DE19925143A1 - Neue liposomale Vektorkomplexe und deren Verwendung für die Gentherapie - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen liposomaler Vektorkomplex, enthaltend folgende Komponenten: (a) eine Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge; (b) einen kationischen Träger, welcher die Komponente a) kondensiert und zugleich lysosomotrop ist; (c) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden; und (d) optional einen Liganden, welcher eine Bindungsstelle für eine Zielzelle hat und mit einem Lipid konjugiert ist; und (e) ebenfalls optional die funktionale Sequenz aus der Untereinheit HA-2 des Hemagglutinin des Influenzavirus; erhältlich durch (1) Mischung von Komponente a) mit Komponente b) im molaren Verhältnis [a) : b)] von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist, und (2) der aus Schritt 1) resultierende Komplex in die Komponente c) eingeführt wird und (3) optional Komponente d) in die Komponente c) eingefügt wird; und (4) optional Komponente e) in den aus Schritt 2 und 3 resultierenden Komplex eingefügt wird, seine Herstellung und Verwendung.

Description

Die wesentlichen Komponenten von Vektoren für die Gentherapie sind bislang Nukleinsäuresequenzen, welche mit einem nichtviralen Träger (z. B. kationische Lipide oder kationische Polymere) komplexiert oder in ein Virus eingefügt werden.

Die bisherige Erfahrung mit solchen Vektoren bei der Gentherapie unterschiedlichster Erkrankungen, insbesondere jedoch von Tumorerkrankungen, zeigt, daß in der Zellkultur besonders nichtvirale Vektorkomplexe nur eine relativ geringe Anzahl von Zellen (meist zwischen 1% und 30%) transduzieren können; des weiteren, daß nach Verabreichung eines gentherapeutischen Vektors in den Kreislauf eines Organismusses diese Vektoren in kurzer Zeit aus dem Kreislauf eliminiert werden und für die Bindung an die Zielzellen und zur Transfektion dieser Zielzellen nicht mehr zur Verfügung stehen (Ogris et al. Gene Ther. 6: 595, 1999; Dash et al., Gene Ther. 6: 643, 1999; Li et al., Gene Ther. 5: 930, 1998; Liu et al. Gene Ther. 4: 517, 1997).

Diese Elimination kann erfolgen durch Degradation der DNA oder durch schnelle Ablagerung der Vektoren in der Lunge, der Leber oder dem sogenannten retikuloendothelialen System (RES), welches besonders ausgebildet ist in der Milz und den Lymphknoten (Zhu et al., Science 261: 209, 1993).

Die Ursachen der schnellen Elimination sind vielgestaltig. Sie können sein: eine zu große negative oder positive Ladung, ein zu großes Volumen oder eine Opsonierung der Vektorpartikel durch Blutproteine. Bei viralen Vektoren können sie des weiteren sein die Bindung der Virushüllproteine an virusspezifische Rezeptoren in den Organen und/oder auch Antikörper oder Immunzellen-spezifisch für die Viren, welche an die Vektoren binden und diese hierdurch eliminieren.

Die bisherige Erfahrung zeigt des weiteren, daß die Kopplung oder Einfügung eines zielzellspezifischen Liganden in den Vektorkomplex dessen schnelle Elimination nach Verabreichung in den Blutkreislauf nicht wesentlich vermindert.

In Kenntnis dieser Probleme besteht die dringliche Notwendigkeit nach neuen Zubereitungen von Vektoren, die möglichst viele Zellen in der Zellkultur transfizieren und die nach Verabreichung in einen lebenden Organismus möglichst lang im Kreislauf verbleiben und nicht vorzeitig aus dem Kreislauf eliminiert werden. Um die Elimination von kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren im Komplex mit Nukleinsäuresequenzen aus dem Blutkreislauf zu vermindern, wurde Polyethylen­ glykol (Senior et al., Biochim. Biophys. Res. Acta 1062: 77, 1991; Mori et al., FEBS Lett 284: 263, 1991; Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999), Vinylpolymere (Torchilin et al., Biochim. Biophys. Res. Acta 1195: 181, 1994) oder andere amphipatische Polymere (Woodle et al., Bioconjugat. Chem. 5: 493, 1994) an die kationischen Lipide oder kationischen Polymere gekoppelt oder mit Hilfe negativ geladener Lipide anionische Liposomen hergestellt, in welche die Nukleinsäuresequenzen im Komplex mit kationischen Lipiden oder kationischen Polymeren eingeschlossen waren (US Patent Nr. 4,946,787; US Patent Nr. 4,245,737; US Patent Nr. 5,480,463; Heywood und Eanes, Calc. Tissue Int. 40: 149, 1992; Lee und Huang, J. Biol. Chem. 271: 8481, 1996; Balicki und Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res. 8: 57, 1998; Lakkaraju et al., J. Lip. Res. 8: 74, 1998; Turner et al., J. Lip. Res. 8: 114, 1998; Schoen et al., J. Lip. Res. 8: 485, 1998).

