CN108845014B - 一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物lb膜修饰电极及其构建方法和应用 - Google Patents
一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物lb膜修饰电极及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极及其构建方法和应用。该方法首先通过Langmuir技术在空气/水界面利用两亲胆固醇‑壳聚糖碳酸酯与组胺之间功能基团的相互作用力重构组合形成胆固醇‑壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份单分子膜；接着采用LB技术将混合组份单分子膜转移到ITO玻璃电极上；随后利用分子印迹法把组胺从混合组份LB膜中洗脱制成选择性识别组胺的分子印迹LB膜电极；最后结合电化学方法测量到分子印迹LB膜电极对组胺的电化学响应性高，组胺线性检测范围宽，检测限低，选择性、重复性和稳定性良好，并实现快速、灵敏地检测啤酒和葡萄酒中痕量的组胺。该方法为表面分子印迹技术开拓一种途径。
Description
技术领域
本发明属于功能高分子超薄膜领域，具体涉及一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极及其构建方法和应用。
背景技术
组胺(HA)，2-(4-咪唑)-乙胺，在人体内由组氨酸经组氨酸脱羧酶(HDC)的催化脱羧而产生，是人体组织细胞中分布广、作用强的生物活性物质之一。组胺通过G蛋白偶联受体的介导参与体内多种生理功能如心血管循环等的调节和疾病如肿瘤等的病理过程。借助现代基因工程技术，人们已经可以从基因水平探讨组胺受体的结构以及与组胺的相互作用。迄今为止，生物体内组胺含量的测试方法有很多种，如血浆、组织检测中广泛使用有荧光分析法、高效液相色谱法等。但其自身缺陷导致其难以达到人们对于测试分析过程简洁高效的要求，如荧光分析法测试前需对样品进行复杂的提取过程；高效液相色谱的测试样品耗时长、用量大。因此，能直接测试且迅速、精准得出结果的传感器的研发是极必要的。
Langmuir膜技术是在空气/液界面上制备有序而密集的两亲单分子层（即Langmuir 膜）技术。形成分子级Langmuir膜的厚度均匀并可精确控制、薄膜中的分子排列高度有序。Britt研究小组采用Langmuir单层表面印迹法，用阳离子和非离子脂质体在空气与水的界面处形成Langmuir单层。脂质体端基会与加入的蛋白质分子发生结构重组，使其部分重组端基结构能在形状和电荷上与蛋白质分子互补，从而实现蛋白质印记。LB法制备的分子印迹膜，具有分布均匀，操作简便，膜厚可控等优点。这种方法具有质量传递好和能与传感器平台相结合的优势。迄今采用非脂质体的两亲化合物进行印迹的相关工作还未见报道。Langmuir-Blodgett (LB) 膜技术则是将上述的空气／液界面上的单分子膜转移到固体表面并实现连续转移组装的技术。在薄膜技术中，为了得到有组织的分子结构和精确的厚度，使用LB技术制备单分子层组装体具有相当重要的意义，LB膜被用于材料科学和纳米技术等研究领域。
壳聚糖是天然高分子甲壳质经脱乙酰作用的衍生物，其特点主要是分子链上C2及C3和C6位含有大量的反应性氨基和羟基基团，因此可以通过结构改性引入具有共价键结合、静电相互作用和配位作用的功能性基团。文献报道主要通过壳聚糖分子链C2位引入疏水链，本发明在C6位引入长碳链，C2位保留氨基亲水基团链端。已经通过引入长链疏水性基团制得两亲壳聚糖衍生物，从而制备壳聚糖衍生物的Langmuir单分子层和识别胆固醇的分子印迹聚合物（Tong Y, et al. Synthesis of O,O′-dipalmitoyl chitosan and itsamphiphilic properties and capability of cholesterol absorption. Carbohydr.Polym., 2005, 60(2): 229-233 ）。研究表明两亲壳聚糖衍生物可以作为吸附识别全氟辛烷磺酸盐的Langmuir 膜的原材料（张新丽. 在空气-水界面上壳聚糖衍生物的两亲性及其与组胺相互作用的研究. 硕士学位论文, 2016, 40-50）。
本发明中两亲分子印迹膜材料基于在壳聚糖分子链羟基上引入胆固醇疏水链端，保留壳聚糖分子链上氨基亲水端形成的两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯。本发明的印迹分子组胺，组胺分子链具有氨基和咪唑基功能基团。胆固醇-壳聚糖碳酸酯与组胺之间可借助于氢键、静电作用、范德华力等多种形式的相互作用力，从而实现壳聚糖衍生物与组胺的相互作用。
