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CN1233660A - 生产l－谷氨酸的细菌和生产l－谷氨酸的方法 - Google Patents

生产l－谷氨酸的细菌和生产l－谷氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

通过在液体培养基中培养微生物产生L－谷氨酸,该微生物属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属,并且具有产生L－谷氨酸的能力,其催化L－谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加,或催化L－谷氨酸分支反应并且产生不是L－谷氨酸的化合物的酶的活性减少或缺乏,并且从培养基中收集产生的L－谷氨酸。

Description

生产L-谷氨酸的细菌和 生产L-谷氨酸的方法
本发明涉及新的生产L谷氨酸的细菌和通过利用同样细菌发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是可作为食物，药物和诸如此类的重要氨基酸。
通常L-谷氨酸已经利用所谓的生产L-谷氨酸的棒状细菌通过发酵方法产生，该细菌原则上属于短杆菌属，棒状杆菌，和微杆菌或它们的变异体(“氨基酸发酵”，Gakkai Shuppan中心，第195-215页，1986)。至于通过利用其它细菌菌株发酵生产L-谷氨酸的方法，已知有利用芽孢杆菌，链霉菌，青霉菌和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,220,929)，利用假单孢菌，节杆菌，沙雷伯氏菌，念珠菌属和诸如此类的微生物的方法(美国专利号3,563,857)，利用芽孢杆菌，假单孢菌，沙雷伯氏菌属和诸如此类或产气气杆菌(目前称为产气肠杆菌)的方法(日本专利公开号(KOKOKU),32-9393(1957))，利用大肠杆菌的变异体菌株的方法(日本未审专利申请公开号(KOKAI)5-244970(1993))和诸如此类的方法。
虽然通过前面所述培育这样的微生物或改善的生产方法已经相当大地提高L-谷氨酸的生产率，仍然需要开发更廉价和更有效的生产L-谷氨酸的方法，以便满足将来对氨基酸的明显增长的需要。
本发明的目的是发现生产L-谷氨酸的能力高的新的生产L-谷氨酸细菌，从而开发生产L-谷氨酸的更廉价和更有效的方法。
为了达到前面的目的，本发明人广泛地研究具有生产L-谷氨酸能力的微生物，这些微生物与过去报道的微生物不同。作为结果是，他们发现了某些起源于属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的菌株具有高的生产L-谷氨酸的能力，并且已经完成本发明。
所以，本发明提供：
(1)属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物并且具有生产L-谷氨酸的能力，至少具有下面的一个特性：
(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和
(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏；
(2)上面(1)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶是至少一种选自包括柠檬酸合成酶(下面简写为“CS”)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(下面简写为“PEPC”)，和谷氨酸脱氢酶(下面简写为“GDH”)的酶；
(3)上面(2)的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶包括CS，PEPC和GDH三者；
(4)上面(1)到(3)中的任何一个的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应和生产不是L-谷氨酸的化合物的酶是α-酮戊二酸脱氢酶(下面简写为“αKGDH”)；
(5)上面(1)到(4)的任何一个的微生物是成团肠杆菌或液化沙雷伯氏菌；和
(6)生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养如上面(1)到(5)的任何一个定义的微生物以便生产和在培养基中积累L-谷氨酸，并收集来自培养基的L-谷氨酸。
由于本发明的微生物具有高的生产L-谷氨酸的能力，通过利用前面已知的生产L-谷氨酸的棒状细菌和诸如此类的培育技术使微生物具有更高的生产能力被认为是可能的，可以期望通过适当选择培养条件和诸如此类能够发展更廉价和更有效的生产L-谷氨酸的方法。
图1显示具有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒pMWCPG的构建。
图2显示了具有gdhA基因的质粒pSTVG的构建。
图3显示了具有广谱寄主范围的质粒RSF1010的复制原点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。
图4显示了具有广谱寄主范围的质粒RSF1010的复制原点，四环素抗性基因，gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。
图5显示了具有gltA基因的质粒pMWCB的构建。
图6显示了起源于成团肠杆菌的pTWVEK101的DNA片断的限制图谱。
图7显示了从起源于成团肠杆菌的sucA基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。上面部分：成团肠杆菌，下面部分：大肠杆菌(下面同样应用)。
图8显示了从起源于成团肠杆菌的sucB基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。
图9显示了从起源于成团肠杆菌的sdhB基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。
图10显示了从起源于成团肠杆菌的sucC基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列与起源于大肠杆菌的序列的比较。
下面将详细解释本发明。
本发明的微生物是属于肠杆菌或沙雷伯氏菌的微生物，并且具有至少一个下面的特性：
(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和
(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成的途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。
这样的微生物可以通过利用肠杆菌属或沙雷伯氏菌属的微生物作为亲本菌株并且使该微生物具有上面(a)和/或(b)的特性而得到。属于可以用作亲本菌株的肠杆菌属或沙雷伯氏菌属的微生物的实例如下列出：
成团肠杆菌
产气肠杆菌
河生肠杆菌
阿氏肠杆菌
阴沟肠杆菌
溶解肠杆菌
日勾维肠杆菌
霍氏肠杆菌
中间肠杆菌
超压肠杆菌
阪崎肠杆菌
生癌肠杆菌
液化沙雷伯氏菌
嗜虫沙雷伯氏菌
无花果沙雷伯氏菌
居泉沙雷伯氏菌
格氏沙雷伯氏菌
变形斑沙雷伯氏菌
气味沙雷伯氏菌
普城沙雷伯氏菌
深红沙雷伯氏菌
更优选地，可以提到下面列出的那些细菌菌株：
成团肠杆菌ATCC12287
成团肠杆菌AJ13355
液化沙雷伯氏菌ATCC14460
成团肠杆菌AJ13355于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，接受的登记号是FERMP-16644，然后于1999年1月11日根据布达佩斯条约转为国际保藏，登记号是FERMBP-6614。可从ATCC得到成团肠杆菌ATCC12287，和液化沙雷伯氏菌ATCC14460。
成团肠杆菌AJ13355是在Iwata-shi,Shizuoka，日本的土壤分离的菌株。
AJ13355的生理特性如下：
(1)革兰氏染色：阴性
(2)氧行为：兼性厌氧菌
(3)过氧化氢酶：阴性
(4)氧化酶：阳性
(5)硝酸盐还原：阴性
(6)Voges-Proskauer反应：阳性
(7)甲基红测试：阴性
(8)脲酶：阴性
(9)吲哚生产：阳性
(10)游动性：存在
(11)在TSI培养基中产生硫化氢：轻微活化
(12)β-半乳糖苷酶：阳性
(13)糖同化能力：
    阿拉伯糖：阳性
    蔗糖：阳性
    乳糖：阳性
    木糖：阳性
    山梨糖醇：阳性
    肌醇：阳性
    海藻糖：阳性
    麦芽糖：阳性
    蜜二糖：阳性
    阿东糖醇：阴性
    蜜三糖：阳性
    水杨苷：阴性
    蜜二糖：阳性
(14)甘油糖同化能力：阳性
(15)有机酸同化能力：
    柠檬酸：阳性
    酒石酸：阴性
    葡糖酸：阳性
    乙酸：阳性
    丙二酸：阴性
(16)精氨酸脱水酶：阴性
(17)鸟氨酸脱羧酶：阴性
(18)赖氨酸脱羧酶：阴性
(19)苯丙氨酸脱氨酶：阴性
(20)形成色素：黄色
(21)明胶液化：阳性
(22)生长pH：在pH4没有很好生长，在pH4.5到7生长很好
(23)生长温度：在25℃生长很好，在30℃生长很好，在37℃生长很好，在42℃能够生长，在45℃不能生长。
从这些细菌特性，确定AJ13355是成团肠杆菌。
在下面所述的工作实施例中，利用成团肠杆菌ATCC12287，成团肠杆菌AJ13355，和液化沙雷伯氏菌ATCC14460作为起始亲本菌株用于获得催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加的菌株，或催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏的菌株。但是，通过属于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的任何细菌经Embden-Meyerhof途径完成糖代谢，在这一途径产生的丙酮酸在需氧条件下的三羧酸循环中氧化。通过GDH或谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶从三羧酸循环的中间产物α-酮戊二酸生物合成L-谷氨酸。所以，这些微生物拥有同样的L-谷氨酸生物合成途径，并且属于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的微生物包含在本发明的一个构思中。所以，除了其它上面提到的种类和菌株，属于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的其它微生物也在本发明的范围内。
本发明的微生物是属于肠杆菌属或沙雷白氏菌属并且具有产生L-谷氨酸的能力的微生物。在本文使用的表述“具有生产L-谷氨酸的能力”指具有在培养过程中在培养基中积累L-谷氨酸的能力。根据本发明，产生L-谷氨酸的能力是通过给予下面的一个或两个特性得到的：
(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和
