JP2002315584A

JP2002315584A - 原核細胞における活性ヘテロダイマーａｍｖ−ｒｔの産生方法

Info

Publication number: JP2002315584A
Application number: JP2001289857A
Authority: JP
Inventors: Harald Sobek; ソーベクハラルト; Rainer Mueller; ミュラーライナー; Manfred Schmidt; シュミッツマンフレート; Bruno Frei; フライブルーノ; Bernhard Suppmann; スプマンベルンハルト; Rainer Schmuck; シュムックライナー; Johann-Peter Thalhofer; タールホファーヨハン−ペーター; Peter Pallua; パルアペーター; Markus Pajatsch; パヤッチュマルクス
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2000-09-22
Filing date: 2001-09-21
Publication date: 2002-10-29
Also published as: ATE471376T1; CA2357540A1; US20020115147A1; EP1191102A2; CA2357540C; US6902920B2; EP1191102A3; CN1346889A; CN1250728C; EP1191102B1; DE60142384D1; ES2346511T3; DE10046960A1

Abstract

(57)【要約】【課題】充分な量で組換え活性ヘテロダイマーＡＭＶ−
ＲＴを提供すること。【解決手段】（ｉ）ＡＭＶ−ＲＴのα鎖および／または
β鎖をコードする１つまたはいくつかのＤＮＡ配列が発
現プラスミドにクローン化される、（ｉｉ）発現プラス
ミドが原核細胞に形質転換される、（ｉｉｉ）ヘテロダ
イマーＡＭＶ−ＲＴの可溶性発現が誘導される、および
（ｉｖ）組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴが細胞から
単離される、原核生物宿主細胞において活性ヘテロダイ
マーＡＭＶ−ＲＴを産生する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、所定の増殖および
誘導の条件下で、原核細胞においてＡＭＶ−ＲＴのαサ
ブユニットおよび／またはβサブユニットをコードする
１つまたはいくつかのＤＮＡ配列を発現させることによ
り組換え活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを産生する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】７０年代の逆転写酵素の発見は、一方向
性プロセスとしてのＤＮＡから、ＲＮＡを介するタンパ
ク質への情報伝達における分子生物学の「セントラルド
グマ」の誤りを立証した（ＴｅｒｍｉｎＨ．およびＭ
ｉｚｕｔａｎｉＳ．，１９７０Ｎａｔｕｒｅ２２
６：１２１１−１２１３；ＢａｌｔｉｍｏｒｅＤ．，
１９７０，Ｎａｔｕｒｅ２２６：１２０９−１２１
１）。これらのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの酵素
学的特徴付けは、ＲＮＡウイルスの増幅サイクルにおけ
る、従ってまた、このタイプのウイルスにより引き起こ
される疾患（癌、エイズなど）の発達および蔓延におけ
る現在の理解の基礎である。

【０００３】しかし、逆転写酵素はまた、ｃＤＮＡの合
成、増幅およびクローニング（ＲＴ−ＰＣＲ）に関する
分子生物学者のためのツールでもある。この技術は、真
核生物細胞における遺伝子発現の単純化し、促進した実
験を可能にする。細胞抽出物または組織から全ｍＲＮＡ
を単離した後、該ｍＲＮＡは、逆転写酵素によりｃＤＮ
Ａに逆転写され、引き続くＰＣＲ工程により増幅され
て、クローニングおよび特徴付けが可能になる。その結
果、一方では、遺伝子のイントロンおよびエキソン構造
を解明する必要がなく、他方では、種々のライフサイク
ルの間または疾患（例えば、癌）の発達の間に細胞にお
いて遺伝子発現を調査することも可能である。

【０００４】３つの異なるレトロウイルスに由来する逆
転写酵素（ＲＴ）は、これまで綿密に調査されている：
モロニーマウス白血球ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）由来のＲ
Ｔ。この酵素は、７８ｋＤａの分子量を有する単一のサ
ブユニットからなる（ＰｒａｓａｄＶ．Ｒ．，１９９
３ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ，Ｃ
ｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１３５に総説されてい
る）。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来
するＲＴが知られている。このＲＴは、２つのサブユニ
ットｐ６６およびｐ５１からなるヘテロダイマーであ
り、ｐ５１サブユニットはｐ６６のタンパク質分解性切
断により形成される（ＬｅＧｒｉｃｅＳ．Ｆ．
Ｊ．，１９９３ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐ
ｔａｓｅ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，
ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１６３に総
説されている）。さらに、トリ肉腫−白血症ウイルス
（ＡＳＬＶ）に由来するＲＴが知られている。トリ骨髄
芽球腫ウイルス（ＡＭＶ）に由来するＲＴもまたＡＳＬ
Ｖファミリーに属する。このＲＴもまた、約６３ｋＤａ
の分子量を有するα鎖および約９５ｋＤａの分子量を有
するβ鎖からなるヘテロダイマーである。この場合、α
鎖はまた、β鎖のタンパク質分解性プロセシングにより
形成される（ＧｏｌｏｍｂＭ．およびＧｒａｎｄｇｅ
ｎｅｔｔＤ．，１９７９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２５４：１６０６−１６１３；ＷｅｉｓｓＲ．ら編、１
９８４、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙｏｆ
ｔｕｍｏｒｖｉｒｕｓｅｓ，第２版：ＲＮＡｔｕｍ
ｏｒｖｉｒｕｓｅｓ１／ｔｅｘｔ．ＣｏｌｄＳｐ
ｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒ
ｋ）。

【０００５】Ｍ−ＭＬＶ−ＲＴは、モノマーとして大腸
菌において発現され、ＨＩＶ−ＲＴはヘテロダイマーと
して発現されるが、大腸菌または他の原核生物において
十分な程度まで活性または可溶性ヘテロダイマーとして
ＡＭＶ−ＲＴを発現させることは、これまで不可能であ
った。ＷＯ００／４２１９９によれば、所定のＲＴバ
リアントが大腸菌または好ましくは真核生物昆虫細胞に
おいて発現されるが、このプロセスで得られる所望のＲ
Ｔは、主に不溶性成分からなる（約９０％）。

【０００６】さらに、大腸菌の粗細胞抽出物において組
換えＡＭＶ−ＲＴを測定することは困難である。なぜな
ら、一方では、ＲＮＡテンプレートは、内因性大腸菌Ｒ
Ｎａｓｅにより分解され、他方では、大腸菌株は、ＤＮ
Ａポリメラーゼ活性に加えてＲＴ活性をも有するＤＮＡ
ポリメラーゼを有する（Ｒｉｃｃｈｅｔｔｉ，Ｍ．およ
びＨｕｃ．Ｈ．，１９９３，ＥＭＢＯＪ．１２
（２），３８７−３９６）。従って、この内因性大腸菌
ＲＴ活性は、大腸菌粗抽出物および精製に由来する画分
における組換えＡＭＶ−ＲＴの活性の測定を相当に妨害
する。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、充分な量で組換え活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴ
を提供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】すなわち、本発明の要旨
は、（１）（ｉ）ＡＭＶ−ＲＴのα鎖および／または
β鎖をコードする１つまたはいくつかのＤＮＡ配列が発
現プラスミドにクローン化される、（ii）発現プラスミ
ドが原核細胞に形質転換される、（iii ）ヘテロダイマ
ーＡＭＶ−ＲＴの可溶性発現が誘導される、および（i
v）組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴが細胞から単離
される、原核生物宿主細胞において活性ヘテロダイマー
ＡＭＶ−ＲＴを産生する方法、（２） α鎖をコードす
るＤＮＡ配列およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列が、１
つの細胞にクローン化された別々の発現プラスミド上で
発現される、前記（１）記載の方法、（３） α鎖をコ
ードするＤＮＡ配列およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列
が、１つの細胞にクローン化された１つの発現プラスミ
ド上で発現される、前記（１）記載の方法、（４） α
鎖ならびにβ鎖がペプチド配列に融合される、前記
（１）〜（３）いずれかに記載の方法、（５） α鎖ま
たはβ鎖が、２〜１０のアルギニン残基からなるペプチ
ド配列と融合され、β鎖またはα鎖が、２〜１０のヒス
チジン残基からなるペプチド配列と融合される、前記
（４）記載の方法、（６）可逆的な結合が可能である
ペプチド配列をコードするＤＮＡ配列に連結されるα鎖
をコードするＤＮＡ配列およびβ鎖をコードするＤＮＡ
配列が、１つの細胞にクローン化された１つの発現プラ
スミドにおいて発現される、前記（１）〜（５）いずれ
かに記載の方法、（７） α鎖およびβ鎖が、可逆的な
結合が可能である同一のペプチド配列と融合される、前
記（１）〜（６）いずれかに記載の方法、（８） α鎖
およびβ鎖が、２〜１０のヒスチジン残基からなるペプ
チド配列と各々融合される、前記（７）記載の方法、
（９）発現が、１０℃〜２５℃の増殖温度および減少
したインデューサー濃度で生じる、前記（１）〜（８）
いずれかに記載の方法、（１０）発現が、ヘルパー遺
伝子の共発現により増大される、前記（１）〜（９）い
ずれかに記載の方法、（１１）トリプトファンｔＲＮ
ＡをコードするｔｒｐＴ遺伝子がヘルパー遺伝子として
使用される、前記（１０）記載の方法、（１２）発現
がシャペロン遺伝子の共発現により増大される、前記
（１０）記載の方法、（１３）ＧｒｏＥＬおよびＧｒ
ｏＥＳ、ＤｎａＫおよびＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよび／ま
たはＣｌｐＢをコードする遺伝子が共発現される、前記
（１０）または（１２）記載の方法、（１４）Ｇｒｏ
ＥＬおよびＧｒｏＥＳをコードする遺伝子が、α鎖をコ
ードする遺伝子およびβ鎖をコードする遺伝子をも保有
する発現プラスミド上にクローン化され、ＤｎａＫ、Ｄ
ｎａＪ、ＧｒｐＥおよびＣｌｐＢをコードする遺伝子が
ヘルパープラスミド上にクローン化される、前記（１
２）または（１３）記載の方法、（１５）適切なアフ
ィニティークロマトグラフィー材料が、組換えヘテロダ
イマーＡＭＶ−ＲＴを単離または精製するために使用さ
れる、前記（１）〜（８）記載いずれかに記載の方法、
（１６）精製に使用されるアフィニティークロマトグ
ラフィー材料がα鎖および／またはβ鎖に結合した異な
るペプチド配列に可逆的に結合する、前記（１５）記載
の方法、（１７）精製に使用されるアフィニティーク
ロマトグラフィー材料が、金属イオンキレート化材料ま
たはカチオン交換体である、前記（１５）または（１
６）記載の方法、（１８）配列番号：５のＤＮＡ配列
または配列番号：４および配列番号：５のＤＮＡ配列が
原核生物宿主細胞において発現される、前記（１）〜
（１７）いずれかに記載の方法、（１９）大腸菌が宿
主細胞として使用される、前記（１）〜（１８）いずれ
かに記載の方法、（２０）活性ヘテロダイマーＡＭＶ
−ＲＴが、配列番号：６および配列番号：７のサブユニ
ットからなる、前記（１）〜（１９）いずれかに記載の
方法、（２１）ＲＮＡ配列を増幅するための、前記
（１）〜（２０）いずれかに記載の方法により得られる
ＡＭＶ−ＲＴの使用、に関する。

【０００９】

【発明の実施の形態】前記目的は、原核生物宿主細胞に
おいて活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを産生する方法
により達成される。ここで、ＡＭＶ−ＲＴのαおよびβ
のサブユニットまたは鎖をコードする１つまたはいくつ
かのＤＮＡ配列は、発現プラスミドにクローン化され、
発現プラスミドは、原核細胞において形質転換され、ヘ
テロダイマーＡＭＶ−ＲＴの発現が誘導され、組換えヘ
テロダイマーＡＭＶ−ＲＴが精製される、すなわち、細
胞から単離される。適切な遺伝子およびＤＮＡ配列は、
とりわけ、ＡＭＶ−ＲＴサブユニットの１つだけをコー
ドするものである。一部または発現産物は、引き続いて
所定の手段、例えばβ鎖のタンパク質分解性切断によ
り、他のサブユニットに変換されうる。サブユニット配
列番号：６および配列番号：７からなる活性ヘテロダイ
マーＡＭＶ−ＲＴを産生する、配列（配列番号：４およ
び配列番号：５）は、本発明の方法に特に適切であるこ
とが証明された。

【００１０】ＡＭＶ−ＲＴのサブユニットをコードする
構造遺伝子およびＤＮＡ配列は、異なる、別々の発現プ
ラスミドにクローン化されるか、１つの発現プラスミ
ド、所望によりいわゆるヘルパープラスミドの存在下で
クローン化され、適切な宿主細胞において発現されう
る。適切な発現プラスミドは、例えば、ｐＤＳ、ｐＫＫ
１７７−３またはｐＫＫＴ５である。それぞれの構造遺
伝子がＴ５プロモーターの制御下で挿入されたプラスミ
ドｐＫＫＴ５が、本発明に好ましい。他の潜在的なプロ
モーター（好ましくはＩＰＴＧ誘導性プロモーターであ
る）は、例えば、ｌａｃ、ｌａｃＵＶ５またはｔａｃ
プロモーターである。プラスミドｐＵＢＳ５２０などの
ヘルパープラスミド、およびアンピシリンまたはカナマ
イシンなどの適切な選択マーカーが、大体において当業
者に知られている。

【００１１】発現プラスミドおよび所望により他のヘル
パープラスミドが、適切な原核生物宿主細胞に形質転換
される。本発明によれば、大腸菌株、例えば、大腸菌Ｋ
１２Ｃ６００、ＤＨ５α、ＬＥ３９２、ＪＭ８３、ＪＭ
１０５、ＮＭ５２２、Ｍ１５、ＲＲ１Δ１５、ＵＴ５６
００、ＴＧ１、Ａ１２００または株、大腸菌Ｂ、ＢＬ２
１、ＨＢ１０１を使用することが好ましい。大腸菌株Ｌ
Ｅ３９２が、本発明に特に好ましい。

【００１２】ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴの発現が、種
々の手段により誘導されうる。特に、所定の増殖条件お
よび誘導条件は、活性ＡＭＶ−ＲＴの発現に対して正の
効果を有する。低インデューサー濃度と組み合わせた１
０〜２５℃の範囲の増殖温度は、本発明に有益であるこ
とが示された。約１５℃の増殖温度および０．１〜０．
５ｍＭ、好ましくは約０．１５ｍＭのインデューサー濃
度は、特に適切であることが示された。ＩＰＴＧ（イソ
プロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）またはラ
クトースがインデューサーとして好適に本発明に使用さ
れる。

