CN1268186A - 重组诱发剂寡核碱基校正肝细胞遗传损害的体内应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及将特定基因改变引入动物细胞的内源基因中的组合物和方法。由寡核碱基或寡核碱基的衍生物和类似物实现所述基因改变,所述寡核碱基或寡核碱基的衍生物和类似物的长度一般小于约100个核碱基。本发明提供大分子载体,可任选地加入披网格蛋白小窝受体的配体。在一个实施方案中,所述配体是乳糖或半乳糖,而在肝细胞中制造所述基因改变。通过本发明,已经在体外改变了靶基因最高达40%的拷贝。观察到具有克－奈样表型和血友病B表型的突变基因的修复。
Description
本申请要求1997年4月30日申请的美国专利申请系列第60/045,288号、1997年8月5日申请的第60/054,837号、1997年11月10日申请的第60/064,996号的优先权，这些专利中的每个通过引用整个结合到本文中。
1.发明领域
本发明涉及使用重组诱发剂寡核碱基(oligonucleobase)体内校正致病的遗传缺陷的方法和组合物。本发明特别适用于治疗该类型的遗传缺陷，其中受治疗者肝细胞中的所述遗传缺陷的校正将减轻该疾病。
2.发明背景
2.1使用嵌合突变载体来实现培养细胞中的遗传改变
该小节中包括出版物和专利申请，不是承认所述申请的出版物或或者发明(如果有的话)出现在本发明之前，或得自本发明人以外的人的概念。
公开的重组诱发剂寡核碱基的实例称为嵌合突变载体(CMV)或嵌合整复体(chimeraplast)，因为它们含有2’-O-修饰的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸。
Kmiec，E.B.等，1994年11月，Mol.and Cell.Biol.14，7163-7172中描述了一种寡核碱基，它具有互补的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸，并含有与噬菌体M13mp19片段同源的序列。所述寡核碱基具有单一的核糖核苷酸的连续区段。Kmiec等表明，所述寡核碱基是得自玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)的REC2同源配对酶的底物。
于1995年6月14日公布的专利公布WO 95/15972和对应的美国专利第5,563,350号(’350专利)，描述了用于将遗传改变引入真核细胞的双链CMV。报道了在玉蜀黍黑粉菌基因中和鼠类ras基因中的实施例。后一实施例设计用以将转化突变引入ras基因中，使得NIH 3T3细胞中ras基因的成功突变可以引起细胞集落的生长(“转化”)。’350专利报道，NIH 3T3的最大转化率低于0.1％，即每106暴露于ras双链CMV的细胞约100个转化子。在玉蜀黍黑粉菌系统中，转化率为约600/106。在Kmiec，E.B.，1996年2月，Seminars in Oncology，23，188中描述了一种设计用以将突变引入人类bcl-2基因的嵌合载体。
在Kmiec，E.B.，1995年12月，Advanced Drug Delivery Reviews 17，333-40中，描述了一种设计用于修复K-ras的密码子12中突变的双链CMV。在得自人类胰腺癌的细胞系Capan 2中测试了该双链CMV，采用LIPOFECTINTM将该双链CMV引入Capan 2细胞中。引入双链CMV后24小时，收获细胞，并提取基因组DNA；通过PCR扩增含K-ras的密码子12的片段，通过与等位基因特异性探针杂交，估计转化率。报道修复率为约18％。
在Yoon，K.等，1996年3月，Proc.Natl.Acad.Sci.93，2071中，公开了一种设计以修复编码肝/骨/肾类型碱性磷酸酶的基因中突变的双链CMV。该碱性磷酸酶基因通过质粒瞬时引入CHO细胞中。6小时后，引入双链CMV。引入双链CMV后24小时，回收质粒并进行分析。结果表明，约30-38％的碱性磷酸酶基因被双链CMV修复。
E.B.Kmiec，A.Cole-Strauss和L.Yoon的WO 97/41411以及出版物Cole-Strauss，A.等，1996年9月，SCIENCE 273，1386，公开了用于治疗造血细胞遗传病(例如镰状细胞病、地中海贫血症和戈谢病)的双链CMV。E.B.Kmiec的WO 97/48714和对应的美国专利第5,731,181号描述了具有非天然核苷酸的双链CMV，用于特异性的定点诱变。在所述申请和Kmiec及其同事的某些出版物中所述的双链CMV，含有一段DNA：DNA同双链体中心区段和RNA：DNA异双链体或2’-OMe-RNA：DNA异双链体的侧翼区段。Kren等，1997，Hepatology 25，1462-1468报道了在非复制型初级肝细胞中成功使用CMV。Kren等，1998年3月，Nature Medicine 4，285报道了，使用CMV在体内将编码凝血因子IX的基因中的遗传缺陷引入大鼠中。
Kmiec及其同事的工作涉及在暴露于CMV时有丝分裂活性的(即增殖)细胞。Kmiec及其同事使用CMV/脂质体大分子载体复合物，其中CMV与预形成的脂质体或脂小泡混合。在这种复合物中，人们认为CMV附着于脂质体表面。
2.2使用聚乙烯亚胺大分子载体进行体内和体外转染
支链的聚乙烯亚胺已经用作载体，以在体内和体外将核酸引入真核细胞中。Boussif，O.等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92，7279；Abdallah，B.等，1996，Human Gene Therapy 7，1947.Boletta，A.等，1997，8，1243-1251。Zanta等，1997年10月1日，Biocoiugate Chemistry 8，839-844报道了体外使用半乳糖基聚乙烯亚胺将DNA引入培养的HepG2肝癌细胞系中。在Kircheis，R.等，1997，Gene Therapy 4，409-418中，描述了将蛋白配体运铁蛋白偶联至聚乙烯亚胺及其利用运铁蛋白受体将测试基因引入培养细胞中的应用。支链的聚乙烯亚胺含有仲氨基和叔氨基，其pK值范围广泛，因此在聚赖氨酸几乎没有或没有缓冲能力的pH下，即在低于约8的pH下，这些聚乙烯亚胺具有相当大的缓冲能力。Tang，M.K.和Szoka，F.C.，1997，Gene Therapy 4，823-832。
Ferrari，S.等，1997，Gene Therapy 4，1100-1106报道了在体内和体外成功地使用线性聚乙烯亚胺转染一种基因。
2.3使用脂质体载体进行体内转染
已经描述了使用脂质体或脂小泡将编码外源蛋白的DNA引入细胞中。最常用的技术是使DNA附着于带正电的脂质体表面上，而不是将DNA包入囊中，尽管已知包囊DNA技术。美国专利第4,235,871和4,394,448号是相关的。Smith，J.G.等，1993，Biochim.Biophy.Acta1154，327-340和Saubinger，R.M.等，1987，Methods in Enzymology 185，512综述了该领域。在Fabrega，A.J.等，1996，Transplantation 62，1866-1871中，描述使用脂质体中的阳离子脂质DOTAP体内转染肝细胞。在Zhu，N.等，1993，Science 261，209中，描述了使用含阳离子脂质的脂质体转染多种成体小鼠细胞。在Fraley，R.等，1981，Biochemistry 20，6978-87中，描述了使用含磷脂酰丝氨酸的脂质形成用于转染的DNA包囊脂质体。
2.4使用脱唾液酸糖蛋白受体进行肝细胞特异性转染
美国专利第5,166,320号和第5,635,383号公开了通过形成DNA、聚阳离子大分子载体和脱唾液酸糖蛋白受体的配体的复合物，转染肝细胞。在一个实施方案中，该大分子载体是聚赖氨酸。Nandi，P.K.等，1986，J.Biol.Chem.261，16722-16722描述了使用含乳糖苷脑苷脂的脂质体体内转染肝细胞。在Hara等，1995，Gene Therapy 2，764-788中，描述了使用脱唾液酸胎球蛋白标记的脂质体与报道质粒一起转染肝细胞。
3.发明概述
本发明涉及包含重组诱发剂寡核碱基的组合物以及用该组合物将特定的遗传改变引入受治疗者个体细胞的DNA中的方法，该方法称为“衍变(transmutation)”。重组诱发剂寡核碱基是一种核碱基(nucleobase)聚合物，它含有少于60个碱基、为衍变靶的基因序列。本发明可以与现在已知或待开发的重组诱发剂寡核碱基一起使用。在一个实施方案中，该重组诱发剂核碱基是一种嵌合突变载体(CMV)，采用CMV实现衍变的方法称为“嵌合整复术(chimeraplasty)”。与现有的这类组合物和方法相比，本发明的组合物和方法可以给予受治疗者个体，以实现体内遗传改变。本发明部分依赖于意外的发现，即CMV有效地使非增殖(即非有丝分裂)细胞衍变。本发明还依赖于意外的发现：与一种大分子载体复合的CMV适用于嵌合整复术，其中通过披网格蛋白小窝内化入内体中的一种细胞表面受体(“披网格蛋白小窝受体”)的配体连接至所述大分子载体。
在具体实施方案中，本发明提供一种组合物，它包含一种CMV和一种选自以下的大分子载体：直径为25-400nm的水性核心脂小泡，其中该水性核心含有该CMV；直径为25-400nm、具有脂质核心的脂质纤球体，其中该脂质核心含有该CMV的亲脂盐；和该CMV的聚阳离子盐。用于这类盐的聚阳离子的实例包括聚乙烯亚胺、聚赖氨酸和组蛋白H1。在一个实施方案中，该聚阳离子是一种支链的聚乙烯亚胺(PEI)盐，其质均分子量大于500道尔顿且低于1.3Md。
该载体可以可任选地用通过披网格蛋白小窝内化入内体的细胞受体的配体取代。在一个实施方案中，该配体为乳糖基部分，而该受体是肝细胞的脱唾液酸糖蛋白受体。其它受体包括运铁蛋白、胰岛素、胰高血糖素、EGF和低密度脂蛋白(LDL)的受体，而该配体可以是结合该受体的天然配体的片段。或者，该配体可以是特异性地结合于该受体的任何化合物，无论它是否与天然存在的配体相关。当给予受治疗者个体时，所述CMV/大分子载体/配体的组合物还包含药用可接受的水性载体，诸如缓冲盐溶液。当给予细胞培养物时，该组合物还包含细胞培养基，该培养基可以补充有血清。
本发明的再一实施方案包括将上述复合物给予具有致病遗传病的人类受治疗者。该复合物可以胃肠外给予，在一个优选实施方案中，该复合物直接给予受该致病遗传病影响的器官。在又一实施方案中，本发明包括在受治疗者个体中和在细胞培养物中将CMV/大分子载体/配体复合物用于嵌合整复术。4.定义
