JPS60185153A - 固定化酵素膜 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の属する技術分野〕 本発明は酵素電極に使用される固定化酵素膜に関する。

ｒ従来技術とその問題点〕 医療・臨床検査分野において、血糖など生体関連物質の
測定は診断・治療に欠くことのできないものとなってい
る。また、発酵・食品工業分野ではアルコール、・アミ
ノ酸、糖などの有機物質の計測がプロセス管理の面から
最近きわめて重要な項目となってきた。

このような背景から、生体関連物質の迅速かつ簡便な測
定法が強く要望されている。Ｍ記生体関連物質の分析法
のひとつに、生体触媒である酵素を利用した分析法（酵
素法）がある。酵素は反応特異性が高く、温和な条件で
反応させることができるため、その有用性が広（認めら
れ、生体関連の物質の測定は吸光光朋定せ法など従来の
化学的方法から、しだいに酵素法に置さかえられつつあ
る。しかしながら、測定に使用される高価な酵素が使い
棄てにされることや、酵素溶液が不安定であり保存上問
題があるなどの欠点を有していた。

このため、酵素が安定でしかも反復利用可能ならしめる
酵素固定化技術を応用した固定化酵素膜が開発され、固
定化酵素膜と電気化学的デバイスと組み合わせた酵素を
極が測定の迅速性、簡易性などの長所を有するために注
目され、すでに実用化段階に達している。

しかしながら、従来の酵素電極法による測定は、専用デ
ィスペンサを用い、′定電の試料を一定容積を有する測
定セル内に注入するなどの操作により、酵素電極近傍の
試料濃度を１０〜４０倍に稀釈して測定するものであっ
た。これは酵素電極に使用される固定化酵素膜に、（１
）基質濃度を低濃度ｔこしないと酵素不足などが原因と
なって酵素−基質反応が飽和してじまい、基質濃度と出
力の間に一定の関係が得られないこと、（２）測定を妨
害する試料中の高分子物質の排除性が弱く、基質の膜内
への拡散を阻害１゛ること、（３）試料濃度が高いと妨
害成分の濃度も高くなり、電極側に接する選択透過膜の
選択透過能が不十分となり、測定値に誤差を与えるなど
である。したがって、試料を稀釈せずに直接測定を可能
とする機能を持った固定化酵素膜の開−発がう虫く滋ま
れでいる。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、従来の酵素電極用固定化酵素膜の前記
欠点を解決し、無稀釈で試料、とくに血液を全血で直接
分析できる機能を有する固定化酵素膜を提供することを
目的とする。

〔発明の要点〕

この発明は、試料側に接する膜として孔径０，０２μｍ
以下の微細孔を有Ｊ′る高分子物置排除膜を用い、電極
側に接する膜として試料中の共存物質の影響を受けず、
酵素反応によって生成−ｒろ過酸化水素のみを選択的に
透過する膜の膜厚を４〜８μｍ１好ましくは６〜７μ餌
に制御し、さらに固定化酵素膜活性を従来の固定化酵素
膜活性よりも低いｏ、ｏ　ｏ　ｉ〜０．００９ＵΔ〃ｉ
の範囲に調製し、血液試料を稀釈操作なしで（全血で）
分１ｉ＋’　ａ丁能ならしめた固定化酵素膜に関するも
のである。

〔発明の実施例〕

０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６，０）にて、牛血清アル
ブミン溶液を４０１１こなるように調製した。仄にこの
牛血清アルブミン浴液を用いて、グルコースオキシダー
ゼ溶液をｉｏｉ個ｌ（約ｉｏ　ＬＪＡｎｔ）になるよう
ｌこ調製した。この溶液に１５％グルタルアルデヒド水
溶液を加え、グルタルアルデヒド濃度２％になるように
した。この混合溶液を４℃で４時開放直し、１杼素と十
血清アルブミンとをグルタルアルデヒドで互いに架橋反
応を行わせた後、固定化酵素膜作製のための酵４−″混
合溶液とした。

孔径００２μｔｎ以下の多孔性膜として孔径０．Ｏｆ　
５μフルのポリカーボ坏−１・膜を選び外径９掩のＱ　
ＩＪソング上接着した。このポリカーボネート膜上に前
記酵素混合溶液５μｔを展開し、その上に膜厚６〜７μ
ｍ１１．０セルロースアセデート’ｆ＞％を積層し接沿
稜、・ト′Ｃで２）時間乾燥させ、ｐＨ７，０の０．１
Ｍリン酸緩柚１叡にて洗６トシ、再び４℃で乾燥させ、
固尾化グルコースオキシダーゼ膜トシた。