【００１３】さらに、原核細胞においてＡＭＶ−ＲＴの
可溶性発現が、ヘルパー遺伝子の共発現により増大され
うることが判明した。潜在的なヘルパー遺伝子は、特に
トリプトファンｔＲＮＡをコードするｔｒｐＴ遺伝子で
ある。さらに、シャペロン遺伝子は、ＧｒｏＥＬおよび
ＧｒｏＥＳ、ＧｒｐＥ、ＣｌｐＢ、ＤｎａＫおよびＤｎ
ａＪをコードする遺伝子などの可溶性発現に適切であ
る。次いで、１つまたはいくつかのシャペロンをコード
する遺伝子は、誘導性プロモーターを有するヘルパープ
ラスミドにおいて好ましくは配置される；シャペロンＧ
ｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをコードする遺伝子は、α鎖
および／またはβ鎖をコードする構造遺伝子もまた配置
された発現プラスミドにおいて構成的なプロモーターの
制御下にある。しかし、ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳを
コードする遺伝子が、α鎖をコードする遺伝子およびβ
鎖をコードする遺伝子を保有する発現プラスミドにクロ
ーン化され、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよびＣｌ
ｐＢをコードする遺伝子がヘルパープラスミドにクロー
ン化されることが本発明において特に好ましい。

【００１４】当業者に一般に知られている方法に加え
て、金属イオンキレート材料または陽イオン交換体など
のアフィニティークロマトグラフィー材料を使用して、
細胞抽出物から組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを精
製および単離することが特に有益である。発現産物、す
なわち、ニッケル、銅または亜鉛ニトリロ酢酸（ＮＴ
Ａ）樹脂などの陽イオン交換体、金属イオンキレート材
料などの特定のカラム材料に可逆的に結合しうるペプチ
ド配列に融合されるα鎖およびβ鎖のためのＡＭＶ−Ｒ
Ｔの精製にとって特に有益である。本発明において適切
であるペプチド配列は、２〜約１００アミノ酸またはア
ミノ酸誘導体を有しうる。２〜１０アミノ酸、例えば、
アルギニン残基またはヒスチジン残基からなるペプチド
配列は、本発明に特に適切であることが示されている。
さらに、８アルギニンまたは６ヒスチジン残基を含有す
るかかるペプチド配列を使用することが特に好ましいこ
とも示されている。さらに、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録
商標）（ＩＢＡＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ／Ｇ
ｅｒｍａｎｙ）またはＧＳＴ−ｔａｇ（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ／Ｓｗｅｄｅｎ）などの市販のペ
プチド配列もまた、本発明の方法に適切である。

【００１５】本発明は、以下の実施例によりさらに明ら
かになる：

【００１６】

【実施例】実施例１： α鎖をコードする遺伝子およびβ鎖をコードする遺伝子
の単離データバンク配列（ＭＥＤＬＩＮＥＩＤ９４３６６
７２２、Ｂａｌｕｄａら、１９９４）を用いて、β鎖の
単離のためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した
（配列番号：１および２を参照）。引き続くベクターへ
のクローニングのために、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位を５’末端に取り込ませ、ＰｓｔＩ制限
切断部位を３’末端に取り込ませた。さらに、α鎖の単
離を可能にするさらなる３’プライマーを設計した（配
列番号：３を参照）。両方の鎖を、ＲＴ−ＰＣＲにより
ウイルス溶解物（ＡＴＣＣＶＲ−２６５）からのＰＣ
Ｒにより、ならびにプラスミド上にβ鎖を保有する大腸
菌クローン（ＡＴＣＣ３１９９０）からのＰＣＲによ
り取り出した。ＰＣＲ混合物を１％アガロースゲルに供
し、α鎖については約１７１５ｂｐのＰＣＲフラグメン
トおよびβ鎖については約２５７０ｂｐのＰＣＲフラグ
メントをアガロースゲルから単離し（ＱＩＡＥＸＩ
Ｉ，ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ，Ｑｉａｇ
ｅｎ／Ｇｅｒｍａｎｙ）、上記の制限エンドヌクレアー
ゼで切断し、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで同様に線状化
したｐＵＣ１９のベクターフラグメントにクローン化
し、単離した。これについて、１μｌ（２０ｎｇ）のベ
クターフラグメントおよび３μｌ（１００ｎｇ）のＰＣ
Ｒフラグメント、１μｌの１０×リガーゼバッファー
（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８９Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎ
ｕａｌ，第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓＮＹ（ＵＳ
Ａ）、２７巻）、１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ、４μ
ｌの二重蒸留滅菌Ｈ₂Ｏをパイペッティングし、注意深
く混合し、１６℃で一晩インキュベートした。クローン
化した遺伝子を、引き続いて制限解析および配列決定に
より調査した。その配列を、配列番号：４（α鎖）およ
び配列番号：５（β鎖）に示す。

【００１７】データバンク配列（ＭＥＤＬＩＮＥＩＤ
９４３６６７２２、Ｂａｌｕｄａ，Ｍ．Ａ．およびＲ
ｅｄｄｙ，Ｅ．Ｐ．，１９９４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ
９：２７６１−２７７４）との比較は、α鎖ならびにβ
鎖についてＤＮＡレベルで９８．８％のホモロジーを示
した。得られたアミノ酸配列を比較すると、ＤＮＡレベ
ルでのほとんどの置換がいわゆるサイレント変異であ
り、すなわち、アミノ酸置換を導かないことが明らかに
なる。３つの塩基置換のみがまた、アミノ酸置換を生じ
たが、それらは、それぞれの単離されたＰＣＲ産物にお
いて再現性があることがわかる。それらの置換は、Ａｒ
ｇ２７３Ｍｅｔ、Ａｒｇ３０４ＧｌｎおよびＡｓｐ４９
５Ｇｌｕである。両方の鎖のアミノ酸配列を配列番号：
６（α鎖）および配列番号：７（β鎖）に示す。

【００１８】実施例２：融合ペプチド配列（タグ）なしのα−鎖およびβ−鎖の
発現２．１．発現プラスミドｐＡＭＶ−αおよびｐＡＭＶ−
βの構築ＡＭＶ−ＲＴを発現するために、Ｔ５プロモーターの制
御下で構造遺伝子が各々正しい向きで挿入される様式
で、両方の鎖に対する遺伝子を発現ベクターに別々にク
ローン化した。このために、α−鎖およびβ−鎖に対す
るそれぞれの構造遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ
によりプラスミドｐＵＣ１９から切り出し、制限混合物
をアガロースゲル電気泳動により分離し、α−鎖の１７
１５ｂｐフラグメントおよびβ−鎖の２５７０ｂｐフラ
グメントをアガロースゲルから単離した。発現プラスミ
ドｐＫＫＴ５は、ｐＤＳ由来のＴ５プロモーター（Buja
rdら、1987, Methods Enzymol. 155: 416-433 ）でｔａ
ｃプロモーターを置換することによりｐＫＫ１７７−３
（Kopetzkiら、1989, Mol. Gen. Genet. 216: 149-155
）から形成され、それを発現に使用した。Ｔ５プロモ
ーターの配列におけるＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアー
ゼ切断部位を、２つの点変異により除去した。ＡＭＶ−
ＲＴに対する遺伝子の挿入のために、得られた発現プラ
スミドをＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで切断し、制限混合
物をアガロースゲル電気泳動により分離し、得られた約
２５００ｂｐのベクターフラグメントをアガロースゲル
から単離した。この方法で得られたベクターフラグメン
トを、実施例１に記載したα−鎖およびβ−鎖に対する
遺伝子と、前記のように別々に結合した。遺伝子の正し
い挿入を制限対照（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｃｏｎｔ
ｒｏｌ）およびシークエンシングにより確認した。種々
の大腸菌株での発現制御のために、得られたプラスミド
ｐＡＭＶ−αおよびｐＡＭＶ−βを最初に別々にヘルパ
ープラスミドｐＵＢＳ５２０で同時形質転換した。この
場合、αα−およびββ−ホモダイマーを得るために、
α−鎖およびβ−鎖が別々に発現しうると考えられる。
ヘルパープラスミドｐＵＢＳ５２０（Brinkmann ら、19
89, Gene 85: 109-114）は、とりわけｌａｃリプレッサ
ーをコードするｌａｑＩ^q遺伝子とコドンＡＧＡおよび
ＡＧＧを認識する大腸菌中の希有なｔＲＮＡ^Argをコー
ドするｄｎａＹ遺伝子とを有する（Garciaら、1986, Ce
ll 45: 453-459）。トランスポゾンＴＮ９０３由来のカ
ナマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとして使用した。

【００１９】２．２大腸菌での発現プラスミドｐＡＭ
Ｖ−αおよびｐＡＭＶ−βの別々の形質転換種々の大腸菌株のコンピテント細胞を、Hanahan の方法
（J. Mol. Biol. 1983, vol. 166, 557 ）により調製し
た。この方法で調製した２００μｌの大腸菌ＬＥ３９２
細胞を、２０ｎｇの単離された発現プラスミドｐＡＭＶ
−α ＤＮＡまたはｐＡＭＶ−β ＤＮＡおよび４０ｎ
ｇヘルパープラスミドＤＮＡと混ぜた。氷上で３０分イ
ンキュベートした後、熱ショック（４２℃で９０秒）を
行なった。次いで細胞を１ｍｌＬＢ培地に移し、表現
型発現のためにＬＢ培地で３７℃で１時間インキュベー
トした。この形質転換混合物のアリコートを、アンピシ
リンとカナマイシンとを選択マーカーとして含むＬＢプ
レート上にプレーティングし、３７℃で１５分間インキ
ュベートした。

【００２０】２．３大腸菌でのα−鎖に対する遺伝子
の発現ＡＭＶ−ＲＴのα−鎖をコードする遺伝子を発現するた
めに、プラスミド含有クローンを３ｍｌＬＢ_ampkan培
地に接種し、振盪器で３０℃でインキュベートした。光
学濃度０．５（５５０ｎｍで測定、ＯＤ₅₅₀）で、細胞
を０．５ｍＭＩＰＴＧで誘導し、振盪器で３０℃で４時
間インキュベートした。次いで個々の発現クローンの光
学濃度を測定し、５．０／ｍｌのＯＤ₅₅₀に対応するア
リコートを取り出し、細胞を遠心分離した（１０分、６
０００ｒｐｍ、４℃）。細胞ペレットを４００μｌＴ
Ｅバッファー（５０ｍＭトリス／５０ｍＭＥＤＴ
Ａ、ｐＨ８．０）中に再懸濁し、細胞を超音波により
破砕し、遠心分離（１０分、１４０００ｒｐｍ、４℃）
により可溶性タンパク質画分を不溶性タンパク質画分か
ら分離した。ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを
含む負荷用バッファーを全画分に添加し、タンパク質を
煮沸（５分、１００℃）により変性させた。その後、各
１０μｌを分析用ＳＤＳゲル（１０％）により分析した
（Laemmli U.K., 1970, Nature 227: 555-557 ）。

【００２１】ＳＤＳゲルの分析は、α−鎖の明白な過剰
発現を示す。強く過剰発現した追加のバンドが、非誘導
対照クローンまたはプラスミドを含まない誘導対照クロ
ーンでは観察されない約６３ｋＤａで見られる。過剰発
現したα−鎖の小片部分が可溶性タンパク質画分に現れ
るのに対して、大部分量が不溶性発現タンパク質として
形成される。

【００２２】２．４大腸菌でのβ−鎖の遺伝子の発現ＡＭＶ−ＲＴのβ−鎖をコードする遺伝子を発現するた
めに、３ｍｌＬＢ_am _pkan培地にプラスミド含有クロー
ンを接種し、振盪器で３０℃でインキュベートした。Ｏ
Ｄ_550nm光学濃度０．５で細胞を０．５ｍＭＩＰＴＧ
で誘導し、振盪器で３０℃で４時間インキュベートし
た。次いで個々の発現クローンの光学濃度を測定し、
５．０／ｍｌのＯＤ₅₅₀に対応するアリコートを取り出
し、細胞を遠心分離した（１０分、６０００ｒｐｍ、４
℃）。細胞ペレットを４００μｌＴＥバッファー（５
０ｍＭトリス／５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
中に再懸濁し、細胞を超音波により破砕し、遠心分離
（１０分、１４０００ｒｐｍ、４℃）により可溶性タン
パク質画分を不溶性タンパク質画分から分離した。ＳＤ
Ｓおよびβ−メルカプトエタノールを含む負荷用バッフ
ァーを全画分に添加し、タンパク質を煮沸（５分、１０
０℃）により変性させた。その後、各１０μｌを分析用
ＳＤＳゲル（８％）により分析した（Laemmli U.K., 19
70, Nature 227: 555-557 ）。

【００２３】ＳＤＳゲルの分析は、β−鎖の明白な過剰
発現を示す。強く過剰発現した追加のバンドが、非誘導
対照クローンまたはプラスミドを含まない誘導対照クロ
ーンでは観察されない約９５ｋＤａで見られる。過剰発
現したβ−鎖の大部分が不溶性タンパク質画分に現れる
が、微量の過剰発現がまた可溶性タンパク質画分に見ら
れる。

【００２４】２．５細胞中の別々のプラスミド上での
両方の鎖の発現１つの細胞で両方の鎖を発現するために、ｌａｃＩ^q発
現カセットおよびｄｎａＹ発現カセットをヘルパープラ
スミドｐＵＢＳ５２０から発現プラスミド上へ最初に再
クローン化するべきである。ｌａｃＩ^q発現カセットを
ｐＡＭＶ−α上へクローン化し、ｄｎａＹ発現カセット
を発現プラスミドｐＡＭＶ−β上へクローン化した。発
現プラスミドの安定した増殖を確保するために、ｐＡＭ
Ｖ−α由来のアンピシリン耐性遺伝子をｐＵＢＳ５２０
由来のカナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。次いで、
得られた発現プラスミドｐＡＭＶ−α_lacIqおよびｐＡ
ＭＶ−β_dnaYを種々の大腸菌発現株で同時形質転換し
た。

【００２５】ＡＭＶ−ＲＴのα−鎖およびβ−鎖をコー
ドする遺伝子を発現するために、３ｍｌＬＢ_ampkan培
地にプラスミド含有クローンを接種し、振盪器で３０℃
でインキュベートした。ＯＤ_550nm０．５で細胞を０．
５ｍＭＩＰＴＧで誘導し、振盪器で３０℃で４時間イ
ンキュベートした。次いで個々の発現クローンの光学濃
度を測定し、５．０／ｍｌのＯＤ₅₅₀に対応するアリコ
ートを取り出し、細胞を遠心分離した（１０分、６００
０ｒｐｍ、４℃）。細胞ペレットを４００μｌＴＥバッ
ファー（５０ｍＭトリス／５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ
８．０）中に再懸濁し、細胞を超音波により破砕し、
遠心分離（１０分、１４０００ｒｐｍ、４℃）により可
溶性タンパク質画分を不溶性タンパク質画分から分離し
た。ＳＤＳおよびβ−メルカプトエタノールを含む負荷
用バッファーを全画分に添加し、タンパク質を煮沸（５
分、１００℃）により変性させた。その後、各１０μｌ
を分析用ＳＤＳゲル（８％）により分析した（Laemmli
U.K., 1970, Nature 227: 555-557 ）。