本发明首先通过Langmuir 技术，利用具有两亲及分子链上反应性氨基的胆固醇-壳聚糖碳酸酯可以在空气/水界面形成Langmuir膜的特性，在Langmuir槽表面两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯经历与水相中组胺发生相互作用重构组合形成胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜；接着采用LB技术将混合组份单分子膜转移到铟锡氧化物(ITO)玻璃电极上；随后利用分子印迹技术，作为目标分子的组胺从混合组份LB膜中洗脱制成与组胺分子的结构和尺寸相匹配空穴的选择性识别组胺的分子印迹LB膜电极，从而可实现两亲壳聚糖衍生物与组胺特异性的相互作用。最后结合电化学方法，研究识别组胺的分子印迹LB膜电极的电化学响应和识别性能，并将本发明的修饰电极用于啤酒和葡萄酒实际样品的检测，实现快速、灵敏地检测啤酒和葡萄酒中痕量的组胺。ITO 电极具有高导电性、宽电化学工作窗、稳定的电化学物理特性而被选为电极基底。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极及其构建方法和应用。该方法利用胆固醇-壳聚糖碳酸酯分子链上具有大量反应性氨基，组胺分子具有氨基和咪唑基功能基团，二者可以通过氢键、静电作用和范德华力多种形式的相互作用力，实现壳聚糖衍生物与组胺的相互作用。再者利用胆固醇-壳聚糖碳酸酯的两亲性和组胺的水溶性，在Langmuir槽空气/水界面形成混合组分单分子膜，进一步采用LB技术将混合组份单分子膜转移到ITO玻璃电极上，并利用分子印迹技术，把组胺从混合组份LB膜中洗脱制成与组胺分子的结构和尺寸相匹配空穴的选择性识别组胺的分子印迹LB膜电极，从而可实现两亲壳聚糖衍生物与组胺特异性的相互作用。结合电化学方法，利用分子印迹LB膜电极对组胺的吸附和选择性识别过程中的电化学响应性探究吸附能力和选择性识别能力，并将本发明的修饰电极用于啤酒和葡萄酒实际样品的检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的构建方法，包括以下步骤：（1）两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯和组胺溶液的配制
将胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶解在氯仿中，配制一系列不同浓度的胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶液，定容在容量瓶中，备用；将组胺溶解于超纯水中配制浓度1.0 mg/mL的组胺溶液，于低温条件下保存，备用；
（2）胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成
按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥
18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液（由步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成），混合均匀后用微量进样器移取步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯的氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定。每组实验至少重复三次；
（3）胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜的转移
按照Langmuir槽操作方法要求，将预处理ITO电极放入Langmuir槽中，按照步骤（2）将组胺和胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶液分别滴加进亚相中，待形成胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合单层膜后，利用Langmuir-Blodgett（LB）技术，以5 mm/s的速度将混合组份单分子膜提拉完成膜的转移，使膜沉积在ITO基底上，形成胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份LB膜修饰的ITO玻璃电极；
（4）分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的制备
用一定量超纯水洗涤由步骤（3）形成的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合LB膜修饰的ITO玻璃电极表面一定时间，除去组胺模板分子得到识别组胺的分子印迹胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰电极。
（5）分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极对组胺识别的实验
利用电化学三电极体系，循环伏安法电位范围-0.4-0.8 V，扫描速度 50 mV/s；以乙醇和0.2 M KCl和1mM K3Fe(CN)6 的水混合溶液作为氧化还原探针的测试溶液体系；采用循环伏安法探究分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极（简称分子印迹LB膜）对组胺的吸附性能，分别测试分子印迹LB膜修饰电极在组胺（3 ml 1µM）存在或不存时的电化学响应性，结果表明在优化吸附条件下，分子印迹LB膜能识别组胺分子，而相同方法制得的非分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极（简称非分子印迹LB膜，没有加入模板分子组胺进行印迹的过程）对组胺几乎没有响应，即在检测组胺目标分子方面具有较高的灵敏度。线性扫描伏安曲线的峰电流响应(∆i)与组胺浓度在0.01-1.5 μM范围内呈线性关系，检出限(S/N=3) 0.09 μM，同一根分子印迹LB膜修饰电极对组胺的响应峰电流相对标准偏差为 2.4%(n=6) 。
