CN1250728C

CN1250728C - 在原核细胞内产生活性异二聚体amv－rt的方法

Info

Publication number: CN1250728C
Application number: CN01140718.2A
Authority: CN
Inventors: H·索贝克; R·米勒; M·施米德特; B·弗雷; B·苏普曼; R·施穆克; J·-P·塔尔霍菲; P·帕卢尔; M·帕亚特施
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2006-04-12
Anticipated expiration: 2021-09-21
Also published as: DE60142384D1; ATE471376T1; EP1191102A2; DE10046960A1; CA2357540A1; CA2357540C; US6902920B2; JP2002315584A; CN1346889A; ES2346511T3; EP1191102B1; US20020115147A1; EP1191102A3

Abstract

本发明描述了在原核细胞内，特别是在大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌)内异源性表达来自鸟成骨髓细胞白血病病毒的逆转录酶(AMV-RT)。本发明还包括简化的纯化该异二聚体AMV-RT的一些方法。

Description

在原核细胞内产生活性异二聚体AMV-RT的方法

技术领域

本发明涉及一种产生重组的活性异二聚体AMV-RT的方法，是通过在某些生长和诱导条件下在原核细胞内表达编码AMV-RTα-和/或β-亚单位的一种或几种DNA序列。

背景技术

二十世纪七十年代发现了逆转录酶，推翻了关于从DNA经过RNA至蛋白质作为单向性过程信息传递的分子生物学“中心法则”(TerminH和Mizutani S.，1970，自然，226：1211-1213；Baltimore D.，1970，自然，226：1209-1211)。对这些RNA-依赖性DNA聚合酶的催化特征鉴定是现代理解RNA病毒增殖周期的基础，因此也是理解由这种类型病毒引起的疾病(癌症、艾滋病等)发展和传播的基础。

但是，对于cDNA的合成、扩增和克隆(RT-PCR)逆转录酶也是一种分子生物学工具。这种技术使之有可能简化和加速对真核细胞内基因表达的测定。从细胞提取物或组织分离出总mRNA之后，借助于逆转录酶将此mRNA回译成cDNA，并通过随后的PCR步骤扩增，以便能够进行克隆和特征鉴定。因而，一方面是不必阐明基因内含子和外显子的结构，但另一方面是在细胞的不同生命周期中或者在疾病(如癌症)的发展过程中也可能测定细胞内基因的表达。

迄今已仔细地测定了来自三种不同逆转录病毒的逆转染酶(RT)：来自Moloney氏鼠白血病病毒(M-MLV)的RT，此酶由具有78kD分子量的单一亚单位组成(Prasad V.R.，1993逆转录酶述评，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，135)。此外还已知一个来自人免疫缺损病毒(HIV)的RT。此RT是由二个亚单位p66和p51组成的异二聚体，p51亚单位是由p66蛋白水解断裂而形成(Le Grice S.F.J.，1993逆转录酶述评，冷泉港，纽约：冷泉港实验室出版社，163)。此外还已知来自鸟肉瘤-白血病病毒(ASLV)的RTs。可从鸟成骨髓细胞白血病病毒(AMV)获得的RT也属于ASLV家族。这种RT也是一种异二聚体，由具有分子量大约63kDa的α-链和具有分子量大约95kDa的β-链组成。在此情况下，α-链也是由β-链的蛋白水解加工而形成(Golomb M和Grandgenett D.，1979，生物化学杂志，254：1606-1613；Weiss R.等编著，1984，肿瘤病毒的分子生物学，第二版：RNA肿瘤病毒1/text。冷泉港实验室，冷泉港，纽约)。

虽然M-MLV-RT是在大肠杆菌中作为单体被表达，HIV-RT是作为异二聚体被表达，但是迄今还不可能在大肠杆菌或其它原核生物内满意地表达AMV-RT作为有活性的或可溶性异二聚体。尽管按照WO 00/42199，在大肠杆菌或优选地在昆虫真核细胞内表达了某些RT变异体，但是，按此方法获得的所需RT主要(大约90％)由不溶性成分组成。

此外，在大肠杆菌细胞粗提取物中也难以测定重组AMV-RT，一方面是因为RNA模板可被大肠杆菌固有的RNA酶降解，另一方面是因为大肠杆菌菌株具有DNA聚合酶，此酶除了具有DNA聚合酶活性外还具有RT活性(Ricchetti，M.和Huc，H.，1993，EMBO杂志，12(2)，387-396)。因此，大肠杆菌这种固有的RT活性会明显地干扰对大肠杆菌粗提取物内和纯化组分内重组AMV-RT活性的测定。

因此，本发明的目标是提供足够量的活性的重组异二聚体AMV-RT。

发明概述

是通过在原核生物宿主细胞内产生活性异二聚体AMV-RT的方法来实现此目标，其中是将编码AMV-RTα和β亚单位或链的一种或几种DNA序列克隆进入表达质粒，然后将此质粒转化进入原核细胞，诱导表达此异二聚体AMV-RT，并从细胞内纯化，即分离出这种重组异二聚体AMV-RT。其中适合的基因和DNA序列是仅编码一种AMV-RT亚单位的序列。随后可以借助于某些方法如蛋白水解切割β-链，将此表达产物的一部分转变成其它的亚单位。已证明序列SEQ IDNO：4和SEQ ID NO：5特别适合于本发明的方法，它们可产生由亚单位SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成的活性异二聚体AMV-RT。

发明内容

编码AMV-RT亚单位的结构基因和DNA序列可以任选地在有所谓辅助质粒存在时，在不同的单独表达质粒上或者在同一个表达质粒上被克隆，并在适当的宿主细胞内表达。适当的表达质粒有例如pDS，pKK177-3或pKKT5。其中将各自的结构基因插入在T5启动子控制之下的质粒pKKT5是本发明优选的。其它可能采用的启动子有例如lac，lac UV5或tac启动子，它们优选地是IPTG-可诱导性启动子。另外几种辅助质粒如质粒pUBS520，以及适合的选择标志如氨苄青霉素或卡那霉素原则上都是本领域的技术人员熟知的。

将表达质粒和任选地其它辅助质粒转化进入适当的原核生物宿主细胞。根据本发明优选地是使用大肠杆菌菌株如大肠杆菌K12 C600，DH5α，LE392，JM83，JM105，NM522，M15，RR1Δ15，UT5600，TG1，A1200或者菌株大肠杆菌B，BL21，HB101。大肠杆菌菌株LE392是本发明特别优选的。

可以通过多种方法诱导对异二聚体AMV-RT的表达。特别是某些培养和诱导条件对表达活性AMV-RT具有阳性作用。根据本发明已证明，在10°-25℃范围内的培养温度同低浓度的诱导剂相结合是有利的。已证明大约15℃的培养温度，以及0.1-0.5mM，优选地大约0.15mM的诱导剂浓度是特别适合的。根据本发明，IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)或乳糖优选地被用作诱导剂。

而且已证明，通过辅助基因的共-表达可增加原核细胞中AMV-RT的可溶性表达。特别可能的辅助基因是编码色氨酸tNRA(tRNA)的trpT基因。此外，伴随基因还适合于可溶性表达如编码GroEL和GroES，GrpE，ClpB，DnaK和DnaJ的基因。然后优选地将一个或几个伴随基因随同可诱导的启动子安排在辅助质粒上，在表达质粒上编码伴随GroEL和GroES的基因是处于必要启动子的控制之下，编码α-和β-链的结构基因也定位于此表达质粒上。但是，根据本发明特别优选的是，将编码GroEL和GroES的基因克隆在携带有编码α-和β-链基因的表达质粒上，并且将编码DnaK、DanJ、GrpE和ClpB的基因克隆在辅助质粒上。

除了本领域的技术人员普遍知道的方法之外，特别有益的是使用亲和层析材料如金属离子螯合材料或阳离子交换剂，以便从细胞提取物中纯化或分离出重组异二聚体AMV-RT。为了纯化AMV-RT，特别有利的是使表达产物即α-以及β-链与能够可逆地结合于特殊层析柱材料的肽序列融合，此特殊的柱材料包括例如阳离子交换剂，金属离子螯合材料如镍、铜或锌次氮基乙酸(NTA)树脂。根据本发明适合的肽序列可以具有2-大约100个氨基酸或氨基酸衍生物。已证明由2-10个氨基酸如精氨酸残基或组氨酸残基组成的肽序列特别适合于本发明。此外还证明，使用含有8个精氨酸或6个组氨酸残基的这种肽序列也特别有利。而且可购买得到的肽序列如Strep-rag^(IBA GmbH，Gottingen/Germany)或GST-tag(Pharmacia，Uppsala/Sweden)也适合于本发明的方法。

附图说明

图1显示具有1.8kb大小的RT-PCR扩增产物，它们是用纯化的天然AMV-RT得到的(电泳道2)，以及用由重组方法获得的AMV-RT得到的(电泳道3)。电泳道1和4显示DNA分子量标志物VI(产品分类号1062590，Roche分子生物化学产品)。图2显示对来自纯化AMV-RT样品的SDS凝胶电泳图谱：

电泳道1：分子量标志物

电泳道2：天然AMV

电泳道3：细胞裂解物

电泳道4：Ni-螯合琼脂糖，用缓冲液C洗

电泳道5：Ni-螯合的合并物

电泳道6：精制的重组AMV-RT

图3是琼脂糖凝胶电泳图谱，显示应用重组AMV-RT RT-PCR反应产物被分离开，电泳道1：8kb扩增产物，电泳道2：10kb扩增产物，电泳道3：DNA长度标准X，电泳道4：12kb扩增产物，电泳道5：13.5kb扩增产物，电泳道6：DNA长度标准X。

具体实施方式

将通过下面的实施例对本发明作进一步阐述：

1.实施例：

分离编码α-链和β-链的基因

为了分离β-链使用资料库序列(MEDLINE ID 94366722，Baluda等，1994)设计寡核苷酸引物(见SEQ ID NO：1和2)。为了随后克隆进入载体，将EcoRI限制性内切酶切割位点掺入于5′末端，将PstI限制性切割位点掺入于3′末端。此外进一步设计了能够用于分离α-链的3′引物(见SEQ ID NO：3)。借助于PCR从病毒裂解物(ATCC VR-265)中，以及借助于RT-PCR从质粒上携带β-链的大肠杆菌克隆(ATCC 31990)钓出了这二种链。将此PCR混合物施加于1％琼脂糖凝胶，从此琼脂糖凝胶中分离出大约1715bp α-链和大约2570bp β-链的PCR片段(QIAEX II，凝胶提取试剂盒，Qiagen/Germany)，用上述的限制性内切核酸酶切割并被克隆进入pCU19的载体片段，此片段也已用EcoRI和PstI线性化了并被分离出。为此，吸取1μl(20ng)载体片段和3μl(100ng)PCR片段，1μl 10倍稀释的连接酶缓冲液(Maniatis等，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，NY(USA)，Vol.27)，1μl T4DNA连接酶，4μl无菌双蒸馏水，仔细混匀，在16℃温育过夜，随后借助于限制性酶切分析和测序对克隆的基因进行检测。其序列被显示在SEQ ID NO：4(α-链)和SEQ IDNO：5(β-链)。