(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应，并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。
作为催化肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的L-谷氨酸的生物合成的反应的酶的例子，可以提到的是GDH，谷氨酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合酶，CS,PEPC，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘油酸变位酶，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果糖二磷酸醛缩酶，磷酸果糖激酶，葡糖磷酸异构酶和诸如此类。在这些酶中，CS,PEPC和GDH中的一个或两个或三种是优选的。作为本发明的微生物，更加优选的是所有三种酶CS,PEPC和GDH的活性增加。是否微生物增加了靶酶的活性，活性增强的程度通过细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性的测量，并且将它与野生型菌株或亲本菌株比较可以确定。
本发明的微生物，属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属，其催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加，例如这种微生物可以作为变异体获得，其中在编码该酶的基因中已经产生突变，或通过利用上面提到的微生物作为起始亲本菌株的遗传重组菌株获得。
为了增强CS,PEPC或GDH的活性，例如，编码CS,PEPC或GDH的基因可以克隆进入适当质粒，可以利用得到的质粒转化作为寄主的前面提到的起始亲本菌株。这可以增加编码CS,PEPC和GDH的基因的拷贝数(下面分别简写为“gltA基因”，“ppc基因”，和“gdhA基因”)，结果，增强了CS,PEPC和GDH的活性。
将选自克隆gltA基因，ppc基因和gdhA基因的一种或两种或三种以任何联合导入上面提到的起始亲本菌株。当导入两或三种基因时，将这两或三种基因克隆进入一种质粒，并且导入寄主，或者它们分别克隆进入两或三种质粒，所述质粒可以在同一寄主中存在，并且导入寄主中。
对质粒没有特别限制只要它能够在属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物中自主复制。质粒的例子包括，例如，pUC19,pUC18,pBR322,pHSG299,pHSG298,pHSG399,pHSG398,RSF1010,pMW119,pMW118,pMW219,pMW218和诸如此类。除了这些质粒，也可以使用噬菌体DNA载体。
通过例如，D.M.Morrison(酶学方法68,326(1979))的方法，利用氯化钙增强受体细胞对DNA的通透性的方法(Mandel,M.和Higa,A.，分子生物学杂志，53,159(1970))，或诸如此类的方法可以达到转化。
CS,PEPC和GDH的活性也可以通过存在于作为寄主的起始亲本菌株的染色体DNA上的gltA基因，ppc基因和/或gdh基因的多个拷贝增强。为了在属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的染色体DNA中导入多个拷贝的gltA基因，ppc基因和/或gdhA基因，可以利用存在于染色体DNA上的多个拷贝的序列如重复DNA，和存在于转座因子末端的倒转重复。可选择地，也可以将多个拷贝的基因导入染色体DNA，方法是利用携带gltA基因，ppc基因或gdhA基因的转座子的转座。这些技术可以增加转化体细胞中的gltA基因，ppc基因，和gdhA基因的拷贝数，结果增强了CS,PEPC和GDH的活性。
可以利用任何生物体作为用于增加拷贝数的gltA基因，ppc基因和gdhA基因的来源，只要生物体具有CS,PEPC和GDH活性。在这些生物体中，细菌，即原核生物，如那些属于肠杆菌，克雷伯氏菌，欧文氏菌，泛菌，沙雷伯氏菌，埃希氏菌，棒状杆菌，短杆菌，和芽孢杆菌属的细菌是优选的。作为特定的实例，可以提到大肠杆菌。从上面提到的这样的微生物的染色体DNA可以得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。
通过分离补充缺乏CS,PEPC或GDH活性的变异体菌株的营养缺陷型的DNA片断可以从前面提到的任何微生物的染色体DNA分别得到gltA基因，ppc基因和gdhA基因。可选择地，因为已经阐明了埃希氏菌或棒状杆菌属的细菌的这些基因的核苷酸序列(生物化学，22卷，5243-5249,1983；生物化学杂志，95卷，909-916,1984；基因，27卷，193-199,1984；微生物学，140卷，1817-1828,1994；分子遗传学，218卷，330-339,1989；和分子微生物学，6卷，317-326,1992)，利用根据每个阐明的核苷酸序列合成的引物和染色体DNA作为模板，通过PCR可以获得这些基因。
除了通过上面提到的基因扩增，通过增强gltA基因，ppc基因或gdhA基因的表达也可以增强CS,PEPC或GDH的活性。例如，通过利用另一个强启动子替代gltA基因，ppc基因或者gdhA基因的启动子增强表达。这样的强启动子的例子包括，例如lac启动子，trp启动子，trc启动子，tac启动子，λ噬菌体PR启动子和PL启动子和诸如此类。启动子已经被替代的gltA基因，ppc基因，gdhA基因可以克隆进入质粒和导入寄主微生物，或利用重复DNA，倒转重复，转座子或诸如此类导入寄主微生物的染色体DNA。
通过利用另一个较强启动子(参见WO87/03006，和日本未审专利申请公开号(KOKAI),61-268183(1986))替代染色体上的gltA基因，ppc基因，gdhA基因的启动子或在每个基因的编码序列的上游插入强启动子(参见基因，29,231-241,1984)也可以增强CS,PEPC或GDH的活性。特定地说，通过在gltA基因，ppc基因，gdhA基因(这些基因的启动子用强启动子替代)或含有它们的一部分的DNA，和染色体上对应的基因之间的同源重组可以达到。
属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的特定例子包括例如，成团肠杆菌ATCC12287/RSFCPG，成团肠杆菌AJ13355/RSFCPG，和液化沙雷伯氏菌ATCC14460/RSFCPG，其中这些微生物的CS,PEPC或GDH活性增强。
催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的例子包括例如，αKGDH，异柠檬酸裂合酶，磷酸乙酰转移酶，乙酸激酶，乙酰羟酸合成酶，乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-吡洛啉脱氢酶和诸如此类。在这些酶中间，αKGDH是优选的。
为了在属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物中获得上面提到的酶活性的下降和缺乏，可以通过常规诱变技术或遗传工程技术在编码酶的基因中导入引起酶活性的下降或缺乏的突变。
诱变技术的例子包括例如，利用X-射线和紫外光辐射的方法，利用诱变试剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍和诸如此类处理的方法。导入突变的基因的位置可以是编码酶蛋白的编码区或如启动子的表达调节区。
遗传工程技术的例子包括，例如基因重组，基因转导，细胞融合和诸如此类。例如，在靶基因中插入药物抗性基因以便产生功能失活的基因(缺陷基因)。然后，这一缺陷基因可以导入属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属的微生物的细胞，并且在染色体上的靶基因可以用缺陷基因通过同源重组替代(基因破坏)。
通过测量候选菌株的细菌细胞提取物或纯化部分的酶活性，并且将它与野生型菌株或亲本菌株的比较可以确定是否微生物降低了靶酶的活性或缺乏该活性，和该酶活性的降低程度。通过例如Reed等人的方法可以测量αKGDH酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法，1969,13,p55-61)。
根据靶酶，可以在变异体的表现型的基础上选择靶变异体。例如，缺乏αKGDH活性或该活性降低的变异体在含有葡萄糖的基本培养基或含有乙酸或L-谷氨酸作为唯-碳源的基本培养基上不能生长，或显示了明显的在需氧条件下生长速率降低。但是，甚至在同样条件下，通过在含有葡萄糖的必需培养基中加入琥珀酸或赖氨酸，甲硫氨酸和二氨基庚二酸，该变异体可以展示出正常的生长。根据这些现象，可以选择缺乏αKGDH活性或该活性降低的变异体。
在WO95/34672详细叙述了通过同源重组生产缺乏αKGDH基因的乳发酵短杆菌菌株的方法，同样的方法可以用于肠杆菌和沙雷伯氏菌属的微生物。
另外，在分子克隆，第二版，冷泉港出版社(1989)和诸如此类中详细叙述了基因克隆，DNA切割和连接，转化和诸如此类。
如上所述得到的缺乏αKGDH活性或该活性降低的变异体菌株的例子是成团肠杆菌AJ13356。将成团肠杆菌AJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省，工业技术院，生命工学工业技术研究所，接受的登记号FERM P-16645，然后按照布达佩斯条约在1999年1月11日转为国际保藏，接受的登记号是FERMBP-6615。
属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属、具有至少(a)和(b)的特性之一和产生L-谷氨酸的能力的微生物，可以培养在液体培养基中以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸。
培养基可以是如果需要，含有碳源，氮源，和无机盐，以及微量有机营如氨基酸，维生素，和诸如此类的普通营养培养基。这可以是合成培养基或天然培养基。任何碳源和氮源可以用于培养基，只要它们可以被培养的微生物利用。
碳源可以是糖，如葡萄糖，甘油，果糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解物，糖蜜和诸如此类。另外，有机酸如乙酸和柠檬酸也可以单独利用或联合其它碳源利用。
氮源可以是氨，铵盐如硫酸铵，碳酸铵，氯化铵，磷酸铵，和乙酸铵，硝酸盐和诸如此类。
作为微量有机营养，可以使用氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，含有它们的物质如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白质分解产物和诸如此类物质，并且当利用其生长需要氨基酸和诸如此类的营养缺陷型变异体时，必需补充需要的营养。
作为无机盐，可以使用磷酸盐，镁盐，钙盐，铁盐，锰盐和诸如此类。
至于培养条件，可以在需氧条件下进行培养，温度为20到42℃，pH为4到8。可以连续培养10小时到4天以便在液体培养基中积累相当量的L-谷氨酸。
在完成培养后，通过已知方法可以收集培养基中积累的L-谷氨酸。例如，通过包括在除去细胞后浓缩培养基以便结晶产物，离子交换层析和诸如此类的方法可以分离L-谷氨酸。