（6）非分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的构建及其在组胺溶液中的电化学响应性
①胆固醇-壳聚糖碳酸酯单层膜的形成：按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水作为亚相，用微量进样器移取100 μL步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯的氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩滑障A和B，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯Langmuir膜，记录单分子膜表面压-平均单分子膜面积等温曲线和Langmuir膜的塌陷压。每条等温曲线至少重复三次以确保重现性；②胆固醇-壳聚糖碳酸酯Langmuir膜的转移：按照Langmuir槽操作方法要求，将预处理ITO电极放入Langmuir槽中，按照步骤①将胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶液滴加亚相中，待滑障A和B压缩到胆固醇-壳聚糖碳酸酯单层膜在固态等温曲线段约一半对应表面压时停止压缩。随后利用Langmuir-Blodgett（LB）技术，以5 mm/s的速度将单分子膜提拉完成膜的转移，使膜沉积在ITO基底上，形成4层胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰的ITO玻璃电极；③非分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的制作：用一定量超纯水淋洗由步骤②形成的胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰的ITO玻璃电极表面一定时间，除去组胺模板分子得到非识别组胺的分子印迹胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰电极（标记为non-ITO A）；④non-ITO A在组胺溶液中的电化学响应性：采用与步骤（5）相同的电化学三电极体系和氧化还原探针测试溶液体系，采用循环伏安法测试non-ITO A在组胺存在（组胺浓度3 ml 1 µM）或不存时的电化学响应性，结果显示在含或不含组胺的情况下循环伏安法曲线几乎一致，意味着non-ITO A对组胺几乎没有产生电化学响应；
（7）分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的识别选择性实验
将组氨酸和多巴胺作为分子印迹LB膜检测模板分子过程中的结构类似物。分别配置 1 μM 组胺溶液、含 5 μM 组氨酸和 1 μM 组胺溶液、含 5 μM 多巴胺和 1 μM 组胺溶液、含 5 μM 的 组氨酸、多巴胺和 1 μM 组胺溶液共5组溶液，将同一根分子印迹LB膜修饰电极分别识别吸附上述溶液，8-16 min 后测其电化学响应信号发现峰值电流差别极小，原因在于该电极表面组胺印迹留下的空穴只与组胺结构匹配，组氨酸和多巴胺不能与之匹配，因此 组氨酸和多巴胺对分子印迹LB膜修饰电极识别组胺无干扰。
在本发明方法中，步骤（2）和（3）中所述的胆固醇-壳聚糖碳酸酯加入量为25-300μL（浓度为1.0 mg/mL）。
在本发明方法中，步骤（3）中所述的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份LB膜可为1-30层，步骤（6）中所述的胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜可为1-30层。
在本发明方法中，步骤（4）中所述的用于洗涤胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合LB膜修饰的ITO玻璃电极表面的方式包括浸泡洗涤和淋洗，浸泡洗涤水量5-100 mL，洗涤时间8-20 min；淋洗水量5-20 mL，洗涤时间30-100 s。
在本发明方法中，步骤（5）中所述的分子印迹LB膜修饰电极吸附组胺的吸附时间在2-20 min；步骤（5）中所述的线性扫描伏安曲线测定峰电流响应(∆i)与组胺浓度关系，考察组胺浓度在0.01-500 μM。
在本发明方法中，步骤（7）中所述的结构类似物组氨酸和多巴胺，它们的量在0.5-35 μM。
本发明的上述的构建方法制得的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极。