この固定化酵素膜をクラーク型過酸化水素電極（Ｃ装着
し、酵素゛成極を４６成した。第１図にその構成を示１
−０第１図において１は白金極、２はこれと１ｌＪＩ心
の円面状猷極であり、両極間には円筒状の絶縁層３が配
されている。電極を囲むガイド４により保持されたＯリ
ング５によって、セルロースアセテート膜６、固定化グ
ルコースオギシダーゼ７およびポリカーボネート膜８の
積層体が固定されている。前記酵素゛電極にグルコース
標準浴Ｍを接触させ、グルコース娘度と加秒後に得られ
た反応出力との関詠を示すと第２図のようになる。

酵素膜活性そ制御゛することに−より、広範囲にわたリ
グルコースｄ’［に対応した出力が得られることがわか
る。酵素膜活性につき種々の侠訂を行ったところ、赫素
膜活性が０．０１１Ｊ／１ｙｔｔｔ”以上ではグルコー
ス磯度約１５０　Ｍψ以上で反応が飽和し、クルコース
濃度と出力との対応が認められなくなる。

また、岬索腺活性が０．θＯｉ　ＩＪ／４″以下では反
応’４流が小さくなり、測足稍度そ上げるためには検出
糸に工夫を要する。したがって、Ｕ素膜活性は０００１
〜０，００９Ｕ、４”の範囲に調製することが必殺であ
ることがわかった。

次に鹸記爵素庫極に対してＪｌｂ害物質とし′Ｃ一般に
知られているアスコルビン酸、尿ばの４１ｍに＆：触さ
せた。アスコルビンば加ｄｌ／ｄＪ　、尿酸１０　＋＋
＆、４’の各溶液とも出力が―められず、この酵素１！
極は妨害物質を選択的に排除していることがわかる。

この酵素を極ｌこ用いる選択透過Ｍ（セルロースアセテ
ートのち密膜）の厚さは４〜８μｍ１　好ましくは６〜
７−／／ｍ程度である。３μ惜以下ではアスコルビン１
２２０　Ｉｎ９／′ｃＩｌの溶液に対する出力が認めら
れ、選択透過性能が劣るため、測定値に誤差を与える要
因となる。また、膜厚９μｍ以上では生成する過酸化水
素に対する応答速度の遅れが認められ、迅速に妨害なく
　ｌｌ１ｌｌ定するためには４〜８μ情、好ましくは６
〜７μｆＩＬ程度の膜厚が適当であることがわかった。

前記酵素電極を全血試料と直接接触させた。用いた全血
中のグルコース濃度は稀釈した後に測定１−ろ従来の酵
素Ｓ！極法でそれぞれ９１　、７１　、７２　ｍｇＡｌ
ｇ　−ｃあった。

全血を直は接触させて得られた値は、それぞれ９４、７
２．６７　ｍ？Ａｌであり、従ンく法とよく一致してい
た。

高分子物質排除膜として用いるボリカーボネー１−　ｊ
ｌＪの孔径が０．０２μｍ以上のものとしてそれぞれ（
＋、０３　Ｉ’ｍ　、０．１　ｐｍを選び、固定化グル
コースオキシダーゼ膜を作製し、従来法でグルコース濃
度が９１νｎ９Ａｌｌである血液試料を測定した。孔径
０．０３μｍでは５６　ｍ？Ａｌｌ　、孔径０．１　ｐ
ｍでは１０　〃ｖｄｉであった。

このことから、孔径Ｑ、１μｍは勿論、００３μｍであ
っても過大であり、０．０２μ７ｒＬ以下の微細孔を有
するポリカーボネート膜を試料側に接する高分子物質排
除膜として用いる固定化酵素膜が血球等の血液中の共存
成分の妨′ｇを受けずに全血測定に適していることがわ
かった。

〔発明の効果〕

この発明により、固定化酵素膜で血液などの試料を稀釈
せずに、そのまま妨害なく測定することが可能となった
。特に、生血を測定対象とした場合、血清分離等の面倒
な操作を省くことができ、少量の血液を固定化酵素膜上
に滴−ドすることによって血液中の糖ｌよどを迅速に、
しかも簡便に妨害なく測定することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による酵素電極の構成を示１−断面図、
第２図は実施例１におけるグルコース濃度と酵素電極の
反応短見との廚係を示′１′線図である。 ｌ：白金電極、２：電極、３：絶縁層、４ニガイド、５
：Ｏリング、６：セルロースアセテート膜、７：固定化
グルコースオキシダー七、８：ボリカーボ不−ト膜。 才１圀

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）酵素電極用固定化酵素膜において、測定試料側に接
   する膜は孔径０．２μ漢以下の微細孔を有する多孔性膜
   であり、電極側に接する膜は厚さ４〜８μｍのセルロー
   スアセテート膜であり、前記多孔性膜とセルロースアセ
   テート膜との間に酵素が固定化され、固定化酵素膜活性
   が０．００１〜０．００９眸の範囲にあることを特徴と
   する固定化酵素膜。 ２、特許請求の範囲第１項記載の膜において、セルロー
   スアセテート膜の膜厚が６〜７μｍであることを特徴と
   する固定化酵素膜。