按照以下定义理解本发明。
寡核碱基是一种核碱基聚合物，该聚合物可以通过Watson-Crick碱基配对，与具有互补序列的DNA杂交。
核碱基包含碱基，该碱基为一种嘌呤、嘧啶或其衍生物或类似物。核碱基包括肽核碱基(肽核酸亚单位)和吗啉核碱基以及核苷和核苷酸。核苷是含有一种戊糖呋喃糖基部分的核碱基，例如可任选取代的核糖核苷或2’-脱氧核糖核苷。核苷可以通过几个连接部分中的一个连接，它可以含有或不含有磷。通过未取代的磷酸二酯键连接的核苷称为核苷酸。
寡核碱基链具有单一的5’端和3’端，它们是该聚合物最后的核碱基。一个特定的寡核碱基链可以含有所有类型的核碱基。核碱基化合物是包含一条或多条互补的或通过Watson-Crick碱基配对杂交的寡核碱基链的化合物。核碱基或者是脱氧核糖型或者为核糖型。核糖型核碱基是含有戊糖呋喃糖基的核碱基，其中2’碳是用羟基、烷氧基或卤素取代的亚甲基。脱氧核糖型核碱基是非核糖型核碱基的核碱基，包括不含有戊糖呋喃糖基部分的所有核碱基。
寡核碱基链从种属上说包括核碱基链和寡核碱基链的区段和区域。寡核碱基链具有一个3’端和一个5’端。当寡核碱基链与一条链共同延伸时，所述寡核碱基链的3’端和5’端也是该条链的3’端和5’端。
区域是寡核碱基的一部分，该部分的序列得自某些特定的来源，例如具有至少15个核苷酸、具有人β-珠蛋白基因片段的序列的CMV。给定的区段或给定的区域可以含有2’-脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。然而，核糖型区段或2’脱氧核糖型区段仅分别含有核糖型和2’-脱氧核糖型核碱基。5.发明详述
在以下5.2节以及下列等等中，应该理解，关于CMV的内容也适用于重组诱发剂寡核碱基。
5.1嵌合突变载体的结构
嵌合突变载体(CMV)由嘌呤和嘧啶的聚合物组成，所述载体与具有合适序列的DNA杂交，即形成嘌呤和嘧啶的Watson-Crick碱基配对。每种CMV均分为相互互补的第一链和第二链，每条链至少有15个碱基，这两条链可以(但不需要)共价连接。寡核碱基聚合物的亚单位称为核碱基。核碱基含有一个碱基，它或者为嘌呤，或者为嘧啶，或者为其类似物或衍生物。有两种类型的核碱基。核糖型核碱基是具有2’-羟基、取代的羟基或2’-卤素取代的核糖的核糖核苷。所有非核糖型核碱基的核碱基均为脱氧核糖型核碱基。
第一链和第二链的序列由至少两个与靶基因同源的区和一个或多个不同于靶基因、且将遗传改变引入靶基因的区(“增变区”)组成。增变区直接在3’方向和5’方向上与同源区相邻。在本发明的一个优选实施方案中，每个增变区在3’和5’方向上与至少3个碱基的同源区相邻。在本发明的一个优选实施方案中，每个增变区在3’和5’方向的侧翼为至少3个碱基的核糖型寡核碱基区段，这些区段不需要与增变区相邻。侧翼核糖型核碱基区段不需要直接与增变区相邻，即可以间插包含脱氧核糖型核碱基的同源区的一部分。所有同源区的总长度优选为至少16个碱基，长度更优选为约20个核苷酸至约60个核苷酸。如果该CMV含有被一个增变区分开的两个同源区，则所述同源区可以更优选每个长8-15个碱基，更优选长10个碱基。
第一链的至少两个同源区由至少3个相邻的核糖型核碱基组成，它们与第二链的脱氧核糖型核碱基进行Watson-Crick碱基配对。在一个优选实施方案中，第一链有9-25个核糖型核碱基，更优选为20个核糖型核碱基，这些核碱基与第二链的脱氧核糖型核碱基进行Watson-Crick碱基配对。在一个实施方案中，第二链中没有核糖型核碱基。在一个实施方案中，第一链的增变区由脱氧核糖型核碱基组成，其侧翼为脱氧核糖型核碱基。或者，该增变区可以第一链的核糖型核碱基和第二链的脱氧核糖型核碱基组成。
该增变区优选由20个或20个以下的碱基组成，更优选由6个或6个以下的碱基组成，最优选由3个或3个以下的碱基组成。该增变区的长度可以不同于将与CMV同源区同源的靶基因区域分开的序列的长度，使得产生靶基因的插入或缺失。当CMV用以将缺失引入靶基因时，没有可鉴别在增变区内的碱基。相反，通过将靶基因中分离的两个同源区并列，实现突变。对本发明来说，认为将缺失引入靶基因的CMV增变区的长度为缺失的长度。在一个实施方案中，该增变区缺失6-1个碱基，更优选缺失3-1个碱基。可以由单一的CMV引入多个分离的突变，在这种情况下，在同一个CMV中有多个增变区。或者，可以同时使用多个CMV，以将多个遗传改变引入单个基因中，或者以将遗传改变引入同一细胞的多个基因中。在此，该增变区也称为异源区。
在一个实施方案中，该CMV是20-200个核碱基的单一的寡核碱基链，最好有40-400个核碱基。在一个可选择的实施方案中，该CMV包含第一和第二寡核碱基链，每条链有20-100个碱基；其中所述第一链包含所述第一链，而所述第二链包含所述第二链。所述第一和第二链不由核碱基共价连接，或者可以仅通过Watson-Crick碱基配对连接。可以用诸如聚乙二醇、聚1，3-丙二醇或聚1，4-丁二醇的寡烷二醇制备所述第一链和第二链的共价连接。
在一个可选择的实施方案中，可以采用包含脱氧核苷酸或脱氧核苷和2’-O取代的核糖核苷酸或核糖核苷的CMV实施本发明。合适的取代基包括Kmiec的申请中指出的取代基-C1-6链烷。可选择的取代基包括美国专利第5,334,711号(Sproat)指出的取代基和专利公告EP629 387和EP 679657(全为Martin的申请)指出的取代基，这些文献通过引用结合到本文中。本文所用的、如Martin的申请或Sproat中所述的具有取代的2’-O的核糖核苷酸或核糖核苷的2’氟、氯或溴衍生物，称为“2’-取代的核糖核苷酸”。特别优选的2’-取代的核糖核苷酸的实施方案是2’-氟、2’-甲氧基、2’-丙氧基、2’-烯丙氧基、2’-羟基乙氧基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟丙氧基和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。在更优选的实施方案中，2’-取代的核糖核苷酸为2’-氟、2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基和2’-烯丙氧基取代的核糖核苷酸。
2’-取代的核糖核苷的定义类似。2’-取代的核糖核苷的特别优选的实施方案是2’-氟、2’-甲氧基、2’-丙氧基、2’-烯丙氧基、2’-羟基乙氧基、2’-甲氧基乙氧基、2’-氟丙氧基和2’-三氟丙氧基取代的核糖核苷酸。在更优选的实施方案中，2’-取代的核糖核苷为2’-氟、2’-甲氧基、2’-甲氧基乙氧基和2’-烯丙氧基取代的核糖核苷酸。
术语“核酸酶抗性核糖核苷”包括2’-取代的核糖核苷，包括2’-取代的核糖核苷酸，也包括非核糖核苷酸的所有2’-羟基核糖核苷。在一个优选实施方案中，该CMV最好包括至少3个、更优选6个核酸酶抗性核糖核苷。在一个优选实施方案中，该CMV不含有核酸酶敏感性核糖核苷。在一个可选择的优选实施方案中，每个其它的核糖核苷均为核酸酶抗性。可以容易地合成嘌呤和嘧啶的某些2’-封闭基团。在该CMV的一个实施方案中，仅所述核糖核苷嘌呤或仅核糖核苷嘧啶是核酸酶抗性的。
该CMV的又一特征在于，含有至少3个核酸酶抗性的核糖型核碱基。在一个优选实施方案中，所有核糖型核碱基均为核酸酶抗性。
5.2适用于体内应用的制剂
CMV和大分子载体的现有技术制剂在体内应用方面具有有限的用途，因为它们的CMV的容量低，并且因为没有保护该CMV抵抗胞外酶。本发明提供三种可选择的大分子载体，克服了现有技术的限制。所述载体是聚乙烯亚胺(PEI)水性核心脂小泡，它们也称为单室脂质体(unilamellelar liposome)和脂质纤球体(nanosphere)。
可以进一步为每种所述载体提供与靶细胞表面蛋白互补的配体。这类配体可用来提高CMV摄入靶细胞的量和特异性。在本发明的一个实施方案中，该靶细胞为肝细胞，而该配体为结合至脱唾液酸糖蛋白受体的半乳糖或乳糖二糖。
5.2.1聚阳离子载体
可以采用体外给予细胞或体内给予受治疗者时无毒的任何聚阳离子实施本发明。合适的实例包括聚碱性氨基酸(诸如聚赖氨酸、聚精氨酸)、碱性蛋白(诸如组蛋白H1)和合成聚合物(诸如支链的聚乙烯亚胺)：
(-NHCH2CH2-)x[-N(CH2CH2NH2)CH2CH2-lγ。
可以用支链的聚乙烯亚胺(PEI)实施本发明，所述聚乙烯亚胺的平均分子量大于约500道尔顿，优选大于约10Kd，更优选大于约25Kd(通过光散射测定的质均分子量)。适用性的上限根据该PEI的毒性和溶解性确定。分子量大于约1.3Md的毒性和溶解性，使得这种PEI材料的适用性较差。在Boussif，O等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.92，7297中，描述高分子量PEI作为载体以用DNA转染细胞的用途，该文献通过引用结合到本文中。可以按照Boussif等的方法，制备PEI溶液。
通过将CMV水溶液和PEI的中性水溶液以每个CMV磷酸酯9-4个氮的比率混合，形成CMV载体复合物。在一个优选实施方案中，该比率为6。例如，通过将0.15M NaCl中的10mM pH 7.0的PEI溶液与CMV混合，形成CMV终浓度为100-50nM，可以形成该复合物。
另外，披网格蛋白小窝受体的配体可以连接至该聚阳离子上，或连接至该聚阳离子的一部分上。在一个实施方案中，该配体是结合至脱唾液酸糖蛋白受体的糖或二糖，诸如乳糖、半乳糖或N-乙酰半乳糖胺。可以使用任何技术连接该配体。通过荧光标记该CMV，并将荧光CMV/分子载体/配体复合物直接注射入目的组织，并按照Kren等，1997，Hepatology 25，1462-1468的方法测定荧光摄入的程度，可以确定配体与聚乙烯亚单位的最佳比率。
用比率为每个氮0.4-0.8个乳糖基部分的乳糖基PEI和未修饰的PEI的1∶1混合物，可以获得良好的结果。该混合物以每个CMV磷酸酯4-9个PEI氮的比率使用。寡核苷酸磷酸酯与氮的优选比率为1∶6。用质均分子量为25Kd和800Kd的PEI可以获得良好的结果，所述PEI可购自Aldrich Chemical Co.，产品目录号分别为40,872-7和18，197-8。
在一个可选择的实施方案中，该聚阳离子载体可以是诸如组蛋白H1的碱性蛋白，它们可以用披网格蛋白小窝受体的配体取代。可以使用组蛋白和CMV的1∶1(w/w)混合物实施本发明。
5.2.2可用于载体中的脂质
