JP2013126402A - 逆転写酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）といった分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を、煩雑な操作なく製造する方法を提供すること。
【解決手段】 特定のサブユニットおよびその断片からなる、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する際、当該特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して逆転写酵素を製造することにより、前記課題を解決する。
【選択図】 図５

Description

本発明は逆転写酵素を製造する方法に関するものである。特に本発明は、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を、煩雑な操作なく製造する方法に関する。

ＲＮＡを遺伝子とするレトロウイルスには、ＲＮＡをＤＮＡに転写する逆転写酵素が存在する。前記逆転写酵素の一つである、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス（Ａｖｉａｎ Ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（以下、本明細書では「ＡＭＶ−ＲＴ」と略記する）は、高い酵素活性および正確な反応性を有していることから、遺伝子工学試薬、遺伝子診断試薬として広く利用されている。

ＡＭＶ−ＲＴは、β鎖（分子量９５ｋＤａ）とα鎖（分子量６３ｋＤａ）の２種類のサブユニットから構成され、α鎖とβ鎖とのヘテロ複合体（以下、本明細書では「αβ複合体」と略記する）、またはβ鎖とβ鎖とのホモ複合体を形成することが知られている。ＡＭＶ−ＲＴ αβ複合体は、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、およびリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）活性を発現する（非特許文献１および２）。前記αβ複合体の形成は、β鎖とα鎖との非共有結合型の相互作用からなるものであり、この異なるポリペプチド鎖（サブユニット）から構成される複合体を形成し、前述した複数の酵素活性を発現する。

ＡＭＶ−ＲＴ β鎖のアミノ酸配列の一例を配列番号１に示す。ＡＭＶ−ＲＴ α鎖は、配列番号１に記載のＡＭＶ−ＲＴ β鎖のアミノ酸配列中５７２番目のチロシンと５７３番目のプロリンとの間のペプチド結合が分解されることで断片化したサブユニットであり、配列番号１の１番目のスレオニンから５７２番目のチロシンまでのアミノ酸からなるポリペプチドである（図１）。

遺伝子組換え技術を用いたＡＭＶ−ＲＴ αβ複合体の製造方法としては、ＡＭＶ−ＲＴ α鎖およびＡＭＶ−ＲＴ β鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ作製し、当該遺伝子を同一、もしくは別々のベクターに挿入した後、宿主を形質転換して得られる遺伝子組換え体を用いて、ＡＭＶ−ＲＴ αβ複合体を製造する方法がある。しかしながら、ＡＭＶ−ＲＴ両鎖（両サブユニット）をコードするポリヌクレオチドを制御するプロモータの誘導等において厳密な制御を必要とし、操作が煩雑であった（特許文献１）。

特開２００２−３１５５８４号公報

Ｔｅｍｉｎ ＨＭ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ Ｓ，Ｎａｔｕｒｅ，２２６，１２１１（１９７０） Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ ＡＲ，Ｎａｔｕｒｅ，２２６，１２０９（１９７０）

本発明は、トリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）といった分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を、煩雑な操作なく製造する方法を提供することにある。

本願発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、本願発明を完成させるに至った。

すなわち本発明の第一の態様は、
分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する方法であって、
逆転写酵素を構成する複数のサブユニットが、特定のサブユニットおよびその断片からなり、
当該特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することで、逆転写酵素を製造する方法である。

また本発明の第二の態様は、逆転写酵素がトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素である、前記第一の態様に記載の方法である。

また本発明の第三の態様は、特定のサブユニットが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、前記第二の態様に記載の方法である。

また本発明の第四の態様は、特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドが配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、前記第二の態様に記載の方法である。

さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の方法で製造した逆転写酵素と、ＲＮＡポリメラーゼとを含む、ＲＮＡ増幅試薬である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明で製造する逆転写酵素は、分子量の異なる複数のサブユニットから構成され、かつ当該複数のサブユニットが、特定のサブユニットおよびその断片からなるのであれば特に限定はなく、前述したＡＭＶ−ＲＴ（β鎖（分子量９５ｋＤａ）およびα鎖（分子量６３ｋＤａ））の他にも、ＨＩＶ（Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｖｉｒｕｓ）逆転写酵素（分子量６６ｋＤａおよび分子量５１ｋＤａのサブユニット）や、トリ肉腫−白血病ウイルス（ＡＳＬＶ）逆転写酵素として知られる一群の逆転写酵素が例示できる。すなわち、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）ヘルパーウイルスＭＣＡＶ逆転写酵素、トリ骨髄細胞腫症ウイルスＭＣ２９ヘルパーウイルスＭＣＡＶ逆転写酵素、トリ網内症ウイルス（ＲＥＶ−Ｔ）ヘルパーウイルスＲＥＶ−Ａ逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスＵＲ２ヘルパーウイルスＵＲ２ＡＶ逆転写酵素、トリ肉腫ウイルスＹ７３ヘルパーウイルスＹＡＶ逆転写酵素、ラウス関連ウイルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、および骨髄芽球症関連ウイルス（ＭＡＶ）逆転写酵素を含むが、それらに限定されない。各サブユニット間の分子量差は特に限定はなく、１００から１０万、好ましくは１０００から数万である。なお本発明においてサブユニットとは、機能を有する１つの単位であり、本発明では逆転写酵素を構成するポリペプチドに相当する。また本発明において特定のサブユニットとは、逆転写酵素を構成する複数のサブユニットのうち、最も分子量の大きいサブユニットのことをいう。例えば逆転写酵素がＡＭＶ−ＲＴの場合、特定のサブユニットはＡＭＶ−ＲＴ β鎖となる。

本発明の方法により、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する場合は、前記複数のサブユニットのうち、特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して製造すればよい。

逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを作製するにあたっては、宿主にウイルス（例えばＡＭＶ）を感染させ、当該宿主により大量に増殖させたウイルスから直接抽出し精製してもよく、当該抽出物を鋳型としたＰＣＲにより前記特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを増幅させてもよく、公知の逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドの配列情報を基に人工的に合成してもよい。逆転写酵素のアミノ酸配列およびそれをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）等の公知のデータベースを利用することで入手可能である。

本発明の製造方法で使用する宿主は、逆転写酵素を構成する特定のサブユニットの発現が可能で、かつ前記特定のサブユニットの一部を断片化可能な宿主であればよく、一例として、大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する菌、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌といった原核細胞、酵母のサッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）に属する菌、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属に属する菌、ポンベ（Ｐｏｍｂｅ）属に属する菌、糸状菌のアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属に属する菌といった真核細胞、昆虫細胞、動物細胞があげられる。その中でも、培養が容易で、遺伝子組み換えタンパク質製造用宿主としての実績も多い、大腸菌が、本発明の製造方法で使用する宿主として好ましい。なおここで、特定のサブユニットの一部を断片化可能とは、特定のサブユニットのポリペプチドを特定の箇所で切断可能であることを意味し、当該ポリペプチド中の特定のペプチド間を認識して切断可能なプロテアーゼ活性を有していると好ましい。プロテアーゼ等により特定のサブユニットのポリペプチドを切断する箇所としては、断片化したポリペプチドに所定の酵素活性が残存していればよい。逆転写酵素が配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるＡＭＶ−ＲＴの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列中、５００番目から６００番目までの任意の箇所で切断すればよい。なお宿主自身では特定のサブユニットの断片化が不可能な場合でも、逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを当該宿主に導入する際に、プロテアーゼ等特定のサブユニットを断片化可能な酵素をコードするポリヌクレオチドも当該宿主に導入することで、前記断片化可能な酵素を発現させ、それにより特定のサブユニットの一部を断片化させればよい。

逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入するには、当該ポリヌクレオチドを宿主に直接導入してもよいが、当該ポリヌクレオチドをベクターに挿入し、それを用いて宿主に導入した方が、当該ポリヌクレオチドが安定して複製される点で好ましい。当該ポリヌクレオチドを挿入するベクターは、ＡＭＶ−ＲＴを発現させる宿主を基づき適宜選択すればよく、宿主が大腸菌の場合、ｐＵＣ、ｐＥＴ、ｐＴｒｃ９９ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＢＢＲ、ｐＢＲ３２２が例示できる。逆転写酵素を構成する特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターを用いて宿主を形質転換させるには、塩化カルシウム法、ヒートショック法、エレクトロポレーション法等、遺伝子組換え技術において汎用されている方法に準じて実施すればよい。

