CN119591744A

CN119591744A - A、c、y、w135群脑膜炎球菌多糖层析的方法

Info

Publication number: CN119591744A
Application number: CN202411853639.4A
Authority: CN
Inventors: 朱绍荣; 徐杨; 田立志; 常晓飞; 汤齐齐
Original assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI RONGSHENG BIOLOGICAL PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2024-12-13
Filing date: 2024-12-13
Publication date: 2025-03-11

Abstract

本发明提供了一种A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖层析的方法。具体的，本发明提供了一种脑膜炎球菌多糖的纯化方法，包括：1)利用0.5～2％脱氧胆酸钠，分别对脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖进行预处理；2)利用Rigose MMA层析柱与Rigose DEAE层析柱串联，纯化步骤1)中预处理后的多糖；3)利用10～100mM磷酸缓冲液对步骤2)中的多糖进行超滤脱盐，获得纯化后的精制多糖；其中，所述脑膜炎球菌多糖为脑膜炎球菌A群多糖、脑膜炎球菌C群多糖、脑膜炎球菌Y群多糖，或脑膜炎球菌W135群多糖。

Description

A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖层析的方法

技术领域

本发明属于多糖制备的技术领域，更具体地，本发明涉及一种A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖层析的方法。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎，简称为脑膜炎，是一种由奈瑟氏脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)引起的急性呼吸道传染病。脑膜炎的致病菌包括A群、C群、Y群、W135群脑膜炎球菌。提取特定菌株脑膜炎球菌的细菌外荚膜多糖，制备成疫苗，可以用于预防该菌株脑膜炎球菌的侵袭感染。

荚膜多糖是大分子物质，分离纯化比单糖或小分子寡糖复杂。在荚膜多糖的分离纯化中，需去除核酸、蛋白质、内毒素等杂质。目前，脑膜炎球菌多糖制备工艺采用苯酚抽提及乙醇沉淀等步骤。由于使用了多步乙醇沉淀和苯酚抽提，过程相对复杂，人为操作差异性大，批间收率不完全一致，过程放大受到限制。另外，苯酚具有很强的毒性，苯酚残留对产品质量和人体会产生影响。另外，脑膜炎球菌多糖层析介质的选择，对于产品的质量也会产生影响。

因此，本领域亟需提供一种改进的A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖层析的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖层析的方法。

在本发明的第一方面，提供一种脑膜炎球菌多糖的纯化方法，包括：

1)利用0.5～2％脱氧胆酸钠，对脑膜炎球菌多糖进行预处理；

2)利用Rigose MMA层析柱与Rigose DEAE层析柱串联，纯化步骤1)中预处理后的多糖；

3)利用磷酸缓冲液对步骤2)中的多糖进行超滤脱盐，获得纯化后的精制多糖；

其中，所述脑膜炎球菌多糖为脑膜炎球菌A群多糖、脑膜炎球菌C群多糖、脑膜炎球菌Y群多糖，或脑膜炎球菌W135群多糖。

在一种或多种实施方案中，步骤1)中，所述脱氧胆酸钠的含量是0.5～2％，优选0.6～1.9％、0.7～1.8％、0.8～1.7％、0.9～1.6％或1.0～1.5％，其中所述含量以质量百分比表示。

在一种或多种实施方案中，步骤1)中，所述脱氧胆酸钠的处理时间是1～15小时，优选2～14小时、3～13小时、3～12小时、5～12小时、6～12小时、7～12小时、8～12小时或9～12小时。

在一种或多种实施方案中，步骤1)中，所述脱氧胆酸钠配制于缓冲体系中，所述缓冲体系还包含1～100mM Tris-HCl缓冲液，优选2～90mM、3～80mM、5～50mM、8～40mM、10～30mM或15～25mM；所述缓冲溶液的pH值为6.0～9.0，优选6.5～8.5、6.5～8.0、7.0～8.5或7.5～8.0。

在一种或多种实施方案中，所述步骤2)还包括：利用缓冲液平衡层析柱。

在一种或多种实施方案中，所述步骤2)还包括：先用不含有脱氧胆酸钠的缓冲溶液对层析柱进行预平衡，再用含有0.5～2％脱氧胆酸钠的缓冲溶液平衡层析柱。

在一种或多种实施方案中，步骤2)中，所述缓冲溶液是1～100mM Tris-HCl缓冲液，优选2～90mM、3～80mM、5～50mM、8～40mM、10～30mM或15～25mM；所述缓冲溶液的pH值为6.0～9.0，优选6.5～8.5、6.5～8.0、7.0～8.5或7.5～8.0。