与资料库序列(MEDLINE ID 94366722，Baluda，M.A.，和Reddy，E.P.，1994，癌基因，9：2761-2774)相比较，对于α-链以及β-链在DNA水平得出了98.8％的同源性。当对所产生的氨基酸序列进行比较时，很显然，在DNA水平的绝大多数取代都是所谓的沉默突变，即不导致氨基酸取代。只有三个碱基取代也导致了氨基酸取代，并发现它们在每次分离的PCR产物中都是可重复性的，这些取代是Arg273Met，Arg304Gln和Asp495Glu。这二种链的氨基酸序列被显示在SEQ IDNO：6(α-链)和SEQ ID NO：7(β-链)中。

2.实施例：

表达不带融合肽序列(标记)的α-链和β-链

2.1.表达质粒pAMV-α和pAMV-β的构建

为了表达AMV-RT，分别将此二种链的基因克隆进入表达载体，此克隆方式可致使将其结构基因以在T5启动子控制之下的正确取向各自被插入。为此，用EcoRI和PstI从质粒pUC19中切取α-链和β-链的各自结构基因，然后借助于琼脂糖凝胶电泳分离此限制性酶切混合物，并从此琼脂糖凝胶中分离出1715bp的α-链片段和2570bp的β-链片段。将表达质粒pKKT5用于表达，此pKKT5是通过从pKK177-3(Kopetzki等，1989，分子基因遗传学，216：149-155)以来自pDS(Bujard等，1987，酶学方法，155：416-433)的T5启动子取代其tac启动子而形成的。通过二个点突变除去了T5启动子序列中EcoRI限制性内切核酸酶的切割位点。为了插入AMV-RT的基因，用EcoRI和PstI切割所形成的表达质粒，然后借助于琼脂糖凝胶电泳分离此限制性酶切混合物，并从此琼脂糖凝胶中分离出所产生的大约2500bp的载体片段。将以这种方式获得的载体片段如上面所述分别与实施例1中所述的α-链和β-链的基因相连接。通过限制性酶切对照和测序核实基因的正确插入。首先用辅助质粒pUBS520分别转化所形成的质粒pAMV-α和pAMV-β，用于在不同的大肠杆菌菌株中作表达对照。在这种情况下可以设想，为了得到αα-和ββ-同型二聚体，可能使α-链和β-链分别被表达。辅助质粒pUBS520(Brinkmann等，1989，基因，85：109-114)在alia之间携带有编码lac阻抑物的lacIq基因，以及编码在大肠杆菌中可识别密码子AGA和AGG的稀少tRNAArg的dnaY基因(Garcia等，1986，细胞，45：453-459)。用来自转座子TN903的卡那霉素抗性基因作选择性标记物。

2.2在大肠杆菌内分别转化表达质粒pAMV-α和pAMV-β

按照Hanahen(分子生物学杂志，1983，Vol.166，557)的方法制备不同大肠杆菌菌株的适用细胞。将按此方法制备的200μl大肠杆菌LE 392细胞同20ng分离的表达质粒pAMV-αDNA或pAMV-βDNA和40ng辅助质粒DNA混合。在冰上孵育30分钟之后进行热休克(42℃90秒)。随后将细胞转移至1ml LB培养基内，为进行表型表达，在LB培养基内37℃温育此细胞1小时。将等分量这种转化的混合物在含有氨苄青霉素和卡那霉素作选择标记的LB培养板上铺开，37℃培育15小时。

2.3在大肠杆菌中表达α-链的基因

为了表达编码AMV-RTα-链的基因，将含有质粒的克隆接种于3ml LB_ampkan培养基内，在30℃震荡培养。达到光密度0.5时(在550nm测定的，OD₅₅₀)用0.5mM IPTG诱导此细胞，在30℃震荡4小时。随后测定此单个表达克隆的光密度，取出相当于5.0/ml OD₅₅₀的等分量细胞进行离心(10分钟，6000rpm，4℃)。将此细胞沉淀再悬浮于400μl TE缓冲液(50mM TRIS/50mM EDTA，pH 8.0)中，用超声波使细胞破裂，通过离心(10分钟，14000rpm，4℃)从不溶性蛋白质组分中分离出可溶性蛋白质组分。对所有的组分加入含有SDS和β-巯基乙醇的应用缓冲液，通过煮沸(100℃，5分钟)使这些蛋白质变性。然后借助于分析性SDS凝胶(10％)(Laemmli U.K.，1970，自然，227：555-557)每次10μl地对此蛋白质进行分析。

SDS凝胶分析显示出α-链的明显过度表达。在大约63kD看到一条附加的强过度表达带，而在未诱导的对照克隆或者不含质粒的诱导的对照克隆都没有观察到这条带。小部分过度表达的α-链出现在可溶性蛋白组分中，而形成了较大量不溶性表达蛋白。

2.4在大肠杆菌中表达β-链的基因

为了表达编码AMV-RTβ-链的基因，以含有质粒的克隆接种于3ml LB_ampkan培养基内，在30℃震荡培养。达到光密度0.5时用0.5mM IPTG诱导此细胞，在30℃震荡培养4小时。随后测定此单个表达克隆的光密度，取出相当于5.0/ml OD₅₅₀的等分量细胞进行离心(10分钟，6000rpm，4℃)。将此细胞沉淀再悬浮于400μl TE缓冲液(50mM TRIS/50mM EDTA，pH 8.0)中，用超声波使细胞破裂，通过离心(10分钟，14000rpm，4℃)从不溶性蛋白质组分中分离出可溶性蛋白质组分。对所有的组分加入含有SDS和β-巯基乙醇的应用缓冲液，通过煮沸(100℃5分钟)使这些蛋白质变性。然后借助于分析性SDS凝胶(8％)(Laemmli U.K.，1970，自然，227：555-557)每次10μl地对此蛋白质进行分析。

SDS凝胶分析显示出β-链的明显过度表达。在大约95kDa看到一条附加的强过度表达带，而在未诱导的对照克隆或者不含质粒的诱导的对照克隆都没有观察到这条带。大部分过度表达的β-链出现在不溶性蛋白质组分中，但是在可溶性蛋白质组分中也看到稍微过度表达的β-链。

2.5在同一细胞内的不同质粒上表达二种链

为在在同一细胞内表达二种链，首先必须将IacI^q表达盒和dnaY表达盒从辅助质粒pUBS520再克隆至表达质粒上。将IacI^q表达盒克隆至表达质粒pAMV-α上，将dnaY表达盒克隆至表达质粒pAMV-β上。为了确保表达质粒的稳定增殖，用来自pUBS520的卡那霉素抗性基因取代pAMV-α中的氨苄青霉素抗性基因。随后将所形成的表达质粒pAMV-α_lacIq和pAMV-β_dnaY共转化进入不同的大肠杆菌表达菌株。

为了表达编码AMV-RTα-链和β-链的基因，以含有质粒的克隆接种于3ml LB_ampkan培养基内，在30℃震荡培养。达到光密度0.5时用0.5mM IPTG诱导此细胞，在30℃震荡培养4小时。随后测定此单个表达克隆的光密度，取出相当于5.0/ml OD₅₅₀的等分量细胞进行离心(10分钟，6000rpm，4℃)。将此细胞沉淀再悬浮于400μlTE缓冲液(50mM TRIS/50mM EDTA，pH 8.0)中，用超声波使细胞破裂，通过离心(10分钟，14000rpm，4℃)从不溶性蛋白质组分中分离出可溶性蛋白质组分。对所有的组分加入含有SDS和β-巯基乙醇的应用缓冲液，通过煮沸(100℃5分钟)使这些蛋白质变性。然后借助于分析性SDS凝胶(8％)(Laemmli U.K.，1970，自然，227：555-557)每次10μl地对此蛋白质进行分析。

SDS凝胶分析惊人地显示出α-和β-链的明显过度表达。在大约63kDa和大约95kDa可看到附加的强过度表达带，而在未诱导的对照克隆或者不含质粒的诱导的对照克隆都没有观察到这种带。这种带对可溶性和不可溶性组分的分配，与分别表达这二种链的实验中的分配相似。二种链的表达产量总体上稍微小于分别表达的产量。

3.实施例：

为了简化纯化过程表达带有融合标记的α-链和β-链

3.1产生不同的融合蛋白质

为了有效地纯化重组AMV-RT异二聚体，可将适当的所谓标记肽序列融合于此二种链的5′末端。标记使亲和层析能够实现。以二种亲和层析一组，每种对二个标记中的一个具有特异性，这样还能够分离出纯异二聚体(Wende W.等，1996，生物化学，377，625-632)。借助于PCR反应，将适当设计的引物用于使8个精氨酸残基附着于α-链，使6个组氨酸残基附着于β-链。有义引物序列被显示在SEQ IDNO：8(对于α-链的5′引物)和SEQ ID NO：9(对于β-链的5′引物)中。将已经被用于基因分离的寡核苷酸SEQ ID NO：2(β-链)和SEQID NO：3(α-链)用作反义引物。

将此PCR混合物施加于1％琼脂糖凝胶，从此琼脂糖凝胶(QIAEXII，凝胶提取试剂盒，Qiagen，Germany)中分离出编码α-链的1739bpPCR片段和编码β-链的2597bp PCR片段，用限制性内切核酸酶EcoRI和PstI切割，然后被克隆进入优选表达质粒的载体片段，此片段也已用EcoRI和PstI线性化了，并被分离出。为此，吸取1μl(20ng)载体片段和3μl(100ng)PCR片段，1μl 10倍稀释的连接酶缓冲液(Maniatis等，1989，分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社NY(USA)，Vol.27)，1μl T4 DNA连接酶和4μl无菌双蒸馏水，仔细混匀，16℃温育过夜。随后借助于限制性酶切分析和测序检测所克隆的基因。将形成的表达质粒定名为pAMV-α_lacIq-Arg和pAMV-β_dnaY-His。

