KR100262258B1 - 고도로 정제된 재조합 역전사효소 - Google Patents
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Abstract
고유 RNAse 활성의 발현이 결여된 이. 콜라이 세포중 몰로니종 쥐 백혈병 바이러스 유래 역전사효소의 발현을 위한 플라스미드, 재조합 효소의 정제방법, 및 cDNA 및 핵산증폭 방법에서 사용하기에 적합한 클론화 및 정제된 역전사효소를 포함하는 조성물이 기재되어 있다.
Description
[발명의 명칭]
고도로 정제된 재조합 역전사효소
[도면의 간단한 설명]
도1 : 플라스미드 pUC18N의 작제.
도2 : 플라스미드 pUC18N 작제용 올리고뉴클레오티드.
도3 : 리보솜 결합 부위의 배열.
도4 : 리보솜 결합 부위 및 스페이서 영역을 변형시키기 위해 사용된 올리고 뉴클레오티드.
도5 : 플라스미드 pUC18N MMLV Sst-Hind의 작제.
도6 : 플라스미드 pUC18N MMLV III 테일드(tailed)의 작제.
도7 : 플라스미드 pUC18N MMLV 테일드 작제용 올리고뉴클레오티드.
도8 : 플라스미드 pUC18N MMLV Gly 및 pUC18N MMLV Gly Tet (-)의 작제.
도9 : 플라스미드 pUC18N SD9D MMLV Gly 및 pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)의 작제.
도10 : 정제된 MMLV-RTR의 P-11 및 세파크릴(Sephacryl) S-200 분획의 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE).
[발명의 상세한 설명]
[발명의 배경]
래트로바이러스는 유전자 물질이 단일 가닥 RNA로 이루어진 바이러스군이다. 래트로바이러스 RNA가 숙주 세포내로 흡착 및 도입되면, 바이러스 RNA는 상보성 DNA 가닥의 합성을 위한 주형으로서 작용한다. 그 다음, DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소의 작용에 의해 DNA가 이중 가닥으로 형성되는데, 이 이중 가닥 DNA가 바로 숙주 게놈내로 통합(integration)되게 된다. 바이러스 RNA 주형으로부터 상보성 DNA를 합성하는 작용을 하는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성은 보통 역전사효소라 불리운다.
다수의 래트로바이러스는 각종 암, 및 기타 질환의 유발 작인과 밀접한 관련이 있기 때문에 특히 주목되어 왔다. 래트로바이러스의 일종인 인간 면역결핍 바이러스는 후천성 면역결핍 증후군(AIDS)의 유발 작인이다. 또한, 역전사효소 자체는 거의 모든 RNA 주형으로부터 상보성 DNA을 형성하는 능력을 가지고 있기 때문에 분자 생물학 분야에서 중요한 제제로 취급되어 왔다. 그러므로, 역전사효소는 혼성화 프로브용 핵산을 제조하고 후속적으로 클로닝(cloning) 및 발현을 시키기 위해 단일 가닥 DNA를 이중 가닥 DNA로 전환시키는데에 통상 사용된다.
최근에, 역전사효소는 전사를 기본으로 하는 증폭계의 성분으로서 사용되어 왔다. 상기 계는 RNA 및 DNA로 표적 서열을 1조배까지 증폭시킨다. [버그(Burg) 등의 WO 89/01050; 긴저라스(Gingeras) 등의 WO 88/10315; 데이비(Davey) 및 말렉 (Malek)의 EPO출원 제0329822호(1988); 긴저라스 등의 EPO출원 제0373960호(1989); 말렉(Malek) 및 데이비의 PCT 특허출원 제WO 91/02814(1989) 및 캐시앙(Kacian) 및 훌쯔(Fultz)의 EP 출원 제0408295 A2호(1990) 참조; 상기 문헌 모두는 본원에 참고 문헌으로 포함됨].
전사에 기초하는 증폭법의 일부는 특히 편리한데, 그 이유는 그 증폭 반응이 등온성을 갖기 때문이다. 그러므로, 상기 계는 통상의 임상 실험실 용도에 특히 적합하다. 그러한 용도에는 감염성 질환을 유발시키는 병원체의 검출과 암이나 유전적 질환과 관련된 유전자 서열의 검출이 포함된다. 역전사효소는 또한 RNA 표적을 증폭시키기 위해 폴리머라제 연쇄 반응법(PCR)을 사용하는 경우, 특정 프로토콜에서 초기단계로서 사용된다[말렉 등의 미국특허 제5,130,238호(1992); 및 모 찰라(Mocharla) 등의 Gene 99:271-275(1990) 참조]. "RT-PCR" 방법에서는, 역전사효소를 사용하여 RNA 표적의 초기 상보성 DNA(cDNA)의 복제물을 제조하고 이어서 이를 DNA 복제 라운드에 의해 증폭시킨다.
래트로바이러스 역전사효소는 3종류의 효소 활성, 즉 RNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성, DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 RNAse H 활성을 갖는다[베르마 (Verma)의 The Reverse Transcriptase Biochim. Biophys. Acta 473: 1-38(1977)]. 후자의 활성은 RNA:DNA 이중체에 포함되어 있는 RNA를 특이적으로 분해시킨다. RNAse H에 의한 RNA:DNA 중간체의 RNA 가닥의 분해는 특정의 전사에 기초하는 증폭계의 중요 요소로서 증폭을 방해하는 오염 뉴클레아제에 기인된 바람직하지 않은 분해와는 구별되어야 할 것이다.
전사에 기초하는 증폭계의 단점은 미량의 뉴클레아제에 대해 민감하다는 것이다. 다수의 중요 질환에서 얻은 샘플은 표적 핵산 분자를 극히 적게 함유하고 있기 때문에, 소량의 표적을 검색하는 것은 정확하고 시의적절한 진단에 있어서 매우 중요하다. 실제로, 표적 분자의 수가 적은 경우에 표적 증폭법의 가치는 매우 크다. 표적 핵산의 농도가 낮으면, RNA 표적 또는 RNA나 DNA의 반응 중간체들이 바람직하지 않게 분해됨에 의해 증폭은 실패되고 그 결과 진단착오를 유발시킬 수 있다. RT-PCR 반응에서 리보뉴클레아제 오염도 문제되는데, 그 이유는 RNA 표적 손실에 의해 증폭이 실패될 수 있기 때문이다.
이러한 리보뉴클레아제는 비교적 어디에서나 존재하며, 특히 래트로바이러스 표본을 포함하여 각종 생물학적 물질중에서 고농도로 발견되며 재조합 단백질을 발현시키기 위해 통상 사용되는 세포내에서도 발견된다. 리보뉴클레아제는 종종 각종 공급원에서 얻은 역전사효소 제제를 오염시키며 cDNA의 합성, 프로브의 제조 및 단독 표적 증폭이외의 기타 용도를 방해하는 것으로 보고되어 있다. 종종, 이와 같은 해로운 오염 효과를 최소화시키기 위해 RNAse 억제제를 반응에 포함시킨다[메니어티스(Maniatis) 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 8.11-8.13(제2판, C old Spring Harbor Laboratory Press(1989); 본원의 참고문헌으로 포함됨].
그런데, RNAse를 억제 또는 불활성화시키기 위해 통상 사용되는 세제, 카오트로프(chaotrope), 유기물, 금속, 프로테아제 및 금속을 비롯한 다수의 물질은 표적 증폭계에 사용하기가 부적절한데, 그 이유는 상기 물질들이 증폭을 위해 사용되는 효소 또한 억제하기 때문이다. 인간 태반 RNAse 억제제[블랙번(blackburn) 등의 J. Biol. Chem. 252: 5904(1977)] 또는 쥐의 간 RNAse 억제제[그리브나우 (Gribnau) 등의 Arch. Biochem. Biophys. 130: 48-52(1969)]와 같은 RNAse 억제 단백질은 불안정하고, 가격이 비싸며 이 억제제에 의해 억제되지 않는 핵산 및 RNAse 등의 추가의 방해 물질을 형성할 수 있다.
뉴클레아제 이외에, 다른 효소, 핵산 및 특정 완충염의 미량도 증폭 반응을 방해할 수 있다. 상기 물질들이 단지 역전사효소를 위한 다수의 용도에서는 바람직하지 않긴 하지만, 증폭 반응의 성질상, 효소 제제에 이들 물질이 가능한한 소량 함유되는 것이 중요하다.
각종 공급원으로부터 역전사효소를 단리 정제시키는 방법이 기록되어 있다. 효소를 바이러스 입자, 세포, 또는 조직으로부터 직접 단리시키는 경우, 진단용 시험 분야에서 대규모 시판용으로 사용하기에는 단가가 높다[캐시앙 등의 Biochim. Biophys. Acta 46: 365-83(1971); 양(Yang) 등의 Biochim. Biophys. Res. Comm. 47: 505-11(1972); 게라드(Gerald) 등의 J. Virol. 15: 785-97(1975), 리우(Liu) 등의 Arch. Virol. 55 187-200(1977); 가또(Kato) 등의 J. Virol, Methods 9: 325-39(1984); 루크(Luke) 등의 Biochemistry 29: 1764-69(1990); 르 그리스(Le Grice)등의 J. Virol. 65: 7004-07(1991)]. 또한, 상기 방법들은 표적 증폭반응을 위한 역전사효소의 사용을 방해하는 상당량의 억제제 또는 오염물질을 확실히 제거하지 못한다. 각종 목적으로 역전사효소를 사용하는데 있어서의 다른 중요한 고려사항이 효소와 연관된 RNAse H 활성이다. RNAse H 활성의 양 및 RNAse H 활성이 RNA- 및 DNA- 의종선 역전사효소의 활성과 동조적으로 작용하게 하는 방법은 전사에 기초하는 증폭계를 포함하여 각종 목적을 위한 효소의 용도에 영향을 미치는 중요한 특징이다. 너무 지나치거나 또는 너무 적은 활성, 잘못 선택된 활성종(가령, 비특이 RNAse), 또는 DNA 합성과 열등하게 동조적인 활성은 모두 특정 응용에 있어 성능을 감소시킬 수 있다. 합성 및 분해 활성의 적절한 균형이 유지되어야 하는데, 이러한 적절한 균형은 단지 사용된 특정 역전사효소의 기능 뿐만 아니라 RNA 및(또는) DNA 분해 활성을 제거하기 위한 정제 프로토콜의 능력에 좌우된다.