参考下面的实施例将更具体地说明本发明。
(1)构建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒
参考图1到图5将能够解释构建含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的质粒的方法。
利用HindⅢ和SphⅠ消化含有起源于大肠杆菌的gdhA基因的质粒pBRGDH(日本未审专利申请公开号(KOKAI)7-203980(1995))，通过T4DNA聚合酶处理将两个末端平齐化。然后，纯化和收集含有gdhA基因的DNA片断。在另一方面，利用XbaⅠ消化含有起源于大肠杆菌的gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(WO97/08294)，利用T4DNA聚合酶处理将两个末端平齐化。将这与含有上面纯化的含有gdhA基因的DNA片断混合，利用T4连接酶连接，得到质粒pMWCPG，该质粒对应于另外携带gdhA基因的pMWCP(附图1)。
纯化和回收利用HindⅢ和SalⅠ消化pBRGDH得到的含有gdhA基因的DNA片断，并导入质粒pSTV29(从Takara Shuzo购买)的HindⅢ-SalⅠ位点，从而得到质粒pSTVG(图2)。
在同一时间，将通过用NotⅠ消化含有广谱宿主范围质粒RSF1010(日本未审专利申请公开号(KOKAI)8-047397(1996))的复制原点的质粒pVIC40，接着通过T4DNA聚合酶处理和PstⅠ消化得到的产物，和通过利用EcoT141消化pBR322，接着T4DNA聚合酶处理和PstⅠ消化得到的产物混合，并用T4连接酶连接以便得到含有RSF1010的复制原点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图3)。
然后，利用EcoRⅠ和PstⅠ消化pMWCPG，纯化和回收含有gltA基因，ppc基因和gdhA基因的DNA片断。同样，利用EcoRⅠ和PstⅠ消化RSF-Tet，纯化和回收含有RSF1010的复制原点的DNA片断。混合这些DNA片断，利用T4连接酶连接以便得到由携带gltA基因，ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet组成的质粒RSFCPG(附图4)。在缺乏gltA基因，ppc基因或gdhA基因的大肠杆菌菌株的营养缺陷型的补充和每种酶活性的测量的基础上证实了得到的质粒RSFCPG表达gltA基因，ppc基因和gdhA基因，和pSTVG表达gdhA基因。
如下构建含有起源于乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒。利用含有选定的SEQIDNO:6和7表示的核苷酸序列的引物，和乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板进行PCR以便得到约3kb的gltA基因。其中SEQIDNO:6和7是基于谷氨酸棒状杆菌的gltA基因的核苷酸序列(微生物学，140,1817-1828,1994)。将这-3kb的片断插入利用SmaⅠ消化的质粒pHSG399(从Takara Shuzo购买)，以便得到质粒pHSGCB(图5)。然后，利用HindⅢ消化pHSGCB，将切出的约3kb的gltA基因片断插入利用HindⅢ消化的质粒pMW218(从Nippon基因购买)，以便得到质粒pMWCB(图5)。通过在成团肠杆菌AJ13355确定酶活性证实得到的质粒pMWCB表达gltA基因。
(2)在成团肠杆菌或液化沙雷伯氏菌中导入RSFCPG,pMWCB和pSTVG，和评估L-谷氨酸生产率
利用RSFCPG,pMWCB和pSTVG通过电穿孔转化成团肠杆菌ATCC12287，成团肠杆菌AJ13355和液化沙雷伯氏菌ATCC 14460(MillerJ.H.，“细菌遗传学的简短方法，手册”，冷泉港实验室出版，美国，1992)以便得到展示四环素抗性的转化体。
将每种得到的转化体和亲本菌株接种到50毫升体积的大小的试管，在试管中含有5毫升培养基，培养基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升七水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升5水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，和30克/升碳酸钙，并且在37℃振摇培养，直到在培养基中含有的葡萄糖耗尽。但是，和亲本菌株AJ13355一样，对于AJ13355/pMWCB菌株和AJ13355/pSTVG菌株，在消耗了约10克/升的葡萄糖，即培养15小时，终止培养。因为它们的葡萄糖消耗速度是低的。在转化体的培养基中，加入25毫克/升的四环素。在完成培养后，测量培养基中积累的L-谷氨酸。结果表示在表1。
表1：L-谷氨酸的积累量
细菌菌株                  L-谷氨酸的积累量
ATCC12287                    0.0克/升
ATCC12287/RSFCPG             6.1
AJ13355                      0.0
AJ13355/RSFCPG               3.3
AJ13355/pMWCB                0.8
AJ13355/pSTVG                0.8
ATCC14460                    0.0
ATCC14460/RSFCPG             2.8
单独培养基                   0.2
尽管成团肠杆菌ATCC12287，成团肠杆菌AJ13355和液化沙雷伯氏菌ATCC14460不积累L-谷氨酸，但通过导入RSFCPG扩增了CS,PEPC和GDH活性的菌株分别积累6.1克/升，3.3克/升，和2.8克/升L-谷氨酸。CS活性单独扩增的AJ13355菌株积累0.8克/升L-谷氨酸，GDH活性单独扩增的菌株也积累0.8克/升的L-谷氨酸。
(3)克隆成团肠杆菌AJ13355的αKGDH基因(下文中称为“sucAB”)
从成团肠杆菌AJ13355的染色体DNA通过选择补充缺乏αKGDH-E1亚单位基因的大肠杆菌菌株的乙酸非同化的DNA片断(下文中称为：“sucA”)克隆成团肠杆菌AJ13355的sucAB基因。
通过如常规使用的从大肠杆菌提取染色体DNA的同样方法分离成团肠杆菌AJ13355的染色体DNA(Seibutsu Kogaku Jikken-sho(生物工程实验教科书)，发酵和生物工程协会编辑，日本，97-98,Baifukan,1992)。用作载体的pTWV228(氨苄青霉素抗性)是Takara Shuzo的市售产品。
利用T4连接酶连接利用EcoT221消化的AJ13355的染色体DNA得到的产物和利用PstⅠ消化的pTWV228得到的产物，利用它们转化缺乏sucA的大肠杆菌JRG465(HerbertJ.等人，分子遗传学，1969,105,p182)。从如上所述得到的转化体选择在乙酸基本培养基上生长的菌株，将从它们提取的质粒命名为pTWVEK101。携带pTWVEK101的大肠杆菌JRG465恢复了乙酸非同化性以及琥珀酸或L-赖氨酸和L-甲硫氨酸的营养缺陷型的特征。这表明pTWVEK101含有成团肠杆菌的sucA基因。
图6显示了起源于成团肠杆菌的pTWVEK101D DNA片断的限制图谱。SEQ IDNO:1中显示了图6中的阴影部分的核苷酸测序的结果，在该序列中，发现了两个全长ORFs和被认为是ORF的部分序列的两个核苷酸序列。SEQ ID NO:2到5从5’末端开始显示了这些ORF和其部分序列编码的氨基酸序列。作为这些序列同源分析的结果，发现核苷酸序列已经确定的部分含有琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白质基因(sdhB)的3’部分序列，全长sucA和αKGDH-E2亚单位基因(sucB基因)，和琥珀酰CoA合成酶β亚单位基因(sucC基因)的5’部分序列。图7到9显示了从这些核苷酸序列推测的氨基酸序列与大肠杆菌的那些的比较(欧洲生物化学杂志，141,351-359(1984)，欧洲生物化学杂志，141,361-374(1984)，和生物化学，24,6245-6252(1985))。如这些结果显示，氨基酸序列展示了明显的高度同源性。同时发现如大肠杆菌，在成团肠杆菌染色体形成了sdhB-sucA-sucB-sucC簇(欧洲生物化学杂志，141,351-359(1984)，欧洲生物化学杂志，141,361-374(1984)，和生物化学，24,6245-6252(1985))。
(4)获得起源于成团肠杆菌AJ13355的αKGDH缺陷菌株
利用如上所述获得的成团肠杆菌的sucAB基因，通过同源重组获得成团肠杆菌的缺乏αKGDH的菌株。
首先，利用BgⅢ消化pTWVEK101以便除去对应于约一半的sucA基因和全长的sucB基因的C末端区。在这一位点，插入了利用AccⅠ从pHSG399(TakaraShuzo)切出的氯霉素抗性基因片断。利用AflⅡ和SacⅠ切出上面得到的SdhB-ΔsucAB::Cmr-sucC区。将得到的片断通过电穿孔用于转化成团肠杆菌AJ13355菌株以便得到氯霉素抗性菌株，从而获得了缺乏sucAB基因的成团肠杆菌AJ13356菌株，在这一菌株中染色体上的sucAB基因用sucAB::Cmr替代了。
为了证实如上所述获得的AJ13356菌株缺乏αKGDH活性，通过Reed的方法确定它的酶活性(L.J.Reed和B.B.Mukherjee，酶学方法1969,13,p55-61)。结果，如表2所示，在AJ13356菌株中不能检测到αKGDH活性，从而证实该菌株缺乏需要的sucAB。
表2：αKGDH活性
细菌菌株                  αKGDH活性
                               (ΔABS/分钟/毫克蛋白质)
AJ13355                    0.481
AJ13356                    ＜0.0001
(5)评估缺乏αKGDH的成团肠杆菌菌株的L-谷氨酸生产率
在含有20毫升培养基的500毫升体积烧瓶中接种AJ13355和AJ13356菌株，该培养基中含有40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升7水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升7水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，30克/升碳酸钙，200毫克/升L-赖氨酸单盐酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和200毫克/升DL-α,ε-二氨基庚二酸(DAP)，在37℃振摇培养直到培养基中含有的葡萄糖耗尽。在完成培养后，测量在培养基中积累的L-谷氨酸和α-酮戊二酸(下文中简写为“αKG”)。表3显示了结果。
表3：L-谷氨酸和αKG的积累量
细菌菌株   L-谷氨酸的积累量  αKG的积累量
AJ13355          0.0克/升        0.0克/升
