CN117756959B - 一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法。本发明提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，所述方法包括：采用β‑丙内酯对肺炎链球菌的发酵培养物进行处理，分离并收集上清液，将所述上清液进行纯化，收集荚膜多糖。本发明使用β‑丙内酯处理肺炎链球菌发酵培养物，减少了蛋白质等杂质残留，同时具有较高的多糖收率；而且，β‑丙内酯易水解，且水解产物无毒无害，具有更高的安全性。本发明的方法制得肺炎链球菌荚膜多糖的质量控制指标均符合要求，可用于肺炎链球菌荚膜多糖疫苗和多糖结合疫苗的制备。
Description
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法。
背景技术
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）是一种具有荚膜的革兰氏阳性球菌，是引起人类肺炎、脑膜炎、中耳炎和菌血症等疾病的主要病原菌。由肺炎链球菌所导致的疾病具有较高的发病率和死亡率，主要易感人群为5岁以下的婴幼儿。随着肺炎链球菌耐药性的日趋加重，通过接种疫苗来预防其感染日益受到重视。荚膜多糖是肺炎链球菌的关键毒力因子，肺炎链球菌经发酵培养后，经提取分离、纯化以及结合制成的多糖或多糖结合疫苗能够有效诱导人体免疫反应，从而预防肺炎链球菌的感染以及发病。
目前临床上普遍应用的是23价肺炎链球菌多糖疫苗、13价肺炎链球菌多糖结合疫苗以及20价肺炎链球菌多糖结合疫苗。
23价肺炎链球菌多糖疫苗的主要成分为肺炎链球菌的多种荚膜多糖抗原，由于多糖为T细胞非依赖性抗原，可以刺激成熟的B淋巴细胞，但不会刺激T淋巴细胞，而由于2岁以下婴幼儿免疫功能发育尚不完善，对T细胞非依赖性抗原的反应较差，因此多糖疫苗只能用于2岁以上人群免疫。
13价、20价肺炎链球菌多糖结合疫苗也是以荚膜多糖为保护性抗原的疫苗，结合疫苗利用结合技术，将细菌荚膜多糖与特定载体蛋白结合，结合后成为T细胞依赖性抗原，接种后可形成免疫记忆，免疫持续时间长，适用于任何年龄段人群，尤其是对2岁以下的婴幼儿具有良好保护作用，可应用于儿童或者老年人的预防性免疫。
目前，在肺炎链球菌荚膜多糖生产过程中，需要通过在发酵液中加入脱氧胆酸钠（DOC）溶液以裂解菌体从而释放菌体内的荚膜多糖（CN107835821A，以及，任克明，白贵杰，张丽芝等. 新型肺炎球菌荚膜多糖纯化方法的建立[J].中国生物制品学杂志,2020,33(10):1181-1185.DOI:10.13200/j.cnki.cjb.003178）。脱氧胆酸钠是一种胆盐，可快速激活自溶酶，加速肺炎链球菌等细菌的自身溶解。肺炎链球菌发酵末期加入终浓度为0.1%的脱氧胆酸钠溶液，可以裂解细菌菌体，从而释放肺炎链球菌细胞壁表面的荚膜多糖。然而，在此过程中，不仅与细胞壁连接的荚膜多糖大量释放，而且菌体胞内产物也同样释放到多糖溶液中，这使得后续纯化难度大大增加，并且提高了残留杂质的含量（蛋白、核酸等）。而且，脱氧胆酸钠属于动物源性物质，可能含有外源因子（如牛源性病毒）或其他致敏物质，进而容易导致更强的副作用或超过敏反应。此外，一定量的脱氧胆酸钠对胃黏膜细胞、鼻黏膜细胞以及胰腺腺泡细胞均有损伤作用。因此，若疫苗制品中存在脱氧胆酸钠残留，当其注入人体后，亦存在造成人体细胞损伤的风险。目前的解决方案是通过建立质控方法（如CN102830185B）及标准，保证疫苗使用的安全。但仍需要开发更好的解决方案能够减少、甚至避免脱氧胆酸钠的使用。
另外，随着肺炎链球菌疫苗价次的增高，制剂中精制多糖的残留蛋白与核酸杂质也会累加，给肺炎链球菌疫苗的安全性和质量控制带来新的挑战。因此，为进一步降低肺炎链球菌多糖疫苗以及肺炎链球菌多糖结合疫苗中残留蛋白与残留核酸的总量，需要降低单个型别精制多糖中残留蛋白与核酸的含量。
发明内容