박테리아 숙주에서의 역전사효소의 클로닝 및 발현은 이미 보고되어 있다. 조류의 골수아구종 바이러스(AMV-RT)로부터 취한 역전사효소를 클로닝 및 발현시키기 위한 시도는 상당량의 정제 효소를 생산하지 못했다. 이는 AMV-RT가 충분하게 활성을 가진 효소가 되기 위해서는 이량체 구조를 형성하고 특이적으로 번역후 수식되어야만 하는 2개의 폴리펩티드 쇄, 즉 α 및 β쇄로 구성되어 있기 때문이다. 유전자가 대장균 중에서 발현되는 경우, 상기와 같은 수식이 발생하지는 않는다.
조류의 바이러스 RT와는 달리, 포유류 바이러스로부터 유래된 다수의 역전사효소는 단지 하나의 폴리펩티드로만 구성되는데, 상기 효소들을 클로닝하고 발현하기 위한 노력은 보다 성공적이었다. 특히, 몰로니종 쥐의 백혈병 바이러스(MMLV-RT)에서 유래되며 대장균 중에서 발현되는 역전사효소의 정제방법이 문헌(고프(Goff) 등의 미국특허 제4,943,531호(1990) 및 코테위쯔(Kotewicz)등의 미국특허 제5,017,492호]에 기재되어 있는데, 상기 방법은 대부분의 시판되고 있는 역전사효소 제제의 근간이 되고 있다.
그러나 다수의 시판되고 있는 역전사효소 제제는 뉴클레아제 오염 때문에 표적 증폭 및 기타 목적으로 사용하기에 바람직하지 않은 것으로 밝혀졌다[샘브룩의 상기 문헌(본원에서 참고문헌으로서 이미 채택되어 있음); 리스코브(Ryskov) 등의 Mol. Biol, Rep, 8: 213-216(1982)]. MMLV-RT의 시판제제가 갖는 다른 문제점은 DNA 합성 및 정제 효소의 RNAse H 활성 사이의 변형된 조화, 합성 및 프라이머 부위에서의 합성 개시 능력의 감소 또는 조밀한 2차구조의 영역을 통한 판독 능력의 감소와 관련이 있을 수 있거나 또는 선택적으로 DNAse 및 다른 단백질 오염에 기인될 수 있다[아그로노브스키(Agronovsly, A.A.)의 Anal. Biochem. 203: 163-65(1992)]. 또한, 이미 정제를 목적으로 활용되고 있는 방법을 사용하여 제조된 시판제제는 상당 정도의 로트 대 로트 가변도를 나타내고 있다.
더욱이, 정제법이 장시간 소요되고 노동집약형이라는 점, 스케일업을 위해 사용되는 시약 및 장치가 고가라는 점, 효소 수율이 낮다는 점 때문에, 표적 증폭계에서 있어서 광범위한 상업적 응용을 하기에는 효소 단가가 비싸다.
그러므로, 본 발명의 목적은 핵산 증폭법에 사용하기에 특히 적합하도록 DNA 합성 활성 및 RNAse H 분해 활성간의 균형이 정확한 역전사효소의 개선된 형태를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 대장균 숙주에서 상기 특성을 갖는 MMLV-RT 효소를 암호화하는 유전자를 클로닝 및 발현시킴으로써 전사에 기초하는 증폭 반응을 방해하는 바람직하지 않은 RNAse 등의 오염물을 저농도로 함유하는 역전사효소의 편리한 공급원을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 리보뉴클레아제 결여된 대장균에서 MMLV-RT를 클로닝 및 발현시킴으로써 정제 전 또는 정제 후 효소와 연관된 RNAse 활성을 감소시키 는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 효소를 단리시키기 위한 간단한 정제법을 개발하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고순도의 RT를 저가로 얻는 효소 정제 방법을 제공하는 것이다.
[발명의 요약]
본 발명은 대장균과 같은 적합한 숙주 세포를 형질전환시키기 위해 사용되는 경우, 래트로바이러스 역전사효소와 관련된 DNA- 및 RNA-의존성 DNA 폴리머라제활성 및 RNAse H 활성을 갖는 유전자 생성물의 발현 및 생성을 주도하는 MMLV-RT를 위한 클로닝 유전자 버젼을 함유하는 발현 벡터 또는 플라스미드를 그 특징으로 하고 있다.
또한 본 발명은 야생 균주와 비교하여 리보뉴클레아제 활성이 감소된 숙주 세포내로 이입된 MMLV-RT 유전자를 함유하는 플라스미드를 특징으로 한다.
또한 본 발명은 적절한 성장 배지, 발효조건, 세포의 수거 및 보관, 세포 용균 및 크로마토그라피를 포함하여, 숙주 세포로부터 생성된 효소를 정제시키는 방법을 포함한다.
또한 본 발명은 발현 벡터, 숙주 세포 및 정제 과정에 의해 형성된 효소를 그 특징으로 하고 있다. 효소는 고도로 정제되어 있으며 핵산 증폭 및 기타 유전공학적 과정에 사용하기 적합하다.
마지막으로, 본 발명은 각종 목적, 특히 전사에 기초하는 증폭 및 RT-PCR 반응에서 상보성 DNA의 합성을 위한 본원의 방법으로 생산된 효소의 용도를 특징으로 하고 있다.
[정의]
본원에서 사용된 하기 용어는 별도로 언급하지 않는 한 다음의 의미를 갖는다.
"선별 마커 유전자"란 숙주 세포에 의해 담지되고 발현되는 경우, 선별 마커 유전자를 함유하는 숙주 세포 및 선별 마커 유전자를 함유하지 않는 세포 양자를 소정 조성의 배양 배지중에 성장시킬 때, 선별 마커 유전자를 함유하지 않는 세포에 비해 함유하는 숙주 세포에 성장상의 이점을 부여할 수 있는 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 의미한다. 예를들면, β-락타마제를 암호화하는 유전자는 이 유전자를 함유하는 숙주 세포에 엠피실린 내성을 부여할 것이지만, 상기 유전자를 함유하지 않는 세포는 엔피실린에 민감하게 작용한다. 따라서 β-락타마제를 위한 유전자를 발현시키는 세포들만이 엠피실린 함유 배지중에서 성장할 것이다. 마찬가지로, 필수 아미노산을 이화작용시킬 수 없는 세포는 그 아미노산을 함유하지 않는 배지중에서는 성장하지 못하지만, 세포가 필수 아미노산을 제조할 수 있도록 하는 유전자를 함유하는 세포는 그 배지중에서 성장할 것이다.
선별 마커 유전자는, 예를들면 플라스미드 또는 발현 벡터내에서, 선별 유전자 및 "사일런트 유전자 및(또는) 유전 요소 모두를 함유하는 세포를 동정하기 위한 수단으로서 하나 이상의 유전자 또는 유전자 요소에 공유 결합될 수 있다.
"정제화" 핵산 또는 단백질이란 특정의 핵산 또는 단백질로부터 탄화수소, 인 지질, 바람직하지 않은 핵산, 또는 바람직하지 않는 단백질 등의 세포 성분들을 제거하기 위한 하나 이상의 단계를 거친 핵산 또는 단백질을 의미한다.
"상류"란 핵산 가닥의 소정 위치의 5'측, 또는 이중 가닥 핵산 분자인 경우, 핵산 분자의 영역에서 유전자 전사 방향에 대해 특정의 위치의 5'측을 의미한다.
"하류"란 핵산 가닥의 소정 위치의 3'측, 또는 이중 가닥 핵산 분자인 경우, 핵산 분자의 영역에서 유전자 전사 방향에 대해 특정의 위치의 3'측을 의미한다.
"Tm"은 이중 가닥 핵산 분자 또는 이중 가닥 영역을 갖는 핵산 분자 집단의 50%가 단일가닥이 되거나 또는 열 변성되는 온도를 의미한다.
"재조합"이란 핵산 분자 또는 단백질이 적어도 부분적으로는 실험실내 생화학 기술로써 만들어진 산물인 것을 의미한다. 따라서, "재조합 DNA 분자'란 비천연 분자이다. 그러한 재조합 분자로는 제한 엔도뉴클레아제 단편, 실험실내 핵산리게이션 생성물, 실험실내 엑소뉴글레아제 단편, 및 프로모터(promotor), 리프레서(repressor) 유전자, 선별 마커 유전자, 감온성 DNA 복제 요소, 구조 유전자 등 중에서 선택되는 하나 이상의 이형 유전자 요소를 포함하는 발현 벡터를 들 수 있는데, 이에 반드시 한정되는 것은 아니다.