【００２６】ＳＤＳゲルの分析は、驚いたことにα−鎖
およびβ−鎖の明白な過剰発現を示す。強く過剰発現し
た追加のバンドが、非誘導対照クローンまたはプラスミ
ドを含まない誘導対照クローンでは観察されない約６３
ｋＤａおよび約９５ｋＤａで見られる。可溶性画分およ
び不溶性画分におけるバンドの分布は、両方の鎖が別々
に発現された実験のものと同様である。両方の鎖の発現
の産出（ｏｕｔｐｕｔ）は、別々の発現に対するものよ
り全体的にみていくらか少ない。

【００２７】実施例３：精製を簡素化するための融合タグを有するα−鎖および
β−鎖の発現３．１種々の融合タンパク質の産生効率よく組換えＡＭＶ−ＲＴヘテロダイマーを精製する
ために、適切なペプチド配列、いわゆるタグを両方の鎖
の５’末端で融合した。タグはアフィニティークロマト
ラフィーを行なうことを可能にする。２つのタグの１つ
に各々特異的な２つのアフィニティークロマトグラフィ
ーの連続は、さらに純粋なヘテロダイマーの単離を可能
にする（Wende W.ら、1996, Biol. Chem. 377, 625-63
2）。適切なプライマー設計を使用して、ＰＣＲ反応に
よりα−鎖に８つのアルギニン残基を、β−鎖に６つの
ヒスチジン残基を結合した。センスプライマーの配列
を、配列番号：８（α−鎖に対する５’プライマー）お
よび配列番号：９（β−鎖に対する５’プライマー）に
示す。遺伝子単離のためにすでに使用した配列番号：２
（β−鎖）および配列番号：３（α−鎖）のオリゴヌク
レオチドを、アンチセンスプライマーとして使用した。

【００２８】ＰＣＲ混合物を１％アガロースゲルに適用
し、α−鎖に対して１７３９ｂｐおよびβ−鎖に対して
２５９７ｂｐのＰＣＲフラグメントをアガロースゲル
（QIAEX II, Gel Extraction Kit, Qiagen, Germany ）
から単離し、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩおよび
ＰｓｔＩで切断し、同様にＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩで
線形にして単離しておいた好ましい発現プラスミドのベ
クターフラグメントにクローン化した。このために、１
μｌ（２０ｎｇ）ベクターフラグメントおよび３μｌ
（１００ｎｇ）ＰＣＲフラグメント、１μｌ１０×リ
ガーゼバッファー（Maniatisら、1989 Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, second Edition,Cold Sprin
g Habor Laboratory Press NY (USA), vol. 27 ）、１
μｌＴ４ＤＮＡリガーゼ、４μｌ滅菌Ｈ₂Ｏ
_bidistilledをピペッティングし、注意深く混合し、１
６℃で一晩インキュベートした。次いでクローン化した
遺伝子を制限分析およびシークエンシングにより調べ
た。得られた発現プラスミドをｐＡＭＶ−α_lacIq-Arg
およびｐＡＭＶ−β_dnaY-Hisと命名した。

【００２９】３．２種々の大腸菌発現株での発現プラ
スミドｐＡＭＶ−α_lacIq-ArgおよびｐＡＭＶ−β
_dnaY-Hisの形質転換種々の大腸菌株のコンピテント細胞をHanahan の方法
（J. Mol. Biol. 1983,vol. 166 pp. 557 ）により調
製した（実施例２．２を参照のこと）。

【００３０】３．３細胞中の別々のプラスミド上での
融合したタグを有する両方の鎖の発現細胞中でタグを有する両方の鎖を発現するために、種々
の大腸菌発現株を発現プラスミドｐＡＭＶ−α
_lacIq-ArgおよびｐＡＭＶ−β_dnaY-Hisと同時形質転換
した。

【００３１】ＡＭＶ−ＲＴのＡｒｇ−タグを有するα−
鎖およびＨｉｓ−タグを有するβ−鎖をコードする遺伝
子を発現するために、プラスミド含有クローンを３ｍｌ
ＬＢ_ampkan培地に接種し、振盪器で３０℃でインキュ
ベートした。ＯＤ₅₅₀０．５で細胞を０．５ｍＭＩＰ
ＴＧで誘導し、振盪器で３０℃で４時間インキュベート
した。次いで個々の発現クローンの光学濃度を測定し、
５／ｍｌのＯＤ₅₅₀に対応するアリコートを取り出し、
細胞を遠心分離した（１０分、６０００ｒｐｍ、４
℃）。細胞ペレットを４００μｌＴＥバッファー（５
０ｍＭトリス／５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）
中に再懸濁し、細胞を超音波により破砕し、遠心分離
（１０分、１４０００ｒｐｍ、４℃）により可溶性タン
パク質画分を不溶性タンパク質画分から分離した。ＳＤ
Ｓおよびβ−メルカプトエタノールを含む負荷用バッフ
ァーを全画分に添加し、タンパク質を煮沸（５分、１０
０℃）により変性させた。その後、各１０μｌを８％分
析用ＳＤＳゲルにより分析した（Laemmli U.K., 1970,
Nature 227: 555-557 ）。

【００３２】ＳＤＳゲルの分析は、驚いたことにα−鎖
およびβ−鎖の明白な過剰発現を示す。強く過剰発現し
た追加のバンドが、非誘導対照クローンまたはプラスミ
ドを含まない誘導対照クローンでは観察されない約６３
ｋＤａおよび約９５ｋＤａで見られる。可溶性画分およ
び不溶性画分におけるバンドの分布は、両方の鎖を１つ
の細胞においてタグなしで別々に発現させた実験のもの
と同様である。

【００３３】３．４プラスミド上での融合タグを有す
る両方の鎖の発現ＡＭＶ−ＲＴのα−鎖およびβ−鎖に対する遺伝子が２
つのプラスミド上に分布する場合、これらのプラスミド
の安定性の差異は、それぞれの鎖の異なる量の産生、し
たがって低収量のαβ−鎖のヘテロダイマーをもたらし
うる。このため、βラクタマーゼに対する遺伝子を除く
２つのプラスミドｐＡＭＶ−α_lacIq-Ar _gおよびｐＡＭ
Ｖ−β_dnaY-Hisの全遺伝子情報を、単一のプラスミドｐ
ＡＭＶ−αβ−１上で結合した。Ｔ５プロモーターに対
する配列、Ｎ−末端Ｈｉｓタグを有するβ−鎖をコード
する遺伝子、ｒｒｎＢターミネーターに対する配列およ
びｄｎａＹ遺伝子を含むｐＡＭＶ−β_dnaY-HisのＳｓｐ
Ｉ−ＡｆｌＩＩＩフラグメントを、Ｔ５プロモーターに
対する配列、Ｎ−末端Ａｒｇ−タグを有するα−鎖をコ
ードする遺伝子、ｒｒｎＢターミネーターに対する配
列、カナマイシン耐性遺伝子およびｌａｃＩ^q遺伝子を
含むｐＡＭＶ−α_lacIq-ArgのＳａｌＩ切断部位に挿入
することにより、このプラスミドを構築した。この目的
のために、発現プラスミドｐＡＭＶ−α_lacIq-Argおよ
びｐＡＭＶ−β_dnaY-Hisの各１μｇ々を、製造業者の指
示書に従って上記制限エンドヌクレアーゼで切断し、制
限混合物を１％アガロースゲルで分離し、ｐＡＭＶ−β
_dnaY-Hisの４１２４ｂｐＳｓｐＩ−ＡｆｌＩＩＩフラ
グメントおよびｐＡＭＶ−α_lacIq-Argの６０２４ｂｐ
フラグメントをアガロースゲル（QIAEX II, Gel Extrac
tion Kit, Qiagen/Germany）から単離した。非適合末端
を、製造業者の指示書に従ってクレノウポリメラーゼ
（Roche Diagnostics GmbH）を用いて調製し、上記のよ
うに２つのフラグメントを互いに連結させた。得られる
新しい発現プラスミドｐＡＭＶαβ−１を制限分析によ
り調べた。

【００３４】制限分析による正しい発現プラスミドを、
上記のように大腸菌Ｋ−１２株ＬＥ３９２で形質転換
し、発現制御に供した。次いで、誘導条件下で４時間増
殖した後、細胞のタンパク質含量をＳＤＳ−ＰＡＧＥに
より調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、発現産出の
レベルおよび可溶性画分および不溶性画分の相対比は別
々のプラスミド上のα−鎖およびβ−鎖に対する遺伝子
の発現に匹敵するが、発現したα−鎖およびβ−鎖の量
は、より均一であるようにみえる。さらに、精製手順の
ために、β−鎖のものと同様のＨｉｓ−タグによりα−
鎖のＡｒｇ−タグを置換した。この目的のために、ｐＡ
ＭＶ−α_lacIq-Arg由来のＥｃｏＲＩ−ＮｈｅＩフラグ
メントがｐＡＭＶ−β_dnaY-His由来のＥｃｏＲＩ−Ｎｈ
ｅＩフラグメントに置換された中間構築物ｐＡＭＶ−α
_lacIq-Hisを調製した。次いで、ｐＡＭＶαβ−１の構
築物のように、βラクタマーゼに対する遺伝子を除く２
つのプラスミドｐＡＭＶ−α_lacIq-HisおよびｐＡＭＶ
−β_dnaY-Hisの全遺伝子情報を単一のプラスミドｐＡＭ
Ｖαβ−２上で結合した。新しい発現ベクターをｐＡＭ
Ｖαβ−２と名付けた。細胞を上記のようにｐＡＭＶα
β−２で形質転換し、標準条件下で発現制御に供した。
発現産出は、この条件下で増加しなかった。

【００３５】実施例４：発現最適化４．１発現条件を変更することによる活性ＡＭＶ−Ｒ
Ｔの発現の増加特定の増殖および誘導条件は、活性ＡＭＶ−ＲＴの発現
に正の効果を有する。その後、増殖温度を誘導期間中３
０℃から１５℃に下げ、ＩＰＴＧ濃度を０．５ｍＭから
０．１５ｍＭに低減して発現を誘導し、誘導時間を４時
間から２６時間に増やした。誘導期後、細胞のタンパク
質含量をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により
上記のように調べた。

【００３６】その後、α−鎖およびβ−鎖の全発現収量
は、予期したとおり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で実質的に
低減したが、可溶性発現α−鎖およびβ−鎖の含量は、
標準増殖および誘導条件下での発現実験と比較してかな
り増加した。活性ＡＭＶ−ＲＴの発現におけるこの増加
もまた、次の精製および活性測定で確認された。

【００３７】４．２ヘルパー遺伝子の共発現による活
性ＡＭＶ−ＲＴの発現の増加４．２．１．トリプトファン−ｔＲＮＡ（ｔＲＮ
Ａ^trp）に対する遺伝子の共発現ＡＭＶ−ＲＴの１つの特性は、真核生物宿主細胞の感染
後、ポリメラーゼ反応のためのプライマーとしてのトリ
プトファンに対する内因性細胞ｔＲＮＡ（ｔＲＮ
Ａ^trp）の使用である（Leisら、1993, in: Reverse Tr
anscriptase, Cold Spring Harbor Monograph Series,
eds.: Skala, A. M.およびGoff, S. P., ColdSpring Ha
rbor NY (USA), 33-48 ）。しかしながら、内因性大腸
菌ｔＲＮＡ^trpがプライマーとしてＡＭＶ−ＲＴにより
使用されうるかどうかは、証明されていない。大腸菌に
おいて、ｔＲＮＡ^trpは単一の遺伝子ｔｒｐＴによりコ
ードされるのみであり、その発現は細胞の通常の要求に
適合する。細胞におけるｔＲＮＡ ^trpの潜在的欠失を除
外するために、配列番号：１０によるｔｒｐＴ遺伝子を
大腸菌ＬＥ３９２からＰＣＲにより単離し（このために
使用されたプライマーは配列番号：１１および１２に示
す）、ｐＡＭＶ−α_lacIq-Hisへの挿入のためにＰｓｔ
Ｉで再切断し、同様にＰｓｔＩで線形にしたｐＡＭＶ−
α_lacIq-Hisのベクターフラグメントに上記のように結
合した。ＰｓｔＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位にＴ
ｒｐ遺伝子を組み込んだクローンを制限分析およびシー
クエンシングにより確認した。この中間構築物ｐＡＭＶ
−α_{lacIq-His-trpT}において、α−鎖に対する遺伝子お
よび大腸菌ｔＲＮＡ^trpに対する遺伝子が１つの転写ユ
ニットを形成し、その発現はＩＰＴＧ誘導Ｔ５プロモー
ターにより調節される。次いで、ｐＡＭＶαβ−１また
はｐＡＭＶαβ−２の構築と同様に、βラクタマーゼに
対する遺伝子を除く２つのプラスミドｐＡＭＶ−α
_{lacIq-His-trpT}およびｐＡＭＶ−β_dnaY-Hisの全遺伝子
情報を単一プラスミドｐＡＭＶαβ−３上で結合した。
細胞を上記のようにｐＡＭＶαβ−３で形質転換し、修
正発現条件を用いて発現制御に供した。その後、ＡＭＶ
−ＲＴの収量が有意に増加した。

【００３８】４．２．２．シャペロン遺伝子の共発現大腸菌には、ＧｒｏＥＳＬ機構と、ＤｎａＫ、Ｄｎａ
Ｊ、ＧｒｐＥおよびＣｌｐＢからなる４成分システムと
を有する、２個の主要シャペロンシステムがある（Kedz
ierska, 1999）。両システムは、新しく形成されたタン
パク質の正しいフォールディングにおいて、およびスト
レスの結果凝集したタンパク質の再生において重要な役
割を果たす（Hartl F.U., 1996, Nature 381, 571-580;
Bukau H.および Horwich A.L., 1998, Cell 92, 351-3
66; MogK A.ら、EMBO J. 18, 6934-6949; Zolkiewski
M., 1999, J. Biol. Chem. 274, 28083-28086; Goloubi
noffP. ら、1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 13
732-13737）。

【００３９】第１工程では、大腸菌由来のｇｒｏＥＳＬ
オペロンをＡＭＶ−ＲＴ産生株において過剰発現させる
べきである。このため、ｐＯＦ３９（Fayet O., Louarn
J.-M., Georgopoulos C., 1986, Mol. Gen. Genet. vo
l. 202,pp 335-345 由来のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ
フラグメントを、プラスミドｐＡＭＶ−β_dnaY-HisのＳ
ｓｐＩ切断部位に組み込んだ。ライゲーションの前に、
製造業者の指示書に従って、クレノウポリメラーゼ（Ro
che Diagnostics ）を用いて非適合末端を調製した。ｇ
ｒｏＥＳＬの配列を配列番号：１３に示す。この新しい
構築物ｐＡＭＶ−β_{dnaY-His-groESL}において、ｇｒｏ
ＥＳＬオペロンは、３’に存在するβラクタマーゼの遺
伝子を含有する人工転写単位を構成する。次いで、発現
は、ここではｇｒｏＥＳＬオペロンの５’側にある内因
性ｂｌａ構成的プロモーターの制御下および/ またはｇ
ｒｏＥＳＬオペロンのσ³²依存性プロモーターの制御下
のいずれかにある。続いて、βラクタマーゼの遺伝子を
除く２個の発現プラスミドｐＡＭＶ−α_{lacIq-His-trpT}
およびｐＡＭＶ−β_{dnaY-His-groESL}の全遺伝情報を、
上記のようにして単一のプラスミドｐＡＭＶαβ−４上
で再度結合した。