本发明提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法。
在已有肺炎链球菌荚膜多糖生产方法中，脱氧胆酸钠作为裂解菌体以释放荚膜多糖的裂解剂对于荚膜多糖的提取具有十分重要的作用，目前尚无替代试剂可用于肺炎链球菌荚膜多糖制备。本发明在研发过程中意外地发现，β-丙内酯（BPL）具有明显的促进肺炎链球菌释放荚膜多糖的作用，可用于处理肺炎链球菌，提取荚膜多糖，且与脱氧胆酸钠不同，β-丙内酯不会裂解菌体，进而显著减少了菌体内蛋白、核酸等杂质的释放，有利于降低荚膜多糖提纯过程中的杂质含量和去除难度，而且，β-丙内酯易水解，且水解产物无毒无害，因此不会造成在荚膜多糖产品中的残留或健康风险。β-丙内酯目前多作为病毒灭活剂用于病毒疫苗的制备，关于其能够促进肺炎链球菌释放荚膜多糖且能够减少胞内蛋白质、核酸等杂质释放的功能，目前尚未见相关报道。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，所述方法包括：采用β-丙内酯对肺炎链球菌的发酵培养物进行处理，分离并收集上清液，将所述上清液进行纯化，收集荚膜多糖。
上述方法中，以β-丙内酯替代脱氧胆酸钠对肺炎链球菌进行杀灭并释放多糖，不仅解决了脱氧胆酸钠残留导致的健康风险或副作用问题，而且显著降低了提取荚膜多糖中蛋白质等杂质的含量，经纯化制得精制多糖中蛋白质等杂质的含量明显降低（尤其对5、10A、14、7F、15B型等肺炎链球菌荚膜多糖中蛋白含量高的型别，β-丙内酯处理菌体使用制得荚膜多糖中蛋白残留显著降低，除杂效果优异），质量明显优于脱氧胆酸钠裂解菌体后经纯化获得的精制多糖，而且具有较高的多糖回收率，回收率明显高于采用甲醛处理肺炎链球菌发酵培养物。
上述方法中，发酵培养物为肺炎链球菌经发酵培养得到的包含肺炎链球菌的培养物（例如发酵液）。
对于β-丙内酯在处理体系中的终浓度，可以本领域常用的β-丙内酯用量加入。
优选地，所述β-丙内酯在处理体系中的终浓度不低于0.01%。
示例性的β-丙内酯终浓度可为0.01%、0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1%等。
在本发明的一些实施方式中，所述β-丙内酯在处理体系中的终浓度不低于0.05%。
在本发明的一些实施方式中，所述β-丙内酯在处理体系中的终浓度为0.05-1%。优选为0.05-0.5%。
优选地，所述处理的温度为2-8℃。
优选地，所述处理的时间为8-16h。
优选地，所述处理为混合均匀后低温孵育。
以上所述的制备方法中，优选不使用脱氧胆酸钠。
优选地，在肺炎链球菌发酵培养的对数生长后期添加β-丙内酯（BPL）进行处理。在添加β-丙内酯（BPL）后，先搅拌混匀，再低温孵育处理。
本发明中，所述分离上清液可采用任意固液分离方法进行，例如可通过离心分离上清液。
本领域技术人员可以理解，肺炎链球菌荚膜多糖的制备分为从菌体中提取荚膜多糖的阶段（即将荚膜多糖与菌体分离，第一阶段）以及荚膜多糖的纯化阶段。β-丙内酯作为促使菌体释放荚膜多糖的试剂，在第一阶段发挥作用，且本发明通过实验证明，使用β-丙内酯处理肺炎链球菌发酵培养物不仅能够有效释放荚膜多糖，而且荚膜多糖提取液（处理后收集的上清液）中蛋白质和核酸的含量较使用脱氧胆酸钠时明显降低。因此，本发明对于后续荚膜多糖的纯化方法事实上没有特殊限制，只要能够有效去除蛋白质、核酸等杂质，使得制得荚膜多糖的纯度符合要求的纯化方法（例如现有技术中已知的用于纯化肺炎链球菌荚膜多糖的方法）均可以使用。
以上所述的纯化包括蛋白去除和核酸去除。
以上所述的纯化包括选自超滤、酸沉淀、盐沉淀、有机溶剂沉淀、层析中的一种或多种。
传统的肺炎链球菌荚膜多糖纯化工艺一般采用乙醇分级沉淀获得粗多糖，再用苯酚抽提、活性炭吸附或层析等方法处理获得精制多糖。使用这些方法虽然均可获得质量合格的肺炎链球菌荚膜多糖，但存在缺点和局限，如步骤多、耗时长，且苯酚作为一种具有极强腐蚀性的试剂，大量使用对人体和环境造成严重的危害。