"재조합" 단백질 또는 효소는 자연상태에서는 발견되지 않는다. 이러한 단백질 또는 효소에는 단백질 표본 또는 재조합 DNA 분자로부터 제조된 단백질이 있다. 재조합 DNA 분자로부터 제조된 단백질은 통상 이종 숙주 세포, 즉 해당 단백질 또는 효소에 대해 고유의 것이 아닌 세포중에서 발현된다. 그런데, 재조합 단백질을 암호화하는 유전자는 해당 단백질을 유도하는 유기체와 동일한 종의 숙주 세포내에 함유되어 있는 발현 벡터상에 존재할 수 있다.
"절단된"이란 해당 유전자 또는 단백질의 보다 작은 버젼을 의미하며, 1차 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 관련하여, 기준 핵산 또는 단백질의 절단형은 기준 분자와 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산이 결여된 것을 나타낸다.
"실질적인 서열 상동체"란 그의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 각각의 약 80% 이상에서 제2기준 핵산 또는 단백질에 인식가능할 정도로 비랜덤한 유사성을 갖는 제1핵산 또는 단백질 분자를 의미한다.
핵산 또는 단백질 "도메인"은 인접 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 하나 이상의 한정된 영역을 의미한다.
"복제 기점"이란 프라이머 형성 및 DNA 폴리머라제 활성의 개시가 시작되는 DNA의 특이 영역을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어는 발현 벡터를 소정의 숙주 세포내에서 복제수를 증가시킬 수 있는 DNA 발현 벡터에 존재하는 핵산 원소를 의미하는 것으로 사용된다.
"프로모터"란 RNA 폴리머라제 효소가 결합, DNA 주형의 전사를 개시하여 핵산 서열에 대응되는 아미노산 서열의 단백질을 만들게 함으로써, 핵산 서열중에 함유되어 있는 유전 정보를 제1단계로 해독하게 하는 DNA 특이영역을 포함하는 유전자 요소를 의미한다.
발현", "유전자 발현" 또는 "단백질 발현"은 숙주 유기체에 의해 유전자내에 포함된 정보로부터 단백질을 형성하는 것을 의미한다.
"형질전환"이란 숙주 세포가 핵산 분자를 자기 것으로 하게 하는 생화학적 방법을 의미한다. 그러한 핵산 분자는 통상 하나이상의 복제 기점, 선별 마커 유전자, 및 숙주 세포내의 선별 마커 유전자를 발현시키기 위한 프로모터를 포함하는 유전자 요소이다.
"이형"이란 동일한 종이 아닌 것을 의미한다. 그러므로, 이형 숙주세포내에 발현된 효소는 원래 유도된 것이 아닌 상이한 종의 숙주세포내에 형성된다.
"유전자"란 발현가능한 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 영역을 의미한다. 유전자는 발현된 단백질의 아미노산 잔기에 대응하는 코돈을 함유하는 하나 이상의 "암호화 서열"을 포함할 수 있으며, 이 유전자는 또한 반드시 그럴 필요는 없으나, 발현된 단백질의 아미노산 잔기에 대응하는 코돈을 함유하지 않는 하나 이상의 "비암호화" 뉴클레오티드 서열을 포함할 수도 있다.
이에 한정되는 것은 아니나, 제한 분해 프로토콜, 겔 전기영동, 써던 블롯(Southern blot) 및 DNA 변형 반응을 비롯하여 MMLV-RT 발현 벡터의 작제 및 평가를 위해 사용되는 모든 생물학적 기술은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본원에서 이미 참고문헌으로 채택한 바 있는 샘브룩 등의 문헌에 기재되어 있다. 또한, 상기 기술 대다수는 본원과 공동의 소유권을 갖고 동일자 제출된 동시 계류중인 리그스(Riggs) 등의 출원[명칭: Purified DNA Polymerase from Bacillus stearothermophilus]에 기재되어 있다. 리그스 등의 출원은 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
I. 클로닝 벡터의 작제
a. 플라스미드 pUC18N의 작제
플라스미드 pUC18N(Life Technologies, Inc., Bethesda, MD)를 모벡터로서 사용하였다. 클론을 아가로즈 겔상 제한 유전자 지도화 기술(당업계에 익히 공지되어 있음)에 의해 스크리닝하였다. 도1에 도시한 바와 같이 2개의 뉴클레오티드 염기를 치환시킴으로써 pUC18의 Eco RI 제한 부위 및 lac Z 리보솜 결합부위 사이에 Nco I 제한 부위를 도입시켰다. 도2에 도시한 바와 같은 2개의 합성 올리고 뉴클레오티드를 올리고뉴클레오티드 1 및 2(서열 동정 번호: 1 및 2)로서 사용하여 변이시켰다. 도시한 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 그 3' 말단에서 30개의 염기만큼 중첩되었다. 올리고뉴클레오티드를 혼성화시키고, 대장균 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용하여 충전시킨 후 Pvu II 및 Eco RI로 분해시켰다. 플라스미드 pUC18을 Eco RI로 분해시키고 Pvu II로 부분 분해시켜 2개의 DNA 단편을 얻었다. 그 중 큰 단편은 고유 엠피실린 내성 유전자(Amp), 복제기점(Ori) 및 lac Z 유전자 일부를 함유하고 있다. 보다 작은 Eco RI-Pvu II 단편은 pUC18 지도의 450 내지 628 위치에 해당하는 lac Z 유전자 부분으로 구성되어 있다. 합성 Eco RI-Pvu II 단편을 보다 큰 벡터 단편내로 삽입시킨 다음 이를 연결시킨 후, 이를 사용하여 대장균 균주 JM 109를 형질전환시켰다. 기질로서 X-갈(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 사용하면 적절히 작제된 벡터를 함유하는 클론은 청색 컬러를 나타내는데, 이는 lac Z 유전자가 적절히 재작제되었음을 나타내는 것이다. 또한,상기 결과는 제한 유전자 지도화에 의해서도 증명되었다. 이 벡터를 pUC18N라 명명하였다(도18 참조).
b. 역전사효소 유전자를 함유하는 플라스미드의 작제
고유 MMLV 유전자를 문헌[Miller and Verma, J. Virol. 49:214-222(1984) 참조]에 기재된 PMMLV-L 클론으로부터 Sst I-Hind III 단편으로서 단리시켰다. 이 단편은 MMLV 2558 위치(Sst I 부위)에서 4894 위치(Hind III 부위)에 해당하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 있으며 40개의 엑스트라 상류 염기 및 284개의 엑스트라 하류 염기 사이에 전제 RT 유전자를 함유하고 있다. 플라스미드 벡터 pUC18을 Sst I 및 Hind III으로 분해시키고 벡터 및 RT 유전자와 연결시킨 다음 이를 사용하여 수용성(competent) 대장균 DH15αf' 세포를 형질전환시켰다. 생성된 플라스미드를 이른바 pUC18 MMLV Sst-Hind(도5 참조)로 명명하였다. 그 다음, 상기 플라스미드를 Eco RI 및 Bgl I로 분해시켜 RT 유전자의 말단 3' 서열이 결여된 MMLV-RT 유전자의 2013 bp 단편을 얻었다. RT 유전자 단편을 Bgl I 부위에서 2개의 합성 올리고뉴클레오티드 8 및 9(각각 서열 동정 번호: 11 및 12)로부터 취한 Bgl I-Hind III 오버행(overhang)으로 디자인된 이중 가닥 링커에 연결시켰다. 합성 링커는 MMLV 역전사효소의 카르복실 말단에 대한 코딩 서열 및 정지 코돈을 포함하고 있다. 플라스미드 pUC18을 Eco RI 및 Hind III로 분해시키고, 보다 큰 벡터 단편을 겔 정제화시키고 재작제된 RT 유전자로 연결시켰다. 생성된 플라스미드를 pUC18 MMLV III 테일드라고 명명하였다. 이는 엑스트라 3' 서열이 제거된 MMLV 유전자를 함유하고 있다.
c. pUC18N MMLV Gly 및 pUC18N MMLV Gly Tet(-)의 작제
클로닝 RT 유전자의 엑스트라 5' 서열을 하기와 같이 제거하였다. 1997 Bp Mam I-Hind III 단편을 pUC18N MMLV III 테일드로부터 단리시켰다(도8 참조). 이 핵산 단편은 MMLV-RT 유전자 서열의 5' 23 뉴클레오티드 무함유 RT 유전자를 함유하고 있다. 2개의 상보성 올리고뉴클레오티드를 합성하고 혼성화시켜 RT 유전자의 5' 부분을 재생시켰다(하기에 명시한 바와 같이, 제2아미노산 위치 중 글리신을 암호화하는 뉴클레오티드 및 개시 코돈을 함유하는 Nco I 5' 오버행에 의함).
올리고뉴클레오티드 #3(서열 동정 번호 : 3) :
CATGGGTCTG AACATCGAAG ATGA
올리고뉴클레오티드 #4(서열 동정 번호 : 4) : TCATCTTCGA TGTTCAGACC
5'- CATGGGTCTGAACATCGAAGATGA-3'
3'- CCAGACTTGTAGCTTCTACT-5'
플라스미드 pUC18N을 Nce I 및 Hind III로 분해시키고 생성된 2종의 단편중 보다 작은 단편을 제거하였다. 혼성화시킨 올리고뉴클레오티드(서열 동정 번호 : 3 및 4)를 Nco I 부위에서 보다 큰 pUC18N 단편에 연결시킨 다음, 마찬가지로 1992 bp MMLV-RT Mam I-Hind III 유전자를 삽입시켜 발현 벡터 pUC18N MMLV Gly를 얻었다(도8 참조). 하기에 기재한 바와 같이 작제된 pUC18 Tet(+)로부터 얻은 Tet 유전자를 Aat II 부위에 삽입시켰으며 이로써 생성된 플라스미드는 pUC18N MMLV Gly Tet (-)라 명명하였다. (-) 표시는 벡터내의 Tet 유전자의 배향을 나타내는 것이다.