前述の形質転換により得られた形質転換体は、宿主の培養に適した培地を用いて培養することによって増殖させることができる。形質転換体が大腸菌の場合は、好ましい培地として、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が例示できる。また、培地には炭素源、窒素源および無機塩類の他に、形質転換体が効率良く増殖するように適宜栄養源を加えてもよい。形質転換体の培養温度、培地のｐＨは、形質転換に用いた宿主に基づき適宜設定すればよく、形質転換体が大腸菌の場合、培養温度は１０℃から５０℃の範囲が好ましく、より好ましくは２５℃から３７℃である。また培地のｐＨはｐＨ６．５からｐＨ７．５が好ましく、より好ましくはｐＨ６．８から７．２の範囲である。

形質転換体培養液からの逆転写酵素の分離・抽出は、宿主の発現形態により適宜選択すればよい。逆転写酵素が宿主細胞外に分泌発現する場合には、培養液を遠心分離等することで細胞を除去後、細胞を除去した培養上清より逆転写酵素を抽出すればよい。一方、逆転写酵素が宿主細胞内に発現する場合には、遠心分離等によって細胞を回収後、回収細胞を中性付近で緩衝能を有する緩衝液に懸濁し、超音波等で細胞を破砕する、または界面活性剤を添加することにより、逆転写酵素を抽出すればよい。

抽出した逆転写酵素をさらに高純度化するには、カラムクロマトグラフィー等、当業者が通常用いる精製手段を用いて行なえばよい。カラムクロマトグラフィーの例として、アフィニティークロマトグラフィー、群特異性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズイクスクルージョンクロマトグラフィーがあげられる。なお当該クロマトグラフィーで使用する、カラムのサイズ、使用する緩衝液、流速、温度等の条件は、当該クロマトグラフィーにより溶出したフラクションの分析結果に基づき適宜決定すればよい。

本発明は、ＡＭＶ−ＲＴといった、特定のサブユニットおよびその断片からなる、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する際、当該特定のサブユニット（ＡＭＶ−ＲＴの場合はＡＭＶ−ＲＴ β鎖）をコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して製造することを特徴としている。本発明により、従来煩雑な操作を必要とした前記逆転写酵素の製造を、簡便に実施できる。

また本発明の方法で製造した逆転写酵素は、複数のサブユニットから構成された状態（ＡＭＶ−ＲＴの場合はＡＭＶ−ＲＴ αβ複合体）で発現するため、逆転写酵素が本来有する、複数の酵素活性は保持されている。よって、本発明の方法で製造した逆転写酵素は、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）等のＲＮＡ増幅法を利用したＲＮＡ増幅試薬の構成試薬として好ましいといえる。

ＡＭＶ−ＲＴを構成する各サブユニットの概略図である。 発現ベクターｐＡＭＶβの構造を示す図である。 バイオゲルを充填したカラムより溶出した各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す図である。 ＣＭ−セファロースを充填したカラムより溶出した各フラクションのＳＤＳ―ＰＡＧＥ結果を示す図である。 ＣＭ−セファロースを充填したカラムより溶出した各フラクションのＴＲＣ反応による評価結果を示す図である。

以下、ＡＭＶ−ＲＴ αβ複合体の製造を実施例として、本発明を更に詳細に説明するが、これら実施例は本発明の一部を示すものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１ 逆転写酵素遺伝子の作製および配列解析
（１）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）β鎖をコードするポリヌクレオチド（配列番号２）を作製するためのオリゴヌクレオチドをＤＮＡＷｏｒｋｓ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，３０，ｅ４３（２００２））により設計し、合成した。合成したオリゴヌクレオチドの配列を配列番号３から１２２に示す。
（２）以下の２段階からなるＰＣＲにより、配列番号２に記載のヌクレオチド配列からなるＡＭＶ−ＲＴ β鎖をコードするポリヌクレオチドを作製した。
（２−１）表１に記載の組成からなるＰＣＲ溶液を調製し、１段階目のＰＣＲを実施した。なお表１のうち、ＤＮＡミックスは、（１）で合成した、配列番号３から１２２に記載のヌクレオチド配列からなる１２０種類のオリゴヌクレオチドを、それぞれ５０ｐｍｏｌ／μＬとなるようＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））に溶解し、その溶解液を１μＬずつ採取して混合したものである。またＰＣＲは、９４℃で５分間の熱処理後、９４℃で３０秒間の第１ステップ−６２℃で３０秒間の第２ステップ−７２℃で１分間の第３ステップからなる反応を２５サイクル行ない、最後に７２℃で４分間反応を行なった。