Derartige Modifikationen führten beispielsweise zu einer Stabilisierung der Vektorpartikelgröße, inhibierten die Aggregation der Vektoren mit sich selbst oder mit Blutzellen, reduzierten die Opsonierung von Vektoren durch Bindung von Immunglobulinen, Complementfaktoren, Fibrinogen oder Fibronektin, schützten (adeno-)virale Vektoren vor der Elimination durch Antikörper (Chillon et al., Gene Ther. 5: 995, 1998) und bewirkten eine Verlängerung der Blutverweilzeit von Vektoren, eine deutlich stärkere Anreicherung in subkutan wachsende Tumoren und eine Transduktion der Tumorzellen (Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999).

Zugleich konnte jedoch auch in der Lunge, der Milz und der Leber eine beträchtliche Anreicherung der Vektoren und Transduktion der Gewebezellen in diesen Organen festgestellt werden (Ogris et al., Gene Ther. 6: 595, 1999), so daß gefolgert werden kann, daß beispielsweise die Kopplung von PEG zwar eine Verbesserung, aber noch keine Optimierung der Verteilung von Vektoren bewirkt.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung sind neue üposomale Vektorkomplexe für die Gentherapie bestehend aus folgenden Komponenten:

• a) einer Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge;
• b) einem kationischen Träger, welcher die Komponente a) kondensiert und zugleich lysosomotrope Eigenschaften aufweist; und
• c) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden.

Komponente a) kann eine nicht-modifizierte oder modifizierte DNA-Sequenz oder eine nicht-modifizierte oder modifizierte RNA-Sequenz sein. Die Nukleotidsequenz kann eine anti-DNA (Triplex) oder anti-RNA (antisense; Ribozym) Funktion ausüben oder für eine derartig wirkende RNA-Sequenz oder für ein Protein kodieren. Die Nukleotidsequenzen und ihre Modifikation kann dergestalt sein, daß die Nukleotidsequenz weitgehend resistent ist gegen den Abbau durch DNAsen oder RNAsen. Beispiele für derartige Nukleotidsequenzen und ihre Modifikationen sind in Breaker, Nature Biotechnol. 15: 427, 1997; Gerwik, Critical Reviews in Oncogenesis 8: 93, 1997; Mukhopadhyay et al., Crit. Rev. Oncogen. 7: 151, 1996; Mercola et al., Cancer Gene Ther. 2: 47, 1995; Frank-Kamenetski, Annu. Rev. Biochem. 64: 65, 1995 und Fraser et al., Exp. Opin. Invest. Drugs 4: 637, 1995 dargestellt. Die DNA- Sequenz kann linear oder zirkulär, beispielsweise in Form eines Plasmids vorliegen.

Komponente a) kann des weiteren ein Virus darstellen, bevorzugt ein Virus, in welches mit den dem Fachmann bekannten Methoden eine für das Virus fremde Nukleinsäuresequenz eingefügt wurde. Beispiele für derartige Viren sind RTV, AAV und Lentiviren. Derartige und weitere Beispiele sind von Vile, Nature Biotechnol. 15: 840, 1997; McKeon et al., Human Gene Ther. 7: 1615, 1996; Flotte et al., Gene Ther. 2: 357, 1995; Jolly, Cancer Gene Ther. 1: 51, 1994; Dubensky et al., J. Virol. 70: 508, 1996 beschrieben worden.

Komponente b) stellt einen kationischen Träger dar, welcher die Komponente a) kondensiert und zugleich starke lysosomotrope Eigenschaften aufweist.

Entsprechend dieser Erfindung stellt in einer besonderen Ausführungsform die Komponente b) ein kationisches Polymer dar, beispielsweise beschrieben von Boussifet al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 7297, 1995; Kaneda et al., Science 243: 375, 1989; Keown et al., Methods in Enzymology 185: 527, 1990; Baker et al., Gene Ther. 4: 773, 1997; Fritz et al., Human Gene Ther. 7: 1395, 1996; Wolfert et al., Human Gene Ther. 7: 2123, 1996 und Solodin et al., Biochem. 34: 13537, 1995.

In einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung stellt die Komponente b) ein Polyethylenimin (PEI) dar, in einer weiteren besonderen Ausführungsform dieser Erfindung besitzt das Polyethylenimin ein Molekulargewicht in einem Bereich von 500-10.000 Da und in einer weiteren Ausführungsform ein Molekulargewicht von durchschnittlich etwa 2000 Da und wurde hergestellt, wie in der Patentanmeldung EP-A 0 905 254 beschrieben.

Komponente c) stellt ein beliebiges Liposom mit einer beliebigen, dem Fachmann bekannten Zusammensetzung dar. In einer besonderen Ausführungsform hat dieses Liposom eine anionische Ladung. In einer weiteren besonderen Ausführungsform ähnelt die Lipid- und Phospholipidzusammensetzung des anionischen Liposoms der Zusammensetzung einer Virushülle. Die Herstellung von Liposomen mit anionischer Ladung ist bereits vielfach beschrieben worden, so beispielsweise von in den US Patenten Nr. US 4,946,787, US 4,245,737, US 5,480,463, sowie bei Heywood und Eanes, Calc. Tissue Int. 40: 149, 1992; Lee und Huang, J. Biol. Chem. 271: 8481, 1996; Balicki und Beutler, Blood 88: 3884, 1996; Lucie et al., J. Lip. Res. 8: 57, 1998; Lakkaraju et al., J. Lip. Res. 8: 74, 1998; Turner et al., J. Lip. Res. 8: 114, 1998; Schoen et al., J. Lip. Res. 8: 485, 1998.

Die Herstellung von Liposomen, die Virushüllen ähnlich sind, wurde beispielsweise beschrieben in den US-Patenten Nr. US 5,252,348; US 5,753,258; US 5,766,625 und EP-A 0 555 333.

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Ergänzung der erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe durch Hinzufügung einer Komponente d).

Diese Komponente d) stellt einen Liganden dar, welcher eine Bindungsstelle für die Zielzelle hat und mit einem Lipid konjugiert ist. Die Zielzellspezifität des Liganden kann beliebig sein.

Bevorzugt werden Zielzellspezifitäten von Liganden, ausgewählt aus einer Gruppe, im Detail beschrieben bei

• - mehrfach funktionelle Ligandensysteme zur zielzellspezifischen Übertragung von Nukleotidsequenzen EP-A 0 846 772
• - einzelkettige, zweifach-antigenbindende Moleküle (DE 1 981 61 417, noch unveröffentlicht)
• - spezifisch Zellmembran-penetrierende Moleküle (DE 198 50 987.1, noch unveröffentlicht) oder
• - zielzellspezifischen, multivalenten Proteinen (DE 199 10 419.0, noch unveröffentlicht).

Die Art des Lipids kann beliebig sein, bevorzugt werden jedoch natürlich vorkommende Lipide, wie beispielsweise in den US-Patenten Nr. US 5,252,348; US 5,753,258; US 5,766,625 und EP-A 0 555 333 beschrieben.

Die Konjugation des Lipids an den zielzellspezifischen Liganden erfolgt mit einer der dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise wie in US-Patent Nr. US 5,662,930 beschrieben.

Die Einfügung von Komponente d) in das erfindungsgemäße Liposom (Komponente c) erfolgt mit der dem Fachmann bekannten Methode, beispielsweise beschrieben in den US-Patenten Nr. US 5,252,348 und US 5,753,258).

Gegenstand der Erfindung ist des weiteren die Ergänzung der erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe durch Hinzufügung einer Komponente e). Diese Komponente e) stellt die funktionale Sequenz eines Fusionspeptides, bevorzugt aus der Untereinheit HA-2 des Hemagglutinin vom Influenza Virus (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89(17), 7934-7938) Liganden dar, welches die Freisetzung des Liposomeninhaltes aus dem Endosom erleichtert.

Die Herstellung des erfindungsgemäßen Vektorkomplexes bestehend aus den Komponenten a), b) und c) oder a), b), c) und d) oder a), b), c), d) und e) erfolgt mit den dem Fachmann bekannten Methoden, beispielsweise derartig, daß

• - im 1. Schritt Komponente a) mit Komponente b) vermischt wird und zwar bevorzugterweise im molaren Verhältnis [a) : b)] von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt werden soll, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist und nachfolgend
• - im 2. Schritt der aus Schritt 1) resultierende Komplex in die Komponente c) eingeführt wird und
• - in einem 3. Schritt Komponente d) in die Komponente c) eingefügt wird.
• - in einem 4. Schritt Komponente e) in den aus Schritt 2 oder 3 resultierenden Komplex eingefügt wird.