본 발명의 클로닝 MMLV-RT는 2가지 관점에서 천연의 효소와 상이하다. 첫째, 천연 효소의 위치 1에 해당하는 트레오닌 잔기를 암호화하는 코돈(RT 유전자의 제2 코돈)은 본 발명의 클로닝 R내에서의 글리신 코돈으로 대체되었다. 둘째, 성숙 천연 단백질 서열의 2, 3 및 4위치에 해당하는 류신, 아르기닌 및 이소류신 잔기에 대한 코돈은 대장균에 의해 보다 선호되는 코돈으로 대체되었다. 류신을 암호화하는 CTA 코돈은 퇴화 코돈 CTG로 대체되었으며 아스파라긴을 암호화하는 AAT 코돈은 퇴화 코돈 AAC로 대체되었으며, ATA 코돈은 퇴화 코돈 AT C로 대체되었다[와다 (Wada, K.) 등의 Nucl. Acids Res. 19(supp) : 1981-1986(1991) 참조].
d. 플라스미드 pUC18N SD9D의 작제
클로닝 MMLV-RT의 발현을 최적화하기 위해, pUC18N의 lac Z 리보솜 결합부위(RBS)를 변형시켜 pUC18 모 벡터내에 존재하는 대장균 16S rRNA에 상보성인 4개의 염기보다는 오히려 그러한 대장균 16S rRNA에 상보성인 9개의 염기를 포함하도록 하였다. 동시에, SD7, SB8 및 SD9로서 도3에 명시된 가닥들 중 어느 하나에 도시한 바와 같이 7, 8 또는 9개의 염기쌍에 의해 ATG 개시 코돈 및 RBS을 분리시키는 스페이서 영역을 갖는 플라스미드를 작제하였다. 이들 스페이서 서열을 디자인함에 있어서의 일반적 요소로는 1) ATG 개시 코돈에 대한 제3 위치 5'에서의 아데노신 (A)이 있어야 하고, 2) Nco I 부위를 제외한 스페이서 영역에서는 구아니딘 (G) 또는 시토신(C)이 없어야 하며, 및 3) RBS 및 스페이서를 스패닝(spanning) 시키는 5'-RRTTTRR-3' 서열[여기서, T는 디미딘이고, R은 푸린 뉴클레오티드(아데닌 또는 구아닌임)임]가 있어야 한다. 이형 유전자 발현에 대한 상기 일반 요소가 하기 문헌에 제시되어 있다[제이(Jay) 등의 Proc.Natl. Acad. Sci. USA 78 : 4543-48(1981) 및 제스퍼스(Jespers) 등의 Protein Engineering 4 : 485-92(1991) 참조].
이들을 변형시키기 위해 사용된 올리고뉴클레모티드는 도4에 도시한 바와 동일하다. 올리고뉴클레오티드 5, 6 및 7(서열 동정 번호 : 5, 6 및 7)은 각각 도2 에 도시한 바와 같이 올리고뉴클레오티드 1과 함께 사용되었다. 올리고뉴클레오티드 6의 ATG 개시 코돈의 5'측상 뉴클레오딕드 4염기 및 올리고뉴클레오티드 7중 ATG 개시 코돈에 의한 5'측상 4 및 5염기는 모두 이론적으로 선호되지 않기 때문에 A 및 T의 혼합물과 함께 합성하였다[제스퍼스 등의 상기 문헌]. pUC18N의 작제에서와 같이, 30염기쌍 상보성 영역은 올리고뉴클레오티드 1과 올리고뉴클레오티드 3, 4 및 5 각각의 사이에 존재하였다. 전술한 바와 같이, 각각의 올리고뉴클레오티드 쌍을 혼성화시키고, 대장균 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용하여 충전시키고 Pvu II 및 Eco RI로 분해시킨 후 pUC18N 작제시에 사용된 동일한 큰 pUC18 Pvu II-Eco RI 단편내에 삽입시켰다. 그 다음, MMLV-RT 유전자를 전술한 바와 같이 Nco I-Hind III 단편으로서 상기 벡터내로 클론시켰다.
상기 작제물에 대하여 MMLV-RT 발현 정도를 측정 평가하였다. 9-염기 스페이서(SD9; 올리고뉴클레오티드 7)를 갖는 플라스미드를 함유하는 세포는 가장 높은 정도의 역전사효소 발현을 나타내었다. 플라스미드를 단리시키고 서열분석하였다: ATG 개시 코돈의 5'측의 퇴화 뉴클레오티드 4 및 5염기는 모두 아데노신(A) 잔기인 것으로 판명되었다. 발현 벡터는 pUC18N SD9D이라 명명하였다.
e. 테트라사이클린 내성 유전자의 삽입
pUC18의 엠피실린 내성 (β-락타마제) 유전자를 초기 벡터 작제시 선별 마커로서 사용하였다. 그런데, β-락타마제는 항생물질을 비교적 신속하게 파괴하기 때문에, 엠피실린이 유일한 선별기준이 되는 배양물중 상당한 크기의 플라스미드 결여된 복귀 돌연변이체 집단이 존재할 수 있다.
배양물중의 세포 집단을 치밀하게 조절하기 위해, 벡터를 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하도록 변형시켰다. 테트라사이클린이 항생물질을 불활성화시키기 보다는 항생물질의 세포질 흡수를 차단시키는 작용을 하기 때문에, 배양물은 엠피실린에서보다는 테트라사이클린의 존재시에 보다 안정하여야 한다.
테트라사이클린 내성 유전자를 pBR322로부터 1427 bp Eco RIO-Ava I 단편으로서 단리시켰다. 단일 가닥 오버행을 대장균 DNA 폴리머라제 I의 클레나우 단편을 사용하여 충전시켜, 평활 말단(blunt-ended) 단편을 얻었다. Aat II 링커를 테트라사이클린 내성 유전자 단편에 연결시키고 Aat II로 분해시켰다. 플라스미드 pUC18을 Aat II로 분해시키고 선형화된 벡터를 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하는 Aat II 단편에 연결시켰다. 연결 혼합물을 사용하여 수용성 대장균 JM109 세포를 형질전환시키고 형질전환물을 테트라사이클린 내성을 기준으로 하여 선별하였다. 플라스미드의 구조를 제한 유전자 지도화 방법에 의해 확인하였다. 양 방향으로 삽입시킨 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 클론을 선정하고, 이 플라스미드들을 pUC Tet(+) 및 pUC Tet (-)로 명명하였다.
2개의 플라스미드를 콜론된 MMLV 역전사효소를 함유하는 플라스미드내로 삽입시키기 위한 테트라사이클린 내성 유전자(Tet)의 공급체로서 사용하였다. RT유전자가 Aat II 부위를 갖고 있지 않은 반면, Tet 유전자는 역전사효소 클로닝에 사용되는 효소에 대한 제한 부위를 갖고 있기 때문에, 역전사효소 유전자(RT)를 이미 Tet 유전자를 함유하는 벡터내로 삽입시키기 위한 시도를 행하는 것이 바람직하다.
f. pUC18N SD9D MMLV Gly 및 pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(-) 작제
pUC18N MMLV Gly Tet (-)로부터 고유의 변형된 역전사효소를 2018 bp Nco I-Hind III 단편으로서 단리시키고 Nco I-Hind III 폴리링커 영역이 제거된 벡터 pUC18N SD9D로 연결시켰다. pUC18N SD9D MMLV Gly라 불리우는 생성된 플라스미드는 전술한 바와 같이 개선된 리보솜 결합부위 및 스페이서 영역을 갖는 것 이외에, 전술한 바와 같이 3가지 방식으로 변형시킨 MMLV-RT 유전자를 함유하였다.
이 플라스미드를 유일한 Aat II 부위에서 절단하고 pUC18 Tet (+)로부터 취한 Aat II Tet 유전자 단편을 벡터내에 삽입시키고 연결시켰다. Tet 유전자 삽입물을 함유하는 플라스미드를 양쪽의 가능한 배향으로 단리시키고 각 플라스미드를 함유하는 클론에 대해서 RT 발현 정도를 시험하였다. (-) 배향의 Tet 유전자를 갖는 클론(MMLV-RT와 동일한 배향으로의 암호화 가닥을 가짐)은 대향 배향의 Tet 유전자를 갖는 클론보다 RT 정도가 보다 높은 것으로 판명되었으며, 따라서 보다 선호되는 클론으로 선정되었다.
II. 숙주 세포 균주의 선정
하기 대장균 균주를 MMLV-RT의 발현 및 정제를 위해 시험하였다: JM109, DH5 αf', SLI Blue(Stratagene, San Diego, California), JM105, ER 1458, NM 522, Inv αf'(Invitrogen, San Diego, California), TOPPTM균주 1-6(Stratagene), 1200, MRE 600, Q 13, and A 19, 상기 균주들중 일부는 RNase I(균주 1200, MRE 600, Q 13, and A 19)이 결여된 돌연변이체이며, 다른 것들은 통상의 시험실 균주이다. 상기 균주들중 일부는 lac Iq억제자를 함유하며 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)에 의한 유도를 필요로 하였다. RT 유전자를 함유하는 숙주 세포의 RT 발현 정도는 SDS-폴리아크릴아미드 겔상 생성된 단백질의 가시화에 의해 측정되며, 또한, 대다수의 경우 조(crude) 세포 용균물상의 효소 활성 분석에 의해 측정된다. 상기 분석방법에 의하면, RNase I 결여 균주중에서 대장균 1200(Yale University E. coli Genetic Stock Center, Strain 4449)이 일관성있게 높은 정도의 효소 발현을 나타내었다. 별도의 언급이 없는 한, 본원에서 기술된 모든 실험은 이 균주를 사용하여 행하였다.