加入本发明脂小泡和脂质纤球体载体的脂质的选择不是关键。采用半纯化的脂质生物制剂，例如豆油(Sigma Chem.Co.)、卵磷脂酰胆碱(EPC)(Avanti Polar Lipids)，可以构建脂质纤球体。可用于脂质纤球体和/或脂小泡制备的其它脂质包括中性脂质(例如二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)和二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE))、阴离子脂质(例如二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS))和阳离子脂质(例如二油酰三甲基铵丙烷(DOTAP)、二-十八基二酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)、二油酰三甲基铵(DOTMA)和DOSPER(1，3-二-油酰氧基-2-(6-羟基-spermyl)-丙基-酰胺四乙酸盐，可购自Boehringer-Mannheim)。在Gao，X.和Huany，L，1995，GeneTherapy 2，710中可以发现可用于本发明的脂质的其它实例。糖配体可以以糖脑苷脂的形式(例如乳糖基脑苷脂或半乳糖脑苷脂(Avanti PolarLipids)加入。
脂质的具体选择不是关键。氢化EPC或溶血卵磷脂可以用来替代EPC。可以掺入DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)以提高所述传递系统的效能和/或稳定性。
5.2.3脂质纤球体载体的构建
可以通过以下方法构建脂质纤球体。将一种磷脂的甲醇或氯仿甲醇溶液加入小试管中，通过氮气流去除溶剂，留下脂质膜。通过将CMV的盐水溶液与一种阳离子脂质的乙醇溶液混合，形成CMV亲脂盐。当所述阳离子种类相对于CMV阴离子(磷酸盐)过量4倍摩尔浓度时，可以获得良好的结果。将亲脂CMV盐溶液加至脂质膜，轻轻地涡旋混合，然后加入与所述磷脂等重量量的中性脂质。CMV的浓度可以高至约脂质总量的3％(w/w)。
加入中性脂质后，该乳液于4℃超声处理1小时，直至形成乳状悬浮液，而没有明显的分离迹象。将悬浮液通过聚碳酸酯滤膜挤出，直至达到最终的直径为约50nm。当靶细胞为网状内皮细胞时，脂质纤球体的优选直径为约100-200nm。然后，可以洗涤携带CMV的脂质纤球体，并将其置于药用可接受的载体或组织培养基中。脂质纤球体的容量为约2.5mg CMV/500μl纤球体悬浮液。
5.2.4脂小泡的构建
通过将脂质的氯仿甲醇溶液置于一个试管中，通过氮气流去除溶剂，形成脂质膜。加入CMV的盐水溶液，使得CMV的量为最终混合物中脂质量的20％-50％(w/w)，而水性溶剂量为脂质量的约80％。轻轻涡旋混合后，迫使含脂质体液体通过连续的较细的聚碳酸酯滤膜，直至达到最终的直径为约50nm。通过连续的较细的聚碳酸酯滤膜，导致多层脂质体转化为单室脂质体，即小泡。当靶细胞为网状内皮细胞时，所述脂质纤球体的优选直径为约100-200nm。然后可以洗涤携带CMV的脂质纤球体，并将其置于药用可接受的载体或组织培养基中。
将所述CMV包入所述小泡的水性核心中。包入约50％加入的CMV。
基本方法的变化包括形成含比率为每个CMV磷酸盐约4个PEI亚胺的PEI/CMV浓缩物的水溶液。当所述脂质体带正电时，即当所述脂小泡含有的阳离子脂质(诸如DOTAP、DOTMA或DOSPER)的阳离子浓度大于阴离子脂质(诸如DOPS)的阴离子浓度时，所述浓缩物特别有用。脂小泡的容量为约每500μl脂小泡悬浮液150μg CMV。
在一个优选实施方案中，所述脂小泡含有阴离子磷脂DOPS和中性脂质(诸如DOPE或DOPC)的混合物。或者，可以用以制备脂小泡的带负电磷脂包括二油酰磷脂酸(DOPA)和二油酰磷脂酰甘油(DOPG)。在一个更优选的实施方案中，所述中性脂质为DOPC，而DOPS∶DOPC的比率在2∶1和1∶2之间，最好为1约1∶1。带负电脂质与中性脂质的比率应该大于1∶9，因为低于10％的带电荷脂质由于小泡融合而导致脂小泡不稳定性。
通过采用特定的脂小泡制剂和长度约5.0kb的质粒一起转染靶细胞，可以测定该制剂，其中所述质粒在转染的靶细胞中表达某些容易检测到的产物。如果该质粒与PEI以亚胺∶磷酸盐约9-4∶1的比率浓缩，则可以用脂小泡和该质粒一起转染细胞。该脂小泡制剂与质粒一起转染细胞的能力，是该制剂将CMV引入细胞并实现衍生的能力的指标。
某些脂质，特别是聚阳离子脂质，可能对某些细胞系和原代细胞培养物有毒性。应该调节所述脂小泡制剂，以避免这类有毒的脂质。
可以通过多种方法，将披网格蛋白小窝受体的配体引入所述脂小泡中。可以将诸如乳糖脑苷脂或半乳糖脑苷脂的脑苷脂类引入脂质混合物中，并掺入脂小泡中，以产生脱唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一个可选择的实施方案中，所述脂小泡还包含一个完整的膜蛋白，该蛋白本身插入所述脂小泡的脂质双层中。在一个具体实施方案中，该蛋白为融合性的(fusigenic)(F-蛋白)，来自或者称为仙台病毒或日本血凝病毒(HVJ)的病毒。已经报道了含F-蛋白的脂小泡的制备和使用其将DNA引入肝细胞、心肌细胞和内皮细胞。参见例如美国专利第5,683,866号、国际申请PCT JP97/00612(公布为WO 97/31656)。也参见Ramani，K.等，1996，FEBS Letters 404，164-168；Kaneda，Y.等，1989，J.Biol.Chem.264，121126-12129；Kenada，Y.等，1989，Science243，375；Dzau，V.J.等，Proc.Natl. Acad.Sci.93，11421-11425；Aoki，M.等，1997，J.Mol.Cardiol.29，949-959。
5.3疾病和疾病特异性CMV
本发明用来校正任何致病的突变，其中该突变导致一个或多个核苷酸改变、或插入或缺失1至约30个核苷酸。在一个优选实施方案中，缺失或插入1至约6个核苷酸。通过给予含与该突变基因座同源的野生型基因序列的CMV，校正所述致病突变。构建该CMV，使得有多个与异源区侧翼的突变DNA序列同源的区，即含有该突变体不存在的野生型序列的部分的CMV区。当该突变由插入组成时，该CMV的异源区被认为是与插入位点同源的点。因此，该CMV异源区的长度被认为是突变序列中插入的长度。请注意，通过突变位置确定CMV的序列，然而，该突变的序列并不重要。相反，CMV的序列通常是野生型基因序列或所需的相关序列。在以下每个序列中，在异源区下划线。
本发明的第一个实施方案，是可以用来校正引起威勒布兰特病的突变的CMV。校正该突变的CMV含有序列5’-CTC GGA GAG
C CCCCTC GCA-3’(SEQ ID No.1)或其互补序列，所述序列是混合的核糖-脱氧核糖寡核碱基的序列，具有相同的碱基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。需要校正威勒布兰特因子基因的组织是血管内皮。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起血友病B的突变的CMV，所述突变为人凝血因子IX基因的nt 1234的A→T的置换。校正该突变的CMV含有序列5’-CAA GGA GAT
AGT GGG GGA C-3’(SEQ ID No.2)或其互补序列，所述序列是混合的核糖-脱氧核糖寡核碱基的序列，具有相同的碱基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。本发明可以用来校正人类凝血因子IX基因中的其它突变，该基因的序列在Kurachi，K.等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.79，6461-6464中给出，该文献通过引用结合到本文中。需要校正因子IX基因的组织是肝脏肝细胞。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起α1-抗胰蛋白酶缺陷的Z-突变的CMV。Z-突变为人类α1-抗胰蛋白酶基因的nt 1145的G→A的置换。校正该突变的CMV含有序列5’-ACC ATC GAC
GAGAAA GGG A-3’(SEQ ID No.3)或其互补序列，所述序列是混合的核糖-脱氧核糖寡核碱基的序列，具有相同的碱基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。本发明用来校正人类α1-抗胰蛋白酶基因中的其它突变，该基因的序列在Long，G.L.等，1984，Biochemistry 23，4828-4837中给出，该文献通过引用结合到本文中。需要校正α1-抗胰蛋白酶基因的组织是肝脏肝细胞。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起家族性血胆固醇过多(FH)的低密度脂蛋白受体(LDLR)突变的CMV。没有引起大多数FH病例的单一突变。在Hobbs，H.H.等，1992，Hum.Mutat.1，445-466和Leren，T.P.等，Hum.Genet.95，671-676中，可以发现对引起FH的超过105个点突变或25nt或更少的插入或缺失的调查，所述文献通过引用结合到本文中。人类LDLR cDNA的完整序列公开于Yamamoto，T.等，1984，CELL 39，27-38中。需要校正LDLR以减轻FH的组织是肝脏肝细胞。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起戈谢病的葡萄糖脑苷脂酶基因突变的CMV。可以用来校正戈谢病突变的CMV的结构，可以在共同特许的美国申请序列第08/640,517号中发现。可以校正葡萄糖脑苷脂酶突变以获得减轻戈谢病的组织是肝脏网状内皮(Kupffer细胞)。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起1型胰高血糖素储存病(GSD)的葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-P)基因突变的CMV。在Lei，K.-J.等，SCIENCE 262，580中给出所述人类G-6-P的完整序列，该文献通过引用结合到本文中。引起1型GSD的两种最常见的突变为nt 326的C→T、nt 1118的C→T、和于nt 459插入TA，如Lei，J.-J.等，J.Clin.Investigation 95，234-240中所述，该文献通过引用结合到本文中。校正这两种最常见突变的CMV含有序列5’-TTT GGA CAG
CGTCCA TAC T-3’(SEQ ID No.4)或5’TGC CTC GCC