在一种或多种实施方案中，步骤3)中，所述超滤脱盐包括；利用磷酸缓冲液对步骤2)中的多糖进行超滤，再利用注射用水超滤洗脱去除磷酸缓冲液。

在一种或多种实施方案中，步骤3)中，所述磷酸缓冲液的浓度是10～100mM，优选20～90mM、30～80mM、40～70mM、40～60mM或45～55mM。

在一种或多种实施方案中，所述步骤3)还包括：对超滤脱盐后的多糖溶液进行冻干，从而获得固体形式的纯化后的精制多糖。

在一种或多种实施方案中，步骤1)中，所述脑膜炎球菌粗制多糖为利用脑膜炎致病菌发酵液分离获得的脑膜炎球菌粗制多糖。

在一种或多种实施方案中，所述脑膜炎致病菌包括或为：奈瑟脑膜炎球菌。

在一种或多种实施方案中，所述脑膜炎致病菌包括或选自：奈瑟脑膜炎球菌A、C、Y、W135血清群。

在一种或多种实施方案中，利用脑膜炎致病菌发酵液分离粗制多糖的步骤包括：将A群、C群、Y群或W135群脑膜炎致病菌进行发酵培养，发酵液灭活后经过离心，离心上清液中加入阳离子去污剂和多糖沉淀剂，分离获得脑膜炎球菌粗制多糖。

在一种或多种实施方案中，所述阳离子去污剂是CTAB和/或所述多糖沉淀剂是乙醇。

在一种或多种实施方案中，加入CTAB和乙醇后，溶液中所述CTAB的质量百分比是0.1±0.05％，所述乙醇的体积百分比是75±1％。

在本发明的第二方面，提供一种脑膜炎球菌多糖，其通过本发明任一实施方案中所述的纯化方法获得；其中，所述脑膜炎球菌多糖为脑膜炎球菌A群多糖、脑膜炎球菌C群多糖、脑膜炎球菌Y群多糖，或脑膜炎球菌W135群多糖。

在一种或多种实施方案中，所述脑膜炎球菌多糖具有如下的一个、多个或全部特征：

蛋白含量＜8mg/g，优选＜7mg/g、＜6mg/g、＜5mg/g、＜4mg/g、＜3mg/g或＜2mg/g；

核酸含量＜8mg/g，优选＜7mg/g、＜6mg/g、＜5mg/g、＜4mg/g、＜3mg/g或＜2.5mg/g；

A群多糖磷含量＞80mg/g，优选＞82mg/g、＞83mg/g、＞84mg/g、＞85mg/g、＞86mg/g或＞87mg/g；

C群多糖唾液酸含量＞800mg/g，优选＞802mg/g、＞803mg/g、＞804mg/g、＞805mg/g、＞806mg/g或＞807mg/g；

Y群多糖唾液酸含量＞560mg/g，优选＞562mg/g、＞563mg/g、＞564mg/g、＞565mg/g、＞566mg/g、＞567mg/g、＞568mg/g、＞569mg/g或＞570mg/g；

W135群多糖唾液酸含量＞560mg/g，优选＞562mg/g、＞563mg/g、＞564mg/g、＞565mg/g、＞566mg/g、＞567mg/g、＞568mg/g、＞569mg/g、＞570mg/g、＞572mg/g、＞575mg/g、＞577mg/g、＞578mg/g或＞579mg/g；

A群O-乙酰基含量≥2.0mmol/g，优选≥2.1mmol/g、≥2.2mmol/g或≥2.3mmol/g；

C群O-乙酰基含量≥1.5mmol/g，优选≥1.7mmol/g、≥1.8mmol/g、≥1.9mmol/g、≥2.0mmol/g、≥2.1mmol/g、≥2.2mmol/g或≥2.3mmol/g；

Y群O-乙酰基含量≥0.3mmol/g，优选≥0.4mmol/g、≥0.5mmol/g、≥0.6mmol/g、≥0.8mmol/g、≥1.0mmol/g、≥1.1mmol/g或≥1.2mmol/g；

W135群O-乙酰基含量≥0.3mmol/g；

内毒素＜12.5EU/μg，优选＜12EU/μg、＜11EU/μg、＜10EU/μg、＜9EU/μg、＜8EU/μg、＜7EU/μg或＜6EU/μg。

在本发明的第三方面，提供一种缀合物，其包含选自以下的一种或多种：

(1)脑膜炎球菌A群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(2)脑膜炎球菌C群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(3)脑膜炎球菌Y群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(4)脑膜炎球菌W135群多糖以及与其缀合的载体蛋白；