III. pUC18N SD9D MMLV Gly Tet(-)를 함유하는 대장균 1200의 성장
발효 배양 배지(A-Z 아민 배지)는 200리터의 용적에서 하기 성분들을 함유하였다.
N-Z 아민 A(Sheffield Products, Norwich, N.Y.) 2kg
이스트 추출물(Difco) 1kg
NaCl 1kg
NaOH 8kg
테트라사이클린(에탄올 70%중 12mg/ml) 200ml
상기 혼합물을 발효 용기중에서 121℃에서 20분동안 오토클레이브화한 후 방치 냉각시켰다. 온도가 37℃에 도달하였을 때, 테트라사이클린을 첨가하였다.
N-Z 아민 + 테트라사이클린 12㎍/ml(LB + Tet) 2ml를 벡터 함유 균주의 동결 스톡 배양물로 접종시키고 진탕하에 37℃에서 하루밤 배양함으로써 pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)를 함유하는 대장균 1200접종물을 제조하였다. 그 다음, 생성된 배양물 2ml를 사용하여 20개의 1리터들이 배양물을 접종시키고 다시 진탕하에 37℃에서 하루밤 배양하였다.
그 다음, 200리터의 발효조를 종균 배양물 20리터를 사용하여 접종시키고 배양물이 660nm의 파장에서의 광 감쇠를 측정한 바에 따라 결정된 최대 밀도에 도달하게 되면 세포를 37℃에서 30분까지 성장시켰다. 이는 접종한 후 약 7.5시간이 경과한 때이다. 배양하는 동안, 배양물을 초기 3시간동안 150rpm에서 연속 교반시키고 이어서 180rpm에서 교반시켰다. 용기를 45ℓ/분의 속도로 공기 스파아징(sparging)시켰다. 발효하는동안 배지의 pH는 조절하지 않았고, 그 기간동안 약 8.2로 상승되었다.
배양물을 20℃로 냉각시킨 후 샤플리스(Sharples) 원심분리기로 원심분리시켜 세포를 수거하였다. 세포를 세척하지 않았다. 세포덩어리를 200g씩으로 나누고 액체 질소중에서 동결시켰다. 동결시키는동안, 세포체를 작은 조각으로 파쇄시켜 신속하고 철저히 동결되도록 하였다. 이후, 동결시킨 세포 덩어리를 -70℃에서 저장하였다.
IV. 대장균 1200/pUC18N SD9D Gly Tet (-)로부터의 역전사효소의 정제
1. 역전사효소 활성 및 단백질 농도의 분석
역전사효소 활성을 분석하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본원은 캐시앙에 의해 기재된 dT:rA 분석법을 사용하였다[Kacian, Methods for Assaying Reverse Transcriptase, in Methods in Virology(Academic Press 1977); 본원에서 참고문헌으로서 채택됨]. 역전사효소 활성 1단위는 상기 문헌에 기재된 조건하에 dTTP 1 나노몰을 10분내에 산 석출가능한 형태로 전환하는 것이다.
2. 세포 용균
1,100g의 동결 세포덩어리를 파쇄시켜 조각으로 만들고 4℃에서 교반하에 용균 완충액(25mM 트리스-염산(pH 7.5), 10mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 10%(v/v) 글리세롤, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 1%(v/v) 글르세롤, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 1%(v/v) 트리톤 X-100, 10mM NaCl, 1mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드 (PMSF) 3.3리터에 현탁시켰다. 그 다음, 8,000psi의 연속 압력에서 APV Gaulin 15MR 균질화기를 2회 통과시켜 세포를 용균시켰다. 수용 용기를 비수조중에서 유지시키고 초기 균질화물을 2차 통과전에 37분동안 냉각시켰다. 그 다음, 용균물을 4℃에서 1시간동안 4,500 × g에서 원심분리시켜 맑게 하고 펠릿을 따라내어 버렸다. 맑은 용균물을 즉시 사용하거나 또는 -70℃에서 동결상태로 저장하고 사용전 4℃로 가온한다.
3. 포스포셀룰오로스 컬럼 크로마토그라피
포스포셀룰오로스(Whatman P11, 100g)를 제조자가 권장하는 바와 같이 0.5N NaOH 2.5리터 및 이어서 0.5N HCl 2.5리터로 처리하였다. 최종적으로 물로 세척한 후, 포스포셀룰오로스를 1.0M 트리스-염산(pH 7.5) 1.0리터에 현탁시키고 5내지 10분간 방치시키고 부흐너(Buchner) 펀넬로 옮겼다. 진공 여과시켜 완충액을 제거하고, 용출물의 pH가 세척 용액의 pH와 일치할때까지 포스포셀룰오로스를 1.0M 트리스-염산(pH 7.5)으로 세척하였다. 포스포셀룰오로스를 비이커에 옮겨 담고 컬럼 완충액(25mM 트리스-염산(pH 7.5), 1mM EDTA, 10%(v/v) 글리세롤, 1mM DTT, 0.1% 트리톤 X-100 및 1mM PMSF) 1.0리터에 현탁시켰다. 5내지 10분후, 완충액을 전술한 바와 같이 진공여과에 의해 제거하였다. 그다음, 포스포셀룰오로스를 0.05M NaCl을 함유하는 컬럼 완충액 700ml에 현탁시키고 4℃로 냉각시켰다.
후속 단계 모두를 4℃에서 행하였다. 크로마토그라피는 파마시아 FPLC 장치를 사용하여 행하였다. 파마시아 XK 50/30(5.0cm × 26.0cm)를 세척되고 평형화시 킨 포스포셀롤로오스로 채워 500ml의 베드를 얻었다. 그 다음, 컬럼을 60ml/시간의 유속에서 0.05M NaCl을 함유하는 컬럼 완충액 1리터로 세척하였다. 컬럼 어뎁터(Pharmacia AK 50)를 사용하여 컬럼 단부에서 빈 용적을 최소화하였다. 투명 세포 용균물 600ml를 30ml/시간의 유속에서 컬럼에 적용하였다. 컬럼 베드가 수축되기 때문에, 과량의 완충액을 컬럼베드상의 상부 공간으로부터 제거하고 탑 플로우 어뎁터를 재조정하여 베드 표면과의 접촉이 유지되도록 하였다.
컬럼을 30ml/시간에서 컬럼 완충액중 0.2M NaCl내지 0.7M NaCl의 선형 염 구배 1,500ml를 사용하여 용출시켰다. 용출물을 280nm에서의 흡수도에 의해 단백질의 존재를 검사하였다. 15ml분획이 수거되는 단백질 피크 용출 기간을 제외하고는, 25ml분획을 수거하였다.
컬럼 분획을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE) 및 이어서 염색(Coomassie Brilliant Blue staining)를 행하여 분석하였다. SDS-PAGE는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 본원에서 참고문헌으로서 포함되어 있는 라에밀리의 문헌[Laemmli. U.K., Nature 227:680(1970)]에 기재되어 있다. 각 분획에서 취한 10㎕를 각각의 겔 레인에서 분석하였다. 대조용 레인은 소정량의 정제된 MMLV RT를 함유하였다. MMLV-RT 대조군의 것과 유사하거나 또는 동일한 겉보기 분자량으로 이동하는 단백질 유의량 및 소량의 육안관찰 가능 오염 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 주요 단백질 피크내에 용출시킨 단백질 약 95%를 유의량의 오염 단백질을 포함시키지 않고도 수거할 수 있다. 활성 분석법을 또한 사용하여 피크 MMLV-RT 효소 분획을 발견하여 수거였는데, 이러한 절차는 당 업계의 통상의 숙련가에게는 공지되어 있는 기술이다.
4. 세파크릴 S200 겔 여과
용적이 80내지 100ml인 수거된 포스포셀룰오로스 분획을 25psi의 질소에서 아미콘(Amicon) P3O 멤브레인을 사용하여 아미콘 한외여과 세포중에서 한외여과시켜 25ml미만으로 농축시켰다. 2개의 2.6cm × 94cm의 파마시아 XK 26/100컬럼을 제조자의 지시에 따라서 세파크릴 S200(Pharmacia)으로 채웠다. 컬럼 어뎁터를 사용하여 빈 용적을 최소화하였다. 양 컬럼을 직렬로 연결하였다. 컬럼을 90ml/시간의 유속에서 0.2M NaCl을 함유하는 2리터 컬럼완충액으로 세척하였다. 농축시킨 포스포셀룰오로스 푸울(약 25ml)를 상류 컬럼상에 적재하고 컬럼을 90ml/시간의 유속에서 동일 완충액으로 용출시켰다. 다시, 용출물을 280nm에서의 흡수도에 대해 검사하고, 초기 용출물 200ml를 단일 푸울로 수거하고 단백질 피크의 용출동안 4ml분획을 수거하였다. 약 290 내지 300ml의 완충액을 컬럼에 적용시켰을 때, MMLY-RT가 용출되었다.
분획을 다시 전술한 바와 같이 SDS-PAGE를 사용하여 분석하였다. 피크 영역에서의 각 분획에서 취한 3㎕를 각각의 겔 레인에서 분석하였으며, 전술한 바와 같이 대조 레인은 기지의 매스의 정제된 MMLY-RT를 함유하고 있다. 정제된 MMLV-RT과 함께 이동하는 단백질 유의량을 함유하고 소량의 가시적인 오염 단백질을 함유하는 분획을 모았다. 바람직하게는, MMLV-RT보다 높은 겉보기 분자량의 우세 밴드를 함유하는 상기 분획들은 푸울내에 포함되지 않았다. 주요 S200 피크중 단백질 95내지 98%가 푸울중에 포함되었다. 역전사효소 활성에 대한 분석을 사용하여 분획중 MMLV-RT를 발견하고 동정할 수 있기는 하지만, 푸울중에 고분자량의 오염물이 포함되는 것을 방지하기 위해 SDS-PAGE를 포함하는 방법을 사용하는 것이 바람직하다.