在本发明中，本发明的上述的构建方法制得的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极作为检测应用，具体步骤为：通过在ITO玻璃导电电极表面引入分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜，赋予修饰电极对组胺的选择性识别，用于标准加样法对啤酒和葡萄酒实际样品中组胺的检测，啤酒和葡萄酒样本的平均回收率分别为 98.3-105.9%，99.8-105.2%，电化学响应峰电流相对标准偏差小于4.5% (n=3)。
本发明对应的一种非分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极由胆固醇-壳聚糖碳酸酯单组分LB膜修饰的电极经过洗涤除去组胺步骤后而得到。
本发明提供的分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极及其构建方法和应用，其优点在于：
（1）本发明中作为分子印迹超薄膜基料的胆固醇-壳聚糖碳酸酯，由天然高分子甲壳素经脱乙酰后与胆固醇以共价形式相结合形成，具备生物相容性和生物可降解性、生物活性、低免疫原性等优点；
（2）本发明以胆固醇-壳聚糖碳酸酯与组胺混合组分单分子层LB多层膜作为分子印迹超薄膜前体，由于LB膜厚度薄、厚度均匀及膜厚可控，为此制备分子印迹膜过程模板分子洗脱更快更完全，模板分子洗脱效率直接影响分子印迹膜的识别、分离能力；由于分子印迹膜识别过程，试样中目标分子能快速地进入分子印迹膜的识别位点，分子印迹膜识别目标分子过程也更快速，甚至可以在几分钟内达到吸附平衡。总之，由于LB膜厚的特性，分子印迹薄膜具有较高的识别性，电化学响应速度快，可以通过电化学方法快速检测到印迹信号；
（3）本发明利用LB膜具有膜厚度薄、膜厚可控、均匀和致密等特点，分子印迹技术具有预定性、识别性和实用性的特点，以及电化学方法具有快速、方便检测等优点，结合这三种方法在玻璃电极表面组装组胺分子印迹LB膜。
（4）本发明采用的分子印迹两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB薄膜印迹方法，是目前一种新颖、精巧的表面分子印迹技术。这种新颖的LB薄膜表面分子印迹法不仅为环境监测提供有效方法，并为研究其它高分子材料表面功能化的分子印迹聚合物提供理论依据。
本发明用于分子印迹聚合物超薄膜敏感元件的结构设计、修饰的导电电极构建和目标分子的特异性检测。
附图说明
图1 为本发明所制备的一种两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯单组分(a)及其与组胺混合组分(b)单分子膜的表面压 (Surface pressure) -平均单分子膜面积 (Area) 等温曲线。
图2为本发明所制备的一种两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组分单分子膜的转移曲线。
图3 为本发明所构建的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极(I) 和非分子印迹LB膜修饰电极(II)的电化学响应性的对比图。
图4为本发明所构建的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的选择性图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述
本发明利用两亲聚合物与模板分子组胺的结构特点和相互作用机理，在Langmuir槽空气/亚相界面形成两亲壳聚糖衍生物/组胺混合组分单分子层；借助LB膜技术转移混合组分单分子层至ITO表面，进而构建LB膜和分子印迹LB膜。与传统的分子印迹材料比较，本发明构建的分子印迹聚合物LB膜是一种新型的分子印迹材料，具有良好的生物相容性、可生物降解性、低毒性和细胞相容性等特性，可模拟细胞膜和作为药物输送载体；与传统的分子印迹方法比较，本发明采用的分子印迹方法是一种新颖的精巧表面印迹技术，既克服常规分子印迹方法中被印迹的模板分子从块体分子印迹材料中洗脱不完全，又加快分子印迹超薄膜材料通过印迹位点与目标分子再结合。分子印迹超薄膜表面印迹技术必将成为分子印迹材料研制的前沿领域。
实施例1
两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯的合成。步骤如下：首先在反应容器中，取5.49 g胆固醇氯甲酸酯溶解在N, N-二甲基甲酰胺中，在2.4 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在和搅拌下反应5 h （50℃）得到活化的胆固醇氯甲酸酯溶液；随后在另一个容器中加入1.0 g壳聚糖和甲磺酸，搅拌至壳聚糖完全溶解，在氮气保护下，逐滴加入上述步骤得到的活化胆固醇氯甲酸酯溶液，在50℃下反应60 h。产物混合体系经沉淀、离心、洗涤和冷冻干燥得到胆固醇壳聚糖碳酸酯固体。经红外光谱和核磁碳谱证实产物的化学结构。
实施例2
（1）两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯和组胺溶液的配制
将实施例1制得的胆固醇壳聚糖碳酸酯固体配制成胆固醇-壳聚糖碳酸酯1.00mg/mL的氯仿溶液，备用；将组胺溶解于超纯水中配制浓度1.0 mg/mL的组胺溶液，于低温条件下保存，备用；
（2）胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成
