分钟，1次或多次进行这个过程直至交替镀上1～12层包埋酶层；第三步，同a，
c.第一步，用铝粉打磨工作电极下端部分，用蒸馏水冲洗，使电极表面洁净如镜面，浸入到浓度为2mg/mL的含聚烯丙胺、聚乙烯亚胺、聚二烯丙基二甲基氯化铵中的至少一种的阳离子高分子聚合物溶液中20分钟，取出再浸入缓冲液中5分钟，再取出浸入到浓度为2mg/mL的聚磺化乙烯、聚磺化苯乙烯中至少一种的阴离子高分子聚合物溶液中20分钟，重复这个过程直至交替镀上2～15层高分子聚合物累积膜；第二步，同a；第三步，同a，
d.第一步，依次用65％HNO3∶H2O＝1∶1的HNO3和丙酮擦拭工作电极下端裸露部分表面，然后用去离水清洗，自然晾干；第二步，再在工作电极下端部分表面加1μL浓度为1％的二茂铁的酒精溶液形成二茂铁电子媒介体层，自然晾干后再加5μL含5％纳米颗粒和2mg/mL氧化酶的5％明胶溶液，用2％戊二醛交联3分钟，用去离子水冲洗，晾干或在冰箱中6℃下保存；第三步，再在工作电极下端部分表面用滴加1μL～2μL含1％～3％醋酸纤维素的丙酮溶液涂覆，自然晾干，形成扩散限制膜，
上述方法中所用溶液的百分比浓度均为重量/体积比浓度，所用的纳米颗粒是纳米金颗粒、纳米银颗粒、纳米二氧化硅颗粒、纳米铜颗粒中的一种或几种，其颗粒大小范围在8～50nm，所用的氧化酶是葡萄糖氧化酶、或乳酸氧化酶、或胆固醇氧化酶，所用的缓冲液的配方是Na2HPO41.15克，KCl 0.2克，NaCl 8.0克，KH2PO40.2克，定容于1000mL的容量瓶中，pH＝7.4，用做工作电极和对电极的基体的导电材料是金、碳、铂、或银，用做电极基片的有机绝缘材料是聚碳酸酯。
4.根据权利要求3所述的生物传感器用的生物酶电极的制备方法，其特征在于：用包埋酶层基质进行酶的微包埋处理时，所镀上的包埋酶层是聚乙烯吡咯烷酮1层、明胶1层、伴刀豆球蛋白A 1～12层或壳聚糖1～12层。
5.根据权利要求3所述的生物传感器用的生物酶电极的制备方法，其特征在于：工作电极下端部分表面涂覆用的丙酮溶液为含2％～2.5％醋酸纤维素的丙酮溶液。
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