CN101294156B - 一种乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，旨在提供一种能与不同氧化还原电极配合使用，具有普遍适用性，性能好，适合于乙醇在线监控的生物传感器核微孔酶膜的制备方法。包括下述步骤：将可溶性淀粉溶解于含低浓度戊二醛水溶液中，80℃加热并搅拌，使其发生交联反应，再与2％的海藻酸钠溶液混合。取上述醛基化淀粉胶海藻酸钠混合液作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，4℃下放置8分钟使酶固定化，将固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治结构的酶膜，浸入CaCl2溶液10秒钟后取出，冲洗3遍以上制成乙醇酶膜。混合酶溶液由乙醇氧化酶和牛血清白蛋白混合而成。本发明的酶膜具有普遍适用性，性能良好。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器领域，更具体的说，是涉及一种乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法。
背景技术
乙醇含量的测定方法主要有：气相色谱法，分光光度法，密度瓶法，重铬酸钾比色法等，这些方法耗时、繁琐，检测起来既费时又费力。因此，现在普遍看好酶的测定法即乙醇生物传感器法，这种方法具有灵敏、快速、简便、特异性强等特点，而且对样品几乎不用任何预处理。
乙醇生物传感器的研制为乙醇的现场快速检测和发酵过程中乙醇的在线检测提供了有利手段。目前已经出现了各种各样的生物传感器，其中电流型的酶传感器依然是研究最多，也是商品化最为成功的传感器类型，而这类传感器的核心元件就是固定化酶膜。酶膜性能的优劣主要决定于固定化材料的选取和固定方法的选择。
目前在电极上固定化酶的方法主要有吸附法、共价结合法、交联法、聚合物包埋法、组合法等。
为实现乙醇测定，国外已经发明了一些酶电极，这些酶电极主要是通过固定化酶的技术。通过将Alcohol oxidase(AOX)，固定在安培电极上，制成乙醇生物传感器。在这类传感器上直接通过监测反应池内O2的消耗和H2O2的生成来计量电化学反应。另外酶也可以和介导物一起固定在电极上，例如Horseradish Peroxidase(HRP)。介导物增加了酶促反应速率，从而放大了电信号(Azevedo，A.M，2005)。进而，很多不同类型的酶电极被提议出来，例如隔膜电极、玻璃碳电极(GC)、Screen-Printed电极。上述方法都是将酶直接固定到电极上，必须使用相匹配的电极，从而不具有普遍适用性。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中将酶直接固定到电极上之后不具有普遍适用性等不足之处，提供了一种可以和不同氧化还原电极配合使用，酶膜性能好，适合于乙醇在线监控的乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法。
本发明通过下述技术方案实现：
一种乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，其特征是，包括下述步骤：(1)将可溶性淀粉溶解于含低浓度戊二醛的水溶液中，80摄氏度加热溶解并搅拌30分钟，之后，室温放置12小时，使淀粉与戊二醛水溶液发生交联反应，得到醛基化淀粉胶溶液，再与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液混合，得到海藻酸钠-淀粉胶凝胶；其中淀粉与戊二醛交联反应得到的醛基化淀粉胶溶液与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液的体积比为1∶1。可溶性淀粉与含低浓度戊二醛的水溶液的质量体积比为2∶1。
(2)取上述海藻酸钠-淀粉胶凝胶作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化，所述混合酶溶液由乙醇氧化酶和牛血清白蛋白混合而成。取10微升上述固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治结构的酶膜后，浸入CaCl2溶液10秒钟后取出，其中浸入CaCl2溶液后可以使海藻酸钠与钙离子相互作用，形成网状结构，可使海藻酸钠溶液瞬时凝胶化，成为良好的包埋载体。