按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥
18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取25μL实施例2的步骤（1）配制胆固醇-壳聚糖碳酸酯的氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将Langmuir槽的压力传感器归零，固定滑障速度为50cm2/min，开始压缩Langmuir槽中的A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。该实施例2中的步骤（2）的操作至少重复三次以确保重现性。
实施例3
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成。按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取50 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。该实施例3的操作至少重复三次以确保重现性。
实施例4
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成。按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取75 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。该实施例4的操作至少重复三次以确保重现性。
实施例5
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成。按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取100 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线（如图1中b所示）和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。同时为了与混合组分Langmuir 膜比较，制作胆固醇-壳聚糖碳酸酯单组份Langmuir膜并记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线（如图1中a所示）。每条等温曲线至少重复三次以确保重现性。
实施例6
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成。按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取150 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。该实施例6的操作至少重复三次以确保重现性。
实施例7
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成。按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取200 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。该实施例7的操作至少重复三次以确保重现性。
实施例8
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成。按照Langmuir槽操作方法的要求完成前期工作后，往槽中加入超纯水（电阻率≥18.25 Ω·m）作为亚相，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取300 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层），记录单分子层的表面压-平均单分子层面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压以确定单分子层转移的表面压。该实施例8的操作至少重复三次以确保重现性。
实施例9
胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜的转移。按照Langmuir槽操作方法要求，将经过丙酮、乙醇、0.1 M氢氧化钠与异丙醇混合物（体积比1.5:1）和去离子水分别超声30 min 并干燥预处理的ITO玻璃电极 [即铟锡氧化物(ITO)玻璃电极，为市售产品]放入Langmuir槽中，用微量进样器滴加100 μL 浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液 [由实施例2的步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成]，混合均匀后用微量进样器移取100 μL实施例2的步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上。待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩A和B滑障，当形成的序密集排列的胆固醇壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜（单分子层）的表面压为41.00 mN/m时，利用Langmuir-Blodgett（LB）技术，以5 mm/s的速度将混合组份单分子膜提拉完成膜的转移，使4层膜交替沉积在ITO基底上，形成胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份LB膜修饰的ITO玻璃电极（膜转移曲线见图2），同等条件下，构建50片修饰电极。同时为了与混合组分Langmuir 膜修饰的ITO玻璃电极比较，制作胆固醇-壳聚糖碳酸酯单组份LB膜修饰的ITO玻璃电极。