3.2将表达质粒pAMV-α_lacIq-Arg和pAMV-β_dnaY-His转化进入不同的大肠杆菌表达菌株

按照Hanahan(分子生物学杂志，1983，Vol.166pp.557)的方法制备不同大肠杆菌菌株的感受态细胞(见实施例2.2)。

3.3在一种细胞的不同质粒上表达带有融合标记的二种链

为了在一种细胞内表达带有标记的二种链，用表达质粒pAMV-α_lacIq-Arg和pAMV-β_dnaY-His共转化不同的大肠杆菌表达菌株。

为了表达编码AMV-RT带有Arg-标记的α-链和带有His-标记的β-链的基因，以含有质粒的克隆接种于3ml LB_ampkan培养基内，在30℃震荡培养。达到OD₅₅₀ 0.5时用0.5mM IPTG诱导此细胞，在30℃震荡培养4小时。随后测定此单个表达克隆的光密度，取出相当于5.0/ml OD₅₅₀的等分量细胞进行离心(10分钟，6000rpm，4℃)。将此细胞沉淀再悬浮于400μl TE缓冲液(50mM TRIS/50mMEDTA，pH 8.0)中，用超声波使细胞破裂，通过离心(10分钟，14000rpm，4℃)从不溶性蛋白质组分中分离出可溶性蛋白质组分。对所有的组分加入含有SDS和β-巯基乙醇的应用缓冲液，通过煮沸(100℃ 5分钟)使这些蛋白质变性。然后借助于8％的分析性SDS凝胶(LaemmliU.K.，1970，自然，227：555-557)每次10μl地对此蛋白质进行分析。

SDS凝胶分析惊人地显示出α-链和β-链的明显过度表达。在大约63kDa和大约95kDa可看到附加的强过度表达带，而在未诱导的对照克隆或者不含质粒的诱导的对照克隆都没有观察到这种带。这种带对可溶性和不可溶性组分的分配，与在同一细胞中分别表达不带标记的二种链的实验中的分配相似。

3.4在同一质粒上表达带有融合标记的二种链

如果把编码AMV-RTα-和β-链的基因分配在二个质粒上，这些质粒的稳定性差异可能导致产生不同量的相应链，并因此导致较低产量的αβ-链杂二聚体。所以除了β-内酰胺酶之外，将其余二个质粒pAMV-α_lacIq-Arg和pAMV-β_dnaY-His的全部遗传信息都组合在单一质粒pAMV-αβ-1上。通过将pAMV-β_dnaY-His的SspI-AflIII片段插入pAMV-α_lacIq-Arg的SalI切割位点构建了这种质粒，pAMV-β_{dnaY -His}的SsPI-AflIII片段含有T5启动子序列、编码带有N-端His-标记β-链的基因、rrnB终止子序列和dnaY基因，pAMV-α_lacIq-Arg含有T5启动子序列、编码带有N-端Arg-标记α-链的基因、rrnB终止子序列、卡那霉素抗性基因和lacI^q基因。为此目的，用上面所述限制性内切核酸酶按照厂商的说明切割1μg每种表达质粒pAMV-α_{lacIq -Arg}和pAMV-β_dnaY-His，然后在21％琼脂糖凝胶中分离此限制性酶切混合物，从此琼脂糖凝胶(QIAEX II，凝胶提取试剂盒，Qiagen/Germany)中分离出了pAMV-β_dnaY-His的4124 pb SspI-AflIII片段和pAMV-α_lacIq-Arg的6024 bp片段。用Klenow聚合酶(RocheDiagnostics GmbH)按照厂商的说明书制备非匹配性末端，如上面所述将此二个片段连接在一起。借助于限制性酶切分析检测所形成的新表达质粒pAMV-αβ-1。

如上述所述，将根据限制性酶切分析正确的表达质粒转化进入大肠杆菌K-12菌株LE392，并同时作表达对照，在诱导条件下培养4小时之后随即借助于SDS-PAGE测定此细胞的蛋白质内含物。根据SDS-PAGE分析，此表达产量的水平以及可溶性和不可溶性片段的相对比率，与在不同质粒上对α-链和β-链的基因表达相差不大，但是表达的α-和β-链的含量显得比较相似。而且为了纯化过程用像β-链一样的His标记取代了α-链的Arg-标记。为此目的，制备了一种中间构建物pAMV-α_lacIq-His’其中用来自pAMV-β_dnaY-His的EcoRI-NheI片段取代了来自pAMV-α_lacIq-Arg的EcoRI-NheI片段。然后像构建pAMV-αβ-1一样，将二种质粒pAMV-α_lacIq-His和pAMV-β_{dnaY -His}的全部遗传信息除了编码β内酰胺酶的基因之外其余都组合在单一质粒pAMVαβ-2上。此新表达载体被取名为pAMVαβ-2。如上所述用pAMVαβ-2转化细胞，并在标准条件下对表达进行控制。在这些条件下表达产量没有增加。

4.实施例：

使表达最佳化

4.1通过改变表达条件增加活性AMV-RT的表达

特定的培养和诱导条件对活性AMV-RT的表达具有阳性作用。以后在诱导期中将培养温度从30℃降低至15℃，为了诱导表达IPTG的浓度从0.5mM降低至0.15mM，并且诱导时间从4小时增加至26小时。诱导期之后如上面所述通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定细胞中的蛋白质含量。

此后如所预料的，与在标准培养和诱导条件下的表达实验相比较在SDS-PAGE分析中α-和β-链的总表达产量基本都减少了，但是可溶性α-和β-链的表达含量明显地增加了。在随后的纯化和活性测定中也证实了这种活性AMV-RT表达的增加。

4.2通过辅助基因的共表达增加活性AMV-RT的表达

4.2.1共表达色氨酸-tRNA(tRNA^trp)基因

AMV-RT的一个特性是在感染真核宿主细胞之后用细胞内源性色氨酸tRNA(tRNA^trp)作为聚合酶反应的引物(Leis等，1993，逆转录酶，冷泉港专题论文丛书，Skala，A.M和Goff，S.P编著，冷泉港NY(USA，33-48)。但是还未证明是否大肠杆菌内源性tRNA^trp也可被AMV-RT用作引物。在大肠杆菌中tRNA^trp只被单一基因trpT编码，此基因的表达与细胞的正常需要相适应。为了排除细胞中缺乏tRNA^trp的可能性，借助于PCR从大肠杆菌LE392中分离出了相当于SEQ IDNO：10的trpT基因(为此所用的引物被显示在SEQ ID NO：11和12中)，用PstI再切割此基因以便插入pAMV-α_lacIq-His中，并连接进入如上面所述也用PstI线性化的pAMV-α_lacIq-His的载体片段中。通过限制性酶切分析和测序核实了在PstI限制性内切核酸酶切割位点已整合trpT基因的克隆。在此中间构建体pAMV-α_{lacIq-His-trpT}中，编码α-链的基因以及编码大肠杆菌tRNA^trp的基因形成一个转录单位，其表达受IPGT可诱导的T5启动子的调节。然后，类似于pAMVαβ-1或pAMVαβ-2的构建，将二种质粒pAMV-α_{lacIq-His-trpT}和pAMV-β_dnaY-His的全部遗传信息，除了β-内酰胺酶的基因之外其余的都组合在单一质粒pAMVαβ-3上。如上面所述用pAMVαβ-3转化细胞，并应用修改的表达条件进行表达控制。这样发现活性AMV-RT的产量显著增加了。

4.2.2伴随基因的共表达

在大肠杆菌内存在包含GroESL机构的二个主要伴随系统和一个由Dnak，DnaJ，GrpE和ClpB组成的4成分系统(Kedzierska，1999)。对于新形成蛋白质的正确折叠以及由于应急反应已被聚集的蛋白质的复性，这二个系统都有重要的作用(Hartl F.U.，1996，自然，381，571-580；Bukau H.和Horwich A.L.，1998，细胞，92，351-366；Mogk A.等，EMBO杂志，18，6934-6949；Zolkiewski M.，1999，生物化学杂志，274，28083-28086；Goloubinoff P.等，1999，美国国家科学院学报，96，13732-13737)。

第一步应使来自大肠杆菌的groESL操纵子在产生AMV-RT的菌株内过度表达。为此，将来自pOF39(Fayet O.，Louarn J.M.，GeorgopoulosC.，1986，分子基因遗传学，卷202，pp.335-345)的EcoRI-HindIII片段整合进入质粒pAMV-β_anaY-His的SspI切割位点。用Klenow聚合酶(Roche Diagnostics)按照厂商的说明书先制备非匹配性末端然后连接。groESL序列被显示在SEQ ID NO：13中。在这种新构建物pAMV-β_{dnaY-His-groESL}中，groESL操纵子形成一个含有3′-位置β内酰胺酶基因的人工转录单位。然后在现在已位于groESL操纵子5′侧的内源性组成型bla启动子控制之下，以及/或者在groESL操纵子的σ³²-依赖性启动子的控制之下进行表达。随后如上面所述将这二种表达质粒pAMV-α_{lacIq-His-trpT}和pAMV-β_{dnaY-His-groESL}的全部遗传信息，除了β-内酰胺酶基因之外其余的都组合在单一质粒pAMVαβ-4上。

如上面所述用pAMVαβ-4转化细胞，并在修改的表达条件下受到表达控制。GroESL的共过度产生导致生物量和活性AMV-RT含量增加。在纯化和活性测定之后，获得了比以前最好的生产菌株高3-4倍的含量值。

证明了在AMV-RT产生菌株内共过度产生GroESL是一种阳性措施之后，第二步是使其它的大肠杆菌主要伴随系统也共过度生产。这种共过度产生除了具有所推测的一般优点之外，它还能够补偿GroESL机构的不利因素即大约65kDa的不相容体积(Deuerling E.等，1999，自然，400，693-696)。如果它不能被分成相互独立形成的单独功能区，运对于AMV-RT β-链的正确折叠将特别重要。将基因Dnak、DnaJ和GrpE组合在相当于生物学组合的人工操纵子中(DiamantS和Goloubinoff P.1998，生物化学，37，9688-9694；Pierpaoli E.V等，1989，生物化学杂志，273，6643-6649)，而ClpB的基因却形成它自己的转录单位。将二种转录单位都置于IPGT-可诱导性T5启动子的控制之下，以便使其表达与编码AMV-RT亚单位的基因表达相配合。