CAG GTC CTG G-3’(SEQ ID No.5)或它们的互补序列，所述序列是混合的核糖-脱氧核糖寡核碱基的序列，具有相同的碱基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)基因突变的CMV，OTC基因是一种X连锁基因，该酶催化鸟氨酸和氨甲酰磷酸缩合产生瓜氨酸和磷酸。在Horwich，A.L.等，1984，Science224，1068中给出了人类OTC cDNA的完整序列，该文献通过引用结合到本文中。在Tuchman，M.，1992，Human Mutation 2，174中综述了OTC基因的结构和所鉴定的突变体结构的综述。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起克-奈综合征的人类UDP-葡糖醛酸基转移酶基因突变的CMV。在Bosma，P.J.等，1992，Hepatology，15，941-7中给出了人类UDP-葡糖醛酸基转移酶基因的序列，该文献通过引用结合到本文中。可以校正UDP-葡糖醛酸基转移酶基因以减轻克-奈综合征的组织是肝脏肝细胞。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正引起半乳糖血的半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因突变的CMV。在Flack，J.E.等，1990 Mol.Biol.Med.7,365中描述了人类半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶基因的序列，而在Reichert，J.K.V.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.88，2633-37和Reichert，J.K.V.等，1991，Am.J.Hum.Gen.49，860中描述了半乳糖血的分子生物学和群体遗传学，这些文献通过引用结合到本文中。引起半乳糖血的最常见的突变是氨基酸188的Q→R。校正该突变的CMV含有序列5’-CC CAC TGC C
AG GTA TGG GC-3’(SEQ ID No.6)或其互补序列，所述序列是混合的核糖-脱氧核糖寡核碱基的序列，具有相同的碱基序列或因用尿嘧啶取代胸腺嘧啶而不同的序列。
本发明的再一实施方案，是可以用来校正苯丙氨酸羟化酶(PAH，苯丙氨酸-4-单加氧酶，EC 1.14.16.1)突变的CMV，该突变引起苯丙酮酸尿(PKU)或血苯丙氨酸过多。在Woo，SLC，1989，Biochemistry28，1-7中描述了苯丙酮酸尿的分子遗传学和群体遗传学，在Kowk，S.C.M.等，1985，Biochemistry 28，556-561中描述了人类PAH的序列，所述文献通过引用结合到本文中。引起PKU的突变的其它实例可以在Sworniczak，B.等，1992，Hum Mutat.1，138-146中发现。
本领域技术人员会认识到，本发明可以用来在“正常”基因中制造有益的改变，其中已经鉴定出这种有益改变的身份。例如，3,000个人中有多达1人的血清胆固醇水平为100mg/dl或更低，因为这类个体是截短的脂蛋白apo B基因杂合的。Kane，J.P.和Havel，R.J.THEMETABOLIC BASIS OF INHERITED DISEASE，第II卷(1995，McGraw Hill，New York)第1866页。本文所用的“致病突变”包括诸如apo B基因的实例，其中“正常”基因与疾病相关，即动脉硬化症，而杂合形式的稀有等位基因保护抵抗该疾病。因此，在这些情况下，统计学上最普遍的基因应该被认为“致病基因”，而具有有益改变的基因应该被认为是“野生型基因”。5.4所述制剂的体内应用
本发明的CMV可以以50-250μg/gm的剂量直接胃肠外给予靶器官。当靶器官为肝肌或肾时，该CMV/大分子载体复合物可以直接注射入器官中。当靶器官为肝脏时，可以使用静脉内注射入肝脏的肝静脉或门静脉，所述静脉的循环已暂时阻塞。或者，CMV/大分子复合物可以还包含肝导向配体，诸如乳糖基糖或半乳糖基糖，该配体允许将所述CMV/大分子复合物静脉内给予进入体循环。
当靶器官是肺或其组织时，例如为细支气管上皮时，可以通过气溶胶给予CMV/大分子复合物。在Schwarz L.A.等，1996，Human GeneTherapy 7，731-741中，描述了脂质体/DNA复合物的小颗粒气溶胶传递。
当靶器官为血管内皮时，例如在威勒布兰特病中，可以将CMV/大分子复合物直接传递入体循环中。利用提供有配体的脂质体可以导向其它器官，所述配体使得脂质体能够通过循环系统内皮细胞外渗。
对于酶缺陷，通过校正1％的受影响组织的细胞，可以获得治疗效果。在实质细胞具有较长寿命的组织中，例如在肝脏中，可以重复进行用CMV的治疗，以获得增强的治疗效果。
6.实施例
6.1CMV/大分子载体复合物
6.1.1脂质纤球体材料
卵磷脂酰胆碱(EPC)、DOTAP和半乳糖脑苷脂(Gc)(Avanti PolarLipids)；豆油(Sigma Chemical Co.)；二-十八基二酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)(Promega)。方法
将EPC、DOTAP和Gc以限定浓度预先溶于氯仿和无水甲醇中，并于20℃贮存于干燥容器中的小玻璃瓶中直至使用。将EPC(40-45mg)、DOTAP(200μg)和Gc(43μg)的溶液等份装入小的10×75mm硼硅酸盐试管中，在氮气流下去除溶剂。CMV在0.15M NaCl(～80-125μg/250-300μl)中稀释；DOGS(作为乙醇中的10mg/ml溶液)以3-5倍于加入的CMV的重量在250-300μl 0.15M NaCl中稀释。将两种溶液温和涡旋混合，以混合内容物，然后将CMV溶液缓慢加入DOGS溶液中。通过轻敲并倒转试管数次，混合内容物。将DOGS复合物溶液加至干燥的脂质，然后加入豆油(40-45mg)，将该混合物涡旋高速混合数秒，在控制4℃温度的房间，在FS-15(Fisher Scientific)中浴式超声波仪(bath sonicator)中浴式超声处理～1小时。不时从浴式超声波仪中取出试管并进行涡旋混合。当看起来均匀时，形成乳状悬浮液(没有明显的油滴分离)，将其通过一系列聚碳酸酯膜挤出至孔径为50nm。制剂贮存于4℃待用，并在使用前进行涡旋混合。
6.1.2带负电定向脂小泡材料
二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、半乳糖脑苷脂(Gc)或乳糖基脑苷脂(Avanti Polar Lipids)。方法
将DOPS、DOPC和Gc以1∶1∶0.16(500μg总脂质)的摩尔比溶于氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然后在氮气流下干燥，获得均匀的脂质膜。将CMV在500μl0.15M NaCl(约100-250μg/500μl)中稀释。于室温下将该溶液加至脂质膜。通过交替的温和涡旋混合和加温(在37-42℃水浴中)将脂质完全分散。在均匀的乳状悬浮液形成后，用Liposofast小挤出机，将其通过一系列聚碳酸酯膜(孔径为0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)挤出。通过每种孔径挤出5-7次。制备后，脂小泡贮存于4℃待用。在这些条件下，所述脂小泡稳定至少1个月。可以将终产物冻干。
6.1.3中性定向脂小泡材料
二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、半乳糖脑苷脂(Gc)或乳糖基脑苷脂(Avanti Polar Lipids)。方法
将DOPC、DOPE和Gc(1∶1∶0.16摩尔比)或DOPC∶Gc(1∶0.08)溶于氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然后在氮气流下干燥，获得均匀的脂质膜。将所述寡核苷酸(或嵌合分子)在500μl 0.15M NaCl(约100-250μg/500μl)中稀释。于室温下将该溶液加至脂质膜。通过交替的温和涡旋混合和加温(在37-42℃水浴中)将脂质完全分散。在均匀的乳状悬浮液形成后，用Liposofast小挤出机，将其通过一系列聚碳酸酯膜(孔径为0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)挤出。通过每种孔径挤出5-7次。制备后，脂小泡贮存于4℃待用。所述制剂的脂小泡的大小稳定约5天。
6.1.4带正电定向脂小泡材料
二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二油酰三甲基铵丙烷(DOTAP)、半乳糖脑苷脂(Gc)或乳糖基脑苷脂(Avanti Polar Lipids)、聚乙烯亚胺(PEI)(M.W.800Kd)，Fluka Chemicals。方法
将DOPC、DOTAP和Gc(6∶1∶0.56摩尔比)(500μg总脂质)溶于氯仿∶甲醇(1∶1v/v)中，然后在氮气流下干燥，获得均匀的脂质膜。将PEI用水稀释至45mg/100ml的浓度。用HCl将该溶液的pH调至～7.6。每次新制备该PEI母液，该母液等于约50nmol胺/μl。将CMV在0.15M NaCl中稀释，浓度为250μl中～250μg。将PEI进一步稀释到250μl0.15M NaCl中，使得每摩尔寡核苷酸/嵌合磷酸酯存在约4摩尔PEI胺。将PEI溶液滴加至CMV溶液(均在室温下)，并涡旋混合5-10分钟。然后将PEI-复合物溶液加至脂质膜，如上所述分散脂质。在均匀的乳状悬浮液形成后，用Liposofast小挤出机，将其通过一系列聚碳酸酯膜(孔径为0.8、0.4、0.2、0.1和0.05μm)挤出。通过每种孔径挤出5-7次。制备后，脂小泡贮存于4℃待用。在这些条件下，所述脂小泡稳定至少1个月。为了稳定更长时间和提高稳定性，可以将该终产物冻干。
6.1.5乳糖基-PEI/PEI复合物