수거된 S200 분획은 최적 사용을 위해 효율적으로 농축되었다. 효소를 -20℃에서 50% 글리세롤중에 저장할 수 있다.
[실시예 1]
pUC18N MMLV Gly Tet (-) 또는 변형된 리보솜 결합 부위 및 상이한 길이의 스페이서 서열을 갖는 pUC18N MMLV Gly Tet (-)을 함유하는 대장균에 의한 MMLV-RT의 발현
제1위치에서 글리신 아미노산 치환된 MMLV-RT 유전자를 벡터 pUC18N 및 전술한 바와 같이 스페이서와 변형된 리보솜 결합 부위를 갖는 벡터 pUC18N 중에서 평가하였다. 모든 벡터는 Tet 유전자를 함유하고 있으며 대장균 균주 1200중에서 평 가하였다.
2개의 작제물 중 어느 하나를 함유하는 대장균 1200 배양물 50ml를 진탕하에 37℃에서 16.5시간동안 성장시켰다. 0.5ml 분취액을 수거하고 미세원심분리기에서 2분동안 원심분리시키고 상등액을 버렸다. 세포 펠릿을 완충 세척액(50mM 트리스-염산(pH 8.0), 10mM 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 10%(v/v) 글리세롤, 5mM NaCl, 5mM EDTA 및 5mM 수크로오스) 0.5ml상에서 재현탁시킨 다음, 전과 같이 원심분리시켰다. 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시키고 용균 완충액(50mM 트리스-염산(pH 8.0), 10mM NaCl, 1mM EDTA, 1% 글리세롤, 5mM DTT, 0.2mM PMSF 및 100㎍/ml 리소자임) 200㎍에 재현탁시키고 20분동안 얼음상에서 방치시켰다. 100㎕의 0.75%(v/v) 트리톤 X-100을 각 샘플에 첨가하고 혼합물을 동결시키고 2회 해동시켰다. 용균물을 원심분리에 의해 맑게 하고 총 단백질을 본원에서 참고문헌으로 채택되는 리드(Read) 및 노쓰코트(Northcote)의 방법[Anal. Biochem. 116;53-64(1981)]에 의해 분석하였다.
용균물 분취량을 역전사효소 활성에 대해 분석하였다. 각 클론에 있어서의 역전사효소 활성 정도를 용균물중 총 단백질 mg당 단위 및 세균성 배양물 ml당 단위의 측면에서 계산하였다. 표 1에 나타낸 결과는 변형된 리보솜 결합부위(RBS) 및 9개의 스페이서 서열을 함유하는 벡터가 가장 높은 정도의 효소 발현을 나타내었음을 설명하고 있다.
[표 1]
[실시예 2]
대장균 1200 및 JM109 숙주 균주에 있어서의 변형된 MMLV-RT 비교
플라스미드 pUC18N을 사용하여 제1고유 아미노산 위치에서 글리신, 알라닌 또는 발린 치환체를 갖는 MMLV-RT를 암호화하는 플라스미드를 생성하였다. 상기 치환 형태는 개시 코돈에 이어 올리고머 3 및 4와 유사하나 RT 유전자의 제2위치에서의 서열 5'-GTT-3' 또는 5'-GCT-3'(발린 또는 알라닌 각각을 위한 암호화)의 코돈을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 이루어진 것이다. pUC18 Tet (+)로부터의 Tet 유전자를 비교용을 위해 각 배향으로 존재하는 생성된 플라스미드내로 삽입시켰다. 이 플라스미드를 사용하여 lac 리프세서 lac Iq유전자의 에피솜 복제물을 함유하는 대장균 JM 109 숙주세포를 형질전환시켰다. 세포가 로그상 성장에 도달할 때, IPTG 0.5mm를 약 22시간동안 첨가하여 lac 프로모터를 유발시키는 것을 제외하고는 세포 형질전환물을 실시예 1에서과 같이 하루밤 성장시켰다. 분취액을 수거하고 실시예 1에서와 같이 역전사효소 활성에 대해 분석하였다. 결과를 하기 표 2에 나타내었다, 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, Gly Tet (-)작제에 의한 것이 효소 발현 정도가 가장 높았다.
[표 2]
각 실험에서, Gly Tet (-) 및 Val Tet (-) 작제물을 대장균 숙주 1200 및 JM 109중에서 평가하였다 JM 109 배양물을 상기와 같이 유도하되, 단 1200 배양물은 유도시키지 않았다. 표 3에 나타낸 결과는 양 균주에서의 발현 정도가 Gly 치환된 MMLV-RT에 대해서는 필적할만하고, Val 치환된 플라스미드에 대해서는 균주 1200가 보다 높다는 사실을 나타내고 있다.
[표 3]
[실시예 3]
대장균 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)의 성장 및 MMLV-RT의 발현
성장 배지 1리터에는 N-Z아민 A 10g, 이스트 추출물 5g, NaCl 5g , 및 10N NaOH 0.1ml를 함유하고 있다. 70% 에탄올중 테트라사이클린 12mg/ml 1리터를 냉각시킨 오토클레이브 처리한 배지에 첨가하였다.
배지 2ml를 대장균 형질전환물의 동결 스톡 배양물로부터 접종하였다. 37℃에서 진탕하에 하루밤 성장시켰다. 세균성 배양물 2ml를 사용하여 배지 500ml를 접종시키고 이 배양물을 상기와 같이 하루밤 성장시켰다. 이어서, 배양물 500ml를 사용하여 발효조(New Brunswick BioFlo III fermenter)중에서 배지 5리터를 접종시켰다. 배양물을 35ORPM에서 진탕하에 37℃에서 성장시켰다. 배양물을 발효시키는동안 4ℓ/분으로 공기 스파아징시켰다. 매시간마다 5내지 10ml의 샘플을 취하여 PH, 광학농도, 단백질 농도 및 역전사효소 활성을 측정하였다. 이 결과를 하기 표 4에 명시하였다.
[표 4]
[실시예 4]
클로닝 MMLV-RT의 대규모 정제
효소를 상기 실시예 1에 기재한 바와 같이 제조하였다. 시약 용량은 실험과정 초기에 펠릿화 세포의 중량에 비례하여 조정하였다. 표 5에 명시한 바와 같이, 고도로 정제된 효소를 48%의 수율로 회수하였다.
[표 5]
[실시예 5]
1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)클론으로부터 정제된 MMLV-RT의 SDS-PAGE
정제 과정을 상기 실시예 4의 세파크릴 푸울 및 P-11 푸울중 단백질의 SDS-PAGE 분석에 의해 모니터하였다. SDS-PAGE를 필수적으로 상기한 라엠리(Laemmli)의 문헌에 기재한 바와 같이 10% 환원성 겔 중에서 행하였다. 샘플은 하기와 같이 제조하였다. P-11 푸울 분취액을 겔 샘플 완충액(50mM 트리스-염산(pH 6.8), 10% (v/v) 글리세롤, 5% β-메르캅토에탄올(BME), 2%(w/v) SDS 및 0.05%(w/v) 브로모페놀 블루) 중에서 50배 희석시켰다. 세파크릴 컬럼 푸울로부터의 분취액을 겔 샘플 완충액으로 10배 희석하고 동일 방식으로 가열하였다. 시판품으로서 얻을 수 있는 MMLV-RT(USB, Cleveland, OH) 샘플을 동일하게 제조하였다. 공급자에 의하면, 상기 시판품에서 얻는 샘플은 187,000U/mg의 특이활성을 갖고 1500U/㎕의 초기 농도를 갖고 있다. 예비 염색시킨 분자량 마커(Bio Rad Laboratories, San Rafael, CA)를 사용하여 샘플 푸울중에 함유된 단백질의 분자량을 예측하였다. 마커 단백질의 겉보기 분자량은 18,500Da(난백 리소자임), 27,500Da(대두 트립신 억게제), 32,500Da(소의 탄산 탈수소효소), 49,500Da(닭의 오브 알부민), 80,000Da(소의 혈청 알부민), 및 106,000Da(토끼 근육에서 취한 포스포릴라제 B)이다. 겔을 표 6에 명시한 바와 같이 적용시키고 결과를 도 10에 도시하였다.
[표 6]
[실시예 6]
MMLV-RT의 시판 제품에서의 오염 리보뉴클레아제 활성
세파덱스 G75 24cm ×0.4cm를 하기 완충액(1X컬럼 완충액)으로 평형화시켰다:(20mM 트리스-염산(pH 7.6), 0.1mM EDTA, 200mM NaCl, 1mM 디티오트레이톨(DTT), 0.01%(v/v) 노니데트(Nonidet) P-40 및 10%(v/v) 글리세롤.