Die aus diesen Herstellungsschritten resultierenden Liposomen haben vorzugsweise einen Durchmesser von 100-300 nm und eine anionische Ladung.

Derartige erfindungsgemäße liposomalen Vektorkomplexe sind durch ihre Komponente c) weitgehend abgeschirmt, d. h. ihre Bindung und Transfektion und Transduktion von Zellen, die keinen Rezeptor für die Komponente d) innerhalb des erfindungsgemäßen Vektorkomplexes tragen, ist weitgehend vermindert.

Infolgedessen ist nach Verabreichung der erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe in einen Organismus, entweder lokal, auf die Haut, in ein Organ, eine Körperhöhle, in ein Binde- oder Stützgewebe oder in den Blutkreislauf, die Verweilzeit deutlich verlängert, nach Verabreichung in den Blutkreislauf beispielsweise bis auf mehrere Stunden bis zu einigen Tagen.

Über diese lange Verweilzeit hinweg reichern sich die erfindungsgemäßen Liposomen beispielsweise im Tumorgefäßbett an aufgrund des sogenannten "passiven Targetings" (Unezaki et al., Int. J. Pharmaceutics 114: 11, 1996; Sadzuka et al., Cancer Lett. 127: 99, 1998 und Wunder et al., Int. J. Oncol. 11: 497, 1997). Des weiteren, und auch unabhängig vom passiven Targeting, binden die erfindungsgemäßen Liposomen über ihre Komponente d) an die Zielzelle und transfizieren diese, so daß die Nukleinsäuresequenz im erfindungsgemäßen Vektorkomplex in der Zelle freigesetzt wird.

Diese Nukleinsäuresequenz kann, je nach Zusammensetzung, in der Zielzelle ihre Wirkung entfalten, d. h. beispielsweise die Transkription oder Translation eines bestimmten Genes oder einer bestimmten RNA hemmen, oder die Zelle transduzieren zur Expression der RNA oder des Proteins kodiert von dieser Nukleinsäuresequenz.

Die Transduktionsrate durch die erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexe ist im Vergleich zur bestehenden, dem Fachmann bekannten Technik, erheblich verbessert und liegt, beispielsweise in der Zellkultur, bei über 80% der Zellen, welche einen Rezeptor für die Komponente d) tragen und mit den erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexen in Kontakt gebracht werden.

Die erfindungsgemäßen Vektorkomplexe sind somit bevorzugt geeignet für die in vitro Transduktion von Zellen und für die in vivo Verabreichung mit dem Ziel der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen.

Beispiele zur Verdeutlichung des Erfindungsgedankens

Die folgenden Beispiele sollen verdeutlichen, wie man die vorliegende Erfindung ausführen könnte.

Beispiel 1 Herstellung eines erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexes Herstellung von Komponente a)

Als Komponente a) wurde das Plasmid "pEGFP-C1" von Clontech verwendet, welches folgende Nukleotidsequenzen enthält:

• - CMV-Promotor
• - cDNA für das "enhanced green fluorescent protein" (EGFP)
• - SV40-Poly A-Signal

Mit den dem Fachmann bekannten Methoden wurde das Plasmid in E. coli Bakterien eingeführt, die Bakterien in Kulturmedium vermehrt und die Plasmide isoliert.

Herstellung von Komponente b)

Niedrigmolekulares PEI-2000 wurde hergestellt wie in der Patentanmeldung EP-A 0 905 254 beschrieben. Hierzu wurde eine 10%ige Ethyleniminmonomer- Lösung in Wasser (5 ml Ethyleniminmonomer + 45 ml destilliertes Wasser, Auflösung unter Rühren) unter Zusatz von 1% (0,5 ml) konzentrierter Salzsäure (37°C) als Katalysator 4 Tage lang bei 50°C gerührt, einrotiert und unter Vakuum bei Raumtemperatur getrocknet. Die Molekulargewichtsbestimmungen wurden mittels Laserstreulichtmessung (Lichtstreuphotometer Wyatt Dwan DSP) bei 633 nm nach Direktinjektion in eine K5-Meßzelle durchgeführt. Die Molmassen werden aufgrund der in Toluol bestimmten Kalibrierkonstanten und der bekannten Probeneinwaage bestimmt.