实施例10
分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的制备。用10 mL超纯水淋洗由实施例8构建的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合LB膜修饰的ITO玻璃电极表面1 min，除去组胺模板分子得到识别组胺的分子印迹胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰电极（标记为ITO A），同等条件下，分别构建10片分子印迹LB膜修饰电极。同时在相同条件下，用10 mL超纯水淋洗由实施例8制作的胆固醇-壳聚糖碳酸酯单组份LB膜修饰ITO玻璃电极表面1 min，制备得到非分子印迹LB膜修饰电极（标记为non-ITO A）。
实施例11
分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的制备。用50 mL超纯水浸洗由实施例8构建的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合LB膜修饰的ITO玻璃电极表面10 min，除去组胺模板分子得到识别组胺的分子印迹胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰电极（标记为ITO B）。同等条件下，分别构建10片分子印迹LB膜修饰电极。
实施例12
由实施例9构建的分子印迹LB膜修饰电极ITO A对组胺的吸附。采用电化学三电极体系，循环伏安法电位范围-0.4-0.8 V，扫描速度 50 mV/s；以乙醇和0.2 M KCl和1mMK3Fe(CN)6 的水混合溶液作为氧化还原探针的测试溶液体系。循环伏安法用于测量分子印迹LB膜修饰电极在组胺（3 ml 1µM）存在或不存时的电化学响应性，结果显示在优化吸附条件下，分子印迹LB膜修饰电极对组胺快速响应电化学信号[如图3(I)所示，图中曲线a代表裸ITO电极，b代表ITO A，c代表ITO A再结合组胺分子HA标注为ITO A-HA]，而由实施例8相同方法制得的非分子印迹LB膜修饰电极（没有加入模板分子组胺进行印迹的过程）对组胺几乎没有电化学响应信号[如图3(II)所示，图中曲线a代表裸ITO电极，b代表non-ITO A，c代表non-ITO A再结合组胺分子HA标注为non-ITO A-HA]，即分子印迹LB膜修饰电极在检测组胺目标分子具有较高的灵敏度。线性扫描伏安曲线的峰电流响应(∆i)与组胺浓度在0.01-1.50 μM范围内呈线性关系，检出限(S/N=3) 0.09 μM，同一根分子印迹LB膜修饰电极对组胺的响应峰电流相对标准偏差为 2.4% (n=6) 。
实施例13
由实施例9构建的分子印迹LB膜修饰电极ITO B对组胺的吸附。采用电化学三电极体系，循环伏安法电位范围-0.4-0.8 V，扫描速度 50 mV/s；以乙醇和0.2 M KCl和1mMK3Fe(CN)6 的水混合溶液作为氧化还原探针的测试溶液体系。循环伏安法用于测量分子印迹LB膜修饰电极在组胺（3 ml 1µM）存在或不存时的电化学响应性，结果显示在优化吸附条件下，分子印迹LB膜修饰电极对组胺快速响应电化学信号，而由实施例8相同方法制得的非分子印迹LB膜修饰电极（没有加入模板分子组胺进行印迹的过程）对组胺几乎没有电化学响应信号，即分子印迹LB膜修饰电极在检测组胺目标分子具有较高的灵敏度。线性扫描伏安曲线的峰电流响应(∆i)与组胺浓度在0.01-1.45 μM范围内呈线性关系，检出限(S/N=3)0.10 μM，同一根分子印迹LB膜修饰电极对组胺的响应峰电流相对标准偏差为 2.5% (n=6) 。
实施例14
分子印迹LB膜修饰电极的识别选择性。将组氨酸和多巴胺作为分子印迹LB膜检测模板分子过程中的结构类似物。分别配置 1 μM 组胺溶液(标记为HA)、含 5 μM 组氨酸和1 μM 组胺溶液(标记为HA-HD)、含 5 μM 多巴胺和 1 μM 组胺溶液(标记为HA-DM)、含 5 μM 的 组氨酸、多巴胺和 1 μM 组胺溶液共5组溶液(标记为HA-HD- DM)，由实施例9构建的分子印迹LB膜修饰电极A或B分别插入上述溶液，8 min 后测其电化学响应信号发现峰值电流值差别极小，原因在于电极表面组胺印迹留下的空穴只与组胺分子匹配，作为组胺结构相似物的组氨酸和多巴胺不能与之匹配，因此组氨酸和多巴胺对分子印迹LB膜修饰电极ITO A）识别组胺无干扰（如图4所示 ）。
实施例15
采用标准加样法测量啤酒实际样品中的组胺。在测试溶液中分别加入0.5、1.0和1.5 μM组胺溶液，用由实施例9构建的分子印迹LB膜修饰电极（ITO A）检出组胺平均回收率分别在105.9、103.0和98.3%，标准偏差分别为3.5、2.6和2.7%，实现快速、灵敏地检测啤酒和葡萄酒中痕量的组胺。