其中，所述的脑膜炎球菌A群多糖、脑膜炎球菌C群多糖、脑膜炎球菌Y群多糖、脑膜炎球菌W135群多糖为本发明任一实施方案中所述的脑膜炎球菌多糖，或通过本发明任一实施方案中所述的纯化方法获得。

在一种或多种实施方案中，所述载体蛋白为个体可接受的、并能诱导免疫细胞依赖性应答的蛋白或其片段。

在一种或多种实施方案中，所述载体蛋白具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合。

在一种或多种实施方案中，所述载体蛋白包括：破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。

在一种或多种实施方案中，所述的破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素均包含其突变体。

在一种或多种优选的实施方案中，所述的白喉类毒素包含白喉类毒素突变体。

在本发明的第四方面，提供一种组合物，所述组合物包括：本发明任一实施方案中所述的脑膜炎球菌多糖，和/或，本发明任一实施方案中所述的缀合物。

在一种或多种实施方案中，所述组合物还包括佐剂。

在一种或多种实施方案中，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21、CpG、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。

在本发明的第五方面，提供本发明任一实施方案中所述的脑膜炎球菌多糖，或本发明任一实施方案中所述的缀合物，或本发明任一实施方案中所述的组合物，在制备用于提供对抗细菌性脑膜炎致病菌感染的保护的药物中的应用。

在一种或多种实施方案中，所述药物为疫苗。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、对第一批新型脑膜炎球菌A群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图2、对第二批新型脑膜炎球菌A群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图3、对第三批新型脑膜炎球菌A群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图4、对第一批新型脑膜炎球菌C群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图5、对第二批新型脑膜炎球菌C群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图6、对第三批新型脑膜炎球菌C群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图7、对第一批新型脑膜炎球菌Y群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图8、对第二批新型脑膜炎球菌Y群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图9、对第三批新型脑膜炎球菌Y群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图10、对第一批新型脑膜炎球菌W135群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图11、对第二批新型脑膜炎球菌W135群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

图12、对第三批新型脑膜炎球菌W135群粗制多糖进行层析纯化的图谱。

具体实施方式

经过深入的研究，本发明人建立了一种新的脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群粗制多糖层析纯化工艺：将A群、C群、Y群、W135群粗制多糖用Tris-HCl缓冲液溶解后，含脱氧胆酸钠(DOC)Tris-HCl缓冲液等体积稀释，用串联的Rigose MMA与Rigose DEAE层析介质，采用流穿的模式，经一步层析将多糖与其他杂质分离，收获液经过50mM磷酸缓冲液(PB)和灭菌注射用水超滤、洗滤、冻干的方式得到精制多糖，多糖原液根据《中国药典》的方法和标准进行检测。结果显示，四个群脑膜炎多糖能与蛋白质和核酸完全分离，层析纯化后的精制多糖检测指标符合《中国药典》标准，各群多糖回收率均高于80％。

术语

如本文所用，术语“脑膜炎球菌”或“脑膜炎致病菌”是指能引起细菌性脑膜炎的细菌，包括但不限于奈瑟脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)，例如奈瑟脑膜炎球菌A、C、Y、W135血清群中的1、2、3或4种。在一些实施方案中，A、C、Y、W135血清群的多糖分子量在40-400kD之间。在一些实施方案中，所述细菌性脑膜炎致病菌包括奈瑟脑膜炎球菌A、C、Y和/或W135血清群。

如本文所用，术语“纯化”是指从脑膜炎球菌中提取的粗制多糖中去除非多糖组分，从而获得精制多糖的过程。所述非多糖组分包括但不限于：蛋白、核酸、磷酸、唾液酸、O-乙酰基和内毒素。本文中，所述纯化可以利用层析的方法进行。

如本文所用，术语“多糖回收率”是指纯化后的精制多糖有效成分占纯化前粗制多糖有效成分的百分比。

脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖的纯化方法

本发明提供了一种脑膜炎球菌多糖的纯化方法，包括：

1)利用0.5～2％脱氧胆酸钠，分别对脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖进行预处理；

3)利用10～100mM磷酸缓冲液对步骤2)中的多糖进行超滤脱盐，获得纯化后的精制多糖；

步骤1)中，所述的脱氧胆酸钠是一种阴离子去污剂，其可以使得多糖与蛋白、核酸和内毒素进行初步分离。在所述步骤1)中，所述脱氧胆酸钠的含量是0.5～2％，例如0.6～1.9％、0.7～1.8％、0.8～1.7％、0.9～1.6％或1.0～1.5％，其中所述含量以质量百分比表示。脱氧胆酸钠的处理时间可以是1～15小时，例如2～14小时、3～13小时、3～12小时、5～12小时、6～12小时、7～12小时、8～12小时或9～12小时。通常，所述0.5～1.5％脱氧胆酸钠配制于缓冲体系中，所述缓冲体系还包含Tris-HCl缓冲液，其浓度可以是1～100mM，优选2～90mM、3～80mM、5～50mM、8～40mM、10～30mM或15～25mM，例如20mM。所述缓冲溶液的pH值通常为6.0～9.0，例如6.5～8.5、6.5～8.0、7.0～8.5或7.5～8.0。