PEI(25 kDa)购自Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)。PEI(800kDa)购自Fluka Chemicals(Ronkokoma，NY，USA)。通过先前描述的将寡糖与蛋白缀合的方法的修改方法，进行PEI的乳糖基化。简而言之，将3-5ml PEI(0.1-1.2M单体)的乙酸铵(0.2M)或Tris缓冲液(0.2M)(pH7.6)溶液与7-8mg氰基硼氢钠(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)和约30mg乳糖单水合物(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)一起温育。在盖紧的聚丙烯试管中于37℃振荡水浴中进行反应。10天后，将反应混合物对蒸馏水(500ml)透析48小时，更换1-2次水。将纯化的复合物通过0.2μm滤膜除菌过滤，并贮存于4℃。通过苯酚-硫酸法测定与PEI结合的糖(作为半乳糖)量。
如下测定乳糖基PEI中游离胺(伯胺+仲胺)的摩尔数：用0.02MPEI母液建立标准曲线；用去离子水在玻璃试管中将数等份母液稀释至1ml，然后将50μl茚三酮试剂(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo)加入每个试管中，并剧烈涡旋混合10秒。让其于室温下显色10-12分钟，然后在Beckman DU-64分光光度计上读出485nm下的O.D.(在4分钟内)。如上处理20-50μl等份的L-PEI样品，并根据标准曲线测定游离胺的摩尔数。如下制备乳糖基-PEI(L-PEI)复合物：将每mmolRNA/DNA磷酸酯3mmol作为L-PEI的胺和3mmol作为PEI的胺的相当物一起混合，并在0.15M NaCl中根据需要稀释；将混合物滴加至嵌合溶液中，并涡旋混合5分钟。
为了证实嵌合寡核苷酸与PEI或L-PEI的完全结合，进行未复合和复合的嵌合物的凝胶分析(4％LMP琼脂糖)。为了测定由所述嵌合物的复合提供的抵抗核酸酶降低的保护作用的程度，将样品用RNA酶和DNA酶处理。氯仿苯酚抽提后，用肝素(50单位/μg核酸)将复合物解离，在4％LMP琼脂糖凝胶上分析产物。6.2PEI/CMV介导的大鼠和人类因子IX改变的证明
材料.胎牛血清得自Atlanta Biologicals，Inc.(Atlanta，GA)。末端转移酶、荧光素-12-dUTP、ExpandTM高保真度PCR系统、dNTP和高纯度PCR模板制备试剂盒得自Boehringer Mannheim Corp.(Indianapolis，IN)。ReflectionTM NEF-496放射自显影膜和ReflectionTMNEF-491增感屏来自DuPont NENResearch Products(Boston，MA)。聚乙烯亚胺(PEI)800 kDa得自Fluka Chemical Corp.(Ronkonkoma，NY)。[γ-32P]ATP获自ICN Biochemicals Inc.(Costa Mesa，CA)。pCRTM2.1获自Invitrogen(San Diego，CA)。OPTIMENTM、Dulbecco修改的Eagle培养基、William E培养基和寡核苷酸365-A和365-C来自Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)。为30,000molwt截留值的离心膜购自Millipore Corp.(Bedfor，MA)。Dil和SlowFadeTM抗褪色封固剂获自Molecular Probes，Inc.(Eugene，OR)。T4多核苷酸激酶购自New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)。MSI MagnaGraph膜购自Micron Separations，Inc.(Westboro，MA)。用于PCR扩增的引物获自Oligos Etc.，Inc.(Wilsonville，OR)。氯化四甲基铵购自Sigma ChemicalCompany(St.Louis，MO)。所有其它化学药品均是分子生物学级或试剂级，购自Aldrich Chemical Company(Milwaukee，WI)、CurtinMatheson Scientific，Inc.(Eden Prairie，MN)和Fisher Scientific(Itasca，IL)。
寡核苷酸合成，合成嵌合的RNA/DNA寡核苷酸HIXF、RIXF和RIXR。用DNA和2’-O-甲基RNA磷酰胺核苷单体，在ABI 394合成仪上制备该CMV。用苯甲酰(腺苷和胞苷)和异丁酰(鸟苷)保护DNA磷酰胺外向环胺基团。在2’-O-甲基RNA磷酰胺上的保护基团对于腺苷为苯氧基乙酰，对于胞苷为异丁酰，而对于鸟苷为二甲基甲酰胺。在合成后，通过在乙醇/浓氢氧化铵中于55℃加热20小时，去除碱基保护基团。将粗制寡核苷酸在含有7M尿素的15％聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用UV shadowing使DNA显现。从凝胶条上洗脱出所述嵌合分子，通过沉淀浓缩，并用G-25离心柱脱盐。大于95％的纯化的寡核苷酸是全长的。
野生型和“突变型”大鼠因子IX的序列为
(SEQ ID No.7) 365
wt AAA GAT TCA TGT GAA GGA GAT AGT GGG GGA CCC CAT GTT
Lys Asp Ser Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
(SEQ ID No.8)
(SEQ ID No.9)
mt AAA GAT TCA TGT GAA GGA GAT
CGT GGG GGA CCC CAT GTT
Arg
RIXR、RIXF和HIXRCMV的结构如下：
RIXR (SEQ ID No.10)
TGCGCG-ccccagggggTG
CTAgaggaaguguTT TT T
TCGCGC GGGGTCCCCCAC
GATCTCCTTCACAT
3′ 5′
RIXRc (SEQ ID No. 11)
TGCGCG-acacuuccucTA
GCAcccccuggggTT TT T
TCGCGC TGTGAAGGAGAT
CGTGGGGGACCCCT
3′ 5′
RIXF (SEQ ID No. 12)
TGCGCG-acacuuccucTA
GCAcccccuggggTT TT T
TCGCGC TGTGAAGGAGAT
CGTGGGGGACCCCT
3′5′
HIXF (SEQ ID No. 13)
TGCGCG-acaguuccucTA
GCAcccccuggggTT TT T
TCGCGC TGTCAAGGAGAT
CGTGGGGGACCCCT
3′ 5′
大写字母是脱氧核糖核苷酸，小写字母是2’OMe-核糖核苷酸。在异源区的核苷酸下划线。
细胞培养、转染和肝细胞分离。在潮湿的CO2氖围中，HuH-7细胞于37℃在含有10％(体积/体积)热灭活胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基中维持。转染前24小时，每个35mm培养皿平板接种1×105细胞。在转染时，细胞用OPTIMEMTM培养基冲中洗2次，在1ml相同培养基中进行转染。转染后18小时，将2ml含20％(体积/体积)热灭活胎牛血清的Dubecco改进的Eagle培养基，加至每个35mm培养皿，再将细胞维持30小时，然后收获用于DNA分离。制备PEI(800kDa)10mM pH 7.0的母液。简而言之，将嵌合寡核苷酸与10mM PEI以每个嵌合磷酸酯9个PEI氮相当物一起，在100μl 0.15M NaCl中以150nM(4μg)、300nM(8μg)和450nM(12μg)的任一个终浓度转染。18小时后，再加入2ml培养基，并将嵌合物浓度分别减至50nM、100nM和150nM，进行其余30小时的培养。HuH-7载体对照转染利用与HulXF转染中所用的等量的PEI，但用等体积的10mMTris-HCl pH 7.6替代所述寡核苷酸。
通过先前描述的两步胶原酶灌注(Fan等，Oncogene 12：1909-1919，1996，该文献通过引用结合到本文中)，从250g雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan Sprague-Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)中分离大鼠初级肝细胞，并在PrimariaTM板上以每35mm培养皿4×105细胞的密度平板接种。培养物在William E培养基中维持，该培养基补充了10％热灭活FBS、26mM碳酸氢钠、23mM HEPES、0.01U/ml胰岛素、2mML-谷酰胺、10mM地塞米松、5.5mM葡萄糖、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素。平板接种后24小时，用相同培养基洗涤肝细胞两次，加入1ml新鲜培养基，用PEI/嵌合寡核苷酸复合物，以HuH-7细胞的相同浓度转染细胞。18小时后，再加入2ml培养基，6小时或30小时后收获细胞。
将嵌合寡核苷酸直接注射入肝脏将雄性Sprague-Dawley大鼠(约175g)维持在标准的12小时光/黑暗周期，并随意喂食标准实验室食物。将大鼠麻醉，施行中线切口，暴露肝脏。当它们进入尾状叶时，将夹子夹于肝静脉和门静脉上，将终体积为250-300μl的75μg 1∶9嵌合物/PEI复合物直接注射入尾状叶。将尾状叶保持结扎15分钟，除去夹子恢复血液流动。缝合切口后，让动物从麻醉中苏醒，随意给予食物和水。用等体积Tris-HCl pH 7.6替代嵌合寡核苷酸，进行载体对照。注射后24小时和48小时，处死动物，取出尾状叶，解剖注射部位周围的组织用于DNA分离。分离DNA，通过PCR扩增大鼠因子IX基因的末端外显子。
嵌合分子的核摄入按照生产商的建议，用末端转移酶和荧光素-12-dUTP对嵌合双链体进行3’末端标记，然后将其与未标记的寡核苷酸以2∶3的比率混合。如上所述进行转染，24小时后，将细胞在含有4％低聚甲醛(重量/体积)的磷酸缓冲盐水pH 7.4中于室温下固定10分钟。固定后，按照生产商的建议，细胞用Dil在0.32M蔗糖中的5μM溶液复染10分钟。用0.32M蔗糖洗涤，然后用磷酸缓冲盐水pH 7.4洗涤后，细胞用磷酸缓冲盐水中的SlowFadeTM抗褪色封固剂盖上盖玻片，用MRC1000聚焦显微镜(BioRad，Inc.，Hercules，CA)检查。如上所述用荧光标记的嵌合物原位注射肝脏尾状叶，注射后24小时收获。将尾状叶纵向对切，用OCT包埋并冷冻。将冷冻切片切为约10μm厚，于室温下用含有4％低聚甲醛(重量/体积)的磷酸缓冲盐水pH 7.4固定10分钟。固定后，按照生产商的建议，细胞用Dil在0.32M蔗糖中的5μM溶液复染10分钟。用0.32M蔗糖洗涤，然后用磷酸缓冲盐水pH 7.4洗涤后，切片用SlowFadeTM抗褪色封固剂盖上盖玻片，用MRC1000聚焦显微镜(BioRad，Inc.)检查。以1μM的跨距制备固定细胞和切片组织的标本系列，以确立在核中存在该嵌合物。