（２−２）表２に記載の組成からなるＰＣＲ溶液を調製し、２段階目のＰＣＲを実施した。なおＰＣＲプライマーとして、配列番号１２３（５’―ＡＴＧＣ［ＧＡＡＴＴＣ］ＡＴＧＡＣＴＧＴＴＧＣＧＣＴＡＣＡＴＣＴＧＧＣ―３’、角かっこ内は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチド、および配列番号１２４（５’―ＧＡＣＴ［ＧＧＴＡＣＣ］ＴＴＡＣＧＣＡＡＡＴＡＡＣＧＧＧＣＴＧＧＣＣ―３’、角かっこ内は制限酵素ＫｐｎＩの認識部位）に記載のヌクレオチド配列からなるオリゴヌクレオチドを用いた。またＰＣＲ条件は、前述の１段階目のＰＣＲ（２−１）と同じである。

（３）２段階ＰＣＲ終了後、ＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＫｐｎＩで消化し、０．９％のアガロース電気泳動でＰＣＲ産物を確認した。結果、設計サイズである約２．５ｋｂａｓｅに相当する位置にＰＣＲ産物のバンドを確認することができた。
（４）約２．５ｋｂａｓｅに相当する位置のバンドをＱｉａｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出し、抽出ＤＮＡをＴＡＫＡＲＡ ＢＫＬ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてリン酸化処理を行なった。
（５）リン酸化されたＤＮＡを、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．１（タカラバイオ社製）を用いて、あらかじめ制限酵素ＥｃｏＲＩおよび制限酵素ＫｐｎＩで消化したｐＴｒｃ９９ａベクターにライゲーションした。
（６）ライゲーション後、ライゲーション液と大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ（タカラバイオ社製）とを氷上で混合後、ヒートショック法により大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を形質転換した。形質転換後の溶液を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地プレートに塗布し培養した。
（７）得られたコロニーを、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃で１８時間培養した。
（８）培養液を遠心分離操作することにより得られた培養菌体から、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてプラスミドを抽出した。
（９）ｐＴｒｃ９９ａベクターに挿入したＤＮＡの塩基配列を、チェーンターミネーター法に基づくＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いるサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ｐｒｉｓｍ ３７００ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）により解析した。なおシークエンス用プライマーとして、（１）で合成したオリゴヌクレオチドを適宜使用した。配列解析の結果、ｐＴｒｃ９９ａベクターに挿入したＤＮＡの塩基配列は設計通りの配列であることを確認した。

本実施例で作製した、ＡＭＶ−ＲＴ β鎖を発現可能なベクターをｐＡＭＶβと命名した。ｐＡＭＶβの構造概略図を図２に示す。

実施例２ 逆転写酵素遺伝子の培養
（１）実施例１で作製した発現ベクターｐＡＭＶβを用いて、ヒートショック法により、大腸菌 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０株を形質転換した。形質転換後の溶液を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢ寒天培地プレートに塗布し培養した。
（２）得られたコロニーを、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む２０ｍＬの２×ＹＴ培地（１．６％ Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％ Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ、０．５％ ＮａＣｌ）に接種し、３７℃で１８時間振とう培養した（１２０ｒｐｍ）。
（３）１０ｍＬの培養液を２０００ｍＬの２×ＹＴ培地に接種し、引き続き３７℃で振とう培養した（１２０ｒｐｍ）。
（４）培養液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ_６００）を測定し、ＯＤ_６００の値が約０．５になったところで、培養温度を２５℃に変更した。変更約１時間後、ＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）（タカラバイオ社製）を培養液に添加（終濃度５ｍＭ）し、２５℃で４８時間振とう培養した（１２０ｒｐｍ）。