步骤1)中，脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖为粗制多糖。所述粗制多糖可以是从A群、C群、Y群或W135群脑膜炎奈瑟氏菌中获得的多糖。例如，将A群、C群、Y群或W135群脑膜炎奈瑟氏菌，进行发酵培养，发酵液灭活后经过离心(例如连续流离心或碟式离心)，离心上清液中加入阳离子去污剂(CTAB)和多糖沉淀剂(乙醇)，可以获得所述粗制多糖。

步骤2)中，所述Rigose MMA层析柱与Rigose DEAE层析柱串联时，由于Rigose MMA为复合模式层析介质，既有离子交换模式，也有疏水模式，Rigose DEAE为弱阴离子交换介质，二者串联，既可以通过静电作用结合非多糖组分，也可通过疏水作用结合非多糖组分，能够很好的去除非多糖组分。并且，在DOC缓冲体系下，大量脱氧胆酸根占据层析柱上的结合位点，与多糖形成竞争抑制，使静电作用强的蛋白、核酸和内毒素等非多糖组分结合在层析柱上，多糖则通过流穿模式被洗脱，从而很好地分离纯化多糖。

在一些优选的实施方案中，步骤2)中，所述Rigose MMA层析柱与Rigose DEAE层析柱是国产层析柱。相比于采用进口层析介质，即Capto Adhere层析柱、Capto DEAE层析柱和Sephodex G25层析柱的方法，采用Rigose MMA层析柱与Rigose DEAE层析柱的成本更低，并且能够产生更为优异的纯化精制多糖的技术效果。

所述步骤2)还可以包括：利用缓冲液平衡层析柱。所述利用缓冲液平衡层析柱可以是一次，也可以是两次、三次或更多次利用缓冲液平衡层析柱。示例性的，可以先用不含有脱氧胆酸钠的缓冲溶液对层析柱进行预平衡，再用含有0.5～1.5％(质量百分比)脱氧胆酸钠的缓冲溶液平衡层析柱。所述缓冲溶液可以是Tris-HCl缓冲液，其浓度可以是1～100mM，优选2～90mM、3～80mM、5～50mM、8～40mM、10～30mM或15～25mM，例如20mM。所述缓冲溶液的pH值通常为6.0～9.0，例如6.5～8.5、6.5～8.0、7.0～8.5或7.5～8.0。

步骤3)中，所述磷酸缓冲液的浓度可以是10～100mM，优选20～90mM、30～80mM、40～70mM、40～60mM或45～55mM，例如50mM。先利用磷酸缓冲液对步骤2)中的多糖进行超滤，可以快速的去除样品中的DOC，再用注射用水进行脱盐浓缩，获得纯化后的精制多糖的多糖回收率较高。若不利用磷酸缓冲液，直接用注射用水进行超滤洗滤，由于DOC在较低pH环境会析出沉淀，会导致脱盐不彻底。

本发明所述脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖的纯化方法，还可以包括冻干的步骤，例如对脱盐后的多糖进行冻干。冻干形成的精制多糖为固体形式，方便后续制备疫苗时与载体蛋白结合，并且易于保存。

采用本发明的纯化方法对脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖进行纯化后，可以根据中国药典的标准，对所得的精制多糖进行质量分析。所述质量分析包括但不限于：分析精制多糖中的非多糖组分(例如蛋白、核酸、磷酸、唾液酸、O-乙酰基和内毒素)的含量，测定多糖回收率。

脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群多糖、缀合物、组合物及其应用

本发明还提供了采用本发明的方法纯化获得的脑膜炎球菌A群、C群、Y群或W135群多糖。

本发明中，纯化后获得的精制多糖，具有如下的一个、多个或全部特征：

W135群O-乙酰基含量≥0.3mmol/g；

本发明也提供了一种缀合物，所述缀合物包含选自以下的一种或多种：

(1)脑膜炎球菌A群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(2)脑膜炎球菌C群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(3)脑膜炎球菌Y群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(4)脑膜炎球菌W135群多糖以及与其缀合的载体蛋白。