Die Molekulargewichtsbestimmung mit Hilfe der Lichtstreuanalyse ergab 2000 Da. Vergleichsweise hatte das kommerziell (Fa. Fluka, Neu Ulm) erhaltene PEI ein Molekulargewicht entsprechend der Lichtstreuanalyse von 791 kDa (HMW-PEI).

Herstellung der Komponenten c) und d)

Synthese des DPPE Derivates (Anker-Lipid)

Material

DPPE wird in frisch destilliertem, wasserfreiem Chloroform (1 Woche über Mg-Sulfat; 2 Tage über Phosphorpentoxid getrocknet) gelöst. Zu der Mischung werden Glutarsäureanhydrid und wasserfreies Pyridin gegeben und der Ansatz 2 Tage bei 20°C gerührt. Der Nachweis des gewünschten Reaktionsproduktes erfolgt mittels Dünnschichtchromatographie (DC), es schließt sich die Einengung des Ansatzes bis zur Trockene mittels Vakuumpumpe an. Der Ansatz wird in Chloroform aufgenommen und das N-glut-PE mittels einer präparativen DC (Merck, Kieselgelplatten 60 F 254) isoliert und mit Methanol aus dem Kieselgel herausgelöst. Nach Entfernen des Methanols erhält man die gebrauchsfertige N-glut-PE Stammlösung (2 µmol/ml) durch Lösen des N-glut-PE in Chloroform. Der Nachweis des Produktes erfolgte über ¹H NMR [2].

Literatur

[1] Volker Weissig, Habilitationsschrift im Fach Physiologische Chemie, 1991, 28-29
[2] Ahl et al., (1997), Biochimia et Biophysica Acta 1329: 370-382.

Modifiziertes Peptid mit RGD-Sequenz

Zur Verbesserung des Targetings der Integrin Rezeptoren wurde ein cyclisches Peptid vom IMT (hier Input Dr. Krause) synthetisiert. Es handelt sich um ein CDCRGDCFC-Peptid (SEQ ID NO: 1) mit einem zusätzlichen Arginin am N- terminalen Ende (FW 1163.35). Die terminale Aminosäure verringert das Ausmaß der Kopplung des Peptids am aktiven Zentrum, der RGD-Sequenz.

Die Cyclisierung findet durch Oxidation der Thiolgruppen zu Disulfid-Brücken statt. Die erfolgreiche Cyclisierung wird mittels HPLC-Analytik überprüft.

Nach der HPLC-Aufreinigung wird das Peptid lyophilisiert, bei 4°C aufbewahrt und vor Gebrauch in Puffer gelöst (250 µg/150 µl Tris Puffer 10 mM pH 7.4 oder PBS- Puffer pH 7.4).

RGD mit zusätzlichem Arginin am N-terminalen C, FW: 1163.35

Herstellung der Liposomen [1]

Material

Stammlösungen

Die Herstellung der Liposomen erfolgt nach der Film/Hydration-Methode. Die in Chloroform gelösten Lipide und der Lipidanker werden in einen 100 ml Rundkolben pipettiert und das Chloroform 15 min abgezogen. Der Kolben taucht dabei in ein temperaturkontrolliertes Wasserbad mit einer Temperatur, die über der Phasenübergangstemperatur der Lipide liegt, in diesem speziellen Fall 30°C. Zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels wird der Film 15 min im Hochvakuum getrocknet.

Es folgt die Hydratisierung des Films mit Puffer (Tris 10 mM, pH 7.4 oder PBS pH 7.4). Der Puffer wird zusammen mit wenigen kleinen Glaskügelchen in den Kolben gegeben und der Ansatz unter N₂-Begasung 45 min rolliert, auch hierbei taucht der Kolben in das 30°C warme Wasserbad. Zum Quellen des Lipidfilms und zur Erzeugung von multilamellaren Liposomen (MLV) wird der Ansatz für 2 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen [1, S. 38]. Die MLV-Suspension wird in ein spezielles Sonicator-Glasgefäß überführt und der Ansatz 15 sec mittels eines Probe Sonicators (hier Soniprep 150 (bevorzugt eingestellte Amplitude in Mikron 8-12)) beschallt. Die Suspension taucht dabei in ein Eisbad [1, S. 44-47] ein. Nach der Beschallung wird zum Abkühlen der Suspension eine Pause von 30 sec eingelegt. Diese Prozedur (Beschallung - Pause) wird 10mal wiederholt. Die Größenmessung der erhaltenen SUV ergibt eine Größe von 120 bis 300 nm. Nach anschließender Extrusion [1, S. 52-56][2] mittels LiposoFast durch einen Polycarbonatfilter, Porengröße 50 nm, reduziert sich die Größe in diesem Beispiel auf einen Wert zwischen 107.5-128 nm. Die so hergestellten Liposomen sind mindestens 2 Monate stabil und verändern in dieser Zeit ihre Größe nicht meßbar. Die Abfüllung der Liposomen zur weiteren Verarbeitung erfolgt unter dem LF in ein steriles Eppendorf- Hütchen.