由于技术的原因，克隆过程需要许多中间步骤才能得到最终的构建体pCHAP-5。因此首先构建pKKT5衍生物pCHAP-1和pCHAP-2。pCHAP-1包含来自大肠杆菌的dnaKJ操纵子的遗传信息，以编码dnaK的起始密码子开始，直至编码dnaJ的终止密码子；pCHAP-2携带有作为插入片段的来自GrpE和ClpB的基因编码区的人工转录单位；通过PCR从大肠杆菌K12KE392的基因组DNA扩增了其相应的DNA片段。dnaKJ操纵子序列被显示在SEQ ID NO：14中，用于分离dnaKJ操纵子的相应引物被显示在SEQ ID NO：15和16中。grpE基因的序列被显示在SEQ ID NO：17中，用于分离grpE基因的相应引物被显示在SEQ ID NO：18和19中。ClpB基因序列被显示在SEQ IDNO：20中，用于分离ClpB基因的相应引物被显示在SEQ ID NO：21和22中。为了构建pCHAP-1，如上面所述用SmaI和BamHI再次切割含有dnaKJ操纵子的PCR片段，连接进入也用SmaI和BamHI线性化的pKKT5载体片段。以grpE基因的EcoRI-PstI片段、clpB基因的PstI-HindIII片段和用EcoRI和HindIII线性化的pKKT5载体片段，通过三重连接构建了pCHAP-2。其中clpB基因作为转录单位单独存在的pCHAP-3来源于pCHAP-2，是通过将来自pCHAP-2的PstI-HindIII片段连接进入如上所述用EcoRI和HindIII线性化的pKKT5载体片段而形成。在连接反应之前用Klenow聚合酶(RocheDiagnostics)按照厂商的说明书制备此二种片段的非-匹配末端。pCHAP-4是pCHAP-1的衍生物，它的插入片段通过来自pCHAP-2的grpE基因而延伸，因此该人工转录单位含有DnaK、DnaJ和GrpE的基因。由于在这种情况下Shine Dalgarno序列未达到最佳状态，与pCHAP-2相比较grpE的表达会降低，并因此比较适合于dnaKJ的表达(Diamant和Goloubinoff，1998；Pierpaoli等，1998)。为了构建pCHAP-4，先用Klenow聚合酶(Roche Diagnostics)按照厂商的说明书制备二种片段的非匹配性末端，然后将来自pCHAP-2的EcoRI-AvaI片段插入pCHAP-1的BamHI切割位点中。最后一个构建体pCHAP-5是含有以pCHAP-3的插入片段作为补充遗传信息的pCHAP-4衍生物。为此，借助于已几次描述的限制性酶切和连接法，用来自pCHAP-3的BspLU11I-SspI片段取代pCHAP-4中的BspLU11I-NdeI片段。为了确保末端的可匹配性，用Klenow聚合酶(Roche Diagnostics)按照厂商的说明书预先填充了由NdeI产生的突出末端。

测定了将表达质粒pAMVαβ-4与不同的辅助质粒pCHAP-1至pCHAP-5组合对活性AMV-RT过度产生的作用。至少在修改的标准表达条件下，所有的辅助质粒都明显地增加了活性AMV-RT的前述产量，并且如所预料的，辅助质粒pCHAP-5给出了最好的结果。通过SDS-PAGE以及通过后续的纯化和活性测定都证实了这点。

5.实施例：

分析方法

5.1对逆转录酶活性的测定(测定法A)

纯化过程中借助于非放射性测定系统检测组分中逆转录酶的活性。为此使用了“非放射性逆转录酶测定法”(Roche分子生物化学，产品分类号1468120)。温育时间缩短至30分钟。

5.2对逆转录酶活性的测定(测定法B)

借助于放射性检测系统测定集合体中的特异性逆转录酶活性。在100μl检测体积(50mM Tris/HCl，pH 8.3(37℃)，40mM KCl，6mM MgCl₂，0.5mM dTTP，0.04 OD₂₆₀nm聚(A)×dT₁₅，0.1μm[3H]-dTTP)中测定逆转录酶的活性。以适当的稀释度加入AMV-RT(5μl)。37℃温育10分钟应用10％TCA溶液(500μl)终止反应。沉淀之后漂洗在硝酸纤维素滤纸上形成的放射性标记的产物。用闪烁计数器测定放射活性的掺入比率并计算样品中RT的活性。1酶单位被定义为在37℃10分钟内将1.0nMol TMP掺入酸性不溶解产物的AMV-RT含量。

5.3对DNA聚合酶的测定

通过测定切口平移检测来自大肠杆菌的DNA聚合酶活性。借助于非放射性切口平移试验检测DNA聚合酶。在50μl检测体积(50mMTris/HCl，pH 7.5，10mM MgCl₂，0.1mM DTE，28.875μM DIG-dUTP，1.444μM bio-16-dUTP，95.865μM dTTP，20μMdATP，20μM dCTP，20μM dGTP，1μg pBR322，1pg DNaseI)中进行此切口平移试验。加入样品(1μl)之后在37℃温育此反应混合物30分钟。然后将反应混合物转移至以链亲和素包被的微量滴定板内。随后类似于“非放射性逆转录酶测定法”，(Roche分子生物化学，产品分类号1468120)对此试验进行处理和评定。

5.4对污染性活性的测定

在由10mM Tris/HCl，pH 7.5，10mM MgCl₂，1mM DTE组成的溶液中测定存在的外源性污染活性。

使适当的单个酶组分样品与相应的核酸共温育。通过在37℃与质粒pBR322(1μg)共温育2-16小时检测所谓的切口活性。通过在37℃与λ-DNA/EcoRI，HindIII(1μg)共温育2-16小时检测非特异性核酸酶。通过在37℃与MSII-RNA(5μg)共温育2-4小时检测非特异性RNA酶。

为了检测外源核酸酶的污染，将样品在37℃与4μg[3H]-标记的DNA共温育4小时，然后测定释放的[3H]-标记核苷酸。

6.实施例：

纯化和功能测定

6.1来自大肠杆菌LE392 pAMV-α_IacIq-Arg/pAMV-β_dnaY-His构建体的AMV-RT

6.1.1纯化

将过度表达AMV-RT二种链的大肠杆菌细胞(见上面)用作纯化重组AMV-RT的起始材料。

在4℃纯化AMV-RT。使细胞裂解，分离出核酸之后借助于层析法进行纯化。这种纯化方法产生无污染酶活性的重组AMV-RT，并且在RT-PCR中具有与从天然材料中纯化的AMV-RT相同的功能活性。

缓冲液：

缓冲液A：50mM Tris/HCl，pH 7.9，0.5M KCl，0.02％ Triton X-100，20％甘油，

缓冲液B：20mM Tris/HCl，pH 7.9，0.25M KCl，0.02％ Triton X-100，10％甘油，

缓冲液C：20mM Tris/HCl，pH 7.9，0.25M KCl，0.02％ Triton X-100，10％甘油，1M咪唑，

缓冲液D：50mM Tris/HCl，pH 8.2，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.02％ Triton X-100，10％甘油，

缓冲液E：20mM 磷酸钾，pH 7.1，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.02％ Triton X-100，10％甘油，

贮存缓冲液：200mM 磷酸钾，pH 7.2，2mM DTT，0.02％ Triton X-100，50％甘油。

细胞裂解：

将200ml缓冲液A加入到大约50g融化并悬浮的大肠杆菌LE392细胞(pAMV-α_IacIq-Arg/pAMV-β_dnaY-His)中。对此悬液加入2片Complete(Roche分子生物化学制品，产品号1697498)。随后在冷却条件下(温度＜10％)借助于超声波(Branson超声波发生器)使细胞裂解。细胞悬液裂解后程度通常达到40-50％。

核酸沉淀：

然后通过Polymin P沉淀分离核酸。滴加10％Polymin P溶液5ml。如果沉淀不完全可再滴加。在4℃温育30分钟后进行离心(4℃，13000rpm，30分钟)。

层析纯化：

在Ni-螯合柱上作亲和层析：

用缓冲液B稀释澄清的离心上清液(1+1)，并使它吸附于已用缓冲液B平衡的镍饱和螯合的琼脂糖ff柱(2.6cm×10cm，Pharmacia)上，然后用大约500ml缓冲液B洗柱，随后再用200ml缓冲液B+10mM咪唑洗，以及用200ml缓冲液B+20mM咪唑洗。用缓冲液B+20mM咪唑后以及缓冲液C的线性梯度液总量500ml洗脱该酶。流速为5ml/分钟，每个组分的体积为20ml。该酶在50mM-200mM咪唑之间被洗脱出。合并活性组分，对缓冲液D进行透析。

在肝素-琼脂糖柱上层析：

随后将透析的合并组分吸附于用缓冲液D平衡的肝素-琼脂糖ff柱(1.6cm×10cm，Pharmacia)上，先用大约200ml缓冲液D然后用大约200ml缓冲液D+300mM KCl洗柱。以缓冲液D+300mM KCl的，以及缓冲液D+1M KCl的线性梯度液总量200ml洗脱该酶。流速2.5m/分钟，组分体积为10ml。AMV-RT在500mM-700mM KCl浓度被洗脱出。

在S-琼脂糖ff柱上层析：

合并RT-活性组分，对缓冲液E进行透析。将此透析液施加在用缓冲液E平衡的S-琼脂糖ff柱(1.6cm×10cm，Pharmacia)上。用大约200ml缓冲液E洗柱之后，以缓冲液E的以及缓冲液E+1M KCl的线性梯度液总量400ml洗脱该酶。流速为2.5ml/分钟，组分体积为10ml。

在羟基磷灰石柱上层析：

合并RT-活性组分，对缓冲液E进行透析。将此透析液施加在用缓冲液E平衡的HA-ultrogel柱(1.6cm×10cm，Biosepra)上。用大约200ml缓冲液E洗柱之后，以缓冲液E的以及缓冲液E+0.5M磷酸钾的线性梯度液总量400ml洗脱该酶。流速为2.5ml/分钟，组分体积为10ml。

合并RT-活性组分，对贮存缓冲液进行透析。对此纯化的蛋白质加入含有SDS和β-巯基乙醇的应用缓冲液，并通过煮沸(100℃5分钟)使此样品变性。然后借助于分析性SDS凝胶(4-20％)(LaemmliUK，1970，自然，227：555-557)对20μl等分量样品进行分析。发现了等摩尔比例的AMV-RTα-和β-亚单位。