本发明也提供了一种组合物，所述组合物包括：

(A)脑膜炎球菌A群多糖、C群多糖、Y群多糖、W135群多糖中的任意一种、多种或全部的组合；和/或

(B)(1)～(4)中任一种、多种或全部的缀合物。

本发明所述的脑膜炎球菌A群、C群、Y群或W135群多糖，或所述的组合物，可用于制备疫苗。例如，可以将本发明所述的脑膜炎球菌A群、C群、Y群或W135群多糖，或所述的组合物，与合适的载体相结合，从而制备获得针对脑膜炎球菌的疫苗。存在于疫苗中的脑膜炎球菌A群、C群、Y群或W135群多糖可以是游离多糖的形式，或作为缀合物的一个组分，在缀合物中多糖与载体蛋白共价相连。

通常，所述载体蛋白是个体可接受的、并能诱导免疫细胞(例如T-细胞)依赖性应答的任何蛋白质或其片段。作为载体的蛋白通常具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合。在一些实施方案中，所述载体蛋白是任何天然或重组细菌蛋白，并且其本身是诱导年轻和成年哺乳动物中T-细胞依赖性应答的免疫原。示例性的载体蛋白包括但不限于：破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素。

本发明所述的疫苗可以单独使用，也可以与辅剂、其他疫苗等进行混合搭配使用，示例性的辅剂包括但不限于：氢氧化铝、硫酸铝、甲酰基甲硫氨酰肽、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂。

本发明的有益效果包括：

本发明的纯化方法，利用0.5～2％脱氧胆酸钠对粗制多糖进行预处理，使用Rigose MMA层析柱与Rigose DEAE层析柱串联进行纯化，并采用超滤脱盐的方法，去除了利用层析柱进行脱盐的工序，多个改进步骤协同作用，缩短了工艺时间，节省了工艺成本，获得了符合药典标准、多糖回收率更高的精制多糖。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验设备与材料：

1、主要设备：

表1、主要设备

设备名称	设备型号	厂家
			电子天平	JA41002	上海舜宇恒平
磁力搅拌器	MS-S	大龙兴创实验仪器
			层析系统	AKTA Avant 150	Cytiva
超滤夹具	CM018LV	PALL
			超滤膜包	OS100T02	PALL

2、主要材料：

2.1多糖：A群、C群、W135群、Y群粗制多糖，采用如下方法制备获得：使用采购于中国食品药品检定研究院的A群、C群、W135群、Y群脑膜炎奈瑟氏菌，经过发酵培养，向发酵液灭活离心上清液中缓慢加入10％CTAB溶液(质量百分比)，使上清液终浓度为0.1％(质量百分比)，边加边搅拌后，静置3小时以上，静置结束后通过管式离心机进行连续流离心，离心转速为15000rpm。离心去上清液，收集沉淀，即为复合多糖并称重。每克复合多糖中加入4mL的2M氯化钙溶液，搅拌1.5小时至完全溶解。根据其体积，加入预冷的95％(体积比)乙醇溶液，使溶液中乙醇终浓度为25％，混匀后静置于2～8℃，沉淀3小时以上。沉淀后混合溶液离心去沉淀，离心参数为7000rpm、8℃、40min。向离心上清液中加入95％乙醇溶液，使其终浓度为75％(体积比)，2～8℃静置8～24小时，沉淀后混合溶液离心去上清液，离心参数为7000rpm、8℃、15min，离心后收集沉淀即为粗制多糖。

2.2主要试剂：1％脱氧胆酸钠(DOC)Tris-HCl缓冲液pH8.0、2％脱氧胆酸钠(DOC)Tris-HCl缓冲液pH8.0、20mM Tris-HCl缓冲液pH8.0、50mM磷酸缓冲液(PB)pH8.0、层析介质Rigose MMA、Rigose DEAE。

表2、层析介质及试剂信息

层析介质及试剂	规格	厂家
			Rigose MMA	PrePack GL 50/400	千纯生物
Rigose DEAE	PrePack GL 50/200	千纯生物
			DOC	500g/瓶	Sigma
Tris base	1000g/瓶	苏州亚科
			一水磷酸二氢钠	500g/瓶	湖南九典宏阳
无水磷酸氢二钠	500g/瓶	湖南九典宏阳