【００４０】ｐＡＭＶαβ−４を用いて上記のようにし
て細胞を形質転換し、修正した発現条件下で発現制御に
供した。ＧｒｏＥＳＬの同時過剰産生は、バイオマスの
増加および活性ＡＭＶ−ＲＴ量の増加をもたらす。精製
および活性試験後、これまでで最も優れた産生株と比
べ、３倍から４倍高い値が得られた。

【００４１】ＡＭＶ−ＲＴ産生株におけるＧｒｏＥＳＬ
の同時過剰産生が陽性測定値であることがわかった後、
第２工程において大腸菌の他方の主要シャペロンシステ
ムをさらに同時過剰産生させた。この同時過剰産生の予
想される一般的な利点に加えて、これは、ＧｒｏＥＳＬ
機構の不都合、すなわち約６５ｋＤａの排除容積（Deue
rling E.ら、1999, Nature 400, 693-696 ）を補いう
る。このことは、それが互いに独立して形成される単一
ドメインに分割され得ないならば、ＡＭＶ−ＲＴ（９３
ｋＤａ）のβ鎖の正しいフォールディングのために特に
重要であるはずである。遺伝子ＤｎａＫ、ＤｎａＪおよ
びＧｒｐＥを、該生理学的結合に対応する人工のオペロ
ン内で結合したが（Diamant S.および Goloubinoff P.,
1998, Biochemistry 37, 9688-9694; Pierpaoli E.V.
ら、1998, J. Biol. Chem. 273, 6643-6649 ）、Ｃｌｐ
Ｂの遺伝子は、自身の転写単位を構成する。ＡＭＶ−Ｒ
Ｔのサブユニットの遺伝子との発現を同調（coordinat
e）させるために、両転写単位をＩＰＴＧ誘導性Ｔ５プ
ロモーターの制御下に置いた。

【００４２】技術的な理由のため、クローニング工程
は、最終構築物ｐＣＨＡＰ−５への経路において、いく
つかの中間工程を必要とした。したがって、ｐＫＫＴ５
誘導体であるｐＣＨＡＰ−１およびｐＣＨＡＰ−２をま
ず構築した。ｐＣＨＡＰ−１は、ｄｎａＫの開始コドン
から開始してｄｎａＪの終止コドンまでの大腸菌由来ｄ
ｎａＫＪオペロンの遺伝情報を含み；ｐＣＨＡＰ−２
は、ＧｒｐＥおよびＣｌｐＢの遺伝子のコード領域由来
の人工転写単位を挿入フラグメントとして保有し；対応
するＤＮＡフラグメントを大腸菌Ｋ１２ＫＥ３９２のゲ
ノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅した。ｄｎａＫＪオペ
ロンの配列を配列番号：１４に、ｄｎａＫＪオペロンの
単離に使用した対応のプライマーを配列番号：１５およ
び１６に示す。ｇｒｐＥ遺伝子の配列を配列番号：１７
に、ｇｒｐＥ遺伝子の単離のための対応するプライマー
を配列番号：１８および１９に示す。ｃｌｐＢ遺伝子の
配列を配列番号：２０に、ｃｌｐＢ遺伝子の単離のため
の対応するプライマーを配列番号：２１および２２に示
す。ｐＣＨＡＰ−１を構築するため、ｄｎａＫＪオペロ
ンを含むＰＣＲフラグメントを、ＳｍａＩおよびＢａｍ
ＨＩで再度切断し、同様にＳｍａＩおよびＢａｍＨＩで
線状化しておいたｐＫＫＴ５のベクターフラグメントに
上述のようにして連結した。ｐＣＨＡＰ−２は、ｇｒｐ
Ｅ遺伝子のＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩフラグメント、ｃｌｐ
Ｂ−遺伝子のＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、
ならびにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで線状化した
ｐＫＫＴ５のベクターフラグメントでの３倍（three-fo
ld）ライゲーションにより構築した。ｃｌｐＢ遺伝子が
転写単位として単独で存在するｐＣＨＡＰ−３は、上述
のようにしてＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで線状化
したｐＫＫＴ５のベクターフラグメントにｐＣＨＡＰ−
２由来ＰｓｔＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを連結す
ることによりｐＣＨＡＰ−２から誘導する。ライゲーシ
ョン反応の前に、製造業者の指示書に従って、クレノウ
ポリメラーゼ（Roche Diagnostics ）を用いてこの２個
のフラグメントの非適合末端を調製した。ｐＣＨＡＰ−
４は、その挿入フラグメントがｐＣＨＡＰ−２由来ｇｒ
ｐＥ遺伝子により延長されたｐＣＨＡＰ−１誘導体であ
り、したがって人工転写単位は、ＤｎａＫ、ＤｎａＪお
よびＧｒｐＥの遺伝子を含有する。この場合において最
適下限であるシャイン・ダルガーノ配列の結果、ｇｒｐ
Ｅの発現は、ｐＣＨＡＰ−２と比べて低下するはずであ
り、したがって、ｄｎａＫＪの発現に対してより良好に
適合（adapted ）するはずである（Diamant & Goloubin
off, 1998; Pierpaoliら、1998）。ｐＣＨＡＰ−４を構
築するため、製造業者の指示書に従って、クレノウポリ
メラーゼ（Roche Diagnostics ）を用いてこの２個のフ
ラグメントの非適合末端を調製した後、ｐＣＨＡＰ−２
由来ＥｃｏＲＩ−ＡｖａＩフラグメントをｐＣＨＡＰ−
１のＢａｍＨＩ切断部位に挿入した。最終構築物ｐＣＨ
ＡＰ−５は、追加の遺伝情報としてｐＣＨＡＰ−３の挿
入フラグメントを含むｐＣＨＡＰ−４誘導体である。こ
のため、すでに何度か記載しているような制限およびラ
イゲーションにより、ｐＣＨＡＰ−４内のＢｓｐＬＵ１
１Ｉ−ＮｄｅＩフラグメントを、ｐＣＨＡＰ−３由来の
ＢｓｐＬＵ１１Ｉ−ＳｓｐＩに置換した。該末端の適合
性を確実にするため、製造業者の指示書に従って、クレ
ノウポリメラーゼ（Roche Diagnostics ）にＮｄｅＩに
より生じた突出末端をあらかじめ平滑化（filled in ）
した。

【００４３】発現プラスミドｐＡＭＶαβ−４を種々の
ヘルパープラスミドｐＣＨＡＰ−１〜ｐＣＨＡＰ−５と
結合することの活性ＡＭＶ−ＲＴの過剰産生に対する効
果を調べた。少なくとも修正した標準発現条件下では、
すべてのヘルパープラスミドが、これまでの活性ＡＭＶ
−ＲＴ収率をかなり増大させ、予期した通り、ヘルパー
プラスミドｐＣＨＡＰ−５が最も優れた結果をもたらし
た。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥならびに続く精製お
よび活性測定により確認した。

【００４４】実施例５：解析方法５．１．逆転写酵素活性の試験（試験Ａ）精製の間、画分の逆転写酵素活性を、非放射性試験シス
テムにより検出した。「逆転写酵素アッセイ非放射性(r
everse transcriptase assay non-radioactive) 」（Ro
che Molecular Biochemicals、カタログ番号１４６８１
２０）をこれに使用した。インキュベーション期間を３
０分間に短縮した。

【００４５】５．２．逆転写酵素活性の試験（試験Ｂ）プールの特異的逆転写酵素活性を、放射性試験システム
により測定した。逆転写酵素活性を、１００μｌ（５０
ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．３（３７℃）、４０
ｍＭＫＣｌ、６ｍＭＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭｄＴ
ＴＰ、０．０４ＯＤ₂₆₀ ｎｍポリ（Ａ）×ｄＴ₁₅、
０．１μＭ［３Ｈ］−ｄＴＴＰ）の試験容量において測
定した。ＡＭＶ−ＲＴ（５μｌ）を適切な希釈率で添加
した。１０分間３７℃でインキュベートした後、１０％
ＴＣＡ溶液（５００μｌ）で反応を停止した。形成され
た放射性標識産物を、沈殿させた後にニトロセルロース
フィルター上で洗浄した。放射能の取り込み率をシンチ
レーションカウンターで測定し、試料のＲＴ活性を算出
した。一酵素単位を、３７℃で１０分間に酸不溶性産物
内に１．０ｎＭｏｌＴＭＰを取り込んだＡＭＶ−ＲＴ
の量と定義した。

【００４６】５．３．ＤＮＡポリメラーゼの試験大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼの活性をニックトランス
レーションの測定により調べた。該ＤＮＡポリメラーゼ
は、非放射性ニックトランスレーション試験により検出
した。ニックトランスレーションは、５０μｌ（５０ｍ
ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣ
ｌ₂、０．１ｍＭＤＴＥ、２８．８７５μＭＤＩＧ
−ｄＵＴＰ、１．４４４μＭｂｉｏ−１６−ｄＵＴ
Ｐ、９５．８６５μＭｄＴＴＰ、２０μＭｄＡＴ
Ｐ、２０μＭｄＣＴＰ、２０μＭｄＧＴＰ、１μｇ
ｐＢＲ３２２、１ｐｇＤＮａｓｅＩ）の試験容量にお
いて行った。試料（１μｌ）を添加した後、反応混合物
を３７℃で３０分間インキュベートした。その後、スト
レプトアビジンをコートしたマイクロタイタープレート
に反応混合物を移した。次の処理および試験の評価を
「逆転写酵素アッセイ非放射性」（Roche Molecular Bi
ochemicals、カタログ番号１４６８１２０）と同様に行
った。

【００４７】５．４．夾雑活性の試験夾雑外来活性の存在についての試験を、１０ｍＭＴｒ
ｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１
ｍＭＤＴＥからなる溶液中にて行った。

【００４８】個々の酵素画分の適当な試料を対応する核
酸とともにインキュベートした。いわゆるニッキング活
性を、プラスミドｐＢＲ３２２（１μｇ）とともに２〜
１６時間３７℃でインキュベートすることにより検出し
た。非特異的（unspecific）ヌクレアーゼを、λ−ＤＮ
Ａ／ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（１μｇ）とともに２
〜１６時間３７℃でインキュベートすることにより検出
した。非特異的ＲＮａｓｅは、ＭＳＩＩ−ＲＮＡ（５μ
ｇ）とともに２〜４時間３７℃でインキュベートするこ
とにより検出した。

【００４９】エキソヌクレアーゼによる夾雑を試験する
ため、試料を、４μｇの［３Ｈ］標識ＤＮＡとともに３
７℃で４時間インキュベートし、その後、放出された
［３Ｈ］標識ヌクレオチドを測定した。

【００５０】実施例６：精製および機能試験６．１．大腸菌ＬＥ３９２ｐＡＭＶ−α_lacIq-Arg／
ｐＡＭＶ−β_dnaY-His構築物由来ＡＭＶ−ＲＴ６．１．１．精製ＡＭＶ−ＲＴの両鎖（上記参照）を過剰発現する大腸菌
細胞を出発原料として用い、組換えＡＭＶ−ＲＴを精製
した。

【００５１】ＡＭＶ−ＲＴを４℃で精製した。精製を、
細胞溶解後のクロマトグラフィー法および核酸の分離に
より行なった。精製工程により、夾雑酵素活性がなく、
ＲＴ−ＰＣＲにおいて天然物から精製したＡＭＶ−ＲＴ
と同じ機能性を有する組換えＡＭＶ−ＲＴが生じる。

【００５２】バッファー：バッファーＡ：５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．
９、０．５ＭＫＣｌ、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−
１００、２０％グリセロール、バッファーＢ：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．
９、０．２５ＭＫＣｌ、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００、１０％グリセロール、バッファーＣ：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．
９、０．２５ＭＫＣｌ、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００、１０％グリセロール、１Ｍイミダゾール、バッファーＤ：５０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ８．
２、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．０２
％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、バッファーＥ：２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．１、
０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、０．０２％Ｔ
ｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、保存バッファー：２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．
２、２ｍＭＤＴＴ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、５０％グリセロール

【００５３】細胞溶解：２００ｍｌバッファーＡを、解
凍および懸濁させた大腸菌ＬＥ３９２細胞（ｐＡＭＶ−
α_lacIq-Arg／ｐＡＭＶ−β_dnaY-His）約５０ｇに添加
した。２錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（Roche Molecular Bioc
hemicals、カタログ番号１６９７４９８）を懸濁液に加
えた。続いて、冷却（温度：＜１０℃）しながら細胞を
超音波（Branson sonicator ）により溶解した。達成さ
れた細胞懸濁液の溶解程度は典型的には４０〜５０％で
あった。

【００５４】核酸の沈殿：その後、核酸をポリミン（po
lymin ）沈殿により除去した。５ｍｌの１０％ポリミン
Ｐ溶液を滴下した。沈殿が不完全な場合、さらなる滴下
を行った。３０分間４℃でのインキュベーション後、遠
心分離を行った（３０分間、１３０００ｒｐｍ、４
℃）。

【００５５】クロマトグラフィー精製：Ｎｉキレートカラムでのアフィニティークロマトグラフ
ィー：清澄な遠心分離上清みを、バッファーＢ（１＋
１）で希釈し、バッファーＢで平衡化しておいたニッケ
ル負荷キレートセファロースｆｆカラム（２．６ｃｍ×
１０ｃｍ、Pharmacia ）に吸収させ、次いで、それを約
５００ｍｌのバッファーＢ、その後２００ｍｌのバッフ
ァーＢ＋１０ｍＭイミダゾールおよび２００ｍｌのバッ
ファーＢ＋２０ｍＭイミダゾールで洗浄した。全容量５
００ｍｌで、バッファーＢ＋２０ｍＭイミダゾールおよ
びバッファーＣの直線勾配によって酵素を溶出した。流
速は１分あたり５ｍｌであり、画分サイズは画分あたり
２０ｍｌであった。酵素は５０ｍＭ〜２００ｍＭの間で
溶出された。活性画分のプールをバッファーＤに対して
透析した。

【００５６】ヘパリン−セファロースでのクロマトグラ
フィー：続いて、透析したプールを、バッファーＤで平
衡化したヘパリン−セファロースｆｆカラム（１．６ｃ
ｍ×１０ｃｍ、Pharmacia ）に吸収させ、約２００ｍｌ
のバッファーＤ、次いで約２００ｍｌのバッファーＤ＋
３００ｍＭＫＣｌで洗浄した。全容量２００ｍｌで、
バッファーＤ＋３００ｍＭＫＣｌからバッファーＤ＋
１ＭＫＣｌの直線勾配によって酵素を溶出した。流速
は１分あたり２．５ｍｌであり、画分サイズは１０ｍｌ
であった。ＡＭＶ−ＲＴは５００ｍＭ〜７００ｍＭのＫ
Ｃｌ濃度で溶出された。