Literatur

[1] Roger R. C. New, "Preparation of liposomes", chapter 2, Liposomes a practical approach (1989)
[2] Olson et al. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 394, 483

Kopplung des Peptides an Lipidanker [1]

Material

Zunächst wird die Carboxylgruppe des Glutarsäurerestes des Lipidankers durch die Zugabe von 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl) Carbodiimid aktiviert [3, S. 170]. Dazu werden 400 µl der Liposomensuspension (4 µmol Gesamtlipid, 0,4 µmol N-glut- PE, Medium Tris-Puffer pH 8, 10 mM) gevortext und 3.5 mg EDC hinzugewogen. Der Ansatz wird erneut gevortext und 5 h vor Licht geschützt, geschüttelt (IKA-Vibrax- VXR). Es bildet sich die aktivierte Zwischenstufe, das O-Acyl-Intermediat, an welches das Peptid mit einer freien Aminofunktion unter Ausbildung eines Amids bindet. 250 µg RGD gelöst in PBS-Puffer pH 7.4 oder Tris-Puffer 10 mM pH 7.4 (250 µg/150 µl) werden hinzugeben, der Ansatz gevortext und über Nacht schütteln gelassen. Nach erfolgter Kopplung erfolgt die gelchromatographische Abtrennung des ungebundenen Peptids von den Liposomen. Die Größenausschlußchromatographie wird mit einer Sephadex G 50 Säule durchgeführt, Eluent ist Tris Puffer 10 mM, pH 7.4.

1. Aktivierung durch 1-Ethyl-3-(3-Dimethylaminopropyl)Carbodiimid

2. Kopplung des Peptids an der Aminogruppe

Die Kopplungsausbeute wird über einen gleichzeitig durchgeführten Ansatz mit Fluoreszenzfarbstoff (5-DTAF) gelabeltem RGD durchgeführt [4] und liegt mindestens bei 6 µg RGD/1 µmol PL (berechnet für tatsächliche Lipidmenge mit Cholesterol). Die Größe der mit RGD gekoppelten Liposomen liegt zwischen 100-150 nm.

Literatur

[1] Weissig, V., Lasch, J., Klibanov, A. L. Torchilin, V. P., A new hydrophobic anchor for the attachment of proteins to liposomal membranes. FEBS Lett. 202, 1986, 86-90
[2] Diplomarbeit Ragna Schmidt, Universität Halle (1997)
[3] Martin et al. "Covalent attachment of protein to liposomes", chapter 4, Roger R. C. New, Liposomes a practical approach (1989)
[4] Product Information Sheet 5-DTAF, Molecular Probes (MP 00143 08/19/98) "Conjugation with Amine-Reactive Probes"

Komplexbildung

Material

Ansatz für eine Zellkulturschale 3 cm

Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der negativ geladenen Bestandteile Plasmid DNA und Liposomen. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen aller genannten Bestandteile beträgt 100 µi. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.4, andere Puffer ebenfalls möglich) vorgelegt und 10 µg Plasmid (10 µg/60 µl) sowie 40 µg Liposomen (variabel, zwischen 3 und 6 µg/µl) zusammengegeben durch einfaches Pipettieren. Die Mischung wird gevortext.

Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agenz, zunächst wird 19.96 µg Protaminsulfat zugeben (Ladungsverhältnis +/- 3.3). Dazu wird das Protaminsulfat mit einer Eppendorfpipette schnell dazu gegeben und der Ansatz durch 10maliges Auf- und Abpipettieren vermischt und ein Coaten des Komplexes mit den Lipiden erzielt. Danach erfolgt die Zugabe von 29.7 µg (Mengen bis 17.93 µg sind ebenfalls möglich) PEI (Ladungsverhältnis +/- 20.7, Reduzierung bis 12.5 möglich), ein weiteres kationisches Agenz. Dazu werden 33 µl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit 250 µl Reinstwasser verdünnt und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 2*100 µl und 1*85 µl Schritten, je 10* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren, 15 min warten. Ein derartiger Komplex hat 1 h nach der Herstellung ein Größe von 180-230 nm und wird unverzüglich nach Herstellung für die Zellkulturexperimente verwendet. Die Komplexe sind in dem für die Transfektion verwendeten Zellkulturmedium M199 + 10% FCS stabil (Größe 360-400 nm).