实施例1、新型脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群粗制多糖层析纯化工艺

本实施例中，提供了新型脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群粗制多糖层析纯化工艺，包括：

1、样品的预处理：

称取A群、C群、W135群、Y群粗糖以5mg/mL浓度溶解于20mM Tris-HCl(pH 8.0)中，完全溶解后加入等体积2％ DOC 20mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲溶液混匀后得到粗糖样品。A、C、Y、W135群粗糖复溶液在室温下充分反应3h以上，样品经9000rpm、8℃离心20min，0.45μm滤膜澄清过滤，进行后续操作。由于阴离子去污剂脱氧胆酸钠的作用，可以使多糖与蛋白、核酸及内毒素分开，并沉淀析出，经过离心和0.45μm滤膜过滤后，去除部分析出的蛋白、核酸和内毒素。

2、层析纯化：

将PrePack GL 50/400Rigose MMA与PrePack GL 50/200Rigose DEAE串联，用20mM Tris-HCl pH8.0缓冲液进行预平衡，用1％ DOC 20mM Tris-HCl pH8.0缓冲溶液平衡层析柱。

计算串联后层析柱体积(CV)，按20％CV进行上样，将处理后的A群、C群、W135群、Y群粗制多糖上柱，用串联的Rigose MMA与Rigose DEAE层析介质，采用流穿的模式，同时以206、280和260nm紫外吸收峰监控多糖、蛋白和核酸，多糖收集峰，A群λ₂₀₆为120mAu开始收峰，过紫外峰顶点后λ₂₀₆120mAu停止收峰；C、Y、W135群λ₂₀₆为120mAu开始收峰，当λ₂₈₀或λ₂₆₀数值为20mAu停止收峰。将多糖层析收获液经50mM PB(PB为磷酸缓冲液，配方如下：准确称量一水磷酸二氢钠0.37g，磷酸氢二钠6.72g，加适量注射用水充分溶解后，调节pH至8.0，补加注射用水至1L，即先使用50mM PB pH8.0缓冲液)pH8.0溶液超滤洗滤去除脱氧胆酸钠，再用注射用水超滤洗滤去除PB，以超滤方式进行多糖收获液脱盐，大部分蛋白及核酸通过阴阳离子作用，结合在柱子上，通过高盐洗脱阶段洗出。多糖超滤液预冻后，置于冻干机中进行冻干，得到A群、C群、W135群、Y群的精制多糖。

实施例2、层析纯化结果、精制多糖检测结果

按照实施例1的方法，对新型脑膜炎球菌A群、C群、Y群、W135群粗制多糖分别进行连续三批层析纯化，层析图谱如图1-12所示。

层析纯化后的精制多糖，按《中国药典》的方法和标准，对各群样品的检定指标进行检测，根据《中国药典》的标准，精制多糖应满足如下条件：

蛋白含量＜8mg/g；

核酸含量＜8mg/g；

磷/唾液酸含量：A群多糖磷含量＞80mg/g，C群多糖唾液酸含量＞800mg/g，Y群多糖唾液酸含量＞560mg/g，W135群多糖唾液酸含量＞560mg/g；

O-乙酰基含量：A群≥2.0mmol/g、C群≥1.5mmol/g、Y群或W135群≥0.3mmol/g；

内毒素＜12.5EU/μg。

实际检测结果如表3所示。

表3、A群、C群、Y群、W135群三批层析纯化多糖回收率及检定结果

注：未检出为低于仪器的检测下限。

结果如表3所示，采用本发明的方法，对于脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群，多糖回收率均能达到80％以上，蛋白、核酸和内毒素等杂质含量都低于药典规定标准。

实施例3、DOC浓度、处理时间的探究

本实施例中，按照实施例1的方法，对样品进行预处理时DOC的处理浓度(质量百分比)和处理时间进行探究。结果如表4所示。

表4、DOC处理浓度和时间对多糖回收率的影响

结果显示，DOC预处理浓度在0.5％～1.5％，处理时限3～12h，均可起到较好的分离效果。并且，粗制多糖在0.5％～1.5％的DOC缓冲体系内都能较好的分离。

实施例4、层析介质的探究

本实施例中，按照实施例1的方法，分别采用国产层析介质或进口层析介质(表4)，对多糖进行层析纯化，除以下步骤外，其他步骤均与实施例1中的方法相同：

国产层析介质：Rigose MMA与Rigose DEAE串联。将PrePack GL 50/400RigoseMMA与PrePack GL 50/200Rigose DEAE串联，用20mM Tris-HCl pH8.0缓冲液进行预平衡，用1％ DOC 20mM Tris-HCl pH8.0缓冲溶液平衡层析柱。将多糖层析收获液经50mM磷酸缓冲液(PB)pH8.0溶液超滤洗滤，再用注射用水超滤洗滤，通过超滤方式进行多糖收获液脱盐。