【００５７】Ｓ−セファロースｆｆでのクロマトグラフ
ィー：ＲＴ−活性画分をプールし、バッファーＥに対し
て透析した。バッファーＥで平衡化したＳ−セファロー
スｆｆカラム（１．６ｃｍ×１０ｃｍ、Pharmacia ）に
透析物を負荷した。約２００ｍｌのバッファーＥで洗浄
した後、全容量４００ｍｌで、バッファーＥからバッフ
ァーＥ＋１ＭＫＣｌの直線勾配によって酵素を溶出し
た。流速は１分あたり２．５ｍｌであり、画分サイズは
１０ｍｌであった。

【００５８】ヒドロキシアパタイトでのクロマトグラフ
ィー：ＲＴ−活性画分をプールし、バッファーＥに対し
て透析した。バッファーＥで平衡化したＨＡ−ｕｌｔｒ
ｏｇｅｌカラム（１．６ｃｍ×１０ｃｍ、Biosepra）に
透析物を負荷した。約２００ｍｌのバッファーＥで洗浄
した後、全容量４００ｍｌで、バッファーＥからバッフ
ァーＥ＋０．５Ｍリン酸カリウムの直線勾配によって
酵素を溶出した。流速は１分あたり２．５ｍｌであり、
画分サイズは１０ｍｌであった。

【００５９】ＲＴ−活性画分をプールし、保存バッファ
ーに対して透析した。ＳＤＳおよびβ−メルカプロエタ
ノールを含有する負荷用バッファーを精製タンパク質に
添加し、試料を煮沸（５分間、１００℃）により変性さ
せた。続いて、２０μｌのアリコートを解析用ＳＤＳゲ
ル（４〜２０％）（Laemmli UK., 1970, Nature 227:55
5-557）により解析した。ＡＭＶ−ＲＴのα−サブユニ
ットおよびβ−サブユニットが当モル比で見出された。

【００６０】記載の方法により、安定なＡＭＶ−ＲＴ
が、α−サブユニットおよびβ−サブユニットの等モル
分布を伴って生じる。得られた酵素はＲＴ−ＰＣＲにお
いて機能性である。

【００６１】６．１．２．ＲＴ−ＰＣＲにおける機能性
試験得られた組換えＡＭＶ逆転写酵素を、機能性試験におい
て調べた。機能性試験は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）と組み合わせた逆転写（ＲＴ）から構成された。こ
のため、５単位の組換えＡＭＶ逆転写酵素を、Ｔｉｔａ
ｎＴＭＯｎｅＴｕｂｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ
（カタログ番号１８８８３８２、Roche Molecular Bioc
hemicals）の酵素混合物のように使用した。ヒトジスト
ロフィン遺伝子の１．８ｋｂフラグメントを増幅した。
１０ｎｇのヒト筋肉ＲＮＡを鋳型として用いた。プライ
マー（４００ｎＭ）は、Ｄｙｓプライマー２ｒｅＶ
（５’ＧＡＧＴＧＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＧＣ
ＣＣＡＴＧＧＡＴＴＧ−３）およびＤｙｓプライ
マー８ｆｏｒ（５’−ＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧ
ＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＧ−
３’）であった。標的を、以下のプログラム：５０℃で
３０分、９４℃で２分、続いて１０サイクル（９４℃で
１０秒、５８℃で３０秒、６８℃で１分１０秒）および
２０サイクル（９４℃で１０秒、５８℃で３０秒、６８
℃で１分１０秒；＋１０秒／サイクル）を用いてＲＴ−
ＰＣＲにより増幅した。続いて、それを６８℃で７分間
インキュベートした。１％アガロースゲルで反応を停止
させた後、ＲＴ−ＰＣＲの反応産物を分離した（図
１）。

【００６２】図１は、天然精製ＡＭＶ−ＲＴ（レーン
２）および組換え手段により得られたＡＭＶ−ＲＴ（レ
ーン３）を用いて得られた１．８ｋｂのサイズのＲＴ−
ＰＣＲ増幅産物を示す。レーン１および４は、ＤＮＡ分
子量マーカーＶＩ（カタログ番号１０６２５９０、Roch
e Molecular Biochemicals）を示す。

【００６３】６．２．大腸菌ＬＥ３９２ｐＡＭＶαβ
−４＋ｐＣＨＡＰ−５構築物由来ＡＭＶ−ＲＴ６．２．１．精製ＡＭＶ−ＲＴの両鎖（上記参照）を過剰発現する大腸菌
ＬＥ３９２ｐＡＭＶαβ−４＋ｐＣＨＡＰ−５細胞を
出発原料として用い、組換えＡＭＶ−ＲＴを精製した。

【００６４】ＡＭＶ−ＲＴは４℃で精製した。精製は、
細胞溶解後のクロマトグラフィー法および核酸の分離に
より行なった。精製工程により、夾雑酵素活性がなく、
ＲＴ−ＰＣＲにおいて天然物から精製したＡＭＶ−ＲＴ
と同じ機能性を有する組換えＡＭＶ−ＲＴが生じる。

【００６５】バッファー：バッファーＡ：５０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．２、１
ＭＮａＣｌ、３ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、バッファーＢ：５０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ５．０、１
ＭＮａＣｌ、３ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、バッファーＣ：５０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ６．０、１
ＭＮａＣｌ、３ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、０．２Ｍイミダゾール、バッファーＤ：５０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ７．７、１
ＭＮａＣｌ、３ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０
％グリセロール、０．５ＭイミダゾールバッファーＥ：５０ｍＭＮａＰＯ₄、ｐＨ６．０、３
ｍＭ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロー
ル、保存バッファー：２００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．
２、２ｍＭＤＴＴ、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０、５０％グリセロール

【００６６】細胞溶解：約５０ｇの大腸菌ＬＥ３９２
ｐＡＭＶ−αβ−４＋ｐＣＨＡＰ−５細胞を４００ｍｌ
のバッファーＡと混合し、解凍し、懸濁した。２錠のＣ
ｏｍｐｌｅｔｅ（Roche Molecular Biochemicals、カタ
ログ番号１６９７４９８）を懸濁液に加えた。続いて、
冷却（温度：＜１０℃）しながら細胞を超音波（Branso
n sonicator ）により溶解した。達成された細胞懸濁液
の溶解程度は典型的には４０〜５０％であった。

【００６７】核酸の沈殿：その後、核酸をポリミン沈殿
により除去した。５ｍｌの１０％ポリミンＰ溶液を滴下
した。沈殿が不完全な場合、さらなる滴下を行った。３
０分間４℃でのインキュベーション後、遠心分離を行っ
た（３０分間、１３０００ｒｐｍ、４℃）。

【００６８】クロマトグラフィー精製：Ｎｉキレートカ
ラムでのアフィニティークロマトグラフィー：清澄な遠
心分離上清みを、バッファーＡで平衡化しておいたニッ
ケル負荷キレートセファロースｆｆカラム（２．６ｃｍ
×１０ｃｍ、Pharmacia ）に吸収させ、次いで、それを
約５００ｍｌのバッファーＡ、その後５００ｍｌのバッ
ファーＢおよび５００ｍｌのバッファーＣで洗浄した。
全容量５００ｍｌのバッファーＤによって酵素を溶出し
た。流速は１分あたり５ｍｌであり、画分サイズは画分
あたり２０ｍｌであった。活性画分のプールをバッファ
ーＥに対して透析した。

【００６９】ヘパリン−セファロースでのクロマトグラ
フィー：続いて、透析したプールを、バッファーＥ＋２
５０ｍＭＮａＣｌで平衡化したヘパリン−セファロー
スｆｆカラム（１．６ｃｍ×１０ｃｍ、Pharmacia ）に
吸収させ、約２００ｍｌのバッファーＥ＋２５０ｍＭ
ＮａＣｌで洗浄した。全容量２００ｍｌで、バッファー
Ｅ＋２５０ｍＭＮａＣｌからバッファーＥ＋１ＭＮ
ａＣｌの直線勾配によって酵素を溶出した。流速は１分
あたり２．５ｍｌであり、画分サイズは１０ｍｌであっ
た。ＡＭＶ−ＲＴは５００ｍＭ〜７００ｍＭのＮａＣｌ
濃度で溶出された。

【００７０】ＲＴ−活性画分をプールし、保存バッファ
ーに対して透析した。ＳＤＳおよびβ−メルカプロエタ
ノールを含有する負荷用バッファーを精製タンパク質に
添加し、試料を煮沸（５分間、１００℃）により変性さ
せた。続いて、２０μｌのアリコートを解析用ＳＤＳゲ
ル（４〜２０％）（Laemmli UK., 1970, Nature 227:55
5-557）により解析した。ＡＭＶ−ＲＴのα−サブユニ
ットおよびβ−サブユニットが当モル比で見出された
（図２、レーン６）。

【００７１】図２はＡＭＶ−ＲＴ精製由来の試料を用い
たＳＤＳゲルを示す。レーン１：分子量マーカーレーン２：天然ＡＭＶレーン３：細胞溶解レーン４：Ｎｉ−キレートセファロース、バッファーＣ
で洗浄レーン５：Ｎｉ−キレートプールレーン６：組換え（ｒｅｃ．）ＡＭＶ−ＲＴ最終調製物

【００７２】記載の方法により、安定なＡＭＶ−ＲＴ
が、α−サブユニットおよびβ−サブユニットの当モル
分布を伴って生じる。得られた酵素はＲＴ−ＰＣＲにお
いて機能性である。

【００７３】６．２．２．ＲＴ−ＰＣＲにおける機能性
試験得られた組換えＡＭＶ逆転写酵素を、機能性試験におい
て調べた。機能性試験は、逆転写（ＲＴ）、続くポリメ
ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）から構成された。１０ｕｎｉ
ｔの組換えＡＭＶ逆転写酵素をこれに用いた。ヒトジス
トロフィン遺伝子の８ｋｂ、１０ｋｂ、１２ｋｂおよび
１３．５ｋｂフラグメントを増幅した。

【００７４】１μｇのヒト筋肉ＲＮＡを鋳型として用い
た。プライマー（４００ｎＭ）は、８ｋｂでは、Ｄｙｓ
プライマー２ｆｏｒ（５’−ＣＡＡＴＣＣＡＴＧ
ＧＧＣＡＡＡＣＴＧＴＡＴＴＣＡＣＴＣ−
３’）およびＤｙｓプライマー５ｒｅｖ（５’−ＣＧＴ
ＣＣＣＧＴＡＴＣＡＴＡＡＡＣＡＴＴＣＡ
ＧＣＡＧＣ−３’）、１０ｋｂでは、Ｄｙｓプライマ
ー８ｆｏｒ（５’−ＡＡＧＡＡＧＴＡＧＡＧＧ
ＡＣＴＧＴＴＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡ−
３’）および５ｒｅｖ、１２ｋｂでは、Ｄｙｓプライマ
ー８ｆｏｒおよびＤｙｓプライマー９ｒｅｖ（５’−Ａ
ＧＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＧＡＣ
ＴＧＡＣＴＡＧＡＡＧ−３’）、および１３．５
ｋｂでは、Ｄｙｓプライマー８ｆｏｒおよび１０ｒｅｖ
（５’−ＡＡＴＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＡＣＣ
ＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＴＣＴＧ−３’）であっ
た。ｃＤＮＡ合成を４２℃で６０分間行なった。

【００７５】ｃＤＮＡ合成を、ＡＭＶ逆転写酵素（カタ
ログ番号１４９５０６２、Roche Molecular Biochemica
ls）の製品情報の指示書に従って行った。

【００７６】ＥｘｐａｎｄＬｏｎｇＴｅｍｐｌａｔ
ｅＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（カタログ番号１６８１８３
４、Roche Molecular Biochemicals）をＰＣＲに使用し
た。以下のＰＣＲプログラム：９４℃で２分、続いて１
０サイクル（９４℃で１０秒、６０℃で３０秒、６８℃
で１０分）および２０サイクル（９４℃で１０秒、６０
℃で３０秒、６８℃で１０分１０＋１０秒／サイク
ル）を用いて標的を増幅した。続いて、それを６８℃で
５分間インキュベートした。反応を停止させた後、ＲＴ
−ＰＣＲの反応産物を１％アガロースゲルで分離した
（図３）。レーン３およびレーン６は、ＤＮＡ分子量マ
ーカーＸ（カタログ番号１４９８０３７、Roche Molecu
lar Biochemicals）を示す。

【００７７】図３は、組換えＡＭＶ−ＲＴを用いたＲＴ
−ＰＣＲの反応産物が分離されたアガロースゲルを示
す；レーン１：８ｋｂ増幅産物、レーン２：１０ｋｂ増
幅産物、レーン３：ＤＮＡ長標準Ｘ、レーン４：１２ｋ
ｂ増幅産物、レーン５：１３．５ｋｂ増幅産物、レーン
６：ＤＮＡ長標準Ｘ。

【００７８】配列フリーテキスト配列番号：１は、ＡＭＶ−ＲＴのβ鎖のヌクレオチド配
列に基づき設計されたプライマーの配列である。

【００７９】配列番号：２は、ＡＭＶ−ＲＴのβ鎖のヌ
クレオチド配列に基づき設計されたプライマーの配列で
ある。

【００８０】配列番号：３は、ＡＭＶ−ＲＴのα鎖のヌ
クレオチド配列に基づき設計されたプライマーの配列で
ある。

【００８１】配列番号：８は、ＡＭＶ−ＲＴのα鎖のヌ
クレオチド配列に基づき設計されたプライマーの配列で
ある。

【００８２】配列番号：９は、ＡＭＶ−ＲＴのβ鎖のヌ
クレオチド配列に基づき設計されたプライマーの配列で
ある。

【００８３】配列番号：１１は、大腸菌ＬＥ３９２のｔ
ｒｐＴ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計されたプ
ライマーの配列である。

【００８４】配列番号：１２は、大腸菌ＬＥ３９２のｔ
ｒｐＴ遺伝子のヌクレオチド配列に基づき設計されたプ
ライマーの配列である。

【００８５】配列番号：１５は、大腸菌のｄｎａＫＪオ
ペロンのヌクレオチド配列に基づき設計されたプライマ
ーの配列である。

【００８６】配列番号：１６は、大腸菌のｄｎａＫＪオ
ペロンのヌクレオチド配列に基づき設計されたプライマ
ーの配列である。

【００８７】配列番号：１８は、大腸菌のｇｒｐＥ遺伝
子のヌクレオチド配列に基づき設計されたプライマーの
配列である。

【００８８】配列番号：１９は、大腸菌のｇｒｐＥ遺伝
子のヌクレオチド配列に基づき設計されたプライマーの
配列である。

【００８９】配列番号：２１は、大腸菌のｃｌｐＢ遺伝
子のヌクレオチド配列に基づき設計されたプライマーの
配列である。

【００９０】配列番号：２２は、大腸菌のｃｌｐＢ遺伝
子のヌクレオチド配列に基づき設計されたプライマーの
配列である。

【００９１】

【発明の効果】本発明によれば、原核細胞においてＡＭ
Ｖ−ＲＴのαサブユニットおよびβサブユニットを発現
させることにより、充分な量の組換え活性ヘテロダイマ
ーＡＭＶ−ＲＴを得ることができる。