研究表明当某溶液中含有少量Ca2+，即小于0.001％时，能够显著增大酶膜的响应值。因此，用PH＝7的磷酸缓冲液冲洗3遍以上，去除乙醇酶膜上存留的Ca2+、Cl2+等离子，从而消除测定误差，制成乙醇酶膜。其中固定材料与混合酶溶液的体积比为4∶1。
其中，所述低浓度戊二醛水溶液的体积百分比浓度为1-4％。所述CaCl2溶液的重量百分比浓度为5-7％。所述混合酶溶液用0.01g牛血清白蛋白配制，其最终乙醇氧化酶浓度为0.022-0.088g。可溶性淀粉与含低浓度戊二醛的水溶液的质量体积比为1∶5-40。
本发明具有下述技术效果：
本发明采用和国外研究不同的适合于核微孔膜的固定化酶方法制成固定化酶的核微孔膜，而不是直接固定到电极上，从而适合于山东省科学院生物研究所生产的SBA-40C生物传感分析仪，也可以灵活地和其它氧化还原电极配合使用，具有普遍适用性。而且，本发明利用淀粉、戊二醛和海藻酸钠为混合固定材料，并通过合理的配比，使乙醇酶膜性能良好，由该乙醇酶膜制成的电极的线性范围为0-1％，分辨率达到0.001％，响应时间20s，半衰期大于30天。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明详细说明。
实施例1
将0.088g乙醇氧化酶与0.01g牛血清白蛋白混合得到混合酶溶液备用。
称取可溶性淀粉4g，加到20ml体积百分比浓度为1％的戊二醛水溶液中，80摄氏度加热溶解并搅拌30分钟，加热过程中不断搅拌溶液，使其不聚集成固体，之后，室温放置12小时，使可溶性淀粉与戊二醛水溶液进行交联反应，得到醛基化淀粉胶溶液。将上述醛基化淀粉胶溶液与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液按照体积比为1∶1的比例混合，搅拌均匀后，便制成海藻酸钠-淀粉胶凝胶，装入1.5毫升的离心管中避光保存。
取海藻酸钠-淀粉胶凝胶8微升作为固定材料与2微升的混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化，将上述10微升固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治结构的酶膜后，浸入重量百分比浓度为7％的CaCl2溶液10秒钟后取出，用上述配制好的pH＝7的磷酸缓冲液冲洗3遍以上，制成乙醇酶膜，即可装到山东省科学院生物研究所生产的SBA-40C生物传感分析仪上用于分析测试。
储存条件：在膜上滴一滴甘油，4度保存。
实施例2
将0.044g乙醇氧化酶与0.01g牛血清白蛋白混合得到混合酶溶液备用。
称取可溶性淀粉2g，加到20ml体积百分比浓度为1％的戊二醛水溶液中80摄氏度加热溶解搅拌30分钟，加热过程中不断搅拌溶液，使其不聚集成固体，之后，室温放置12小时，使可溶性淀粉与戊二醛水溶液进行交联反应，得到醛基化淀粉胶溶液。将上述醛基化淀粉胶溶液与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液按照体积比为1∶1的比例混合，搅拌均匀后，便制成海藻酸钠-淀粉胶凝胶。装入1.5毫升的离心管中避光保存。
取海藻酸钠-淀粉胶凝胶8微升作为固定材料与2微升的混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化，取上述10微升固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治结构的酶膜后，浸入重量百分比浓度为6％的CaCl2溶液10秒钟后取出，用上述配制好的pH＝7的磷酸缓冲液冲洗3遍以上，制成乙醇酶膜，即可装到山东省科学院生物研究所生产的SBA-40C生物传感分析仪上用于分析测试。
储存条件：在膜上滴一滴甘油，4度保存。
实施例3
将0.022g乙醇氧化酶和0.01g牛血清白蛋白混合得到混合酶溶液备用。
称取可溶性淀粉0.5g，加到20ml体积百分比浓度为1％的戊二醛水溶液中，80摄氏度加热溶解搅拌30分钟，加热过程中不断搅拌溶液，使其不聚集成固体，之后，室温放置12小时，使可溶性淀粉与戊二醛水溶液进行交联反应，得到醛基化淀粉胶溶液。将上述醛基化淀粉胶溶液与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液按照体积比为1∶1的比例混合，搅拌均匀后，便制成海藻酸钠-淀粉胶凝胶。装入1.5毫升的离心管中避光保存。