进口层析介质：Capto adhere与Capto DEAE串联，用20mM Tris-HCl pH8.0缓冲液进行预平衡，用1％ DOC 20mM Tris-HCl pH8.0缓冲溶液平衡层析柱，层析后收获液经Sephodex G25进行脱盐。

表5、国产层析介质、进口层析介质对比

分别采用国产层析介质或进口层析介质，对多糖进行层析纯化，多糖回收率、蛋白含量、核酸含量、磷/唾液酸含量、O-乙酰基和内毒素的检测结果如表5所示。

表6国产与进口层析介质精糖检测指标对比

注：未检出为低于仪器的检测下限。

结果显示，对于脑膜炎球菌A群、C群、W135群、Y群，采用国产厂家层析介质RigoseMMA与Rigose DEAE串联，采用流穿模式，经一步层析将多糖与其他杂质分离，收获液经过超滤洗滤、冻干的方式得到的精制多糖，其检测指标符合药典规定，并且杂质(蛋白质、核酸)去除率，以及多糖回收率均优于采用进口层析介质的方法。而且由于使用的是国产层析介质，不进行分子排阻脱盐，生产成本降低。

实施例5、超滤脱盐步骤的探究

本实施例中，按照实施例1的方法，对超滤步骤进行探究，并进一步将其与文献方法进行对比分析。

文献方法参考《层析法提纯A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖工艺的建立》，吴清胜，孙芳芳，肖詹蓉。国际生物制品杂志2019年4月第42卷第2期和《层析法去除A群流脑多糖疫苗粗糖中杂蛋白》，解红艳，王济源，刘静，王奕军，赵站勇，吴云涛，苗景赟，吴媛媛。中国生物工程杂志China Biotechnology 2010 30(8)：88-92中记载的Sephodex G25分子排阻层析脱盐的方法进行。

DOC残留的检测方法：精密量取供试品溶液1mL置试管中，试管加入43.5％硫酸溶液14mL，混匀，置70℃水浴中20分钟后取出，冷却至室温。精密量取脱氧胆酸钠对照品溶液0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.8mL，分别置试管中，各补加60％醋酸溶液至1mL，每管加入43.5％硫酸溶液14mL，摇匀，置70℃水浴中20分钟后取出，冷却至室温，在波长387nm处测定吸光度值。以脱氧胆酸钠对照品系列浓度(μg/mL)对其相应的吸光度值作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度值代入直线回归方程计算出供试品中DOC的浓度(μg/mL)。

表7、本发明方法与文献方法的对比

注：未检出为低于仪器的检测下限。

结果显示，超滤脱盐时，使用50mM PB进行超滤洗滤，可以快速的去除样品中的DOC，再用注射用水进行脱盐浓缩，若直接用注射用水进行超滤洗滤，由于DOC在较低pH环境会析出沉淀，导致脱盐不彻底。脱盐后，经冻干获得精制多糖，纯度和多糖回收率较高，经检测，多糖回收率能达到80％以上，蛋白、核酸和内毒素等杂质含量都低于药典规定标准。

综上，本发明建立了一种新型的ACYW135群脑膜炎球菌多糖层析纯化工艺，与文献方法相比，更换了层析介质，去除了一步脱盐层析，同时提高了多糖的质量和多糖回收率，有效的提高了产品质量，并且缩短了生产时间及生产成本，可以用于A、C、Y、W135群脑膜炎球菌多糖的纯化。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种脑膜炎球菌多糖的纯化方法，包括：

1)利用0.5～2％脱氧胆酸钠，对脑膜炎球菌多糖进行预处理；

2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述脱氧胆酸钠的含量是0.5～2％，优选0.6～1.9％、0.7～1.8％、0.8～1.7％、0.9～1.6％或1.0～1.5％，其中所述含量以质量百分比表示；和/或，

所述脱氧胆酸钠的处理时间是1～15小时，优选2～14小时、3～13小时、3～12小时、5～12小时、6～12小时、7～12小时、8～12小时或9～12小时；和/或，

所述脱氧胆酸钠配制于缓冲体系中，所述缓冲体系还包含1～100mM Tris-HCl缓冲液，优选2～90mM、3～80mM、5～50mM、8～40mM、10～30mM或15～25mM；所述缓冲溶液的pH值为6.0～9.0，优选6.5～8.5、6.5～8.0、7.0～8.5或7.5～8.0。