Der Ansatz kann auch ohne Protaminsulfat hergestellt werden, Transfektionsexperimente zeigen nahezu identische Effizienz.

Ansatz für eine Zellkulturschale 3 cm

Die Komplexbildung erfolgt zunächst durch Zusammengeben der negativ geladenen Bestandteile Plasmid DNA und Liposomen. Dabei ist die Verdünnung der Lösungen zu beachten, um irreversibler Präzipitatbildung vorzubeugen. Das Endvolumen aller genannten Bestandteile beträgt 100 µl. Zunächst wird der Puffer (Tris 10 mM, pH 7.4, andere Puffer ebenfalls möglich) vorgelegt und 10 µg Plasmid (10 µg/60 µl) und 40 µg Liposomen (variabel, zwischen 3 und 6 µg/µl) zusammengegeben durch einfaches Pipettieren. Die Mischung wird gevortext. Danach erfolgt die Kondensation der DNA durch Zugabe des kationischen Agenz, von 29.7 µg (Mengen bis 17.93 µg sind ebenfalls möglich) PEI (Ladungsverhältnis +/- 20.7, Reduzierung bis 12.5 möglich). Dazu werden 33 µl PEI Lösung 0.9 mg/ml mit 250 µl Reinstwasser verdünnt und in Teilschritten zum Ansatz zugeben. Die Zugabe erfolgt in 2*100 µl und 1*85 µl Schritten, je 10* den Ansatz nach der Zugabe auf und abpipettieren, 15 min warten. Auch durch einfaches Mischen aller angegebener Komponenten werden Komplexe ähnlicher Wirksamkeit erzielt.

Ein derartiger Komplex hat 1 h nach der Herstellung eine Größe von 180-230 nm und wird unverzüglich nach Herstellung für die Zellkulturexperimente verwendet. Die Komplexe sind in dem für die Transfektion verwendeten Zellkulturmedium M199 + 10% FCS stabil (Größe 300-400 nm).

Die Komplexbildung kann ebenfalls durch Kondensation der DNA durch PEI erfolgen. Dazu werden zunächst beide Substanzen zusammengegeben (einmalige Zugabe oder in Anteilen s. o.) und 15 min gewartet. Danach werden die Liposomen hinzupipettiert und die Mischung mehrfach (vorzugsweise 10 ×) auf und abpipettiert. Dieser Komplex wird vor Anwendung ebenfalls 15 min stehen gelassen.

Ansatz für eine Zellkulturschale 3 cm

Endosomale Feisetzung und Transfektionseffizienz können durch ein "Fusionspeptid", vom Membranprotein des Influenza Virus abstammendes Hemagglutinin (HA) [1, 2], verbessert werden. Dazu wird das Peptid zu Beginn der Komplexbildung zu den Liposomen gegeben und die Mischung dann wie die reinen Liposomen laut Vorschrift verwendet. Die Konzentration des HA-Peptides kann zwischen 0.1 und 1 nmol pro Ansatz betragen.
[1] Wagner et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (17), 7934-7938
[2] Smoes und Slepushkin (1998) Gene Therapy 5 (7), 955-964

Beispiel 2 Biologische Prüfung der erfindungsgemäßen Liposomen 1) Untersuchungen an Kulturzellen

Humane Nabelschnurendothelzellen (HUVEC), Melanomzellen (MeWo) und Fibroblasten (3T3) wurden in der Zellkultur mit der dem Fachmann bekannten Zellkulturtechnik vermehrt und isoliert.

Liposomale Vektorkomplexe mit den Komponenten a)+b)+c)+d) oder (zur Kontrolle) mit den Komponenten a)+b)+c) (wobei die Komponente b) Protaminsulfat statt PEI2000 darstellte) wurden im Überschuß (Verhältnis ca. 20 : 1) zu den Zellen gegeben und das Gemisch bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Nachfolgend wurden die Zellen gewaschen und für weitere 60 Stunden im frischen Zellkulturmedium inkubiert. Anschließend wurde die erfolgreiche Aufnahme der Komplexe in die Zelle, die Transkription und die Expression des Reportergens im Plasmid durch Nachweis der GFP Autofluoreszenz.