DNA分离和克隆。转染后24小时和48小时，通过刮取收获细胞。用高纯度PCR模板制备试剂盒，按照生产商的建议，分离大于100-150碱基对的基因组DNA。用500ng分离的DNA，进行人类肝IX基因中第8个外显子的317-nt片段的PCR扩增。所用的引物是分别对应于人类因子IX cDNA的核苷酸1008-1032和1300-1324的5’-CATTGCTGACAAGGAATACACGAAC-3’(SEQ ID No.14)和5’-ATTTGCCTTTCATTGCACACTCTTC-3’(SEQ ID No.15)。将引物于58℃退火20秒，于72℃延伸45秒，并于94℃进行变性45秒。用Expand Hi-fidelityTM聚合酶，将样品扩增30个循环。用500ng从或者初级肝细胞或者肝尾状叶中分离的DNA，进行大鼠因子IX基因的374-nt片段的PCR扩增。所用的引物是分别对应于大鼠因子IX cDNA的核苷酸443-457和782-806的 5’-ATTGCCTTGCTGGAACTGGATAAC-3’(SEQ ID No.16)和5’-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3’(SEQ ID No.17)。将引物于59℃退火20秒，于72℃延伸45秒，并于94℃进行变性45秒。用Expand Hi-fidelityTM聚合酶，将样品扩增30个循环。按照生产商的建议，将来自人类和大鼠因子IX基因的PCR扩增产物，亚克隆入TA克隆载体pCRTM2.1中，并用连接的材料转化冷冻的感受态大肠杆菌。
菌落杂交和序。平板接种18-20小时后，将菌落影印至MSIMagnaGraph尼龙滤膜上，复制并按照生产商的建议处理，以用于杂交。滤膜与17mer寡核苷酸探针365-A(5’-AAGGAGAT
AGTGGGGGA-3’)(SEQ ID No.18)或365-C(5’-AAGGAGAT
CGTGGGGGA-3’)(SEQ ID No.19)杂交24小时，其中下划线的核苷酸是诱变的靶。用[γ-32]ATP(＞7,000 Ci/mmol)和T4多核苷酸激酶，按照生产商的建议，32P末端标记所述探针。于37℃，在含1％SDS的2X氯化钠柠檬酸钠、5X Denhardt’s和200μg/ml变性超声处理的鱼精DNA中进行杂交。杂交后，滤膜在1X氯化钠磷酸盐EDTA、0.5％SDS中冲洗，然后于54℃在含3M氯化四甲基铵、2mM EDTA pH 8.0、0.1％SDS的50mM Tris-HCl pH 8.0中洗涤1小时。用NENReflection膜，采用增感屏于-70℃进行放射自显影。用Qiagen小量制备试剂盒(Chatsworth，CA)，从鉴定为与365-A或365-C杂交的菌落制备质粒DNA，并用mp13反相引物，在ABI 370A测序仪(Perkin-Elmer，Corp.，Foster City，CA)上对质粒DNA进行自动测序。体内结果
将嵌合寡核苷酸进行荧光素标记，并用来测定直接注射入肝脏的尾状叶是否可行。结果表明，在尾状叶内注射位点邻近的肝细胞，与在分离的初级肝细胞和HuH-7细胞中观察到的相似，显示出摄入荧光标记的嵌合分子。尽管在胞质中存在某些点状物质，但主要在核中检测到标记物质。事实上，在距注射位点最远的肝细胞中仅观察到核的标记。用相同的方案，将未标记的PEI/RIXF嵌合复合物和载体对照，直接注射入尾状叶中，注射后24小时和48小时后处死动物。按方法中所述，分离肝脏DNA，对该DNA进行PCR扩增跨越定向nt交换位点的374nt的序列。亚克隆和用PCR扩增物质转化大肠杆菌后，将转化菌落的双份滤膜影印。如在方法中所述，滤膜与对或者365-A(野生型)或365-C(因子IX突变)特异性的32P标记的17mer寡核苷酸探针杂交，并在杂交后处理。接受直接肝注射RIXF嵌合分子的大鼠，于24小时和48小时时，表现出的A→C的转化率为约1％。相反，载体对照没有表现出与365-C探针杂交。培养来自RIXF处理动物、与365-C探针杂交的菌落，分离质粒DNA，并进行测序以证实A→C的转化。扩增的374-nt片段的末端与引物准确地相对应，观察到的唯一核苷酸变化是靶交换位点的A→C。6.3乳糖基-PEI/CMV介导的大鼠因子IX改变的证实
6.3.1结果
如以上6.1.5小节中所述，用RIXR寡核苷酸制备与乳糖基-PEI和PEI的混合物复合的CMV。也构建导向因子IX同一区互补链的CMV(RIXRc)。嵌合寡核苷酸于Ser365的定向核苷酸转化
荧光素标记的嵌合分子的核定位显示在分离的大鼠肝细胞中的有效转染。然后用800kDa PEI作为载体，用浓度相当的未标记的嵌合分子因子RIXRc和RIXR，转染培养的肝细胞。另外，同时进行载体对照转染。转染后48小时，收获细胞，分离DNA并加工，以按6.1.5小节中所述进行杂交。通过PCR扩增和克隆的因子IX基因外显子8的374-nt的序列(Sarkar，B.，Koeberl，D.D.和Somer，S.S.，“对6个物种的因子IX基因的活化肽和催化域的直接测序”，Genomics，6，133-143，1990)双份菌落影印物的杂交，检测于Ser365的A→C定向核苷酸转化。用来区别野生型365-A(5’-AAGGAGATAGTGGGGGA-3’)(SEQ ID No.20)或转化的365-C(5’-AAGGAGATCGTGGGGGA-3’)(SEQ ID No.21)的17mer寡核苷酸探针对应于该cDNA序列的核苷酸710至762。
通过将与365-C寡核苷酸杂交的克隆数除以与两种寡核苷酸探针杂交的克隆数，计算定向核苷酸的总转化率。表1总结了RIXRc的结果。在用RIXR或RIXRc转染的初级肝细胞中，仅观察到于Ser365的A→C的转化。在用RIXR或RIXRc转染的肝细胞中，观察到相似的转化率。在载体转染细胞或用其它嵌合寡核苷酸转染的细胞中，均未产生任何与365-C寡核苷酸探针杂交的克隆(未发表的观察)。另外，没有观察到365-C寡核苷酸探针与下述DNA的克隆杂交，所述DNA从未处理肝细胞中分离、并在0.5-1.5μg所述寡核苷酸存在下PCR扩增。采用6.1.5小节中所述的乳糖基PEI衍生物，分离肝细胞中的A→C转化率也是剂量依赖性的，高达19％。从用乳糖基EPI平行转染的培养细胞中分离的RNA的RT-PCR和杂交分析，证明A→C的转化率范围为11.9-22.3％。通过嵌合寡核苷酸在完整的肝脏中的定点核苷酸交换
荧光素标记的寡核苷酸也用来检测直接注射入肝脏的尾状叶后，所述嵌合分子的细胞摄入。结果表明，尾状叶中注射位点邻近的肝细胞表现出摄入荧光素标记的嵌合物，与在分离的大鼠肝细胞中观察到的相似。尽管在所述肝细胞胞质中存在某些点状物质，但标记物质主要存在于核中。事实上，在距注射位点最远的那些区域中仅观察到核标记。然后，通过尾静脉注射25kDa PEI，体内给予未标记的RIXR嵌合寡核苷酸和载体对照，注射后5天收获肝脏组织。分离肝脏DNA，并采用与初级肝细胞所用的那些引物，PCR扩增跨越定向核苷酸交换位点的374-nt序列。亚克隆和用PCR扩增物质转化大肠杆菌后，进行转化菌落的双份滤膜影印。所述滤膜与相同的32P标记的、对或者365-A(野生型)或者365-C(突变型)特异性的17mer寡核苷酸杂交，并进行杂交后处理。用100μg RIXR嵌合寡核苷酸处理的大鼠，表现出A→C的转化率范围为13.9％-18.9％，而接受两次注射总共350μg的那些大鼠，表现出40％转化。相反，载体对照没有表现出与365-C探针杂交。分离的RNA的RT-PCR杂交表明，在接受高剂量的肝脏中A→C的转化频率为26.4％-28.4％。载体处理的大鼠的APTT范围为对照值的89.7％-181.9％(131.84％±32.89％)，而所述寡核苷酸处理的动物的APTT范围为48.9％-61.7％(53.8％±4.8％)。
测定正常(n＝9)和注射两次的动物(n＝3)的大鼠测试血浆在Hepes缓冲液(50mM Hepes/100mM NaCl/0.02％NaN3，pH 7.4)中的1/10稀释液的APTT时间。根据由12只6-8周龄雄性大鼠合并的血浆的稀释液(1∶10至1∶80)APTT结果构建的log-log标准曲线，测定双份样品的因子IX活性。正常大鼠的APTT结果的范围为对照值的89.7％-181.9％(平均值＝131.84％±32.89％)，而注射两次的动物的APTT结果的范围为49.0％-61.7％(平均值＝53.8％±5.8％)。正常大鼠的APTT凝固时间以秒计的范围为60.9秒至81.6秒(平均值＝71.3±7.3秒)，而两次感染的大鼠的APTT时间范围为92.3秒至98.6秒(平均值＝96.3±2.9秒)。分离的肝细胞和完整肝脏中突变的因子IX基因的序列分析
对野生型和突变型基因进行直接测序，以证实得自体外和体内研究中滤膜杂交的结果。分析了至少10个来自完整肝脏或分离的肝细胞、与或者365-A或者365-C杂交的独立的克隆。测序结果表明，与365-A杂交的菌落(图6，顶部图板)表现出野生型IX序列，即于报道的cDNA序列的Ser365为A。相反，得自因子RIXRc转染的初级肝细胞、与365-C寡核苷酸探针杂交的那些菌落，转化为Ser365的C。在得自转染的大鼠肝脏、与17mer 365-C寡核苷酸探针杂交的克隆中，观察到于Ser365的相同的A→C转化。对所有克隆的因子IX基因的完整的374-nt PCR扩增区进行测序，没有检测到非Ser365的指定变化的改变。最后，得自初级肝细胞和完整的肝脏的374-nt PCR扩增的基因组DNA的起点和终点，准确地对应于用于扩增方法的引物的起点和终点，表明所克隆和测序的DNA得自基因组DNA，而不是非降解的嵌合寡核苷酸。表1 通过菌落影印物杂交测定的大鼠因子IX基因组DNA于Ser365的A→C转化的百分率PEI传递传统 365-C克隆 总克隆 A→C
(％)PEI800kDa1 浓度体外 150nM 24 572 4.2
300 31 367 8.5
450 63 501 12.5Lac-PEI800kDa体外 90 18 337 5.3
180 34 300 11.3
270 47 253 18.6Lac-PEI25kDa体外 90 28 527 5.3
180 53 417 12.7
270 60 305 19.7Lac-PEI25kDa2剂量体内×1 100μg 24 166 14.5