所描述的方法产生了具有α-和β-亚单位等摩尔分配的稳定AMV-RT。所获得的酶在RT-PCR中是具有功能性的。

6.1.2在RT-PCR中的功能性试验

在一种功能性试验中测定了所获得的重组AMV逆转录酶。此功能性试验由与聚合酶链式反应(PCR)偶联的逆转录作用(RT)组成。为此，使用了5单位重组AMV逆转录酶，并同样使用Titan TM单一试管PCR系统(产品分类号1888382，Poche分子生物化学试剂)的酶混合物。扩增了1.8kb的人肌营养不良蛋白基因片段。用10ng人肌肉RNA作模板。引物(400nM)是Dys引物2reV(5′GAG TGA ATACAG TTT GCC CAT GGA TTG-3)和Dys引物8for(5′-AAG AAGTAG AGG ACT GTT ATG AAA GAG AAG-3′)。按如下程序在RT-PCR中扩增此靶标：50℃30分钟，94℃2分钟，随后是10次循环(94℃10秒钟，58℃30秒钟，68℃1分10秒钟)和20次循环(94℃10秒钟，58℃30秒钟，68℃1分10秒钟；+10秒/每次循环)。然后在68℃温育7分钟。终止反应之后在1％琼脂糖凝胶上分离此RT-PCR的反应产物(图1)。

图1显示具有1.8kb大小的RT-PCR扩增产物，它们是用纯化的天然AMV-RT得到的(电泳道2)，以及用由重组方法获得的AMV-RT得到的(电泳道3)。电泳道1和4显示DNA分子量标志物VI(产品分类号1062590，Roche分子生物化学产品)。

6.2来自大肠杆菌LE392 pAMV-αβ-4+pCHAP-5构建体的AMV-RT

6.2.1纯化

将过度表达AMV-RT二种链的大肠杆菌LE392 pAMV-αβ-4+pCHAP-5细胞(见上面)用作纯化重组AMV-RT的起始材料。

在4℃纯化AMV-RT。使细胞裂解、分离出核酸之后借助于层析法进行纯化。这种纯化方法产生无污染酶活性的重组AMV-RT，并且在RT-PCR中具有与从天然材料中纯化的AMV-RT相同的功能活性。

缓冲液：

缓冲液A：50mM NaPO₄，pH 7.2，1M NaCl，3mM 2-巯基乙醇，10％甘油，

缓冲液B：50mM NaPO₄，pH 5.0，1M NaCl，3mM 2-巯基乙醇，10％甘油，

缓冲液C：50mM NaPO₄，pH 6.0，1M NaCl，3mM 2-巯基乙醇，10％甘油，0.2M咪唑，

缓冲液D：50mM NaPO₄，pH 7.7，1M NaCl，3mM 2-巯基乙醇，10％甘油，0.5M咪唑，

缓冲液E：50mM NaPO₄，pH 6.0，3mM 2-巯基乙醇，10％甘油，贮存缓冲液：200mM磷酸钾，pH 7.2，2mM DTT，0.2％ Triton X-100，50％甘油。

细胞裂解：

使大约50g大肠杆菌LE392 pAMV-αβ-4+pCHAP-5细胞与400ml缓冲液A混合，融化成混悬液。对此悬液加入2片Complete(Roche分子生物化学制品，产品分类号1697498)。随后借助于超声波(Branson超声波发生器)使细胞裂解，同时使其冷却(温度＜10℃)。细胞悬液的裂解程度通常达到40-50％。

核酸沉淀：

然后通过Polymin沉淀法分离出核酸。一滴一滴地加入10％Polymin P溶液5ml，如果沉淀不完全可再滴加。在4℃温育30分钟后进行离心(4℃，13000rpm，30分钟)。

层析纯化：

在Ni-螯合柱上作亲和层析：

将澄清的离心上清液吸附于已用缓冲液A平衡的镍-饱和螯合的琼脂糖ff柱(2.6cm×10cm，Pharmacia)上，然后用大约500ml缓冲液A洗柱，随后再用500ml缓冲液B洗，以及用500ml缓冲液C洗。用总量500ml的缓冲液D洗脱该酶。流速为5ml/分钟，每个组分的体积为20ml。合并活性组分，对缓冲液E进行透析。

在肝素-琼脂糖柱上层析：

随后将透析的合并组分吸附于用缓冲液E+250mM NaCl平衡的肝素-琼脂糖ff柱(1.6cm×10cm，Pharmacia)上，并用大约200ml缓冲液E+250mM NaCl洗柱。以缓冲液E+250mM NaCl的，以及缓冲液E+1M NaCl的线性梯度液总量200ml洗脱该酶。流速2.5ml/分钟，组分体积为10ml。AMV-RT在500mM-700mM NaCl浓度被洗脱出。

合并RT-活性组分，对贮存缓冲液进行透析，对此纯化的蛋白质加入含有SDS和β-巯基乙醇的应用缓冲液，并通过煮沸(100℃5分钟)使此样品变性。然后借助于分析性SDS凝胶(4-20％)(LaemmliUK，1970，自然，227：555-557)对20μl等分量样品进行分析。发现了等摩尔比例的AMV-RTα-和β-亚单位(图2，电泳道6)。

图2显示对来自纯化AMV-RT样品的SDS凝胶电泳图谱：

电泳道1：分子量标志物

电泳道2：天然AMV

电泳道3：细胞裂解物

电泳道4：Ni-螯合琼脂糖，用缓冲液C洗

电泳道5：Ni-螯合的合并物

电泳道6：精制的重组AMV-RT

6.2.2在RT-PCR中的功能性试验

在一种功能性试验中测定了所获得的重组AMV-逆转录酶。此功能性试验由逆转录作用(RT)其后面紧随聚合酶链式反应(PCR)组成。为此使用了10单位重组AMV逆转录酶。扩增了人肌营养不良蛋白基因的8kb、10kb、12kb和13.5kb片段。

用1μg人肌肉RNA作模板。引物(400nM)是Dys引物2for(5′-CAA TCC ATG GGC AAA CTG TAT TCA CTC-3′)和Dys引物5rev(5′-CGT CCC GTA TCA TAA ACA TTC AGC AGC-3′)8kb，Dys引物8for(5′-AAG AAG TAG AGG ACT GTT ATG AAA GAG AA-3′)和5rev 10kb，Dys引物8for和Dys引物9rev(5′-AGC AGG TAAGCC TGG ATG ACT GAC TAG AAG-3′)12kb，以及Dys引物8for和10rev(5′-AAT CAA TCA ACC AAC CGA AAT CTC ACT CTG-3′)13.5kb。cDNA的合成在42℃进行60分钟。按照对AMV逆转染酶产品信息说明书(产品分类号1495062，Roche分子生物化学试剂)进行cDNA合成。

将Expand Long模板PCR系统(产品分类号1681834，Roche分子生物化学试剂)用于PCR。用如下PCR程序扩增靶标：94℃2分钟，紧随10次循环(94℃10秒，60℃30秒，68℃10分钟)和20次循环(94℃10秒，60℃30秒，68℃10分钟+10秒/循环)。然后在68℃温育5分钟。终止反应之后在1％琼脂糖上分离RT-PCR反应产品(图3)。电泳道3和6显示出DNA分子量标志X(产品分类号1498037，Roche分子生物化学试剂)。

序列表

<110>霍夫曼-拉罗奇有限公司(F.Hoffmann-La Roche AG)

<120>在原核细胞内产生活性异二聚体AMV-RT的方法

<130>5272/oo/

<140>

<141>

<160>22

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>1

gatgactgga attcatgact gttgcgctac atctggct 38

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>2

gatgactgct gcagttatta tgcaaaaaga gggctcgcct 40

<210>3

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>3

gatgactgct gcagttatta atacgcttga aaggtggctt g 41

<210>4

<211>1716

<212>DNA

<213>鸟成骨髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)

<400>4

actgttgcgc tacatctggc tattccgctc aaatggaagc caaaccacac gcctgtgtgg 60

attgaccagt ggccccttcc tgaaggtaaa cttgtagcgc taacgcaatt agtggaaaaa 120

gaattacagt taggacatat agaaccttca cttagttgct ggaacacacc tgtctttgtg 180

atccggaagg cttccgggtc ttatcgctta ttgcatgact tgcgcgctgt taacgctaag 240

cttgttcctt ttggggccgt ccaacagggg gcgccggttc tctccgcgct cccgcgtggc 300

tggcccctga tggtcctaga cctcaaggat tgcttctttt ctattcctct tgcggaacaa 360

gatcgcgaag cttttgcatt tacgctcccc tctgtgaata accaggcccc cgctcgaaga 420

ttccaatgga aggtcttgcc ccaagggatg acctgttctc ccactatctg tcagttgata 480

gtgggtcaaa tacttgagcc cttgcgactc aagcacccat ctctgcgcat gttgcattat 540

atggatgatc ttttgctagc cgcctcaagt catgatgggt tggaagcggc aggggaggag 600

gttatcagta cattggaaag agccgggttc accatttcgc ctgataaggt ccagagggag 660

cccggagtac aatatcttgg gtacaagtta ggcagtacgt atgtagcacc cgtaggcctg 720

gtagcagaac ccaggatagc caccttgtgg gatgttcaga agctggtggg gtcacttcag 780

tggcttcgcc cagcgctagg aatcccgcct cgactgatgg gcccctttta tgagcagtta 840

cgagggtcag atcctaacga ggcgagggaa tggaatctag acatgaaaat ggcctggaga 900

gagatcgtgc agctcagcac cactgctgcc ttggaacgat gggaccctgc cctgcctctg 960

gaaggagcgg tcgctagatg tgaacagggg gcaatagggg tcctgggaca gggactgtcc 1020

acacacccaa ggccatgttt gtggttattc tccacccaac ccaccaaggc gtttactgct 1080

tggttagaag tgctcaccct tttgattact aagctacgtg cttcggcagt gcgaaccttt 1140

ggcaaggagg ttgatatcct cctgttgcct gcatgctttc gggaggacct tccgctcccg 1200

gaggggatcc tgttagccct tagggggttt gcaggaaaaa tcaggagtag tgacacgcca 1260

tctatttttg acattgcgcg tccactgcat gtttctctga aagtgagggt taccgaccac 1320

cctgtaccgg gacccactgt ctttaccgac gcctcctcaa gcacccataa gggggtggta 1380

gtctggaggg agggcccaag gtgggagata aaagaaatag ctgatttggg ggcaagtgta 1440

caacaactgg aagcacgcgc tgtggccatg gcacttctgc tgtggccgac aacgcccact 1500

aatgtagtga ctgactctgc gtttgttgcg aaaatgttac tcaagatggg gcaggaggga 1560

gtcccgtcta cagcggcggc ttttatttta gaggatgcgt taagccaaag gtcagccatg 1620

gccgccgttc tccacgtgcg gagtcattct gaggtgccag ggtttttcac agaaggaaat 1680

gacgtggcag atagccaagc cacctttcaa gcgtat 1716

<210>5

<211>2574

<212>DNA

<213>鸟成骨髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)