Folgende Ergebnisse werden erzielt:
Etwa 5% der Zellen, welche mit kontroll-liposomalen Vektorkomplexen inkubiert worden sind, zeigten eine Expression von GFP. In HUVEC war diese Expressionsrate etwa gleich groß wie in Melanomzellen und Fibroblasten (3T3).

Im Gegensatz hierzu zeigten nur HUVEC, welche mit dem erfindungsgemäßen liposomalen Vektorkomplexen inkubiert wurden, eine deutliche Expression von GFP. Mehr als 80% der Zellen exprimierten GFP.

Claims (18)

1. Liposomaler Vektorkomplex enthaltend folgende Komponenten

• a) eine Nukleinsäuresequenz beliebiger Länge;
• b) einen kationischen Träger, welcher die Komponente a) kondensiert und zugleich lysosomotrop ist;
• c) Lipide und Phospholipide, welche ein Liposom bilden; und
• d) optional einen Liganden, welcher eine Bindungsstelle für eine Zielzelle hat und mit einem Lipid konjugiert ist; und
• e) optional die funktionale Sequenz aus der Untereinheit HA-2 des Hemagglutinin des Influenzavirus;

erhältlich durch

• 1. Mischung von Komponente a) mit Komponente b) im molaren Verhältnis [a) : b)] von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist, und
• 2. der aus Schritt 1) resultierende Komplex in die Komponente c) eingeführt wird, und
• 3. optional Komponente d) in die Komponente c) eingefügt wird; und
• 4. optional Komponente e) in den aus Schritt 2 oder 3 resultierenden Komplex eingefügt wird.

2. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 1, dessen isoelektrischer Punkt im pH-Bereich von 3-9 liegen.

3. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 2, dessen isoelektrischer Punkt im pH-Bereich von 3-7 liegt.

4. Liposomaler Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1-3, bei welchem die Komponente a) eine DNA oder RNA darstellt.

5. Liposomaler Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1-3, bei welchem die Komponente a) ein viraler Vektor ist.

6. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 5, bei welchem der virale Vektor ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend RTV, AAV und Lenti V.

7. Liposomaler Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1-6, bei welchem der kationische Träger b) ein kationisches Polymer ist.

8. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 7, bei welchem das kationische Polymer Polyethylenimin (PEI) ist.

9. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 8, bei welchem das Molekulargewicht des PEI in einem Bereich von 500 bis 20.000 Da liegt.

10. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 9, bei welchem das PEI ein Molekulargewicht von durchschnittlich 2000 Da aufweist.

11. Liposomaler Vektorkomplex nach Anspruch 10, wobei der zielzellspezifische Ligand an ein Lipid konjugiert ist.

12. Lipsomaler Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1-11, wobei die Zielzelle eine Gewebezelle, eine Epithelzelle, eine Endothelzelle, eine Blutzelle, eine Leukämiezelle oder eine Tumorzelle ist.

13. Liposomaler Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1-12, bei welchem der isoelektrische Punkt des Komplexes im pH-Bereich von 4-7 liegt.

14. Liposomaler Vektorkomplex nach einem der Ansprüche 1-13 für die Transfektion und Transduktion einer Zelle.

15. Verwendung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1-13 oder eine Zelle nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Heilmittels für die Prophylaxe oder Therapie einer Erkrankung.

16. Verwendung des liposomalen Vektorkomplexes nach Anspruch 15 zur Verabreichung auf die Haut, auf eine Schleimhaut, in eine Körperhöhle, in das Bindegewebe, in ein Organ oder in den Blutkreislauf.

17. Liposomale Vektorkomplexe nach Anspruch 1-16, bei welchen in die Komponente c) ein zielzellspezifischer Ligand eingefügt ist.

18. Verfahren zur Herstellung eines liposomalen Vektorkomplexes nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei

• 1. Komponente a) gemäß Anspruch 1 mit Komponente b) gemäß Anspruch 1 vermischt wird im molaren Verhältnis [a) : b)] von 1 : 1 bis 1 : 1000, wobei das Mischungsverhältnis so eingestellt wird, daß die Nettoladung des resultierenden Gesamtkomplexes vorzugsweise entweder kationisch oder anionisch ist;
• 2. der aus Schritt 1 resultierende Komplex in die Komponente c) gemäß Anspruch 1 eingeführt wird; und
• 3. optional Komponente d) gemäß Anspruch 1 in die Komponente c) eingefügt wird; und
• 4. optional Komponente e) gemäß Anspruch 1 in den aus Schritt 2 oder 3 resultierenden Komplex eingefügt wird.