实施例16
采用标准加样法测量葡萄酒实际样品中的组胺。在测试溶液中分别加入0.5、1.0和1.5 μM组胺溶液，用由实施例9构建的分子印迹LB膜修饰电极（ITO B）检出组胺平均回收率分别在104.4、99.8和105.2%，标准偏差分别为1.9、3.5和4.3%，实现快速、灵敏地检测啤酒和葡萄酒中痕量的组胺。
上述的具体实施方式是对本发明申请的进一步详细说明，但本发明权利要求保护的范围并不局限于实施方式中所描述的范围，凡采用等同替换或等效变形的技术方案，均落在本发明权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）两亲胆固醇-壳聚糖碳酸酯和组胺溶液的配制
将胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶解在氯仿中，配制一系列不同浓度的胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶液，定容在容量瓶中，备用；将组胺溶解于超纯水中配制浓度1.0 mg/mL的组胺溶液，于低温条件下保存，备用；
（2）胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir 膜的形成
往Langmuir 槽中加入超纯水作为亚相，用微量进样器滴加100 μL由步骤（1）配制的组胺溶液稀释而成的浓度为0.2 mg/mL的组胺溶液，混合均匀后用微量进样器移取步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯的氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上；待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜，记录单分子膜表面压-平均单分子膜面积等温曲线和混合组份薄膜的塌陷压；每条等温曲线至少重复三次以确保重现性；
（3）胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜的转移
将预处理的ITO玻璃电极放入Langmuir槽中，往Langmuir 槽中加入超纯水作为亚相，用微量进样器滴加100 μL由步骤（1）配制的组胺水溶液稀释而成的浓度为0.2 mg/mL的组胺水溶液，混合均匀后用微量进样器移取步骤（1）配制的胆固醇-壳聚糖碳酸酯的氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上；待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩滑障，待滑障压缩到步骤（2）中胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份Langmuir膜在单分子膜表面压-平均单分子膜面积等温曲线固态段一半时所对应的单分子膜表面压时停止压缩，随后利用Langmuir-Blodgett（LB）技术，以5 mm/s的速度将混合组份单分子膜提拉完成膜的转移，使膜沉积在ITO基底上，形成胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份LB膜修饰的ITO玻璃电极；
（4）分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的制备
用一定量超纯水洗涤由步骤（3）形成的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合LB膜修饰的ITO玻璃电极表面一定时间，除去组胺模板分子得到识别组胺的分子印迹胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰电极；
（5）分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极对组胺的识别性能
采用电化学三电极体系，循环伏安法电位范围-0.4―0.8 V，扫描速度 50 mV/s；以乙醇和0.2 M KCl和1mM K3Fe(CN)6 的水混合溶液作为氧化还原探针的测试溶液体系；采用循环伏安法探究分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极对组胺的吸附性能，分别测试分子印迹LB膜修饰电极在3 mL浓度为1 µM组胺存在或不存在时的电化学响应性，结果表明在优化吸附条件下，分子印迹LB膜修饰电极能识别组胺分子，即在检测组胺目标分子方面具有较高的灵敏度，线性扫描伏安曲线的峰电流响应(∆i)与组胺浓度在0.01-1.50 μM范围内呈线性关系，检出限S/N=3时为 0.09 μM，同一根分子印迹LB膜修饰电极在吸附―脱附6次循环后对组胺的响应峰电流n=6时相对标准偏差为 2.4%。
2.根据权利要求1所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，非分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的构建及其在组胺溶液中的电化学响应性