<400>5

actgttgcgc tacatctggc tattccgctc aaatggaagc caaaccacac gcctgtgtgg 60

attgaccagt ggccccttcc tgaaggtaaa cttgtagcgc taacgcaatt agtggaaaaa 120

gaattacagt taggacatat agaaccttca cttagttgct ggaacacacc tgtctttgtg 180

atccggaagg cttccgggtc ttatcgctta ttgcatgact tgcgcgctgt taacgctaag 240

cttgttcctt ttggggccgt ccaacagggg gcgccggttc tctccgcgct cccgcgtggc 300

tggcccctga tggtcctaga cctcaaggat tgcttctttt ctattcctct tgcggaacaa 360

gatcgcgaag cttttgcatt tacgctcccc tctgtgaata accaggcccc cgctcgaaga 420

ttccaatgga aggtcttgcc ccaagggatg acctgttctc ccactatctg tcagttgata 480

gtgggtcaaa tacttgagcc cttgcgactc aagcacccat ctctgcgcat gttgcattat 540

atggatgatc ttttgctagc cgcctcaagt catgatgggt tggaagcggc aggggaggag 600

gttatcagta cattggaaag agccgggttc accatttcgc ctgataaggt ccagagggag 660

cccggagtac aatatcttgg gtacaagtta ggcagtacgt atgtagcacc cgtaggcctg 720

gtagcagaac ccaggatagc caccttgtgg gatgttcaga agctggtggg gtcacttcag 780

tggcttcgcc cagcgctagg aatcccgcct cgactgatgg gcccctttta tgagcagtta 840

cgagggtcag atcctaacga ggcgagggaa tggaatctag acatgaaaat ggcctggaga 900

gagatcgtgc agctcagcac cactgctgcc ttggaacgat gggaccctgc cctgcctctg 960

gaaggagcgg tcgctagatg tgaacagggg gcaatagggg tcctgggaca gggactgtcc 1020

acacacccaa ggccatgttt gtggttattc tccacccaac ccaccaaggc gtttactgct 1080

tggttagaag tgctcaccct tttgattact aagctacgtg cttcggcagt gcgaaccttt 1140

ggcaaggagg ttgatatcct cctgttgcct gcatgctttc gggaggacct tccgctcccg 1200

gaggggatcc tgttagccct tagggggttt gcaggaaaaa tcaggagtag tgacacgcca 1260

tctatttttg acattgcgcg tccactgcat gtttctctga aagtgagggt taccgaccac 1320

cctgtaccgg gacccactgt ctttaccgac gcctcctcaa gcacccataa gggggtggta 1380

gtctggaggg agggcccaag gtgggagata aaagaaatag ctgatttggg ggcaagtgta 1440

caacaactgg aagcacgcgc tgtggccatg gcacttctgc tgtggccgac aacgcccact 1500

aatgtagtga ctgactctgc gtttgttgcg aaaatgttac tcaagatggg gcaggaggga 1560

gtcccgtcta cagcggcggc ttttatttta gaggatgcgt taagccaaag gtcagccatg 1620

gccgccgttc tccacgtgcg gagtcattct gaagtgccag ggtttttcac agaaggaaat 1680

gacgtggcag atagccaagc cacctttcaa gcgtatccct tgagagaggc taaagatctc 1740

cataccgctc tccatatcgg accccgcgcg ctatccaaag cgtgtaatat atctatgcag 1800

caggctaggg aggttgttca gacctgcccg cattgtaatt cagcccctgc gttggaggcc 1860

ggggtaaacc ctaggggttt gggaccccta cagatatggc agacagactt tacactagag 1920

cctagaatgg ctccccgttc ctggctcgct gttactgtgg ataccgcctc atctgcgata 1980

gtcgtaactc agcatggccg tgtcacatcg gttgctgcac aacatcattg ggccacggct 2040

atcgccgttt tgggaagacc aaaggccata aaaacagata atgggtcctg cttcacgtct 2100

aaatccacgc gagagtggct cgcgagatgg gggatagcac acaccaccgg gattccgggt 2160

aattcccagg gtcaagctat ggtagagcgg gccaaccggc tcctgaaaga taagatccgt 2220

gtgcttgcgg agggggatgg ctttatgaaa agaatcccca ccagcaaaca gggggaacta 2280

ttagccaagg caatgtatgc ccttaatcac tttgagcgtg gtgaaaacac aaaaacaccg 2340

atacaaaaac actggagacc taccgttctt acagaaggac ccccggttaa aatacgaata 2400

gagacagggg agtgggaaaa aggatggaac gtgctggtct ggggacgagg ttatgcagct 2460

gtgaaaaaca gggacactga taaggttatt tgggtaccct ctcgaaaagt taaaccggac 2520

atcgcccaaa aggatgaggt gactaagaaa gatgaggcga gccctctttt tgca 2574

<210>6

<211>572

<212>PRT

<213>鸟成骨髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)

<400>6

Thr Val Ala Leu His Leu Ala Ile Pro Leu Lys Trp Lys Pro Asn His

1 5 10 15

Thr Pro Val Trp Ile Asp Gln Trp Pro Leu Pro Glu Gly Lys Leu Val

20 25 30

Ala Leu Thr Gln Leu Val Glu Lys Glu Leu Gln Leu Gly His Ile Glu

35 40 45

Pro Ser Leu Ser Cys Trp Asn Thr Pro Val Phe Val Ile Arg Lys Ala

50 55 60

Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Leu His Asp Leu Arg Ala Val Asn Ala Lys

65 70 75 80

Leu Val Pro Phe Gly Ala Val Gln Gln Gly Ala Pro Val Leu Ser Ala

85 90 95

Leu Pro Arg Gly Trp Pro Leu Met Val Leu Asp Leu Lys Asp Cys Phe

100 105 110

Phe Ser Ile Pro Leu Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ala Phe Ala Phe Thr

115 120 125

Leu Pro Ser Val Asn Asn Gln Ala Pro Ala Arg Arg Phe Gln Trp Lys

130 135 140

Val Leu Pro Gln Gly Met Thr Cys Ser Pro Thr Ile Cys Gln Leu Ile

145 150 155 160

Val Gly Gln Ile Leu Glu Pro Leu Arg Leu Lys His Pro Ser Leu Arg

165 170 175

Met Leu His Tyr Met Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser His Asp

180 185 190

Gly Leu Glu Ala Ala Gly Glu Glu Val Ile Ser Thr Leu Glu Arg Ala

195 200 205

Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Lys Val Gln Arg Glu Pro Gly Val Gln

210 215 220

Tyr Leu Gly Tyr Lys Leu Gly Ser Thr Tyr Val Ala Pro Val Gly Leu

225 230 235 240

Val Ala Glu Pro Arg Ile Ala Thr Leu Trp Asp Val Gln Lys Leu Val

245 250 255

Gly Ser Leu Gln Trp Leu Arg Pro Ala Leu Gly Ile Pro Pro Arg Leu

260 265 270

Met Gly Pro Phe Tyr Glu Gln Leu Arg Gly Ser Asp Pro Asn Glu Ala

275 280 285

Arg Glu Trp Asn Leu Asp Met Lys Met Ala Trp Arg Glu Ile Val Gln

290 295 300

Leu Ser Thr Thr Ala Ala Leu Glu Arg Trp Asp Pro Ala Leu Pro Leu

305 310 315 320

Glu Gly Ala Val Ala Arg Cys Glu Gln Gly Ala Ile Gly Val Leu Gly

325 330 335

Gln Gly Leu Ser Thr His Pro Arg Pro Cys Leu Trp Leu Phe Ser Thr

340 345 350

Gln Pro Thr Lys Ala Phe Thr Ala Trp Leu Glu Val Leu Thr Leu Leu

355 360 365

Ile Thr Lys Leu Arg Ala Ser Ala Val Arg Thr Phe Gly Lys Glu Val

370 375 380

Asp Ile Leu Leu Leu Pro Ala Cys Phe Arg Glu Asp Leu Pro Leu Pro

385 390 395 400

Glu Gly Ile Leu Leu Ala Leu Arg Gly Phe Ala Gly Lys Ile Arg Ser

405 410 415

Ser Asp Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ile Ala Arg Pro Leu His Val Ser

420 425 430

Leu Lys Val Arg Val Thr Asp His Pro Val Pro Gly Pro Thr Val Phe

435 440 445

Thr Asp Ala Ser Ser Ser Thr His Lys Gly Val Val Val Trp Arg Glu

450 455 460

Gly Pro Arg Trp Glu Ile Lys Glu Ile Ala Asp Leu Gly Ala Ser Val

465 470 475 480

Gln Gln Leu Glu Ala Arg Ala Val Ala Met Ala Leu Leu Leu Trp Pro

485 490 495

Thr Thr Pro Thr Asn Val Val Thr Asp Ser Ala Phe Val Ala Lys Met

500 505 510

Leu Leu Lys Met Gly Gln Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Phe

515 520 525

Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ser Gln Arg Ser Ala Met Ala Ala Val Leu

530 535 540

His Val Arg Ser His Ser Glu Val Pro Gly Phe Phe Thr Glu Gly Asn

545 550 555 560

Asp Val Ala Asp Ser Gln Ala Thr Phe Gln Ala Tyr

565 570

<210>7

<211>858

<212>PRT

<213>鸟成骨髓细胞白血病病毒(Avian Myeloblastosis Virus)

<400>7

Thr Val Ala Leu His Leu Ala Ile Pro Leu Lys Trp Lys Pro Asn His

1 5 10 15

Thr Pro Val Trp Ile Asp Gln Trp Pro Leu Pro Glu Gly Lys Leu Val

20 25 30

Ala Leu Thr Gln Leu Val Glu Lys Glu Leu Gln Leu Gly His Ile Glu

35 40 45

Pro Ser Leu Ser Cys Trp Asn Thr Pro Val Phe Val Ile Arg Lys Ala

50 55 60

Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Leu His Asp Leu Arg Ala Val Asn Ala Lys