优选地，本发明所述的纯化不使用有毒有害试剂，所述有毒有害试剂包括苯酚、丙酮中的一种或多种。
优选地，本发明所述的纯化不使用外源大分子物质，所述外源大分子物质包括核酸酶、蛋白酶中的一种或多种。
上述超滤优选使用孔径为100-300 KD超滤膜进行。
上述酸沉淀优选为在pH为2.5-4.5条件下沉淀。
上述盐沉淀优选采用包括钙盐的沉淀剂进行沉淀。
上述有机溶剂沉淀中使用的沉淀剂可为低级醇（例如乙醇、甲醇）等有机溶剂。
作为一种纯化方法的示例，所述纯化包括：将所述上清液进行超滤，得到第一超滤浓缩液；将所述第一超滤浓缩液进行第一沉淀处理，分离上清液得到第一上清液；将所述第一上清液进行第二沉淀处理，分离上清液得到第二上清液；
其中，所述第一沉淀处理为在pH为2.8-4.2条件下进行；
所述第二沉淀处理使用的沉淀剂包括低级醇。
上述纯化方法中，将经β-丙内酯处理的肺炎链球菌发酵培养物的上清液首先经超滤除去小分子残留物质，再经第一沉淀处理（酸沉淀）和第二沉淀处理（醇沉淀）去除蛋白、核酸等杂质，最后可再经超滤浓缩和干燥获得精制多糖。
优选地，所述第一沉淀处理为在2-8℃条件下静置不低于1h。在本发明中，第一沉淀可简称为酸沉淀。
在本发明的一些实施方式中，所述第一超滤浓缩液可进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射水体积为浓缩液体积的4-6倍。
在本发明的一些实施方式中，第一超滤浓缩液加入酸溶液调节pH至2.8-4.2，充分搅匀后于2-8℃静置不低于1h，然后离心收集第一上清液。
在本发明的另一些实施方式中，第一超滤浓缩液经过定容置换后，加入酸溶液调节pH至2.8-4.2，充分搅匀后于2-8℃静置不低于1h，然后离心收集第一上清液。
优选地，所述第二沉淀处理使用的沉淀剂包括磷酸缓冲盐、钠盐、钙盐以及低级醇。
其中，所述磷酸缓冲盐包括磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠。
所述钠盐包括氯化钠和/或醋酸钠。
所述钙盐包括氯化钙。
所述低级醇包括乙醇。
优选地，所述第二沉淀处理中，磷酸氢二钠的浓度为8-12mM，磷酸二氢钠的浓度为8-12mM，氯化钠的浓度为0.1-2.5M，醋酸钠的浓度为0.3-1.2M，所述氯化钙的浓度为0.1-0.35M，乙醇的用量为与料液体积比为20%-30%。在本发明中该步骤可简称为乙醇沉淀。
在一些实施方案中，所述乙醇可由50%、60%、70%、80%、90%乙醇溶液或无水乙醇提供，优选使用无水乙醇。
优选地，所述第二沉淀处理为在pH为5.3-5.5条件下进行。
优选地，所述第二沉淀处理为静置处理。处理时间优选为不低于3小时。
优选地，用碱液将第一上清液的pH调至6.8-7.2后，加入磷酸缓冲盐、钠盐和钙盐，然后再用酸液将pH调至5.3-5.5后，加入低级醇，进行第二沉淀处理。
上述将pH调至酸性可采用酸液进行，包括但不限于冰醋酸、盐酸、磷酸等；优选为冰醋酸。
上述将pH调至碱性可采用碱液进行，包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾等；优选为氢氧化钠。
优选地，所述超滤为使用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到第一超滤浓缩液。
优选地，所述纯化还包括：将所述第二上清液进行超滤，得到第二超滤浓缩液。
优选地，使用孔径为100-300KD膜对第二上清液进行超滤得到第二超滤浓缩液。
超滤所用注射用水体积可为第二上清液体积的5倍、6倍、7倍或8倍以上，优选为8倍以上。
作为另一种纯化方法的示例，所述纯化包括：将所述上清液依次进行第一超滤处理、沉淀处理和第二超滤处理；
其中，所述沉淀处理使用的沉淀剂包括钙盐，所述沉淀处理为在pH为2.4-3.6条件下进行。