【００９２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F.HOFFMANN-LA ROCHE AG <120> Method for producing an active heterodimeric AMV-RT in prokaryotic cells <130> ROC-01-006 <150> DE 100 46 960.4 <151> 2000-09-22 <160> 22 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of β-chain of AMV-RT <400> 1 gatgactgga attcatgact gttgcgctac atctggct 38

【００９３】 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of β-chain of AMV-RT <400> 2 gatgactgct gcagttatta tgcaaaaaga gggctcgcct 40

【００９４】 <210> 3 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of α-chain of AMV-RT <400> 3 gatgactgct gcagttatta atacgcttga aaggtggctt g 41

【００９５】 <210> 4 <211> 1716 <212> DNA <213> Avian Myeloblastosis Virus <400> 4 actgttgcgc tacatctggc tattccgctc aaatggaagc caaaccacac gcctgtgtgg 60 attgaccagt ggccccttcc tgaaggtaaa cttgtagcgc taacgcaatt agtggaaaaa 120 gaattacagt taggacatat agaaccttca cttagttgct ggaacacacc tgtctttgtg 180 atccggaagg cttccgggtc ttatcgctta ttgcatgact tgcgcgctgt taacgctaag 240 cttgttcctt ttggggccgt ccaacagggg gcgccggttc tctccgcgct cccgcgtggc 300 tggcccctga tggtcctaga cctcaaggat tgcttctttt ctattcctct tgcggaacaa 360 gatcgcgaag cttttgcatt tacgctcccc tctgtgaata accaggcccc cgctcgaaga 420 ttccaatgga aggtcttgcc ccaagggatg acctgttctc ccactatctg tcagttgata 480 gtgggtcaaa tacttgagcc cttgcgactc aagcacccat ctctgcgcat gttgcattat 540 atggatgatc ttttgctagc cgcctcaagt catgatgggt tggaagcggc aggggaggag 600 gttatcagta cattggaaag agccgggttc accatttcgc ctgataaggt ccagagggag 660 cccggagtac aatatcttgg gtacaagtta ggcagtacgt atgtagcacc cgtaggcctg 720 gtagcagaac ccaggatagc caccttgtgg gatgttcaga agctggtggg gtcacttcag 780 tggcttcgcc cagcgctagg aatcccgcct cgactgatgg gcccctttta tgagcagtta 840 cgagggtcag atcctaacga ggcgagggaa tggaatctag acatgaaaat ggcctggaga 900 gagatcgtgc agctcagcac cactgctgcc ttggaacgat gggaccctgc cctgcctctg 960 gaaggagcgg tcgctagatg tgaacagggg gcaatagggg tcctgggaca gggactgtcc 1020 acacacccaa ggccatgttt gtggttattc tccacccaac ccaccaaggc gtttactgct 1080 tggttagaag tgctcaccct tttgattact aagctacgtg cttcggcagt gcgaaccttt 1140 ggcaaggagg ttgatatcct cctgttgcct gcatgctttc gggaggacct tccgctcccg 1200 gaggggatcc tgttagccct tagggggttt gcaggaaaaa tcaggagtag tgacacgcca 1260 tctatttttg acattgcgcg tccactgcat gtttctctga aagtgagggt taccgaccac 1320 cctgtaccgg gacccactgt ctttaccgac gcctcctcaa gcacccataa gggggtggta 1380 gtctggaggg agggcccaag gtgggagata aaagaaatag ctgatttggg ggcaagtgta 1440 caacaactgg aagcacgcgc tgtggccatg gcacttctgc tgtggccgac aacgcccact 1500 aatgtagtga ctgactctgc gtttgttgcg aaaatgttac tcaagatggg gcaggaggga 1560 gtcccgtcta cagcggcggc ttttatttta gaggatgcgt taagccaaag gtcagccatg 1620 gccgccgttc tccacgtgcg gagtcattct gaggtgccag ggtttttcac agaaggaaat 1680 gacgtggcag atagccaagc cacctttcaa gcgtat 1716

【００９６】 <210> 5 <211> 2574 <212> DNA <213> Avian Myeloblastosis Virus <400> 5 actgttgcgc tacatctggc tattccgctc aaatggaagc caaaccacac gcctgtgtgg 60 attgaccagt ggccccttcc tgaaggtaaa cttgtagcgc taacgcaatt agtggaaaaa 120 gaattacagt taggacatat agaaccttca cttagttgct ggaacacacc tgtctttgtg 180 atccggaagg cttccgggtc ttatcgctta ttgcatgact tgcgcgctgt taacgctaag 240 cttgttcctt ttggggccgt ccaacagggg gcgccggttc tctccgcgct cccgcgtggc 300 tggcccctga tggtcctaga cctcaaggat tgcttctttt ctattcctct tgcggaacaa 360 gatcgcgaag cttttgcatt tacgctcccc tctgtgaata accaggcccc cgctcgaaga 420 ttccaatgga aggtcttgcc ccaagggatg acctgttctc ccactatctg tcagttgata 480 gtgggtcaaa tacttgagcc cttgcgactc aagcacccat ctctgcgcat gttgcattat 540 atggatgatc ttttgctagc cgcctcaagt catgatgggt tggaagcggc aggggaggag 600 gttatcagta cattggaaag agccgggttc accatttcgc ctgataaggt ccagagggag 660 cccggagtac aatatcttgg gtacaagtta ggcagtacgt atgtagcacc cgtaggcctg 720 gtagcagaac ccaggatagc caccttgtgg gatgttcaga agctggtggg gtcacttcag 780 tggcttcgcc cagcgctagg aatcccgcct cgactgatgg gcccctttta tgagcagtta 840 cgagggtcag atcctaacga ggcgagggaa tggaatctag acatgaaaat ggcctggaga 900 gagatcgtgc agctcagcac cactgctgcc ttggaacgat gggaccctgc cctgcctctg 960 gaaggagcgg tcgctagatg tgaacagggg gcaatagggg tcctgggaca gggactgtcc 1020 acacacccaa ggccatgttt gtggttattc tccacccaac ccaccaaggc gtttactgct 1080 tggttagaag tgctcaccct tttgattact aagctacgtg cttcggcagt gcgaaccttt 1140 ggcaaggagg ttgatatcct cctgttgcct gcatgctttc gggaggacct tccgctcccg 1200 gaggggatcc tgttagccct tagggggttt gcaggaaaaa tcaggagtag tgacacgcca 1260 tctatttttg acattgcgcg tccactgcat gtttctctga aagtgagggt taccgaccac 1320 cctgtaccgg gacccactgt ctttaccgac gcctcctcaa gcacccataa gggggtggta 1380 gtctggaggg agggcccaag gtgggagata aaagaaatag ctgatttggg ggcaagtgta 1440 caacaactgg aagcacgcgc tgtggccatg gcacttctgc tgtggccgac aacgcccact 1500 aatgtagtga ctgactctgc gtttgttgcg aaaatgttac tcaagatggg gcaggaggga 1560 gtcccgtcta cagcggcggc ttttatttta gaggatgcgt taagccaaag gtcagccatg 1620 gccgccgttc tccacgtgcg gagtcattct gaagtgccag ggtttttcac agaaggaaat 1680 gacgtggcag atagccaagc cacctttcaa gcgtatccct tgagagaggc taaagatctc 1740 cataccgctc tccatatcgg accccgcgcg ctatccaaag cgtgtaatat atctatgcag 1800 caggctaggg aggttgttca gacctgcccg cattgtaatt cagcccctgc gttggaggcc 1860 ggggtaaacc ctaggggttt gggaccccta cagatatggc agacagactt tacactagag 1920 cctagaatgg ctccccgttc ctggctcgct gttactgtgg ataccgcctc atctgcgata 1980 gtcgtaactc agcatggccg tgtcacatcg gttgctgcac aacatcattg ggccacggct 2040 atcgccgttt tgggaagacc aaaggccata aaaacagata atgggtcctg cttcacgtct 2100 aaatccacgc gagagtggct cgcgagatgg gggatagcac acaccaccgg gattccgggt 2160 aattcccagg gtcaagctat ggtagagcgg gccaaccggc tcctgaaaga taagatccgt 2220 gtgcttgcgg agggggatgg ctttatgaaa agaatcccca ccagcaaaca gggggaacta 2280 ttagccaagg caatgtatgc ccttaatcac tttgagcgtg gtgaaaacac aaaaacaccg 2340 atacaaaaac actggagacc taccgttctt acagaaggac ccccggttaa aatacgaata 2400 gagacagggg agtgggaaaa aggatggaac gtgctggtct ggggacgagg ttatgcagct 2460 gtgaaaaaca gggacactga taaggttatt tgggtaccct ctcgaaaagt taaaccggac 2520 atcgcccaaa aggatgaggt gactaagaaa gatgaggcga gccctctttt tgca 2574

【００９７】 <210> 6 <211> 572 <212> PRT <213> Avian Myeloblastosis Virus <400> 6 Thr Val Ala Leu His Leu Ala Ile Pro Leu Lys Trp Lys Pro Asn His 1 5 10 15 Thr Pro Val Trp Ile Asp Gln Trp Pro Leu Pro Glu Gly Lys Leu Val 20 25 30 Ala Leu Thr Gln Leu Val Glu Lys Glu Leu Gln Leu Gly His Ile Glu 35 40 45 Pro Ser Leu Ser Cys Trp Asn Thr Pro Val Phe Val Ile Arg Lys Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Leu His Asp Leu Arg Ala Val Asn Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Pro Phe Gly Ala Val Gln Gln Gly Ala Pro Val Leu Ser Ala 85 90 95 Leu Pro Arg Gly Trp Pro Leu Met Val Leu Asp Leu Lys Asp Cys Phe 100 105 110 Phe Ser Ile Pro Leu Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ala Phe Ala Phe Thr 115 120 125 Leu Pro Ser Val Asn Asn Gln Ala Pro Ala Arg Arg Phe Gln Trp Lys 130 135 140 Val Leu Pro Gln Gly Met Thr Cys Ser Pro Thr Ile Cys Gln Leu Ile 145 150 155 160 Val Gly Gln Ile Leu Glu Pro Leu Arg Leu Lys His Pro Ser Leu Arg 165 170 175 Met Leu His Tyr Met Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser His Asp 180 185 190 Gly Leu Glu Ala Ala Gly Glu Glu Val Ile Ser Thr Leu Glu Arg Ala 195 200 205 Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Lys Val Gln Arg Glu Pro Gly Val Gln 210 215 220 Tyr Leu Gly Tyr Lys Leu Gly Ser Thr Tyr Val Ala Pro Val Gly Leu 225 230 235 240 Val Ala Glu Pro Arg Ile Ala Thr Leu Trp Asp Val Gln Lys Leu Val 245 250 255 Gly Ser Leu Gln Trp Leu Arg Pro Ala Leu Gly Ile Pro Pro Arg Leu 260 265 270 Met Gly Pro Phe Tyr Glu Gln Leu Arg Gly Ser Asp Pro Asn Glu Ala 275 280 285 Arg Glu Trp Asn Leu Asp Met Lys Met Ala Trp Arg Glu Ile Val Gln 290 295 300 Leu Ser Thr Thr Ala Ala Leu Glu Arg Trp Asp Pro Ala Leu Pro Leu 305 310 315 320 Glu Gly Ala Val Ala Arg Cys Glu Gln Gly Ala Ile Gly Val Leu Gly 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Thr His Pro Arg Pro Cys Leu Trp Leu Phe Ser Thr 340 345 350 Gln Pro Thr Lys Ala Phe Thr Ala Trp Leu Glu Val Leu Thr Leu Leu 355 360 365 Ile Thr Lys Leu Arg Ala Ser Ala Val Arg Thr Phe Gly Lys Glu Val 370 375 380 Asp Ile Leu Leu Leu Pro Ala Cys Phe Arg Glu Asp Leu Pro Leu Pro 385 390 395 400 Glu Gly Ile Leu Leu Ala Leu Arg Gly Phe Ala Gly Lys Ile Arg Ser 405 410 415 Ser Asp Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ile Ala Arg Pro Leu His Val Ser 420 425 430 Leu Lys Val Arg Val Thr Asp His Pro Val Pro Gly Pro Thr Val Phe 435 440 445 Thr Asp Ala Ser Ser Ser Thr His Lys Gly Val Val Val Trp Arg Glu 450 455 460 Gly Pro Arg Trp Glu Ile Lys Glu Ile Ala Asp Leu Gly Ala Ser Val 465 470 475 480 Gln Gln Leu Glu Ala Arg Ala Val Ala Met Ala Leu Leu Leu Trp Pro 485 490 495 Thr Thr Pro Thr Asn Val Val Thr Asp Ser Ala Phe Val Ala Lys Met 500 505 510 Leu Leu Lys Met Gly Gln Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Phe 515 520 525 Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ser Gln Arg Ser Ala Met Ala Ala Val Leu 530 535 540 His Val Arg Ser His Ser Glu Val Pro Gly Phe Phe Thr Glu Gly Asn 545 550 555 560 Asp Val Ala Asp Ser Gln Ala Thr Phe Gln Ala Tyr 565 570