実施例３ 逆転写酵素の精製
（１）実施例２で作製した培養液を遠心分離（１００００×ｇ、２０分、４℃）し、培養菌体を回収した。
（２）回収菌体を冷却したＰｈｏｓｐｈａｔｅ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ（ＰＢＳ）で洗浄後、湿菌体９ｇあたり４５ｍＬの緩衝液Ａ（１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、１ｍＭ ＤＴＴ、０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）を含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．４））を添加し、ソニケーター（Ｉｎｓｏｎａｔｏｒ ２０１Ｍ、久保田製作所社製）を使用して菌体を破砕した。
（３）菌体破砕後、破砕液を遠心分離（１００００×ｇ、２０分、４℃）し、破砕物を除去した。
（４）破砕物除去後の遠心上清に０．８３％（ｗ／ｖ）となるようにストレプトマイシン（和光純薬社製）を添加し、４℃で３０分間撹拌後、遠心分離（１００００×ｇ、３０分、４℃）した。
（５）沈殿物に４５ｍＬの緩衝液Ａを添加し、沈殿物を再溶解させることで、粗精製溶液を調製した。
（６）粗精製溶液を、緩衝液Ａで平衡化したホスホセルロースゲル（Ｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｐ１１、Ｗｈａｔｍａｎ社製）を充填したカラム（２６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×９ｃｍ）に添加した。
（７）カラムに十分量の緩衝液Ａを通液し、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、１Ｍ ＫＣｌを含む緩衝液Ａ（緩衝液Ｂ）を用いたリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ−ＲＴを溶出させた。具体的には、緩衝液Ａによる洗浄後、１０カラムボリューム（ＣＶ）で緩衝液Ｂが１００％となるよう、流速５ｍＬ／分で通液した。
（８）溶出した溶液は１０ｍＬ毎に試験管に回収し、後述の活性測定法（実施例６）を用いてＡＭＶ−ＲＴ活性フラクションを決定した。
（９）決定したＡＭＶ−ＲＴ活性フラクションを緩衝液Ａで透析後、緩衝液Ａで平衡化したバイオゲル（バイオゲルＨＴＰ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を充填したカラム（１０ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２ｃｍ）に添加した。
（１０）カラムに十分量の緩衝液Ａを通液し、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、緩衝液Ｂを用いたリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ−ＲＴを溶出させた。具体的には、緩衝液Ａによる洗浄後、１５ＣＶで緩衝液Ｂが１００％となるよう、流速０．５ｍＬ／分で通液した。
（１１）溶出した溶液は２ｍＬ毎に試験管に回収し、後述の活性測定法（実施例６）を用いてＡＭＶ−ＲＴ活性フラクションを決定した。
（１２）決定したＡＭＶ−ＲＴ活性フラクションを緩衝液Ａで透析後、緩衝液Ａで平衡化したＣＭ−セファロースゲル（ＧＥヘルスケア社製）を充填したカラム（１．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×２．５ｃｍ）に添加した。
（１３）カラムに十分量の緩衝液Ａを通液し、ゲルに結合した非特異結合成分を洗浄後、緩衝液Ｂを用いたリニアグラジエント溶出法により、ＡＭＶ−ＲＴを溶出させた。具体的には、緩衝液Ａによる洗浄後、１０ＣＶで緩衝液Ｂが１００％となるよう、流速０．５ｍＬ／分で通液した。
（１４）溶出した溶液は１ｍＬ毎に試験管に回収し、後述の活性測定法（実施例６）を用いてＡＭＶ−ＲＴ活性フラクションを決定した。

実施例４ 逆転写酵素の分析（その１）
実施例３の各精製工程における溶出フラクション、および最終精製物の純度検定をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）により行なった。
（１）メルカプトエタノールを含むサンプル緩衝液を溶出フラクションに添加し、９８℃で５分間熱処理後、５％から２０％濃度勾配のポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した。なお、ＡＭＶ−ＲＴの標準品としてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製のＡＭＶ−ＲＴを使用した。
（２）電気泳動後、ＣＢＢ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ） Ｇ−２５０による染色を行ない、常法によりゲルを脱色した。

バイオゲルカラムより溶出した各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図３に、ＣＭ−セファロースカラムから溶出した各フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を図４にそれぞれ示す。バイオゲルカラムより溶出したフラクションの一部（フラクション１５から２２）およびＣＭ−セファロースカラムから溶出したフラクションの一部（フラクション８から１０）において、ＡＭＶ−ＲＴ β鎖（分子量９５ｋＤａ）に相当するバンドの他に、ＡＭＶ−ＲＴ α鎖（分子量６３ｋＤａ）に相当するバンドも確認できた。

実施例５ 逆転写酵素の分析（その２）
ＡＭＶ−ＲＴ α鎖に相当するバンドのタンパク質のアミノ酸配列を解析するために、電気泳動後のポリアクリルアミドゲル（実施例４）から当該バンドを切り出し、エドマン法によりＮ末端側のアミノ酸配列を決定した。結果、当該バンドのタンパク質のＮ末端側アミノ酸配列はＴｈｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓであり、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１番目から５番目までのアミノ酸配列と同一であることを確認した。すなわち、当該バンドのタンパク質は確かにＡＭＶ−ＲＴ α鎖であることが判明した。