71 386 184
50 360 13.9Lac-PEI 25 kDa体内×2 350μg 237 601 39.4
228 563 40.5
271 678 40.01所显示的初级肝细胞转染的数据代表两个试验的平均值。2以300μl 5％葡萄糖，通过尾静脉注射给予体内嵌合物/PEI复合物。单独显示每个剂量的3只动物的结果。6.3.2材料和方法
嵌合寡核苷酸的体内传递。将雄性Sprague-Dawley大鼠(HarlanSprague-Dawley，Inc.)(～50g)维持在标准的12小时光/黑暗周期，随意喂食标准实验室食物。300μl 5％葡萄糖中的载体对照和比率为每个嵌合磷酸酯6个PEI氮相当物的乳糖基化的25 kDa PEI(Abdallah，B.等，“将基因体内转移入成年哺乳动物脑中的有效的非病毒载体：聚乙烯亚胺”，Human Gene Theapy，7，1947-1954，1996)。通过尾静脉注射，或者以100μg的单一剂量，或者以连续数天150μg和200μg的分割剂量，给予等份样品。注射后5天，取出肝脏组织，用于DNA和RNA分离。按先前描述的方法(Kren，B.T.，Trembley，J.H.和Steer，C.J.，“在大鼠肝脏再生期间mRNA稳定性的改变”，Am.J.Physiol.，270，G763-G777，1996)分离DNA，用于PCR扩增大鼠因子IX基因的外显子8。分离RNA，用RNAexol和RNAmate(Intermoutian Scientific Corp.，Kaysville，UT)，按照生产商的方案，用于RT-PCR扩增与基因组DNA相同的区域。
因子IX的活性测定。第二次尾静脉注射0.1倍体积0.105M柠檬酸钠/柠檬酸后20天，收集载体(n＝9)和寡核苷酸处理(n＝3)的大鼠的血液样品。以2,500xg离心，然后以15,000×g离心后，将所得的血浆贮存于-70℃。根据活化部分促凝血酶原激酶时间(APTT)测定，测定因子IX活性。简而言之，50μl APTT试剂(DADE，Miami，FL)、50μl人类因子IX缺陷的血浆(George King Biomedical，Overland，KS)和50μl大鼠测试血浆在Hepes缓冲液(50mM Hepes/100mMNaCl/0.02％NaN3，pH 7.4)的1/10稀释液，在ST4血凝度计(AmericanBioproducts，Parsippany，NJ)中于37℃温育3分钟。通过加入50μl 33mM CaCl2的Hepes缓冲液，起始凝固。根据由正常雄性大鼠(n＝12)的合并血浆稀释液(1∶10至1∶80)APTT结果构建的log-log标准曲线，确定双份样品的因子IX活性。
DNA/RNA分离和克隆。在转染后48小时，通过刮取收获细胞。用高纯度PCR模板制备试剂盒(Boehringer Mannheim，Corp.，indianapolis，N)，分离大于100-150碱基对的基因组DNA。采用RNAzolTM B(Tel-Test，Inc.，Friendswood，TX)，按照生产商的方案分RNA。用或者从初级肝细胞或者从肝脏组织中分离的DNA 300ng，进行大鼠因子IX基因的374-nt片段的PCR扩增。将引物设计为分别对应于大鼠因子IX cDNA的核苷酸433-457和782-806的5’-ATTGCCTTGCTGGAACTGGATAAAC-3’(SEQ ID No.22)和5’-TTGCCTTTCATTGCACATTCTTCAC-3’(SEQ ID No.23)(Oligos Etc.，Wilsonville，OR)。引物于59℃退火20秒，于72℃延伸45秒，并于94℃进行变性45秒。用Expand Hi-fidelityTM聚合酶(BoehringerMannheim，Corp.)，将样品扩增30个循环。将来自肝细胞和完整的肝脏的因子IX基因的PCR扩增产物，亚克隆入TA克隆载体pCRTM2.1(Invitrogen，SanDiego，CA)中，并用连接的材料转化冷冻的感受态大肠杆菌。为了根除PCR人造产物，将300ng对照DNA与0.1、1.0和1.5μg该寡核苷酸一起温育，然后进行PCR扩增反应。另外，将1.0μg单独的该嵌合物用作PCR扩增的模板。
用一种试管RT-PCR系统TitianTM(Boehringer Mannheim，Corp.)进行RT-PCR扩增。按照生产商的方案，采用用于DNA PCR扩增的相同引物。为了根除DNA污染，RNA样品用RQ1无RNA酶的DNA酶(Promega Corp.，Madison，WI)处理，RNA酶处理的RNA样品的RT-PCR阴性对照与RT-PCR反应平行进行。将每种PCR反应物连接入相同的TA克隆载体中，并转化入冷冻的感受态大肠杆菌中。
菌落杂交和测序。平板接种18-20小时后，将菌落影印至MSIMagnaGraph尼龙滤膜上，复制并处理，以按照生产商的建议进行杂交。滤膜与17mer寡核苷酸探针365-A(5’-AAGGAGAT
AGTGGGGGA-3’)(SEQ ID No.24)或365-C(5’-AAGGAGAT
CGTGGGGGA-3’)(SEQ ID No.25)(Life technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)杂交24小时，其中下划线的核苷酸是诱变的靶。用[γ-32P]ATP(＞7,000 Ci/mmol)和T4多核苷酸激酶(New EnglandBiolabs，Inc.，Beverly MA)，32P末端标记所述探针。于37℃，在含1％SDS的2X氯化钠柠檬酸钠、5X Denhardt’s和200μg/ml变性超声处理的鱼精DNA中进行杂交。杂交后，滤膜在1X氯化钠磷酸钠EDTA、0.5％SDS中冲洗，然后于54℃在含3M氯化四甲基铵、2mM EDTApH 8.0、0.1％SDS的50mM Tris-HCl pH 8.0中洗涤(Melchior，W.B.和VonHippel，P.H.“DNA中dA.dT和dG.dC碱基对相对稳定性的改变”，Proc Natl. Acad.Sci.USA，70，298-302，1973)。用NENReflection膜，采用增感屏于-70℃进行放射自显影。用Qiagen小量制备试剂盒(Chatsworth，CA)，从鉴定为与365-A或365-C杂交的菌落制备质粒DNA，并用mp13正向和反向引物以及基因特异性引物5’GTTGACCGAGCCACATGCCTTAG-3’(SEQ ID No.26)，用ABI370A测序仪(Perkin-Elmer，Corp.，Foster City，CA)，对质粒DNA进行自动测序，其中所述基因特异性引物对应于大鼠因子IX cDNA的核苷酸616-638。6.4在Chapel Hill狗中血友病B突变的校正Chapel Hill品系的狗具有一个在动物导致血友病的(C→A)147突变，将该品系的狗用来获得原代培养的肝细胞。以下给出了设计以校正该突变的CMV。DIX1 (SEQ ID No.28)TGCGCG au uca aag aaT TGA CCC TAA Taa ucg acc cc TT TT TTCG CGC TA AGT TTC TTA ACT GGG ATT ATT AGC TGG GGT
3′5′ 。
所述肝细胞用360nM在含或者25kDa Lac-PEI或者半乳糖脑苷脂的水性核心中复合的DIX1处理，所述DIX1是带负电的脂小泡(Gc-NLV)。以下表II中给出了结果。
于因子IX基因的核苷酸1477处A向G转化的频率
(原代肝细胞，来自Chapel Hill品系血友病B狗)载体 转染次数 浓度 G克隆/总克隆 频率(％)Gc-NLV 一次 360nM 30/195 15.44
30/218 13.76
两次 30/118 25.4Lac-PEI 一次* 360nM 20/141 14.225kDa 48/348 13.3
两次 21/107 19.6*对平行转染的培养物进行的RT-PCR给出A向G转化的频率为11.1％6.5 Gunn大鼠中克-奈样突变的校正
患有高胆红素血症的突变大鼠称为Gunn大鼠，它们在编码胆红素-尿苷二磷酸葡糖醛酸葡糖醛酸基转移酶(UGTlAl)的基因中有单个核苷酸缺失。Roy Chowdhury，J.等，1991，J.Biol.Chem.266，18294。患有克-奈综合征I型的病人也具有UGTlAl基因的突变，导致终身高胆红素血症和随之发生的脑损害。Bosma，P.J.等，1992，FASEB J.6，2859；Jansen，P.L.M.等，Progress In Liver Diseases，XIII，Boyer，J.L.和Ockner，R.K.编辑(W.B.Saunders，Phil.1995)，第125-150页。以下给出设计用于校正Gunn大鼠突变的一种CMV-CN3的结构。CN3(mut→WT) (SEQ ID No.27)T GCGCG gg gac uua caG GAC CTT TAC uga ctt cua TT TT TT CGCGC CC CTG AAT GTC CTG GAA ATG ACT GCC GAT T3′5 ′
按照以上方案，用150nM CN3处理Gunn大鼠的原代培养的肝细胞，只是该载体或者为6.2.2小节的带负电糖基化脂小泡，或者为乳糖基-PEI载体，其寡核苷酸磷酸酯与亚胺的比率为1∶4。用带负电脂质体的结果为转化8.5％，而用乳糖基-PEI载体的转化为3.6％。
给Gunn大鼠注射1mg/Kg与上述或者25kDa Lac-PEI复合或者与带负电Gc脂小泡复合的CN3。通过按照所述用于因子IX的方法进行克隆和杂交，测定基因的转化率。以下所示的结果表明，UGTlAl基因的约15％-25％拷贝被转化。UGT-1基因的核苷酸1239处插入G的频率
(在Gunn大鼠中)载体 剂量 G克隆/总克隆 频率(％)Gc-NLV 1mg 112/815 15.4
208/761 27.3
185/974 18.9
39/273 14.61
78/403 19.3225kDa PEI. 1mg 188/838 22.4(乳糖基化) 254/1150 22.1
245/997 24.61测定的原始转化频率。270％部分肝切除后7天测定的转化频率。
连续5天给Gunn大鼠注射1mg/Kg与上述25 kDaLac-PEI复合的CN3。最后一次注射后25天，血清胆红素从6.2mg/dl降至3.5mg/ml，在随后的25天内维持在该水平。序列表(1)一般资料(i)申请人：
(A)收信人：Steer，Clifford J.