65 70 75 80

Leu Val Pro Phe Gly Ala Val Gln Gln Gly Ala Pro Val Leu Ser Ala

85 90 95

Leu Pro Arg Gly Trp Pro Leu Met Val Leu Asp Leu Lys Asp Cys Phe

100 105 110

Phe Ser Ile Pro Leu Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ala Phe Ala Phe Thr

115 120 125

Leu Pro Ser Val Asn Asn Gln Ala Pro Ala Arg Arg Phe Gln Trp Lys

130 135 140

Val Leu Pro Gln Gly Met Thr Cys Ser Pro Thr Ile Cys Gln Leu Ile

145 150 155 160

Val Gly Gln Ile Leu Glu Pro Leu Arg Leu Lys His Pro Ser Leu Arg

165 170 175

Met Leu His Tyr Met Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser His Asp

180 185 190

Gly Leu Glu Ala Ala Gly Glu Glu Val Ile Ser Thr Leu Glu Arg Ala

195 200 205

Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Lys Val Gln Arg Glu Pro Gly Val Gln

210 215 220

Tyr Leu Gly Tyr Lys Leu Gly Ser Thr Tyr Val Ala Pro Val Gly Leu

225 230 235 240

Val Ala Glu Pro Arg Ile Ala Thr Leu Trp Asp Val Gln Lys Leu Val

245 250 255

Gly Ser Leu Gln Trp Leu Arg Pro Ala Leu Gly Ile Pro Pro Arg Leu

260 265 270

Met Gly Pro Phe Tyr Glu Gln Leu Arg Gly Ser Asp Pro Asn Glu Ala

275 280 285

Arg Glu Trp Asn Leu Asp Met Lys Met Ala Trp Arg Glu Ile Val Gln

290 295 300

Leu Ser Thr Thr Ala Ala Leu Glu Arg Trp Asp Pro Ala Leu Pro Leu

305 310 315 320

Glu Gly Ala Val Ala Arg Cys Glu Gln Gly Ala Ile Gly Val Leu Gly

325 330 335

Gln Gly Leu Ser Thr His Pro Arg Pro Cys Leu Trp Leu Phe Ser Thr

340 345 350

Gln Pro Thr Lys Ala Phe Thr Ala Trp Leu Glu Val Leu Thr Leu Leu

355 360 365

Ile Thr Lys Leu Arg Ala Ser Ala Val Arg Thr Phe Gly Lys Glu Val

370 375 380

Asp Ile Leu Leu Leu Pro Ala Cys Phe Arg Glu Asp Leu Pro Leu Pro

385 390 395 400

Glu Gly Ile Leu Leu Ala Leu Arg Gly Phe Ala Gly Lys Ile Arg Ser

405 410 415

Ser Asp Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ile Ala Arg Pro Leu His Val Ser

420 425 430

Leu Lys Val Arg Val Thr Asp His Pro Val Pro Gly Pro Thr Val Phe

435 440 445

Thr Asp Ala Ser Ser Ser Thr His Lys Gly Val Val Val Trp Arg Glu

450 455 460

Gly Pro Arg Trp Glu Ile Lys Glu Ile Ala Asp Leu Gly Ala Ser Val

465 470 475 480

Gln Gln Leu Glu Ala Arg Ala Val Ala Met Ala Leu Leu Leu Trp Pro

485 490 495

Thr Thr Pro Thr Asn Val Val Thr Asp Ser Ala Phe Val Ala Lys Met

500 505 510

Leu Leu Lys Met Gly Gln Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Phe

515 520 525

Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ser Gln Arg Ser Ala Met Ala Ala Val Leu

530 535 540

His Val Arg Ser His Ser Glu Val Pro Gly Phe Phe Thr Glu Gly Asn

545 550 555 560

Asp Val Ala Asp Ser Gln Ala Thr Phe Gln Ala Tyr Pro Leu Arg Glu

565 570 575

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Pro Arg Met Ala Pro Arg Ser Trp Leu Ala Val Thr Val Asp Thr Ala

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Ala Gln His His Trp Ala Thr Ala Ile Ala Val Leu Gly Arg Pro Lys

675 680 685

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Asp Lys Ile Arg Val Leu Ala Glu Gly Asp Gly Phe Met Lys Arg Ile

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Pro Thr Ser Lys Gln Gly Glu Leu Leu Ala Lys Ala Met Tyr Ala Leu

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Asn His Phe Glu Arg Gly Glu Asn Thr Lys Thr Pro Ile Gln Lys His

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Trp Arg Pro Thr Val Leu Thr Glu Gly Pro Pro Val Lys Ile Arg Ile

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Gly Tyr Ala Ala Val Lys Asn Arg Asp Thr Asp Lys Val Ile Trp Val

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Pro Ser Arg Lys Val Lys Pro Asp Ile Ala Gln Lys Asp Glu Val Thr

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<210>8

<211>62

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>8

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ct 62

<210>9

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>9

gatgactgga attcatgaga ggcagccacc atcaccatca ccatactgtt gcgctacatc 60

tggct 65

<210>10

<211>425

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>10

ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag 60

cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat 120

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gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg 300

atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg 360

ccaggcatca aattaagcag aaggccatgc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa 420

ctctt 425

<210>11

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>11

aaaactgcag agcagtaagc cggtcataaa a 31

<210>12

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>12

aaaactgcag cgtgctggat gaagtgtatt a 31

<210>13

<211>2155

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>13

atcagaattt tttttctttt tcccccttga aggggcgaag cctcatcccc atttctctgg 60

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aaggagagtt atcaatgaat attcgtccat tgcatgatcg cgtgatcgtc aagcgtaaag 180

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cccgcggcga agtgctggct gtcggcaatg gccgtatcct tgaaaatggc gaagtgaagc 300

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gaagcgatgg acaaagtcggtaaagaaggc gttatcaccg ttgaagacgg taccggtctg 1020

caggacgaac tggacgtggt tgaaggtatg cagttcgacc gtggctacct gtctccttac 1080

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gacaagaaaa tctccaacat ccgcgaaatg ctgccggttc tggaagctgt tgccaaagca 1200

ggcaaaccgc tgctgatcat cgctgaagat gtagaaggcg aagcgctggc aactctggtt 1260

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cgtcgtaaag ctatgctgca ggatatcgca accctgactg gcggtaccgt gatctctgaa 1380

gagatcggta tggagctgga aaaagcaacc ctggaagacc tgggtcaggc taaacgtgtt 1440

gtgatcaaca aagacaccac cactatcatc gatggcgtgg gtgaagaagc tgcaatccag 1500

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cgtgctgcgg tagaagaagg cgtggttgct ggtggtggtg ttgcgctgat ccgcgtagcg 1740

tctaaactgg ctgacctgcg tggtcagaac gaagaccaga acgtgggtat caaagttgca 1800

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gttgttgcta acaccgttaa aggcggcgac ggcaactacg gttacaacgc agcaaccgaa 1920

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ctgccgaaaa acgatgcagc tgacttaggc gctgctggcg gtatgggcgg catgggtggc 2100

atgggcggca tgatgtaatt gccctgcacc tcgcagaaat aaacaaaccc ccggg 2155

<210>14

<211>3139

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>14

atgggtaaaa taattggtat cgacctgggt actaccaact cttgtgtagc gattatggat 60

ggcaccactc ctcgcgtgct ggagaacgcc gaaggcgatc gcaccacgcc ttctatcatt 120

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gatatttcta ttatcgaaat cgacgaagtt gacggcgaaa aaaccttcga agttctggca 660

accaacggtg atacccacct ggggggtgaa gacttcgaca gccgtctgat caactatctg 720

gttgaagaat tcaagaaaga tcagggcatt gacctgcgca acgatccgct ggcaatgcag 780

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gttaacctgc catacatcac tgcagacgcg accggtccga aacacatgaa catcaaagtg 900

actcgtgcga aactggaaag cctggttgaa gatctggtaa accgttccat tgagccgctg 960

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ccgcgtaaag acgttaaccc ggacgaagct gtagcaatcg gtgctgctgt tcagggtggt 1140

gttctgactg gtgacgtaaa agacgtactg ctgctggacg ttaccccgct gtctctgggt 1200

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ctgcagggtg aacgtaaacg tgcggctgat aacaaatctc tgggtcagtt caacctagat 1380

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gacggtatcc tgcacgtttc cgcgaaagat aaaaacagcg gtaaagagca gaagatcacc 1500

atcaaggctt cttctggtct gaacgaagat gaaatccaga aaatggtacg cgacgcagaa 1560

gctaacgccg aagctgaccg taagtttgaa gagctggtac agactcgcaa ccagggcgac 1620

catctgctgc acagcacccg taagcaggtt gaagaagcag gcgacaaact gccggctgac 1680

gacaaaactg ctatcgagtc tgcgctgact gcactggaaa ctgctctgaa aggtgaagac 1740

aaagccgcta tcgaagcgaa aatgcaggaa ctggcacagg tttcccagaa actgatggaa 1800

atcgcccagc agcaacatgc ccagcagcag actgccggtg ctgatgcttc tgcaaacaac 1860

gcgaaagatg acgatgttgt cgacgctgaa tttgaagaag tcaaagacaa aaaataatcg 1920

ccctataaac gggtaattat actgacacgg gcgaagggga atttcctctc cgcccgtgca 1980

ttcatctagg ggcaatttaa aaaagatggc taagcaagat tattacgaga ttttaggcgt 2040

ttccaaaaca gcggaagagc gtgaaatcag aaaggcctac aaacgcctgg ccatgaaata 2100

ccacccggac cgtaaccagg gtgacaaaga ggccgaggcg aaatttaaag agatcaagga 2160

agcttatgaa gttctgaccg actcgcaaaa acgtgcggca tacgatcagt atggtcatgc 2220

tgcgtttgag caaggtggca tgggcggcgg cggttttggc ggcggcgcag acttcagcga 2280

tatttttggt gacgttttcg gcgatatttt tggcggcgga cgtggtcgtc aacgtgcggc 2340

gcgcggtgct gatttacgct ataacatgga gctcaccctc gaagaagctg tacgtggcgt 2400

gaccaaagag atccgcattc cgactctgga agagtgtgac gtttgccacg gtagcggtgc 2460

aaaaccaggt acacagccgc agacttgtcc gacctgtcat ggttctggtc aggtgcagat 2520

gcgccaggga ttcttcgctg tacagcagac ctgtccacac tgtcagggcc gcggtacgct 2580

gatcaaagat ccgtgcaaca aatgtcatgg tcatggtcgt gttgagcgca gcaaaacgct 2640

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gcacccgatt ttcgagcgtg aaggcaacaa cctgtattgc gaagtcccga tcaacttcgc 2820