①胆固醇-壳聚糖碳酸酯单层膜的形成：往Langmuir槽中加入超纯水作为亚相，用微量进样器移取100 μL步骤（1）配制的胆固醇―壳聚糖碳酸酯的氯仿溶液，缓慢滴加至亚相水面上，使其铺展在水面上；待氯仿完全挥发，将压力传感器归零，固定滑障速度为50 cm2/min，开始压缩滑障，得到有序密集排列的胆固醇-壳聚糖碳酸酯Langmuir膜，记录单分子膜表面压-平均单分子膜面积等温曲线和Langmuir膜的塌陷压，每条等温曲线至少重复三次以确保重现性；
②胆固醇-壳聚糖碳酸酯Langmuir膜的转移：将预处理ITO玻璃电极放入Langmuir槽中，按照步骤①方法将胆固醇-壳聚糖碳酸酯溶液滴加亚相中，待滑障压缩到胆固醇-壳聚糖碳酸酯Langmuir膜在单分子膜表面压-平均单分子膜面积等温曲线固态段一半时所对应的单分子膜表面压时停止压缩，随后利用Langmuir-Blodgett（LB）技术，以5 mm/s的速度将单分子膜提拉完成膜的转移，使膜沉积在ITO基底上，形成胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰的ITO玻璃电极；
③非分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的制作：用一定量超纯水淋洗由步骤②形成的胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰的ITO玻璃电极表面一定时间，除去组胺模板分子得到非识别组胺的分子印迹胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜修饰电极，标记为non-ITO A；
④non-ITO A在组胺溶液中的电化学响应性：采用与步骤（5）相同的电化学三电极体系和氧化还原探针测试溶液体系，采用循环伏安法测试non-ITO A在浓度3 ml 浓度为1 µM组胺存在或不存在时的电化学响应性，结果显示在含或不含组胺的情况下循环伏安法曲线几乎一致，意味着non-ITO A对组胺几乎没有产生电化学响应。
3.根据权利要求1所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的识别选择性：
以组氨酸和多巴胺作为分子印迹LB膜检测模板分子过程中的结构类似物，具体步骤为：分别配置 1 μM 组胺溶液、含 5 μM 组氨酸和 1 μM 组胺溶液、含 5 μM 多巴胺和 1 μM 组胺溶液、含 5 μM 的 组氨酸、多巴胺和 1 μM 组胺溶液共4组溶液，将同一根分子印迹LB膜修饰电极分别识别吸附上述溶液，8-16 min 后测其电化学响应信号发现峰值电流差别极小，原因在于该电极表面组胺印迹留下的空穴只与组胺结构匹配，组氨酸和多巴胺不能与之匹配，因此组氨酸和多巴胺对分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的识别组胺无干扰。
4.根据权利要求1所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，步骤（2）和（3）中所述的胆固醇-壳聚糖碳酸酯浓度为1.0 mg/mL、加入量为25-300 μL。
5.根据权利要求2所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，步骤（3）中所述的胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合组份LB膜为1-30层，所述的胆固醇-壳聚糖碳酸酯LB膜为1-30层。
6.根据权利要求1所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，步骤（4）中用于洗涤胆固醇-壳聚糖碳酸酯/组胺混合LB膜修饰ITO玻璃电极表面的方式包括浸泡洗涤和淋洗，浸泡洗涤水量5-100 mL，洗涤时间8-20 min；淋洗水量5-30 mL，洗涤时间30-100 s。
7.根据权利要求1所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，步骤（5）中所述的分子印迹LB膜修饰电极吸附组胺的吸附时间在2-20 min。
8.根据权利要求1所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物Langmuir-Blodgett膜（LB膜）修饰电极的构建方法，其特征在于，步骤（5）中所述的线性扫描伏安曲线测定峰电流响应(∆i)与组胺浓度关系，考察组胺浓度在0.01-500 μM。
9.权利要求1-8任一所述的构建方法制得的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极。
10.权利要求9所述的一种分子印迹两亲壳聚糖衍生物LB膜修饰电极的应用，其特征在于，通过在玻璃导电电极表面引入分子印迹两亲性壳聚糖衍生物LB膜，赋予修饰电极对组胺的选择性识别，用于标准加样法对啤酒和葡萄酒实际样品中组胺的检测，啤酒和葡萄酒加标试样中组胺的平均回收率分别为 98.3-105.9%，99.8-105.2%，玻璃导电电极在吸附-脱附3次循环后电化学响应峰电流相对标准偏差小于4.5%。
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