Kren，Betsy T.
Bandyopadhyay，Paramita T.(ii)发明名称：重组诱发剂寡核碱基校正肝细胞遗传损害的体内应用(iii)序列数：28(iv)通信地址：
(A)收信人：Kimeragen，Inc.
(B)街道：300 Pheasant Run
(C)城市：Newtown
(D)州：PA
(E)国家：美国
(F)邮政编码：18940(v)计算机可读形式
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容机
(C)操作系统：DOS
(D)软件：FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)当前申请数据
(A)申请号：
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(C)分类：(vii)在先申请数据
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(B)提交日期：(viii)代理律师/代理人资料
(A)姓名：Hansburg，Daniel
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(A)长度：80个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线性
(ii)分子类型：其它
(xi)顺序描述：SEQ ID NO：28：TAAGTTTCTT AACTGGGATT ATTAGCTGGG GTTTTCCCCA GCUAATAATC CCAGTTAAGA 60AACUUAGCGC GTTTTCGCGC
Claims (36)
1.一种组合物，包含：
a)一种重组诱发剂寡核碱基；
b)一种水性载体；和
c)选自以下的一种大分子载体：
(i)一种水性核心脂小泡，其中所述水性核心含有所述寡
核碱基，
(ii)一种脂质纤球体，它包含所述寡核碱基的亲脂盐，和
(iii)一种聚阳离子，其平均分子量在500道尔顿和1.3Md
之间，其中所述聚阳离子与所述寡核碱基形成盐。
2.权利要求1的组合物，它还包含一种披网格蛋白小窝受体的配体，所述受体连接至所述大分子载体。
3.权利要求2的组合物，其中所述大分子载体是带负电的水性核心脂小泡。
4.权利要求3的组合物，其中所述水性核心脂小泡包含二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰丝氨酸。
5.权利要求4的组合物，其中所述水性核心脂小泡还包含一种脑苷脂。
6.权利要求2的组合物，其中所述大分子载体是支链的聚乙烯亚胺。
7.权利要求2的组合物，其中所述大分子载体是包含融合F-蛋白的水性核心脂小泡。
8.权利要求2的组合物，其中所述寡核碱基包含：
(i)第一同源区和第二同源区，它们一起的长度至少为16个核
碱基，且不多于60个核碱基，所述区与哺乳动物的靶基因
同源；和
(ii)配置于第一同源区和第二同源区之间的一个异源区，至少
长1个核碱基，且不多于20个核碱基，所述异源区与所述
靶基因异源，并含有所述改变。
9.权利要求8的组合物，其中所述重组诱发剂寡核碱基包含至少15个与2’-取代的核糖核苷酸进行Watson-Crick碱基配对的脱氧核糖核苷酸。
10.权利要求9的组合物，其中所述2’-取代的核糖核苷酸独立地选自2’-甲氧基-核糖核苷酸、2’-烯丙氧基-核糖核苷酸、2’-甲氧基乙氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸。
11.权利要求8的组合物，其中所述配体是选自运铁蛋白受体、烟酸受体、肉碱受体、胰岛素受体和胰岛素样生长因子-1受体的受体的配体。
12.权利要求8的组合物，其中所述披网格蛋白小窝受体是脱唾液酸糖蛋白受体。
13.权利要求12的组合物，其中所述配体包含选自以下的一个部分：乳糖、半乳糖和N-乙酰半乳糖胺，并且其中所述寡核碱基的序列包含编码选自以下一种产物的人类基因的连续16个核苷酸片段的序列或其互补序列：α1-抗胰蛋白酶、凝血因子IX、尿苷二磷酸葡糖醛酸葡糖醛酸基转移酶、葡萄糖脑苷脂酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、鸟氨酸转氨甲酰酶和苯丙氨酸羟化酶。
14.改变受治疗哺乳动物组织中靶基因的方法，所述方法包括给予所述受治疗的哺乳动物一种方法，所述方法包含一种水性药用可接受的载体和一种重组诱发剂寡核碱基，所述寡核碱基包含：
a)一种重组诱发剂寡核碱基；
b)一种水性载体；和
c)选自以下的一种大分子载体：
(i)一种水性核心脂小泡，其中所述水性核心含有所述寡
核碱基，
(ii)一种脂质纤球体，它包含所述寡核碱基的亲脂盐，和
(iii)一种聚阳离子，其平均分子量在500道尔顿和1.3Md
之间，其中所述聚阳离子与所述寡核碱基形成盐，
其中披网格蛋白小窝受体的配体共价连接至所述大分子载体。
15.权利要求14的方法，其中所述组织是肝脏。
16.权利要求14的方法，其中所述大分子载体是带负电水性核心脂小泡。
17.权利要求16的方法，其中所述水性核心脂小泡包含二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰丝氨酸。
18.权利要求17的方法，其中所述水性核心脂小泡还包含一种脑苷脂。
19.权利要求14的方法，其中所述大分子载体是一种支链的聚乙烯亚胺。
20.权利要求14的方法，其中所述大分子载体是线性聚乙烯亚胺或线性聚阳离子多肽。
21.权利要求14的方法，其中所述寡核碱基包含：
(a)第一同源区和第二同源区，它们一起的长度至少为16个核
碱基，且不多于60个核碱基，所述区与哺乳动物的靶基因
同源；和
(b)配置于第一同源区和第二同源区之间的一个异源区，至少
长1个核碱基，且不多于20个核碱基，所述异源区与所述
靶基因异源，并含有所述改变。
22.权利要求21的方法，其中所述重组诱发剂寡核碱基包含至少15个与2’-取代的核糖核苷酸进行Watson-Crick碱基配对的脱氧核糖核苷酸。
23.权利要求22的方法，其中所述2’-取代的核糖核苷酸独立地选自2’-甲氧基-核糖核苷酸、2’-烯丙氧基-核糖核苷酸、2’-甲氧基乙氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸。
24.权利要求22的方法，其中所述披网格蛋白小窝受体是一种脱唾液酸糖蛋白受体，而所述大分子载体是聚乙烯亚胺或带负电的水性核心脂小泡。
25.将有益改变引入人类受治疗者细胞的靶基因致病序列中的方法，所述方法包括给予所述受治疗者一定量的组合物，所述组合物包含一种水性药用可接受的载体和一种具有核糖型和脱氧核糖型核碱基的寡核碱基，所述寡核碱基包含：
a)一种重组诱发剂寡核碱基；
b)一种水性载体；和
c)选自以下的一种大分子载体：
(i)一种水性核心脂小泡，其中所述水性核心含有所述寡
核碱基，
(ii)一种脂质纤球体，它包含所述寡核碱基的亲脂盐，和
(iii)一种聚阳离子，其平均分子量在500道尔顿和1.3Md
之间，其中所述聚阳离子与所述寡核碱基形成盐，
其中披网格蛋白小窝受体的配体共价连接至所述大分子载体，并
且所述量有效地减轻由所述序列引起的疾病。
26.权利要求25的方法，其中所述细胞是肝细胞。
27.权利要求25的方法，其中所述大分子载体是带负电的水性核心脂小泡。
28.权利要求27的方法，其中所述水性核心脂小泡包含二油酰磷脂酰胆碱和二油酰磷脂酰丝氨酸。
29.权利要求28的方法，其中所述水性核心脂小泡还包含一种脑苷脂。
30.权利要求25的方法，其中所述大分子载体是支链的聚乙烯亚胺。
31.权利要求25的方法，其中所述大分子载体是线性聚乙烯亚胺或线性聚阳离子多肽。
32.权利要求25的方法，其中所述寡核碱基包含：
(a)第一同源区和第二同源区，它们一起的长度至少为16个核
碱基，且不多于60个核碱基，所述区与哺乳动物的靶基因
同源；和
(b)配置于第一同源区和第二同源区之间的一个异源区，至少
长1个核碱基，且不多于20个核碱基，所述异源区与所述
靶基因异源，并含有所述改变。
33.权利要求32的方法，其中所述重组诱发剂寡核碱基包含至少15个与2’-取代的核糖核苷酸进行Watson-Crick碱基配对的脱氧核糖核苷酸。
34.权利要求33的方法，其中所述2’-取代的核糖核苷酸独立地选自2’-甲氧基-核糖核苷酸、2’-烯丙氧基-核糖核苷酸、2’-甲氧基乙氧基-核糖核苷酸和2’-氟-核糖核苷酸。
35.权利要求33的方法，其中所述披网格蛋白小窝受体是一种脱唾液酸糖蛋白受体，而所述大分子载体是聚乙烯亚胺或带负电的水性核心脂小泡。
36.权利要求35的方法，其中所述配体包含选自以下的一个部分：乳糖、半乳糖和N-乙酰半乳糖胺，并且其中所述寡核碱基的序列包含编码选自以下一种产物的人类基因的连续16个核苷酸片段的序列或其互补序列：α1-抗胰蛋白酶、凝血因子IX、尿苷二磷酸葡糖醛酸葡糖醛酸基转移酶、葡萄糖脑苷脂酶、葡萄糖-6-磷酸酶、低密度脂蛋白受体、鸟氨酸转氨甲酰酶和苯丙氨酸羟化酶。
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