実施例６ 活性測定
ＡＭＶ−ＲＴが有する酵素活性を、下記に示すＴＲＣ法（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を利用した方法（特開２００３−３３４０９５号公報）により評価した。
（１）ＴＲＣＲｔｅｓｔ ＮｏｒｏＷ（東ソー社製）に添付の陽性標準液を、ＴＲＣＲｔｅｓｔ ＮｏｒｏＷ（東ソー社製）に添付の陰性標準液で５倍希釈することにより、ＲＮＡ試料を調製した。
（２）ＴＲＣＲｔｅｓｔ ＮｏｒｏＷ（東ソー社製）に添付の基質試薬１０μＬおよびＴＲＣＲｔｅｓｔ ＮｏｒｏＷ（東ソー社製）に添付のプライマー試薬１０μＬを０．５ｍＬ容量ＰＣＲ用チューブ（Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｄｏｍｅ Ｃａｐ ＰＣＲ Ｔｕｂｅ、ＳＳＩ社）に分注し、これに（１）で調製したＲＮＡ試料５μＬを添加した。
（３）（２）の混合液を４２℃で５分間保温後、あらかじめ４２℃で２分間保温した、以下の組成からなる酵素液５μＬを添加した。

酵素液の組成：
０．１２ｍｇ／ｍＬ 牛血清アルブミン
２．０％（ｗ／ｖ） ソルビトール
２８．４Ｕ／μＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ
１μＬ 溶出フラクション（実施例３）または６．４Ｕ ＡＭＶ−ＲＴ対照品（Ｌ
ｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
（４）引き続きＰＣＲチューブを直接測定可能な温調機能付き蛍光分光光度計を用い、４２℃で反応させると同時に反応溶液の蛍光強度（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に２０分間測定した。

ＣＭ−セファロースカラムから溶出した各フラクションを用いて、前記ＴＲＣ反応を行なった結果を図５に示す。フラクション７から９を用いたときに核酸増幅反応が確認された。さらにフラクション８および９を用いたときは、ＡＭＶ−ＲＴ対照品を用いたときとと同等の核酸増幅反応が確認された。ＴＲＣ法によるＲＮＡ増幅は、ＡＭＶ−ＲＴ αβ鎖複合体が存在することにより進行する（特開２００３−３３４０９５号公報）ことから、このことからも、フラクション８および９にはＡＭＶ−ＲＴ αβ複合体が含まれていることがわかる。

以上をまとめると、実施例１で作製したＡＭＶ−ＲＴ β鎖発現ベクター（ｐＡＭＶβ）を用いて大腸菌を形質転換して得られる組換え体により、ＡＭＶ−ＲＴ β鎖を発現させると、その一部が大腸菌により分解されＡＭＶ−ＲＴ α鎖となり、さらに生成したＡＭＶ−ＲＴ α鎖がＡＭＶ−ＲＴ β鎖と複合体を形成することが明らかとなった。

以上説明したように、特定のサブユニットおよびその断片からなる、分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する際、当該特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養して製造する、本発明の製造方法は、従来煩雑な操作を必要とした前記逆転写酵素の製造を、簡便かつ効率よく製造することできる。そのため、逆転写酵素を用いる遺伝子工学試薬や遺伝子診断試薬などの製造に大きく貢献することができる。

Claims (5)

1. 分子量の異なる複数のサブユニットから構成される逆転写酵素を製造する方法であって、
   逆転写酵素を構成する複数のサブユニットが、特定のサブユニットおよびその断片であり、
   当該特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドを導入して宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養することで、逆転写酵素を製造する方法。
2. 逆転写酵素がトリ骨髄芽細胞腫ウイルス逆転写酵素である、請求項１に記載の方法。
3. 特定のサブユニットが配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項２に記載の方法。
4. 特定のサブユニットをコードするポリヌクレオチドが配列番号２に記載のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドである、請求項２に記載の方法。
5. 請求項１から４のいずれかに記載の方法で製造した逆転写酵素と、ＲＮＡポリメラーゼとを含む、ＲＮＡ増幅試薬。

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