tatggcggcg ctgggtggcg aaatcgaagt accgaccctt gatggtcgcg tcaaactgaa 2880

agtgcctggc gaaacccaga ccggtaagct attccgtatg cgcggtaaag gcgtcaagtc 2940

tgtccgcggt ggcgcacagg gtgatttgct gtgccgcgtt gtcgtcgaaa caccggtagg 3000

cctgaacgaa aggcagaaac agctgctgca agagctgcaa gaaagcttcg gtggcccaac 3060

cggcgagcac aacagcccgc gctcaaagag cttctttgat ggtgtgaaga agttttttga 3120

cgacctgacc cgctaataa 3139

<210>15

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>15

cccccccggg atgggtaaaa taattggtat cgac 34

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>16

cgcgggatcc ttattagcgg gtcaggtcgt caaaaaa 37

<210>17

<211>594

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>17

atgagtagta aagaacagaa aacgcctgag gggcaagccc cggaagaaat tatcatggat 60

cagcacgaag agattgaggc agttgagcca gaagcttctg ctgagcaggt ggatccgcgc 120

gatgaaaaag ttgcgaatct cgaagctcag ctggctgaag cccagacccg tgaacgtgac 180

ggcattttgc gtgtaaaagc cgaaatggaa aacctgcgtc gtcgtactga actggatatt 240

gaaaaagccc acaaattcgc gctggagaaa ttcatcaacg aattgctgcc ggtgattgat 300

agcctggatc gtgcgctgga agtggctgat aaagctaacc cggatatgtc tgcgatggtt 360

gaaggcattg agctgacgct gaagtcgatg ctggatgttg tgcgtaagtt tggcgttgaa 420

gtgatcgccg aaactaacgt cccactggac ccgaatgtgc atcaggccat cgcaatggtg 480

gaatctgatg acgttgcgcc aggtaacgta ctgggcatta tgcagaaggg ttatacgctg 540

aatggtcgta cgattcgtgc ggcgatggtt actgtagcga aagcaaaagc ttaa 594

<210>18

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>18

cgcggaattc atgagtagta aagaacagaa aacg 34

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>19

aaaactgcag ttattaagct tttgctttcg ctacagt 37

<210>20

<211>2574

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>20

atgcgtctgg atcgtcttac taataaattc cagcttgctc ttgccgatgc ccaatcactt 60

gcactcgggc acgacaacca atttatcgaa ccacttcatt taatgagcgc cctgctgaat 120

caggaagggg gttcggttag tcctttatta acatccgctg gcataaatgc tggccagttg 180

cgcacagata tcaatcaggc attaaatcgt ttaccgcagg ttgaaggtac tggtggtgat 240

gtccagccat cacaggatct ggtgcgcgtt cttaatcttt gcgacaagct ggcgcaaaaa 300

cgtggtgata actttatctc gtcagaactg ttcgttctgg cggcacttga gtctcgcggc 360

acgctggccg acatcctgaa agcagcaggg gcgaccaccg ccaacattac tcaagcgatt 420

gaacaaatgc gtggaggtga aagcgtgaac gatcaaggtg ctgaagacca acgtcaggct 480

ttgaaaaaat ataccatcga ccttaccgaa cgagccgaac agggcaaact cgatccggtg 540

attggtcgtg atgaagaaat tcgccgtacc attcaggtgc tgcaacgtcg tactaaaaat 600

aacccggtac tgattggtga acccggcgtc ggtaaaactg ccatcgttga aggtctggcg 660

cagcgtatta tcaacggcga agtgccggaa gggttgaaag gccgccgggt actggcgctg 720

gatatgggcg cgctggtggc tggggcgaaa tatcgcggtg agtttgaaga acgtttaaaa 780

ggcgtgctta acgatcttgc caaacaggaa ggcaacgtca tcctatttat cgacgaatta 840

cataccatgg tcggcgcggg taaagccgat ggcgcaatgg acgccggaaa catgctgaaa 900

ccggcgctgg cgcgtggtga attgcactgc gtaggtgcca cgacgcttga cgaatatcgc 960

cagtacattg aaaaagatgc tgcgctggaa cgtcgtttcc agaaagtgtt tgttgccgag 1020

ccttctgttg aagataccat tgcgattctg cgtggcctga aagaacgtta cgaattgcac 1080

caccatgtgc aaattactga cccggcaatt gttgcagcgg cgacgttgtc tcatcgctac 1140

attgctgacc gtcagctgcc ggataaagcc atcgacctga tcgatgaagc agcatccagc 1200

attcgtatgc agattgactc aaaaccagaa gaactcgacc gactcgatcg tcgtatcatc 1260

cagctcaaac tggaacaaca ggcgttaatg aaagagtctg atgaagccag taaaaaacgt 1320

ctggatatgc tcaacgaaga actgagcgac aaagaacgtc agtactccga gttagaagaa 1380

gagtggaaag cagagaaggc atcgctttct ggtacgcaga ccattaaagc ggaactggaa 1440

caggcgaaaa tcgctattga acaggctcgc cgtgtggggg acctggcgcg gatgtctgaa 1500

ctgcaatacg gcaaaatccc ggaactggaa aagcaactgg aagccgcaac gcagctcgaa 1560

ggcaaaacta tgcgtctgtt gcgtaataaa gtgaccgacg ccgaaattgc tgaagtgctg 1620

gcgcgttgga cggggattcc ggtttctcgc atgatggaaa gcgagcgcga aaaactgctg 1680

cgtatggagc aagaactgca ccatcgcgta attggtcaga acgaagcggt tgatgcggta 1740

tctaacgcta ttcgtcgtag ccgtgcgggg ctggcggatc caaatcgccc gattggttca 1800

ttcctgttcc tcggcccaac tggtgtgggg aaaacagagc tttgtaaggc gctggcgaac 1860

tttatgtttg atagcgacga ggcgatggtc cgtatcgata tgtccgagtt tatggagaaa 1920

cactcggtgt ctcgtttggt tggtgcgcct ccgggatatg tcggttatga agaaggtggc 1980

tacctgaccg aagcggtgcg tcgtcgtccg tattccgtca tcctgctgga tgaagtggaa 2040

aaagcgcatc cggatgtctt caacattctg ttgcaggtac tggatgatgg gcgtctgact 2100

gacgggcaag ggagaacggt cgacttccgt aatacggtcg tcattatgac ctctaacctc 2160

ggttccgatc tgattcagga acgcttcggt gaactggatt atgcgcacat gaaagagctg 2220

gtgctcggtg tggtaagcca taacttccgt ccggaattca ttaaccgtat cgatgaagtg 2280

gtggtcttcc atccgctggg tgaacagcac attgcctcga ttgcgcagat tcagttgaaa 2340

cgtctgtaca aacgtctgga agaacgtggt tatgaaatcc acatttctga cgaggcgctg 2400

aaactgctga gcgagaacgg ttacgatccg gtctatggtg cacgtcctct gaaacgtgca 2460

attcagcagc agatcgaaaa cccgctggca cagcaaatac tgtctggtga attggttccg 2520

ggtaaagtga ttcgcctgga agttaatgaa gaccggattg tcgccgtcca gtaa 2574

<210>21

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>21

aaaactgcag atgcgtctgg atcgtcttac taat 34

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>22

cccgggaagc ttattactgg acggcgacaa tccggtc 37

Claims

1.一种在原核宿主细胞内产生可溶性形式的活性异二聚体AMV-RT的方法，其中

(i)在一个或多个表达质粒内单独地或组合地克隆编码AMV-RTα-亚单位的DNA序列和编码AMV-RTβ-亚单位的DNA序列，

(ii)将此表达质粒转化进入原核细胞，

(iii)诱导表达可溶性异二聚体AMV-RT，以及

(iv)从该细胞中分离出重组异二聚体AMV-RT

其中是在10℃-25℃的培养温度和降低的诱导剂浓度下进行表达。

2.权利要求1的方法，其中是在被克隆进入同一细胞的不同表达质粒上表达编码α-和β-链的DNA序列。

3.权利要求1的方法，其中是在被克隆进入同一细胞的同一表达质粒上表达编码α-和β-链的DNA序列。

4.权利要求1-3中任何之一的方法，其中使α-链以及β-链与一种肽序列融合。

5.权利要求4的方法，其中是使α-或β-链与由2-10个精氨酸残基组成的肽序列融合，以及使β-或α-链与由2-10个组氨酸残基组成的肽序列融合。

6.权利要求4的方法，其中是在被克隆进入同一细胞的同一表达质粒上表达编码α-和β-链的DNA序列，此DNA序列连接于编码能够可逆结合的肽序列的DNA序列。

7.权利要求6的方法，其中使α-和β-链与能够可逆结合的相同肽序列融合。

8.权利要求7的方法，其中的α-和β链各与一个由2-10个组氨酸残基组成的肽序列融合。

9.权利要求1的方法，其中是通过辅助基因的共表达使表达增加。

10.权利要求9的方法，其中是将编码色氨酸tRNA的trpT基因用作辅助基因。

11.权利要求9的方法，其中是通过伴随基因的共表达使表达增加。

12.权利要求11的方法，其中是使编码GroEL和GroES、Dnak和DnaJ，GrpE和/或ClpB的基因共表达。

13.权利要求12的方法，其中编码GroEL和GroES的基因被克隆在也携带有编码α-和β-链基因的表达质粒上，而编码DnaK、DanJ、GrpE和ClpB的基因被克隆在辅助质粒上。

14.权利要求4的方法，其中是用适当的亲和层析材料分离或纯化该重组异二聚体AMV-RT。

15.权利要求14的方法，其中用于纯化的亲和层析材料可逆地结合连接于α-和/或β-链的不同的肽序列。

16.权利要求15的方法，其中用于纯化的亲和层析材料是金属离子螯合材料或阳离子交换剂。

17.权利要求1的方法，其中是在一种原核宿主细胞中表达DNA序列SEQ ID NO：5或者DNA序列SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5。

18.权利要求1的方法，其中大肠杆菌被用作该宿主细胞。

19.权利要求1的方法，其中该活性异二聚体AMV-RT是由亚单位SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7组成。

20.借助于权利要求1-19中任一项的方法可获得的AMV-RT用于扩增RNA序列的用途。