本发明在肺炎链球菌荚膜多糖制备方法的研发过程中，偶然发现了一种简单、快速的肺炎链球菌多糖制备方法，该方法只需利用钙盐在酸性条件下进行一步沉淀（一步钙盐酸沉）配合常规超滤步骤，即可制备高质量的精制多糖，且制得精制多糖的各项指标均高于中国药典标准，显著降低了物料和时间成本，提高了纯化效率。以钙盐作为沉淀剂并在pH2.4-3.6的酸性条件下进行沉淀处理（钙盐酸沉）是上述制备方法得以实现其效果的关键。配合于上述“钙盐酸沉”，在其前后分别设置一次超滤处理，第一超滤处理的主要作用在于去除发酵培养物杀菌处理后的上清液中的小分子杂质，进而更有利于“钙盐酸沉”更好地发挥除杂作用，提高杂质的去除效率，第二超滤处理的主要作用在于浓缩多糖溶液以及对多糖溶液进行洗滤，进一步除去多糖溶液中的小分子杂质以及盐离子。
优选地，所述钙盐为氯化钙。
所述沉淀处理中，钙盐的浓度为80-200mmol/L。
所述沉淀处理为在2-8℃静置1-5小时后收集上清液，得到第一上清液。
优选地，所述纯化还包括将沉淀处理得到的第一上清液的pH调至6.8-7.5后，收集上清液，得到第二上清液，将所述第二上清液进行第二超滤处理。
其中，所述第一超滤处理使用孔径为100-150KD（优选为100KD）的超滤膜进行。在本发明的一些实施方式中，所述第一超滤处理为使用孔径为100KD的膜包浓缩3~5倍后等体积超滤。优选地，超滤所用纯化水体积为浓缩液体积的4~6倍。所述第二超滤处理使用孔径为100-150KD的超滤膜进行。在本发明的一些实施方式中，所述第二超滤处理中，洗滤所用注射用水体积为上清液体积的8-15倍。
上述将pH调至酸性可采用酸液进行，包括但不限于冰醋酸、盐酸、磷酸等；优选为磷酸。
上述将pH调至碱性可采用碱液进行，包括但不限于氢氧化钠、氢氧化钾等；优选为氢氧化钠。
本发明通过实验验证，上述不同纯化方法配合β-丙内酯处理肺炎链球菌发酵培养物均能取得较好的肺炎链球菌荚膜多糖精制效果，制得肺炎链球菌荚膜多糖中蛋白质等杂质含量较使用DOC处理明显降低，且均符合要求，特异基团含量等质量控制指标也均符合要求。
以上所述的制备方法还包括：将所述第二超滤浓缩液进行干燥处理。
优选地，所述干燥处理为冷冻干燥处理。
本发明所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法可用于不同型别的肺炎链球菌，包括但不限于：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型。
在本发明的一些实施方式中，所述肺炎链球菌为5、10A、14、7F、15B型中的一种或多种。
本发明还提供以上所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法制备得到的肺炎链球菌荚膜多糖。
优选地，所述肺炎链球菌荚膜多糖不含有脱氧胆酸盐。
进一步优选地，所述肺炎链球菌荚膜多糖不含有脱氧胆酸钠。
本发明提供以上所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法或所述肺炎链球菌荚膜多糖在制备含肺炎链球菌荚膜多糖产品中的应用。
优选地，所述含肺炎链球菌荚膜多糖产品为疫苗。
所述疫苗包括肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗。
本发明提供一种肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗，所述疫苗包含以上所述的肺炎链球菌荚膜多糖。
上述肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗可为单价或多价疫苗。
其中，所述多价疫苗包含肺炎链球菌1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型中的至少两种型别的荚膜多糖。