핵산 혼성화를 가용하여 RNase 분석을 행하여 효소로 배양시킨 RNA의 손실을 측정하였다. 상기 방법에 대해서는 하기 문헌에 상세하게 기재되어 있다[아놀드 등의 미국특허 제5,283,174호, 넬슨(Nelson) 등의 미국특허출원 제08/094,577호]. 각 효소 샘플에서 취한 5ml를 시험관에 옮겨 담았다. 물 중 실험실 합성 RNA 전사물(약 1내지 4fmol)를 첨가하고 반응물을 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. RNA 전사물 영역에 상보성인 아크리디늄 에스테르 표지화 DNA프로브 50ml를 0.1M 리튬 숙시네이트(pH 4.7), 1.1M 리튬 클로라이드, 2%(w/v) 리튬 라우릴 술페이트, 20mM EDTA, 20mM 에틸렌 글리콜 비스(베타-아미노 에틸 에테르) N, N, N-1, N-1테트라아세트산(EGTA), 15mM 알드리티올(Aldrich Chemical Company, Milwaukee, Wisconsin)에 첨가하고 반응 흔합물을 60℃에서 20분동안 배양시켰다. 0.6M 나트륨 보레이트(pH 8.5), 1%(v/v) 트리톤 X-100용액 300ml를 첨가하고 반응 혼합물을 60℃에서 7분동안 배양시켜 비표지화 표적상에 존재하는 아크리디늄 에스테르를 분해시켰다. 잔존 표지의 양을 발광측정기상에서 측정하였다.
방사선표지 프로브를 사용하여 RNase 활성을 분석하거나 또는 산 수용성 형태로 석출가능한 산으로부터의 전환을 모니터하여 방사선표지화 RNA의 분해를 직접 측정하는 유사방법이 당업계에 공지되어 있으며 본 발명의 실행하는데 사용할 수 있다. 저능도의 RNase 활성을 분석하는 다른 방법들을 과학 문헌에서 찾아 볼 수 있으며 본 발명을 실행하는데 있어 그를 응용하는 방법은 당업계의 숙련가에 의해 인지될 것이다.
시판 MMLV-RT제제(U.S. Biochemicals, Cleveland, Ohio) 25㎕를 글리세롤 무함유 1OX 컬럼 완충액 12.5㎕, 블루 덱스트란(Blue Dextran) 10mg/ml 용액 10㎕, 및 물 77.5㎕와 혼합시켰다. 사용하기전에 물을 전술한 샘브륙의 문헌에 기재한 바와 같이 디에틸 피로카르보네이트로 처리하여 오염 RNAse를 분해시켰다. 효소를 컬럼에 적용하고 유속 1.8ml/시간에서 컬럼 완충액으로 용출시켰다. 230㎕ 분획을 수거하고 전술한 바와 같이 역전사효소 및 RNAse 활성에 대해 분석하였다.
2개의 동일한 컬럼 실험에 대한 결과를 하기 표 7에 명시하였다
[표 7]
상기 표에서 설명한 바에 따르면, 시판되는 효소제제는 유의성 있는 내인성 RNAse 활성을 갖고 있다. 이 RNAse 활성은 단일 가닥 RNA를 분해시키기 때문에, MMLV-RT 효소 연관 RNAse H 활성 이외의 것이다. 겔 여과 크로마토그라피에 의해 분석하는 경우, 비-RNAse H RNAse 활성의 적어도 4개의 피크가 얻어진다. 상기 피크는 4개의 별개의 효소를 나타내고 있다. 또한, 이들은 하나 이상의 단백질 응집, 상기 단백질의 소단위로의 해리, 또는 기타 크로마토그라피 인공 산물을 나타낼 수 도 있다. 비-RNAse H RNAse 활성의 피크중 적어도 하나는 MMLV-RT와 동시 용출된다.
[실시예 7]
대장균 숙주 세포 JM 109 및 1200에서 취한 부분 정제 재조합 MMLV-RT중 오염 리보뉴클레아제의 비교
숙주 세포와 JM 109 및 1200 사이의 P-11 컬럼 정제물을 플라스미드 pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)로 형질전환시킨 후, MMLV-RT 함유 세포 용균물 중에 존재하는 오염 리보뉴클레아제의 양을 비교하기 위해, 각 컬럼에서 취한 분획을 캐시앙의 문헌[Meth, Virol. 상기 참조]에 기재된 dT:rA 분석법을 사용하여 역전사효소 활성에 대해 그리고 전기의 실시예에서 기재한 분석법을 사용하여 비-RNAse H RNAse 활성에 대해 분석하였다.
각 세포 유형에서 얻은 결과를 하기 표에 명시하였다.
[표 8]
[표 9]
상기 데이타는 JM 109 세포로부터 제조된 효소는 P11 컬럼 프로파일 전반에 걸쳐 유의성 있는 양의 비-RNAse H 리보뉴클레아제 활성을 갖고 있음을 나타낸다. 대조적으로, 원 추출물을 포스포셀룰오로스 컬럼 크로마토그라피에 의해 정제시킨 후, 대장균 1200 세포로부터 정제된 역전사효소는 검출가능한 오염 RNAse 활성이 존재하지 않았다.
[실시예 8]
대장균 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)로부터 취한 정제 재조합 MMLV 역전사효소를 사용한 마이코박테리움 결핵 리보솜 RNA 표적 서열의 증폭
핵산 증폭은 본원에 참고문헌으로서 채택되어 있으며 본 출원과 공동 소유권자인 캐시앙 및 훌쯔의 유럽특허공개공보 제0 408 295 A2호에 기재된 방법을 사용하여 수행하였다. 시약 혼합물을 하기와 같이 제조하였다: 물 768㎕를 1M 트리스-염산(pH 8.0) 25㎕, 1M Mgcl250㎕, KCl 44㎕, 40mM rTNPs 500㎕, 10mM dNTPs 500㎕, T7 프로모터-프라이머(84pmoles/㎕) 9㎕ 및 비-T7프라이머(150 pmole/㎕) 5㎕를 순서대로 혼합하였다. 상기 혼합물 용적(용액 A)을 계산하여 5O회의 분석에 적합하도록 하였다. 용액 A 5O㎕를 각 반응 튜브에 첨가하였다. 주형 희석 완충액(150mM NaCl중 소의 혈청 알부민 0.2%(w/v))중에 희석시킨 정제 표적 rRNA(0.05 내지 25fg/㎕) 40㎕를 각 튜브에 첨가하였다. 표적 rRNA는 긴축 혼성화 조건하에 혼성화를 위해 프라이머 및 프로모터-프라이머에 효과적으로 상보성인 핵산 서열을 갖는다. rRNA 표본은 당 업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 실리콘 오일 200㎕를 각 반응 혼합물 표면에 적층시키고 반응 튜브를 가열 블럭에서 95℃에서 15분동안 가열하였다. 그 다음, 반응 튜브를 42℃의 수조에 옮겨 담고 5분동안 방치 냉각시켰다.
희석 완충액 46.8㎕를 튜브에 옮겨 담고 MMLV-RT(900 U) 1.1㎕ 및 T7 RNA 폴리머라제(400 U) 2㎕를 첨가하여 효소 혼합물을 제조하였다. 그 다음, 혼합물을 각 튜브에 첨가하엿다. 그 다음, 반응물을 42℃에서 2시간동안 배양시켰다.
모두 본원에서 참고문헌으로 채택되어 있는 아놀드(Arnold) 등의 문헌[PCT W089/02476; 본 발명과 공동 소유권자임] 및 아놀드 등의 문헌[Clin. Chem. 35:1588-1594(1989)]에 기재된 표적 서열로 의존성된 아크리디늄 에스테르 표지화 DNA 프로브를 사용하여 발생시킨 증폭 RNA의 양을 측정하였다. 음성 대조군의 경우에만 2회 행하는 것을 제외하고는, 모든 반응을 4회 시행하였다. 하기 표 10에 명시된 결과는 증폭 표적의 포화도는 실험 초기에 투입된 주형 RNA 2.5fg 만큼 적은 양을 사용하여 얻었다는 사실을 나타내고 있다.
[표 10]
[실시예 9]
대장균 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)로부터 취한 정제 재조합 MMLV-RT를 사용한 cDNA의 합성
rRNA 서열화 반응에서 재조합 정제 MMLV-RT의 cDNA 합성능을 시판되고 있는 역 전사효소 제제(U.S. Biochemicals)의 것과 비교하였다.
1M 트리스-염산(pH 7,5) 20ml, 0.4mM EDTA(pH 8.7) 및 트리에틸아민 281.7 ㎕를 혼합하여 TTE 완충액을 제조하였다. 프라이머는 하기 서열을 포함하고 있다.
프라이머를 폴리뉴클레오티드 키나제를 사용하여 그의 5' 말단에서32P로 표지화시켰다. 말단 표지화 핵산에 대한 절차는 일반적으로 당업계에 공지되어 있다. 말단 표지화시킨 후, 프라이머를 제조자의 기술 내용에 따라 넨소르브TM(NensorbTM) 컬럼(New England Nuclear)상에서 크로마토그라피시킨 후, 에탄올 석출시켜 정제하였다.
반응은 대장균 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-) 또는 상업적 매매인에게서 구입한 역전사효소를 사용하여 수행하였다.
반응 흔합물은 하기 시약을 최종 용적 100㎕로 함유하였다. GPE 완충액(5OO mM 트리스-염산(pH 7.6), 175mM Mgcl2, 250mM KCl, 20mM 스페르미딘) 10㎕, 스톡 dNTPs(25mM rCTP 및 rUTP; 65mM rATP 및 rGTP) 8㎕, 스톡 dXTPs(10mM) 4㎕, 1M DTT 0.5㎕,32P-표지화 프라이머 20pmloe, 비표지 프라이머 20pmole, 정제 대장균 rRNA 20pmoles, 역 전사효소 600U. 모든 성분들을 역전사 효소없이 혼합한 다음, 혼합물을 95℃에서 5분동안 가열하여 주형 RNA 2차 구조를 변성시켰다. 그 다음, 반응물을 60℃에서 30분동안 정치시켜 프라이머를 rRNA 표적에 어니일링시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 역전사효소를 첨가하였다. DNA 합성은 40℃에서 60분동안 수행하였다. 반응물을 필수적으로 월리암 등의 문헌[BioTechniques 4: 138-147(1986)]에 기재된 7% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분석하였다.