【００９８】 <210> 7 <211> 858 <212> PRT <213> Avian Myeloblastosis Virus <400> 7 Thr Val Ala Leu His Leu Ala Ile Pro Leu Lys Trp Lys Pro Asn His 1 5 10 15 Thr Pro Val Trp Ile Asp Gln Trp Pro Leu Pro Glu Gly Lys Leu Val 20 25 30 Ala Leu Thr Gln Leu Val Glu Lys Glu Leu Gln Leu Gly His Ile Glu 35 40 45 Pro Ser Leu Ser Cys Trp Asn Thr Pro Val Phe Val Ile Arg Lys Ala 50 55 60 Ser Gly Ser Tyr Arg Leu Leu His Asp Leu Arg Ala Val Asn Ala Lys 65 70 75 80 Leu Val Pro Phe Gly Ala Val Gln Gln Gly Ala Pro Val Leu Ser Ala 85 90 95 Leu Pro Arg Gly Trp Pro Leu Met Val Leu Asp Leu Lys Asp Cys Phe 100 105 110 Phe Ser Ile Pro Leu Ala Glu Gln Asp Arg Glu Ala Phe Ala Phe Thr 115 120 125 Leu Pro Ser Val Asn Asn Gln Ala Pro Ala Arg Arg Phe Gln Trp Lys 130 135 140 Val Leu Pro Gln Gly Met Thr Cys Ser Pro Thr Ile Cys Gln Leu Ile 145 150 155 160 Val Gly Gln Ile Leu Glu Pro Leu Arg Leu Lys His Pro Ser Leu Arg 165 170 175 Met Leu His Tyr Met Asp Asp Leu Leu Leu Ala Ala Ser Ser His Asp 180 185 190 Gly Leu Glu Ala Ala Gly Glu Glu Val Ile Ser Thr Leu Glu Arg Ala 195 200 205 Gly Phe Thr Ile Ser Pro Asp Lys Val Gln Arg Glu Pro Gly Val Gln 210 215 220 Tyr Leu Gly Tyr Lys Leu Gly Ser Thr Tyr Val Ala Pro Val Gly Leu 225 230 235 240 Val Ala Glu Pro Arg Ile Ala Thr Leu Trp Asp Val Gln Lys Leu Val 245 250 255 Gly Ser Leu Gln Trp Leu Arg Pro Ala Leu Gly Ile Pro Pro Arg Leu 260 265 270 Met Gly Pro Phe Tyr Glu Gln Leu Arg Gly Ser Asp Pro Asn Glu Ala 275 280 285 Arg Glu Trp Asn Leu Asp Met Lys Met Ala Trp Arg Glu Ile Val Gln 290 295 300 Leu Ser Thr Thr Ala Ala Leu Glu Arg Trp Asp Pro Ala Leu Pro Leu 305 310 315 320 Glu Gly Ala Val Ala Arg Cys Glu Gln Gly Ala Ile Gly Val Leu Gly 325 330 335 Gln Gly Leu Ser Thr His Pro Arg Pro Cys Leu Trp Leu Phe Ser Thr 340 345 350 Gln Pro Thr Lys Ala Phe Thr Ala Trp Leu Glu Val Leu Thr Leu Leu 355 360 365 Ile Thr Lys Leu Arg Ala Ser Ala Val Arg Thr Phe Gly Lys Glu Val 370 375 380 Asp Ile Leu Leu Leu Pro Ala Cys Phe Arg Glu Asp Leu Pro Leu Pro 385 390 395 400 Glu Gly Ile Leu Leu Ala Leu Arg Gly Phe Ala Gly Lys Ile Arg Ser 405 410 415 Ser Asp Thr Pro Ser Ile Phe Asp Ile Ala Arg Pro Leu His Val Ser 420 425 430 Leu Lys Val Arg Val Thr Asp His Pro Val Pro Gly Pro Thr Val Phe 435 440 445 Thr Asp Ala Ser Ser Ser Thr His Lys Gly Val Val Val Trp Arg Glu 450 455 460 Gly Pro Arg Trp Glu Ile Lys Glu Ile Ala Asp Leu Gly Ala Ser Val 465 470 475 480 Gln Gln Leu Glu Ala Arg Ala Val Ala Met Ala Leu Leu Leu Trp Pro 485 490 495 Thr Thr Pro Thr Asn Val Val Thr Asp Ser Ala Phe Val Ala Lys Met 500 505 510 Leu Leu Lys Met Gly Gln Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala Ala Ala Phe 515 520 525 Ile Leu Glu Asp Ala Leu Ser Gln Arg Ser Ala Met Ala Ala Val Leu 530 535 540 His Val Arg Ser His Ser Glu Val Pro Gly Phe Phe Thr Glu Gly Asn 545 550 555 560 Asp Val Ala Asp Ser Gln Ala Thr Phe Gln Ala Tyr Pro Leu Arg Glu 565 570 575 Ala Lys Asp Leu His Thr Ala Leu His Ile Gly Pro Arg Ala Leu Ser 580 585 590 Lys Ala Cys Asn Ile Ser Met Gln Gln Ala Arg Glu Val Val Gln Thr 595 600 605 Cys Pro His Cys Asn Ser Ala Pro Ala Leu Glu Ala Gly Val Asn Pro 610 615 620 Arg Gly Leu Gly Pro Leu Gln Ile Trp Gln Thr Asp Phe Thr Leu Glu 625 630 635 640 Pro Arg Met Ala Pro Arg Ser Trp Leu Ala Val Thr Val Asp Thr Ala 645 650 655 Ser Ser Ala Ile Val Val Thr Gln His Gly Arg Val Thr Ser Val Ala 660 665 670 Ala Gln His His Trp Ala Thr Ala Ile Ala Val Leu Gly Arg Pro Lys 675 680 685 Ala Ile Lys Thr Asp Asn Gly Ser Cys Phe Thr Ser Lys Ser Thr Arg 690 695 700 Glu Trp Leu Ala Arg Trp Gly Ile Ala His Thr Thr Gly Ile Pro Gly 705 710 715 720 Asn Ser Gln Gly Gln Ala Met Val Glu Arg Ala Asn Arg Leu Leu Lys 725 730 735 Asp Lys Ile Arg Val Leu Ala Glu Gly Asp Gly Phe Met Lys Arg Ile 740 745 750 Pro Thr Ser Lys Gln Gly Glu Leu Leu Ala Lys Ala Met Tyr Ala Leu 755 760 765 Asn His Phe Glu Arg Gly Glu Asn Thr Lys Thr Pro Ile Gln Lys His 770 775 780 Trp Arg Pro Thr Val Leu Thr Glu Gly Pro Pro Val Lys Ile Arg Ile 785 790 795 800 Glu Thr Gly Glu Trp Glu Lys Gly Trp Asn Val Leu Val Trp Gly Arg 805 810 815 Gly Tyr Ala Ala Val Lys Asn Arg Asp Thr Asp Lys Val Ile Trp Val 820 825 830 Pro Ser Arg Lys Val Lys Pro Asp Ile Ala Gln Lys Asp Glu Val Thr 835 840 845 Lys Lys Asp Glu Ala Ser Pro Leu Phe Ala 850 855

【００９９】 <210> 8 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of α-chain of AMV-RT <400> 8 gatgactgga attcatgcgt cgccgtcgcc gtcgccgtcg cactgttgcg ctacatctgg 60 ct 62

【０１００】 <210> 9 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of β-chain of AMV-RT <400> 9 gatgactgga attcatgaga ggcagccacc atcaccatca ccatactgtt gcgctacatc 60 tggct 65

【０１０１】 <210> 10 <211> 425 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag attaaatcag aacgcagaag 60 cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat 120 gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag 180 agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc 240 gttttatctg ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgggagcgg 300 atttgaacgt tgcgaagcaa cggcccggag ggtggcgggc aggacgcccg ccataaactg 360 ccaggcatca aattaagcag aaggccatgc tgacggatgg cctttttgcg tttctacaaa 420 ctctt 425

【０１０２】 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of trpT gene from E.coli LE392 <400> 11 aaaactgcag agcagtaagc cggtcataaa a 31

【０１０３】 <210> 12 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of trpT gene from E.coli LE392 <400> 12 aaaactgcag cgtgctggat gaagtgtatt a 31

【０１０４】 <210> 13 <211> 2155 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 atcagaattt tttttctttt tcccccttga aggggcgaag cctcatcccc atttctctgg 60 tcaccagccg ggaaaccacg taagctccgg cgtcacccat aacagatacg gactttctca 120 aaggagagtt atcaatgaat attcgtccat tgcatgatcg cgtgatcgtc aagcgtaaag 180 aagttgaaac taaatctgct ggcggcatcg ttctgaccgg ctctgcagcg gctaaatcca 240 cccgcggcga agtgctggct gtcggcaatg gccgtatcct tgaaaatggc gaagtgaagc 300 cgctggatgt gaaagttggc gacatcgtta ttttcaacga tggctacggt gtgaaatctg 360 agaagatcga caatgaagaa gtgttgatca tgtccgaaag cgacattctg gcaattgttg 420 aagcgtaatc cgcgcacgac actgaacata cgaatttaag gaataaagat aatggcagct 480 aaagacgtaa aattcggtaa cgacgctcgt gtgaaaatgc tgcgcggcgt aaacgtactg 540 gcagatgcag tgaaagttac cctcggtcca aaaggccgta acgtagttct ggataaatct 600 ttcggtgcac cgaccatcac caaagatggt gtttccgttg ctcgtgaaat cgaactggaa 660 gacaagttcg aaaatatggg tgcgcagatg gtgaaagaag ttgcctctaa agcaaacgac 720 gctgcaggcg acggtaccac cactgcaacc gtactggctc aggctatcat cactgaaggt 780 ctgaaagctg ttgctgcggg catgaacccg atggacctga aacgtggtat cgacaaagcg 840 gttaccgctg cagttgaaga actgaaagcg ctgtccgtac catgctctga ctctaaagcg 900 attgctcagg ttggtaccat ctccgctaac tccgacgaaa ccgtaggtaa actgatcgct 960 gaagcgatgg acaaagtcgg taaagaaggc gttatcaccg ttgaagacgg taccggtctg 1020 caggacgaac tggacgtggt tgaaggtatg cagttcgacc gtggctacct gtctccttac 1080 ttcatcaaca agccggaaac tggcgcagta gaactggaaa gcccgttcat cctgctggct 1140 gacaagaaaa tctccaacat ccgcgaaatg ctgccggttc tggaagctgt tgccaaagca 1200 ggcaaaccgc tgctgatcat cgctgaagat gtagaaggcg aagcgctggc aactctggtt 1260 gttaacacca tgcgtggcat cgtgaaagtc gctgcggtta aagcaccggg cttcggcgat 1320 cgtcgtaaag ctatgctgca ggatatcgca accctgactg gcggtaccgt gatctctgaa 1380 gagatcggta tggagctgga aaaagcaacc ctggaagacc tgggtcaggc taaacgtgtt 1440 gtgatcaaca aagacaccac cactatcatc gatggcgtgg gtgaagaagc tgcaatccag 1500 ggccgtgttg ctcagatccg tcagcagatt gaagaagcaa cttctgacta cgaccgtgaa 1560 aaactgcagg aacgcgtagc gaaactggca ggcggcgttg cagttatcaa agtgggtgct 1620 gctaccgaag ttgaaatgaa agagaaaaaa gcacgcgttg aagatgccct gcacgcgacc 1680 cgtgctgcgg tagaagaagg cgtggttgct ggtggtggtg ttgcgctgat ccgcgtagcg 1740 tctaaactgg ctgacctgcg tggtcagaac gaagaccaga acgtgggtat caaagttgca 1800 ctgcgtgcaa tggaagctcc gctgcgtcag atcgtattga actgcggcga agaaccgtct 1860 gttgttgcta acaccgttaa aggcggcgac ggcaactacg gttacaacgc agcaaccgaa 1920 gaatacggca acatgatcga catgggtatc ctggatccaa ccaaagtaac tcgttctgct 1980 ctgcagtacg cagcttctgt ggctggcctg atgatcacca ccgaatgcat ggttaccgac 2040 ctgccgaaaa acgatgcagc tgacttaggc gctgctggcg gtatgggcgg catgggtggc 2100 atgggcggca tgatgtaatt gccctgcacc tcgcagaaat aaacaaaccc ccggg 2155

【０１０５】 <210> 14 <211> 3139 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 atgggtaaaa taattggtat cgacctgggt actaccaact cttgtgtagc gattatggat 60 ggcaccactc ctcgcgtgct ggagaacgcc gaaggcgatc gcaccacgcc ttctatcatt 120 gcctataccc aggatggtga aactctagtt ggtcagccgg ctaaacgtca ggcagtgacg 180 aacccgcaaa acactctgtt tgcgattaaa cgcctgattg gtcgccgctt ccaggacgaa 240 gaagtacagc gtgatgtttc catcatgccg ttcaaaatta ttgctgctga taacggcgac 300 gcatgggtcg aagttaaagg ccagaaaatg gcaccgccgc agatttctgc tgaagtgctg 360 aaaaaaatga agaaaaccgc tgaagattac ctgggtgaac cggtaactga agctgttatc 420 accgtaccgg catactttaa cgatgctcag cgtcaggcaa ccaaagacgc aggccgtatc 480 gctggtctgg aagtaaaacg tatcatcaac gaaccgaccg cagctgcgct ggcttacggt 540 ctggacaaag gcactggcaa ccgtactatc gcggtttatg acctgggtgg tggtactttc 600 gatatttcta ttatcgaaat cgacgaagtt gacggcgaaa aaaccttcga agttctggca 660 accaacggtg atacccacct ggggggtgaa gacttcgaca gccgtctgat caactatctg 720 gttgaagaat tcaagaaaga tcagggcatt gacctgcgca acgatccgct ggcaatgcag 780 cgcctgaaag aagcggcaga aaaagcgaaa atcgaactgt cttccgctca gcagaccgac 840 gttaacctgc catacatcac tgcagacgcg accggtccga aacacatgaa catcaaagtg 900 actcgtgcga aactggaaag cctggttgaa gatctggtaa accgttccat tgagccgctg 960 aaagttgcac tgcaggacgc tggcctgtcc gtatctgata tcgacgacgt tatcctcgtt 1020 ggtggtcaga ctcgtatgcc aatggttcag aagaaagttg ctgagttctt tggtaaagag 1080 ccgcgtaaag acgttaaccc ggacgaagct gtagcaatcg gtgctgctgt tcagggtggt 1140 gttctgactg gtgacgtaaa agacgtactg ctgctggacg ttaccccgct gtctctgggt 1200 atcgaaacca tgggcggtgt gatgacgacg ctgatcgcga aaaacaccac tatcccgacc 1260 aagcacagcc aggtgttctc taccgctgaa gacaaccagt ctgcggtaac catccatgtg 1320 ctgcagggtg aacgtaaacg tgcggctgat aacaaatctc tgggtcagtt caacctagat 1380 ggtatcaacc cggcaccgcg cggcatgccg cagatcgaag ttaccttcga tatcgatgct 1440 gacggtatcc tgcacgtttc cgcgaaagat aaaaacagcg gtaaagagca gaagatcacc 1500 atcaaggctt cttctggtct gaacgaagat gaaatccaga aaatggtacg cgacgcagaa 1560 gctaacgccg aagctgaccg taagtttgaa gagctggtac agactcgcaa ccagggcgac 1620 catctgctgc acagcacccg taagcaggtt gaagaagcag gcgacaaact gccggctgac 1680 gacaaaactg ctatcgagtc tgcgctgact gcactggaaa ctgctctgaa aggtgaagac 1740 aaagccgcta tcgaagcgaa aatgcaggaa ctggcacagg tttcccagaa actgatggaa 1800 atcgcccagc agcaacatgc ccagcagcag actgccggtg ctgatgcttc tgcaaacaac 1860 gcgaaagatg acgatgttgt cgacgctgaa tttgaagaag tcaaagacaa aaaataatcg 1920 ccctataaac gggtaattat actgacacgg gcgaagggga atttcctctc cgcccgtgca 1980 ttcatctagg ggcaatttaa aaaagatggc taagcaagat tattacgaga ttttaggcgt 2040 ttccaaaaca gcggaagagc gtgaaatcag aaaggcctac aaacgcctgg ccatgaaata 2100 ccacccggac cgtaaccagg gtgacaaaga ggccgaggcg aaatttaaag agatcaagga 2160 agcttatgaa gttctgaccg actcgcaaaa acgtgcggca tacgatcagt atggtcatgc 2220 tgcgtttgag caaggtggca tgggcggcgg cggttttggc ggcggcgcag acttcagcga 2280 tatttttggt gacgttttcg gcgatatttt tggcggcgga cgtggtcgtc aacgtgcggc 2340 gcgcggtgct gatttacgct ataacatgga gctcaccctc gaagaagctg tacgtggcgt 2400 gaccaaagag atccgcattc cgactctgga agagtgtgac gtttgccacg gtagcggtgc 2460 aaaaccaggt acacagccgc agacttgtcc gacctgtcat ggttctggtc aggtgcagat 2520 gcgccaggga ttcttcgctg tacagcagac ctgtccacac tgtcagggcc gcggtacgct 2580 gatcaaagat ccgtgcaaca aatgtcatgg tcatggtcgt gttgagcgca gcaaaacgct 2640 gtccgttaaa atcccggcag gggtggacac tggagaccgc atccgtcttg cgggcgaagg 2700 tgaagcgggc gagcatggcg caccggcagg cgatctgtac gttcaggttc aggttaaaca 2760 gcacccgatt ttcgagcgtg aaggcaacaa cctgtattgc gaagtcccga tcaacttcgc 2820 tatggcggcg ctgggtggcg aaatcgaagt accgaccctt gatggtcgcg tcaaactgaa 2880 agtgcctggc gaaacccaga ccggtaagct attccgtatg cgcggtaaag gcgtcaagtc 2940 tgtccgcggt ggcgcacagg gtgatttgct gtgccgcgtt gtcgtcgaaa caccggtagg 3000 cctgaacgaa aggcagaaac agctgctgca agagctgcaa gaaagcttcg gtggcccaac 3060 cggcgagcac aacagcccgc gctcaaagag cttctttgat ggtgtgaaga agttttttga 3120 cgacctgacc cgctaataa 3139