AJ13356          1.5             3.2
缺乏αKGDH活性的AJ13356菌株积累1.5克/升L-谷氨酸，同时积累了3.2克/升αKG。
(6)在缺乏αKGDH的成团肠杆菌菌株中导入RSFCPG和评估L-谷氨酸的生产率
利用RSFCPG转化AJ13356，将利用RSFCPG导入得到的菌株，AJ13356/RSFCPG接种到500毫升体积的烧瓶，该烧瓶含有20毫升培养基，该培养基中包括40克/升葡萄糖，20克/升硫酸铵，0.5克/升7水硫酸镁，2克/升磷酸二氢钾，0.5克/升氯化钠，0.25克/升7水氯化钙，0.02克/升7水硫酸亚铁，0.02克/升四水硫酸锰，0.72毫克/升二水硫酸锌，0.64毫克/升7水硫酸铜，0.72毫克/升六水氯化钴，0.4毫克/升硼酸，1.2毫克/升二水钼酸纳，2克/升酵母提取物，25毫克/升四环素，30克/升碳酸钙，200毫克/升L-赖氨酸单盐酸，200毫克/升L-甲硫氨酸和200毫克/升DL-α,ε-DAP，并在37℃振摇培养直到在培养基中含有的葡萄糖耗尽。在完成培养后，测量在培养基中积累的L-谷氨酸和αKG。表4显示了结果。
表4：L-谷氨酸和αKG的积累量
细菌菌株    L-谷氨酸的积累量    αKG的积累量
AJ13356          1.4克/升           2.9克/升
AJ13356/RSFCPG   5.1                0.0
在通过导入RSFCPG扩增CF,PEPC和GDH活性的菌株中，αKG的积累量减少了，L-谷氨酸的积累量进一步提高。
                       序列表<110>Ajinomoto Co.,Inc.<120>生产L-谷氨酸的细菌和生产L-谷氨酸的方法<130><150>JP10-69068<151>1998-03-18<150>JP10-297129<151>1998-10-19<160>7<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>4556<212>DNA<213>成团肠杆菌<220><221>CDS<222>(2)..(121)<220><221>CDS<222>(322)..(3129)<220><221>CDS<222>(3145)..(4368)<220><221>CDS<222>(4437)..(4556)<400>1t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt 49Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val
1               5                  10                  15tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct atc ggc cac att aag tcg   97Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser
         20                  25                  30atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc      148Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala
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                                                       Met
                                                         1cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc   372Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly
          5                  10                  15 gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat  420Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp
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     100                 105                 110ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat  708Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp
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     180                 185                 190cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg  948Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu
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 355                 360                 365gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg  1476Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr370                 375                 380                 385gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg  1524Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro
             390                 395                 400aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg  1572Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val
         405                 410                 415ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc  1620Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala
     420                 425                 430ttt gtt acc cgc ctg gcg ctg gac tat cgc aac acc ttc aaa cgc gat  1668Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp
 435                 440                 445gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg  1716Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala450                 455                 460                 465gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag  1764Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys
             470                 475                 480cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt  1812His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly
         485                 490                 495gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat  1860Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp
     500                 505                 510gcg ctc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc  1908Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser
515                 520                 525ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag  1956Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu530                 535                 540                 545cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg  2004Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu
            550                 555                 560cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc  2052Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala
        565                 570                 575aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc  2100Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe
    580                 585                 590gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa  2148Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu
595                 600                 605ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc  2196Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe610                 615                 620                 625ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat  2244Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr
            630                 635                 640acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg  2292Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp
        645                 650                 655gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac  2340Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr
    660                 665                 670gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt  2388Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly
675                 680                 685gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct  2436Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser690                 695                 700                 705ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg  2484Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro
            710                 715                 720cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa  2532His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu
        725                 730                 735cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg  2580Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro
    740                 745                 750tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc  2628Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg
755                 760                 765 ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc  2676Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Set Pro Lys Set Leu Leu Arg770                 775                 780                 785cat cca ctg gcg atc tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc  2724His Pro Leu Ala Ile Set Set Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe
             790                 795                 800cag ccg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa  2772Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys
         805                 810                 815cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag  2820Arg Val Val Leu Cys Set Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln
     820                 825                 830cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag  2868Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln
 835                 840                 845ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat  2916Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr850                 855                 860                 865tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag  2964Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln
             870                 875                 880ggc gcc tgg tac tgt agc cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt  3012Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe
         885                 890                 895ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc  3060Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala
     900                 905                 910gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat  3108Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn
 915                 920                 925gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt agc gta gat  3159Asp Ala Leu Asn Val Asn                     Met Ser Ser Val Asp930                 935                       1               5att ctc gtt ccc gac ctg cct gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca  3207Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala
              10                  15                  20acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc agc cgc gat gaa gtc atc  3255Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile
          25                  30                  35gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc  3303Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala
      40                  45                  50gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg  3351Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr
  55                  60                  65tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa  3399Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys 70                  75                  80                  85gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt  3447Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg
             90                  95                 100cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg  3495Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala
        105                 110                 115atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa  3543Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys
    120                 125                 130ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat  3591Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His
135                 140                 145ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt  3639Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly150                 155                 160                 165gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt  3687Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val
            170                 175                 180ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc  3735Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala
        185                 190                 195aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag  3783Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys
    200                 205                 210ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt  3831Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg
215                 220                 225cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc  3879His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val230                 235                 240                 245gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tct atc gat ggc gaa  3927Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu
            250                 255                 260gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg  3975Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr
        265                 270                 275cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc  4023Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser
    280                 285                 290atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt  4071Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg
295                 300                 305gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc  4119Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile310                 315                 320                 325acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac  4167 Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn
             330                 335                 340ccg cca cag agc gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct  4215Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys Asp Arg Pro
         345                 350                 355atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg atc ctg cca atg atg tac ctg gct  4263Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala
     360                 365                 370ctc tcc tac gat cac cgt tta atc gat ggt cgt gaa tct gtc ggc tat  4311Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr
 375                 380                 385ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg  4359Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu390                 395                 400                 405gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca   4415Asp Valgatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag  4466
                     Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln
                       1               5                  10ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act  4514Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr
              15                  20                  25aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa atc ggt gca          4556Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala
          30                  35                  40<210>2<211>39<212>PRT<213>成团肠杆菌<400>2Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val1         5           l0           15Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser
            20                25                 30Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala
       35<210>3<211>935<212>PRT<213>成团肠杆菌<400>3Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala1               5                  10                  15Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr
          20                  25                  30Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu
      35                  40                  45Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu
  50                  55                  60Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val65                  70                  75                  80Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile
              85                  90                  95Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu
         100                 105                 110Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His
     115                 120                 125Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe
 130                 135                 140Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu145                 150                 155                 160Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn
             165                 170                 175Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala
         180                 185                 190Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu
     195                 200                 205Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro
 210                 215                 220Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met225                 230                 235                 240Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val
             245                 250                 255Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val
         260                 265                 270Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His
     275                 280                 285Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser
 290                 295                 300Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe305                 310                 315                 320Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val
             325                 330                 335Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu
         340                 345                 350Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val
     355                 360                 365Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly
 370                 375                 380Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn385                 390                 395                 400 Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met
             405                 410                 415Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val
         420                 425                 430Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg
     435                 440                 445Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu
 450                 455                 460Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys465                 470                 475                 480Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu
             485                 490                 495Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg
         500                 505                 510Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met
     515                 520                 525Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp
 530                 535                 540Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala545                 550                 555                 560Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val
             565                 570                 575Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala
          580                585                 590Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp
     595                 600                 605Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr
 610                 615                 620Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr625                 630                 635                 640Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val
             645                 650                 655Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly
         660                 665                 670Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe
     675                 680                 685Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser
 690                 695                 700Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu705                 710                 715                 720Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu
             725                 730                 735Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Ash Met Gln Val Cys Val
         740                 745                 750Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu
     755                 760                 765Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu
770                 775                 780Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser785                 790                 795                 800Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val
            805                 810                 815Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu
        820                 825                 830Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu
    835                 840                 845Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala
850                 855                 860Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn865                 870                 875                 880Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro
            885                 890                 895Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro
        900                 905                 910Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Vel
    915                 920                 925Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn
930                 935<210>4<211>407<212>PRT<213>成团肠杆菌<400>4Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala1               5                  10                  15Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser
         20                  25                  30Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu
     35                  40                  45Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu
 50                  55                  60Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly65                  70                  75                  80Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr
             85                  90                  95Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp
        100                 105                 110Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp
    115                 120                 125Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu
130                 135                 140Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala145                 150                 155                 160Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg
            165                 170                 175Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu
        180                 185                 190Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn
    195                 200                 205Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp
210                 215                 220Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr225                 230                 235                 240Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala
            245                 250                 255Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser
        260                 265                 270Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp
    275                 280                 285Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu
290                 295                 300Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly305                 310                 315                 320Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser
            325                 330                 335Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala
        340                 345                 350Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro
    355                 360                 365Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg
370                 375                 380Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro385                 390                 395                 400Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val
            405<210>5<211>40<212>PRT<213>成团肠杆菌<400>5Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly1               5                  10                  15Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu
         20                  25                  30Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala
     35                  40<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>6gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg                         30<210>7<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：引物<400>7aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt                         30

Claims (6)

1、属于肠杆菌或沙雷伯氏菌属并且具有生产L-谷氨酸的能力和至少下面一个特征的微生物：
(a)该微生物催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的活性增加；和
(b)该微生物催化L-谷氨酸生物合成途径的分支反应和产生不是L-谷氨酸的化合物的酶的活性降低或缺乏。
2、根据权利要求1所述的微生物，其中该催化L-谷氨酸生物合成的反应的酶是至少一种选自以下的酶：柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和谷氨酸脱氢酶。
3、根据权利要求2所述的微生物，其中催化L-谷氨酸生物合成反应的酶包括柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，和谷氨酸脱氢酶三者。
4、根据权利要求1到3的任何一个所述的微生物，其中该催化L-谷氨酸生物合成的分支反应并产生不是L-谷氨酸的化合物的酶是α酮戊二酸脱氢酶。
5、根据权利要求1到4的任何一个所述的微生物，它是成团肠杆菌或液化沙雷伯氏菌。
6、生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养权利要求1到5的任何一个定义的微生物，以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸，并从培养基中收集L-谷氨酸。
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