取海藻酸钠-淀粉胶凝胶8微升作为固定材料与2微升的混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化，取上述10微升固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治结构的酶膜后，浸入重量百分比浓度为5％的CaCl2溶液10秒钟后取出，用上述配制好的pH＝7的磷酸缓冲液冲洗3遍以上，制成乙醇酶膜，即可装到山东省科学院生物研究所生产的SBA-40C生物传感分析仪上用于分析测试。
储存条件：在膜上滴一滴甘油，4度保存。
测定原理：
乙醇在乙醇氧化酶的催化下水解为乙醛和H2O2，其氧化还原反应的化学计量学信号通过电极的电信号表现出来，从而达到对乙醇进行定量测定的目的。
本发明利用淀粉、戊二醛和海藻酸钠为混合固定材料的乙醇酶膜性能良好，由该乙醇酶膜制成的电极最低乙醇检出浓度为0.001％，响应时间20秒，0％-1％范围内线性关系R2达到0.995以上，每天测样40次，1周以后酶膜活性没有明显下降。
Claims (5)
1.一种乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，其特征是，包括下述步骤：
(1)将可溶性淀粉溶解于含低浓度戊二醛的水溶液中，80摄氏度加热溶解并搅拌30分钟，之后，室温放置12小时，使淀粉与戊二醛水溶液发生交联反应，得到醛基化淀粉胶溶液，再与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液混合，得到海藻酸钠-淀粉胶凝胶；其中淀粉与戊二醛交联反应得到的醛基化淀粉胶溶液与质量体积百分比浓度为2％的海藻酸钠溶液的体积比为1∶1；
(2)取上述海藻酸钠-淀粉胶凝胶作为固定材料与混合酶溶液充分混合后，4摄氏度下放置8分钟使酶固定化，所述混合酶溶液由乙醇氧化酶和牛血清白蛋白混合而成；取10微升上述固定化的酶均匀涂抹于两张聚碳酸酯微孔膜上，制成三明治结构的酶膜后，浸入CaCl2溶液10秒钟后取出，用pH＝7的磷酸缓冲液冲洗3遍以上，制成乙醇酶膜；其中固定材料与混合酶溶液的体积比为4∶1。
2.根据权利要求1所述的乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，其特征是，所述低浓度戊二醛水溶液的体积百分比浓度为1％-4％。
3.根据权利要求1所述的乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，其特征是，所述CaCl2溶液的重量百分比浓度为5-7％。
4.根据权利要求1所述的乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，其特征是，所述混合酶溶液用0.01g牛血清白蛋白与乙醇氧化酶0.022-0.088g配制而成。
5.根据权利要求1所述的乙醇生物传感器核微孔酶膜的制备方法，其特征是，可溶性淀粉与含低浓度戊二醛的水溶液的质量体积比为1∶5-40。
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| 李家鹏等.核微孔膜为基础的乳糖-葡萄糖双功能酶电极的研制.食品科学第28卷 第3期.2007,第28卷(第3期),第285-289页. |
| 李家鹏等.核微孔膜为基础的乳糖-葡萄糖双功能酶电极的研制.食品科学第28卷 第3期.2007,第28卷(第3期),第285-289页. * |
| 李莎等.基于纳米材料、聚电解质制备高性能乙醇生物传感器.分析化学第36卷 第2期.2008,第36卷(第2期),第227-230页. |
| 李莎等.基于纳米材料、聚电解质制备高性能乙醇生物传感器.分析化学第36卷 第2期.2008,第36卷(第2期),第227-230页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101294156A (zh) | 2008-10-29 |
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