【０１０６】 <210> 15 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of dnaKJ operon from E.coli <400> 15 cccccccggg atgggtaaaa taattggtat cgac 34

【０１０７】 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of dnaKJ operon from E.coli <400> 16 cgcgggatcc ttattagcgg gtcaggtcgt caaaaaa 37

【０１０８】 <210> 17 <211> 594 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 atgagtagta aagaacagaa aacgcctgag gggcaagccc cggaagaaat tatcatggat 60 cagcacgaag agattgaggc agttgagcca gaagcttctg ctgagcaggt ggatccgcgc 120 gatgaaaaag ttgcgaatct cgaagctcag ctggctgaag cccagacccg tgaacgtgac 180 ggcattttgc gtgtaaaagc cgaaatggaa aacctgcgtc gtcgtactga actggatatt 240 gaaaaagccc acaaattcgc gctggagaaa ttcatcaacg aattgctgcc ggtgattgat 300 agcctggatc gtgcgctgga agtggctgat aaagctaacc cggatatgtc tgcgatggtt 360 gaaggcattg agctgacgct gaagtcgatg ctggatgttg tgcgtaagtt tggcgttgaa 420 gtgatcgccg aaactaacgt cccactggac ccgaatgtgc atcaggccat cgcaatggtg 480 gaatctgatg acgttgcgcc aggtaacgta ctgggcatta tgcagaaggg ttatacgctg 540 aatggtcgta cgattcgtgc ggcgatggtt actgtagcga aagcaaaagc ttaa 594

【０１０９】 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of grpE gene from E.coli <400> 18 cgcggaattc atgagtagta aagaacagaa aacg 34

【０１１０】 <210> 19 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of grpE gene from E.coli <400> 19 aaaactgcag ttattaagct tttgctttcg ctacagt 37

【０１１１】 <210> 20 <211> 2574 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 atgcgtctgg atcgtcttac taataaattc cagcttgctc ttgccgatgc ccaatcactt 60 gcactcgggc acgacaacca atttatcgaa ccacttcatt taatgagcgc cctgctgaat 120 caggaagggg gttcggttag tcctttatta acatccgctg gcataaatgc tggccagttg 180 cgcacagata tcaatcaggc attaaatcgt ttaccgcagg ttgaaggtac tggtggtgat 240 gtccagccat cacaggatct ggtgcgcgtt cttaatcttt gcgacaagct ggcgcaaaaa 300 cgtggtgata actttatctc gtcagaactg ttcgttctgg cggcacttga gtctcgcggc 360 acgctggccg acatcctgaa agcagcaggg gcgaccaccg ccaacattac tcaagcgatt 420 gaacaaatgc gtggaggtga aagcgtgaac gatcaaggtg ctgaagacca acgtcaggct 480 ttgaaaaaat ataccatcga ccttaccgaa cgagccgaac agggcaaact cgatccggtg 540 attggtcgtg atgaagaaat tcgccgtacc attcaggtgc tgcaacgtcg tactaaaaat 600 aacccggtac tgattggtga acccggcgtc ggtaaaactg ccatcgttga aggtctggcg 660 cagcgtatta tcaacggcga agtgccggaa gggttgaaag gccgccgggt actggcgctg 720 gatatgggcg cgctggtggc tggggcgaaa tatcgcggtg agtttgaaga acgtttaaaa 780 ggcgtgctta acgatcttgc caaacaggaa ggcaacgtca tcctatttat cgacgaatta 840 cataccatgg tcggcgcggg taaagccgat ggcgcaatgg acgccggaaa catgctgaaa 900 ccggcgctgg cgcgtggtga attgcactgc gtaggtgcca cgacgcttga cgaatatcgc 960 cagtacattg aaaaagatgc tgcgctggaa cgtcgtttcc agaaagtgtt tgttgccgag 1020 ccttctgttg aagataccat tgcgattctg cgtggcctga aagaacgtta cgaattgcac 1080 caccatgtgc aaattactga cccggcaatt gttgcagcgg cgacgttgtc tcatcgctac 1140 attgctgacc gtcagctgcc ggataaagcc atcgacctga tcgatgaagc agcatccagc 1200 attcgtatgc agattgactc aaaaccagaa gaactcgacc gactcgatcg tcgtatcatc 1260 cagctcaaac tggaacaaca ggcgttaatg aaagagtctg atgaagccag taaaaaacgt 1320 ctggatatgc tcaacgaaga actgagcgac aaagaacgtc agtactccga gttagaagaa 1380 gagtggaaag cagagaaggc atcgctttct ggtacgcaga ccattaaagc ggaactggaa 1440 caggcgaaaa tcgctattga acaggctcgc cgtgtggggg acctggcgcg gatgtctgaa 1500 ctgcaatacg gcaaaatccc ggaactggaa aagcaactgg aagccgcaac gcagctcgaa 1560 ggcaaaacta tgcgtctgtt gcgtaataaa gtgaccgacg ccgaaattgc tgaagtgctg 1620 gcgcgttgga cggggattcc ggtttctcgc atgatggaaa gcgagcgcga aaaactgctg 1680 cgtatggagc aagaactgca ccatcgcgta attggtcaga acgaagcggt tgatgcggta 1740 tctaacgcta ttcgtcgtag ccgtgcgggg ctggcggatc caaatcgccc gattggttca 1800 ttcctgttcc tcggcccaac tggtgtgggg aaaacagagc tttgtaaggc gctggcgaac 1860 tttatgtttg atagcgacga ggcgatggtc cgtatcgata tgtccgagtt tatggagaaa 1920 cactcggtgt ctcgtttggt tggtgcgcct ccgggatatg tcggttatga agaaggtggc 1980 tacctgaccg aagcggtgcg tcgtcgtccg tattccgtca tcctgctgga tgaagtggaa 2040 aaagcgcatc cggatgtctt caacattctg ttgcaggtac tggatgatgg gcgtctgact 2100 gacgggcaag ggagaacggt cgacttccgt aatacggtcg tcattatgac ctctaacctc 2160 ggttccgatc tgattcagga acgcttcggt gaactggatt atgcgcacat gaaagagctg 2220 gtgctcggtg tggtaagcca taacttccgt ccggaattca ttaaccgtat cgatgaagtg 2280 gtggtcttcc atccgctggg tgaacagcac attgcctcga ttgcgcagat tcagttgaaa 2340 cgtctgtaca aacgtctgga agaacgtggt tatgaaatcc acatttctga cgaggcgctg 2400 aaactgctga gcgagaacgg ttacgatccg gtctatggtg cacgtcctct gaaacgtgca 2460 attcagcagc agatcgaaaa cccgctggca cagcaaatac tgtctggtga attggttccg 2520 ggtaaagtga ttcgcctgga agttaatgaa gaccggattg tcgccgtcca gtaa 2574

【０１１２】 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of clpB gene from E.coli <400> 21 aaaactgcag atgcgtctgg atcgtcttac taat 34

【０１１３】 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Designed primer based on nucleotide sequences of clpB gene from E.coli <400> 22 cccgggaagc ttattactgg acggcgacaa tccggtc 37

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、天然精製ＡＭＶ−ＲＴ（レーン２）お
よび組換え手段により得られたＡＭＶ−ＲＴ（レーン
３）を用いて得られた１．８ｋｂのサイズのＲＴ−ＰＣ
Ｒ増幅産物を示す。レーン１および４は、ＤＮＡ分子量
マーカーＶＩ（カタログ番号１０６２５９０、Roche Mo
lecular Biochemicals）を示す。

【図２】図２はＡＭＶ−ＲＴ精製由来の試料を用いたＳ
ＤＳゲルを示す。レーン１：分子量マーカーレーン２：天然ＡＭＶレーン３：細胞溶解レーン４：Ｎｉ−キレートセファロース、バッファーＣ
で洗浄レーン５：Ｎｉ−キレートプールレーン６：組換え（ｒｅｃ．）ＡＭＶ−ＲＴ最終調製物

【図３】図３は、組換えＡＭＶ−ＲＴを用いたＲＴ−Ｐ
ＣＲの反応産物が分離されたアガロースゲルを示す；レ
ーン１：８ｋｂ増幅産物、レーン２：１０ｋｂ増幅産
物、レーン３：ＤＮＡ長標準Ｘ、レーン４：１２ｋｂ増
幅産物、レーン５：１３．５ｋｂ増幅産物、レーン６：
ＤＮＡ長標準Ｘ。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月１６日（２００１．１０．
１６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

フロントページの続き (72)発明者ライナーミュラードイツ連邦共和国ペンツベルクデー− 82377 アンデアフライハイト 54 (72)発明者マンフレートシュミッツドイツ連邦共和国ペンツベルクデー− 82377 ロスヴァイデ 19 (72)発明者ブルーノフライドイツ連邦共和国ペンツベルクデー− 82377 ホッフフェルトシュトラーセ 50 (72)発明者ベルンハルトスプマンドイツ連邦共和国ヴァイルハイムデー −82362 アンデアバエレンミューレ４ (72)発明者ライナーシュムックドイツ連邦共和国ベーネディクトベウアーンデー−83671 アムクロースターヴァイアー７ (72)発明者ヨハン−ペータータールホファードイツ連邦共和国ヴァイルハイムデー −82362 クロッテンコプフシュトラーセ９ベー (72)発明者ペーターパルアオーストリア国ウィーンアーテー− 1020 ２．ベツィルクレンブラントシュトラーセ 41 (72)発明者マルクスパヤッチュドイツ連邦共和国ミュンヒェンデー− 81375 カール−ヴィッタルムシュトラーセ 28 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA10 CA04 DA06 HA17 4B050 CC03 DD01 EE03 FF05 FF09 FF12 FF14 KK01 4B065 AA26X AA97Y AB01 CA29 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）ＡＭＶ−ＲＴのα鎖および／また
はβ鎖をコードする１つまたはいくつかのＤＮＡ配列が
発現プラスミドにクローン化される、（ii）発現プラス
ミドが原核細胞に形質転換される、（iii ）ヘテロダイ
マーＡＭＶ−ＲＴの可溶性発現が誘導される、および
（iv）組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴが細胞から単
離される、原核生物宿主細胞において活性ヘテロダイマ
ーＡＭＶ−ＲＴを産生する方法。
【請求項２】 α鎖をコードするＤＮＡ配列およびβ鎖
をコードするＤＮＡ配列が、１つの細胞にクローン化さ
れた別々の発現プラスミド上で発現される、請求項１記
載の方法。
【請求項３】 α鎖をコードするＤＮＡ配列およびβ鎖
をコードするＤＮＡ配列が、１つの細胞にクローン化さ
れた１つの発現プラスミド上で発現される、請求項１記
載の方法。
【請求項４】 α鎖ならびにβ鎖がペプチド配列に融合
される、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】 α鎖またはβ鎖が、２〜１０のアルギニ
ン残基からなるペプチド配列と融合され、β鎖またはα
鎖が、２〜１０のヒスチジン残基からなるペプチド配列
と融合される、請求項４記載の方法。
【請求項６】可逆的な結合が可能であるペプチド配列
をコードするＤＮＡ配列に連結されるα鎖をコードする
ＤＮＡ配列およびβ鎖をコードするＤＮＡ配列が、１つ
の細胞にクローン化された１つの発現プラスミドにおい
て発現される、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】 α鎖およびβ鎖が、可逆的な結合が可能
である同一のペプチド配列と融合される、請求項１〜６
いずれかに記載の方法。
【請求項８】 α鎖およびβ鎖が、２〜１０のヒスチジ
ン残基からなるペプチド配列と各々融合される、請求項
７記載の方法。
【請求項９】発現が、１０℃〜２５℃の増殖温度およ
び減少したインデューサー濃度で生じる、請求項１〜８
いずれかに記載の方法。
【請求項１０】発現が、ヘルパー遺伝子の共発現によ
り増大される、請求項１〜９いずれかに記載の方法。
【請求項１１】トリプトファンｔＲＮＡをコードする
ｔｒｐＴ遺伝子がヘルパー遺伝子として使用される、請
求項１０記載の方法。
【請求項１２】発現がシャペロン遺伝子の共発現によ
り増大される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳ、Ｄｎａ
ＫおよびＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよび／またはＣｌｐＢを
コードする遺伝子が共発現される、請求項１０または１
２記載の方法。
【請求項１４】ＧｒｏＥＬおよびＧｒｏＥＳをコード
する遺伝子が、α鎖をコードする遺伝子およびβ鎖をコ
ードする遺伝子をも保有する発現プラスミド上にクロー
ン化され、ＤｎａＫ、ＤｎａＪ、ＧｒｐＥおよびＣｌｐ
Ｂをコードする遺伝子がヘルパープラスミド上にクロー
ン化される、請求項１２または１３記載の方法。
【請求項１５】適切なアフィニティークロマトグラフ
ィー材料が、組換えヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴを単離
または精製するために使用される、請求項１〜８記載い
ずれかに記載の方法。
【請求項１６】精製に使用されるアフィニティークロ
マトグラフィー材料がα鎖および／またはβ鎖に結合し
た異なるペプチド配列に可逆的に結合する、請求項１５
記載の方法。
【請求項１７】精製に使用されるアフィニティークロ
マトグラフィー材料が、金属イオンキレート化材料また
はカチオン交換体である、請求項１５または１６記載の
方法。
【請求項１８】配列番号：５のＤＮＡ配列または配列
番号：４および配列番号：５のＤＮＡ配列が原核生物宿
主細胞において発現される、請求項１〜１７いずれかに
記載の方法。
【請求項１９】大腸菌が宿主細胞として使用される、
請求項１〜１８いずれかに記載の方法。
【請求項２０】活性ヘテロダイマーＡＭＶ−ＲＴが、
配列番号：６および配列番号：７のサブユニットからな
る、請求項１〜１９いずれかに記載の方法。
【請求項２１】ＲＮＡ配列を増幅するための、請求項
１〜２０いずれかに記載の方法により得られるＡＭＶ−
ＲＴの使用。