3.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤2)还包括：利用缓冲液平衡层析柱；

优选地，先用不含有脱氧胆酸钠的缓冲溶液对层析柱进行预平衡，再用含有0.5～2％脱氧胆酸钠的缓冲溶液平衡层析柱；

更优选地，所述缓冲溶液是1～100mM Tris-HCl缓冲液，更优选2～90mM、3～80mM、5～50mM、8～40mM、10～30mM或15～25mM；所述缓冲溶液的pH值为6.0～9.0，更优选6.5～8.5、6.5～8.0、7.0～8.5或7.5～8.0。

4.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤3)中，所述超滤脱盐包括；利用磷酸缓冲液对步骤2)中的多糖进行超滤，再利用注射用水超滤洗脱去除磷酸缓冲液；和/或，

步骤3)中，所述磷酸缓冲液的浓度是10～100mM，优选20～90mM、30～80mM、40～70mM、40～60mM或45～55mM；和/或，

所述步骤3)还包括：对超滤脱盐后的多糖溶液进行冻干，从而获得固体形式的纯化后的精制多糖。

5.如权利要求1-3任一项所述的纯化方法，其特征在于，步骤1)中，所述脑膜炎球菌粗制多糖为利用脑膜炎致病菌发酵液分离获得的脑膜炎球菌粗制多糖；

优选地，所述脑膜炎致病菌包括或为：奈瑟脑膜炎球菌；更优选地，所述脑膜炎致病菌包括或选自：奈瑟脑膜炎球菌A、C、Y、W135血清群；

优选地，利用脑膜炎致病菌发酵液分离粗制多糖的步骤包括：将A群、C群、Y群或W135群脑膜炎致病菌进行发酵培养，发酵液灭活后经过离心，离心上清液中加入阳离子去污剂和多糖沉淀剂，分离获得脑膜炎球菌粗制多糖；更优选地，所述阳离子去污剂是CTAB和/或所述多糖沉淀剂是乙醇；更优选地，加入CTAB和乙醇后，溶液中所述CTAB的质量百分比是0.1±0.05％，所述乙醇的体积百分比是75±1％。

6.一种脑膜炎球菌多糖，其通过如权利要求1-5中任一项所述的纯化方法获得；其中，所述脑膜炎球菌多糖为脑膜炎球菌A群多糖、脑膜炎球菌C群多糖、脑膜炎球菌Y群多糖，或脑膜炎球菌W135群多糖。

7.如权利要求6所述的脑膜炎球菌多糖，其特征在于，所述脑膜炎球菌多糖具有如下的一个、多个或全部特征：

W135群O-乙酰基含量≥0.3mmol/g；

8.一种缀合物，其包含选自以下的一种或多种：

(1)脑膜炎球菌A群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(2)脑膜炎球菌C群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(3)脑膜炎球菌Y群多糖以及与其缀合的载体蛋白，

(4)脑膜炎球菌W135群多糖以及与其缀合的载体蛋白；

其中，所述的脑膜炎球菌A群多糖、脑膜炎球菌C群多糖、脑膜炎球菌Y群多糖、脑膜炎球菌W135群多糖为如权利要求5或6所述的脑膜炎球菌多糖，或通过如权利要求1-4中任一项所述的纯化方法获得；

优选地，所述载体蛋白为个体可接受的、并能诱导免疫细胞依赖性应答的蛋白或其片段；更优选地，所述载体蛋白具有至少一个自由氨基，用于与多糖的缀合；更优选地，所述载体蛋白包括：破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素；更优选地，所述的破伤风类毒素、霍乱毒素、白喉类毒素、假单胞菌、葡萄球菌、链球菌、百日咳和包括大肠杆菌的产肠毒素细菌的毒素或类毒素包含其突变体。

9.一种组合物，所述组合物包括：如权利要求6或7所述的脑膜炎球菌多糖，和/或，如权利要求8所述的缀合物；

优选地，所述组合物还包括佐剂；更优选地，所述佐剂包括选自氢氧化铝、磷酸铝、单磷酰基脂A、QS21、CpG、硬脂酰酪氨酸和弗氏佐剂的中的一种或多种。

10.如权利要求6或7所述的脑膜炎球菌多糖，或如权利要求8所述的缀合物，或如权利要求9所述的组合物，在制备用于提供对抗细菌性脑膜炎致病菌感染的保护的药物中的应用；优选地，所述药物为疫苗；

优选地，所述脑膜炎致病菌包括或为：奈瑟脑膜炎球菌；更优选地，所述脑膜炎致病菌包括或选自：奈瑟脑膜炎球菌A、C、Y、W135血清群。