겔 전기영동 그래프로부터 판단한 바, 양 효소는 RNA 주형으로부터 cDNA를 동등한 효율로 합성하는 것으로 판명되었다.
[실시예 10]
대장균 1200/pUC18N SD9D MMLV Gly Tet (-)로부터 취한 재조합 MMV-RT를 사용한 역전사효소 개재된 PCR
모든 PCR 반응을 퍼킨 엘머-세투스(Perkin Elmer-Cetus) 모델 9600 DNA 열순환기(thermal cycler) 중에서 시행하였다. 열순환기는 반응물을 하기 방식 및 순서로 배양시키도록 프로그램이 짜여 있다: 94℃에서 3분간; 51℃에서 30초동안 35회 순환, 72℃에서 2분동안 순환, 및 94℃에서 1분동안 순환; 72℃에서 5분; 4℃에서하루밤.
상기 실험을 위해 2종류의 별개의 MMLV-RT 제제 및 상기한 바와 같은 동일한 상업적 매매자로부터 구한 로트(lot)를 사용하였다. 상이한 양의 RT를 시험한 결과, 사용된 모든 효소 제제에 있어 효소 50U가 가장 적합한 것으로 밝혀졌다. 본 실험에서 사용된 시약은 하기와 같다: 5X RT완충액(50mM 트리스-염산(pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl2, 5mM DTT); 1OX PCR 완충액(퍼킨 엘머)(100mM 트리스-염산(pH 8.3), 5OOmM KCl, 15mM Mgcl2, 0.1% 젤라틴); RT 프리믹스(각 반응에 대해) (5X RT 완충액 4㎕, 각 dNTPs의 25mM용액 0.8㎕, RT 50단위, (-) 센스 프라이머 100mole, 총 용적 20㎕까지의 물); PCR 프리믹스(각 반응에 대해) (1OX PCR 완충액 8㎕, (+) 센스 프라이머 100pmole, Taq DNA 폴리머라제 2.5단위, 및 총 용적 80㎕까지의 물). 프로브를 10mM 리튬 숙시네이트 완충액(pH 5.0), 0.1%리튬 라우릴 술페이트 (LLS)중에 저장하였다.
본 실험을 위해 사용된 프로브 및 프라이머를 인간 유두종(papilloma) 바이러스(HP7) 게놈 서열에 상보성이 되도록 디자인하였다. 프로브를 본원에서 참고문헌으로 채택된 아놀드 및 넬슨의 PCT 특허출원 제W089/02476호에 기재된 아크리디늄 에스테르로 표지화하였다.
10mM 나트륨 포스페이트(pH 7.6), 100mM NaCl중 1.6 × 107세포/ml 농도에서 시하(SiHa) 세포(그 게놈중에 삽입시킨 HPV 핵산 서열을 함유함)를 현탁시켜 비스플라이스(unspliced) 주형 RNA 조야 표본을 제조하였다. 세포를 95℃에서 15분동안 가열하고 실온으로 냉각시킨 다음, 목적하는 농도로 물로 희석시켰다. E6 유전자에서의 RNA 전사물을 HPV16 E6 유전자를 함유하는 플라스미드로부터 DNA의 실험실내 전사에 의해 제조하였다. 문헌[마쯔구라(Matsukura) 등의 J. Virol. 58:979-982(1986)]에 기재된 HPV 클론으로부터 DNA 단편을 pBluescriptTMII SK (+) 및 (-) 센스 클로닝 벡터(Stratagene, San Diego, California)내로 클로닝시켜 이 플라스미드를 작제하였다. 상기 언급한 문헌은 본원에서 참고문헌으로서 채택되어 있다. RNA 전사물은 제조자에 의해 지시된 방법대로 제조하였다.
증폭 반응은 하기와 같이 행하였다. 표적 핵산을 MMLV-RT 프리믹스에 첨가하였다. 이 혼합물을 95℃에서 2분동안 가열하였다. 프라이머를 첨가하고 표적 핵산을 60℃에서 10분동안 어니일링시켰다. 그 다음, 반응 혼합물을 얼음상에서 냉각시켰다. 역전사효소를 첨가하고 반응물을 37℃에서 30분동안 배양시켰다. 그 다음, 반응물을 95℃에서 10분동안 가열하여 역전사효소를 불활성화시켰다. 혼합물을 얼음중에서 냉각시키고 미네랄 오일 2적을 각 튜브의 표면에 적층시켰다.
Tag DNA 폴리머라제를 전술한 소정의 농도에서 PCR 프리믹스중에서 희석시켰다. PCR 프리믹스 80㎕를 각 샘플에 혼합시켰다. 샘플을 95℃에서 열순환기중에 정치시키고 전술한 바와 같이 순환시켰다.
혼성환 및 검색은 상기 언급한 아놀드 및 넬슨의 문헌에서 기재한 방식대로 행하였다. 각 혼성화 분석의 경우, 물 30㎕를 PCR 반응 혼합물 10㎕에 첨가하였다. DNA를 95℃에서 2시간동안 변성시켰다. 희석 프로브 10㎕를 첨가하고 혼합시켰다. 그 다음, 튜브를 60℃에서 15분동안 배양시켰다. 선택 시약 300㎕를 첨가하고 튜브를 혼합하고 60℃에서 5분동안 배양시켰다. 그 다음, 튜브를 얼음중에서 냉각시키고 잔존 아크리디늄 에스테르-표지를 리이더TM(LEADERTM) 발광측정계(Gen-Probe Incorporated, San Diego, CA)내에서 측정하였다.
결과를 하기 표 11에 명시하였다.
[표 11]
서열표
(1) 일반적 정보 :
(i) 출원인 : 젠-프로브 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭 : 고도로 정제된 재조합 역전사효소
(iii) 서열 수 : 13
(iv) 연락주소
(A) 연락자 : 김＆장
(B) 주소 : 서울시 종로구 운니동 114-31 서울빌딩
(C) 우편번호(ZIP) : 110-350
(v) 컴퓨터 판독형 :
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(B) 컴퓨터 : IBM 호환기종
(C) 운영 체계 : 마이크로소프트 MS-DOS(버젼 6.0)
(D) 소프트웨어 : fastSeq
(vi) 현 출원 데이타 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
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(vii) 우선권 출원 데이타 :
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(B) 출원일 : 1995.3.29
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(ix) 변호사/대리인 정보
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(2) 서열동정 번호 : 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성:
(A) 길이 : 114
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호: 1
(3) 서열동정 번호 : 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성:
(A) 길이 : 112
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 2
(4) 서열동정 번호 : 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 24
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명: 서열 동정 번호 : 3
(5) 서열동정 번호 : 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 20
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열 동정 번호 : 4
(6) 서열동정 번호 : 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 115
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서옅 동정 번호 : 5
(7) 서열동정 번호 : 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 116
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명: 서열 동정 번호 : 6
(8) 서열동정 번호 : 7에 대한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 117
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 7
(9) 서열동정 번호 : 8에 대한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 23
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 8
(10) 서열동정 번호 : 9에 대한 정보
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 16
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 9
(11) 서열동정 번호: 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특성:
(A) 길이 : 15
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호: 10
ATGGGTCTGA ACATC 15
(12) 서열동정 번호 : 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 46
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 11
(13) 서열동정 번호 : 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 53
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 12
(14) 서열동정 번호 : 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 길이 : 19
(B) 형태 : 핵산
(C) 가닥 : 단일
(D) 토폴로지 : 선형
(ii) 서열 설명 : 서열동정 번호 : 13
Claims (4)
- a. 성숙 천연 몰로니종 쥐의 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사 효소와 실질적으로 크기가 같은 RNA 의존성 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 MMLV로부터 유래된 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 함유하고 RNase가 결핍된 다수의 대장균 숙주 세포를 제공하는 단계; b. 상기 재조합 폴리펩티드를 함유하는 다수의 숙주 세포를 용균시켜 세포 용균물을 형성하는 단계; c. 상기 세포 용균물을 약 0.05M 이하의 NaCl에 해당하는 전도도를 갖는 용액의 존재하에 양이온 교환 배지에 첨가하여, 상기 재조합 폴리펩티드를 양이온 교환 배지에 결합시키는 단계; d. 상기 재조합 폴리펩티드를 약 0.2M NaCl에 해당하는 전도도로 시작하여 약 0.7 M NaCl에 해당하는 전도도로 종결되는 염 구배와 접촉시킴으로써 상기 양이온 교환 배지로부터 결합된 폴리펩티드를 용출시킨 다음, 하나 이상의 분획중에서 상기 재조합 폴리펩티드를 회수하는 단계; e. 상기와 같이 회수된 재조합 폴리펩티드를 함유하는 상기 분획을 겔 여과 컬럼에 가하여 상기 재조합 폴리펩티드를 하나 이상의 분획중에서 회수하는 단계를 포함하는, RNA 의존성 및 DNA 의존성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 재조합 폴리펩티드의 정제방법.
- (정정) 제1항에 있어서, 상기 RNAse 결핍 숙주 세포가 대장균 균주 1200으로 이루어진 것인 방법.
- (정정) 제1항에 있어서, 상기 양이온 교환 배지가 포스포셀룰오로스 유도체로 이루어진 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드의 겉보기 분자량이 약 70,000달톤인 것인 방법.
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