优选地，多价肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或荚膜多糖结合疫苗包含5、7F、10A、14、15B型肺炎链球菌中至少一种型别的荚膜多糖。
具体地，所述肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗可为23价肺炎链球菌多糖疫苗，13价肺炎链球菌多糖结合疫苗，20价肺炎链球菌多糖结合疫苗、24价肺炎链球菌多糖结合疫苗。
所述23价肺炎链球菌多糖疫苗含有1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。
所述13价肺炎链球菌多糖结合疫苗含有1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、23F型肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。
所述20价肺炎链球菌多糖结合疫苗含有1、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、10A、11A、12F、14、15B、18C、19A、19F、22F、23F、33F型肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。
所述24价肺炎链球菌多糖结合疫苗含有1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F型肺炎链球菌血清型的荚膜多糖。
本发明还提供一种肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，所述方法包括：利用以上所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法制备得到肺炎链球菌荚膜多糖，以所述肺炎链球菌荚膜多糖为免疫原制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗。
本发明的有益效果至少包括：本发明使用β-丙内酯处理肺炎链球菌发酵培养物，可在不裂解菌体的情况下达到灭活菌体并有效释放荚膜多糖的效果，避免了菌体裂解后胞内蛋白质、核酸等杂质的大量释放，从而降低了后续纯化的难度，减少了蛋白质等杂质残留，同时具有较高的多糖收率；而且，β-丙内酯易水解，且水解产物无毒无害，不存在其在成品疫苗中残留导致的健康风险和副作用问题，安全性更高。采用β-丙内酯替代脱氧胆酸钠处理肺炎链球菌避免了引入动物源性物质以及脱氧胆酸钠的潜在健康风险，制得肺炎链球菌荚膜多糖中蛋白质、核酸等杂质含量及特异基团含量等质量控制指标均符合要求，可用于肺炎链球菌荚膜多糖疫苗和多糖结合疫苗的制备。
具体实施方式
本发明提供肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，所述方法包括：采用β-丙内酯对肺炎链球菌的发酵培养物进行处理，分离并收集上清液，将所述上清液进行纯化，收集荚膜多糖。
具体地，所述肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法包括如下步骤：
1、在培养至发酵对数生长后期的肺炎链球菌发酵液中加入β-丙内酯（BPL）至终浓度不低于0.01%并搅拌混匀，低温孵育处理8-16h后，将处理后的发酵液离心收集上清液；
2、将所述上清液进行纯化，得到精制荚膜多糖。
对于纯化方法，作为示例，在本发明的一些具体实施方式中，所述纯化包括如下步骤：
（1）将β-丙内酯处理收集的上清液用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到第一超滤浓缩液，浓缩液进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射水体积为浓缩液体积的4-6倍；
（2）在步骤（1）得到的进行定容置换后的第一超滤浓缩液中加入冰醋酸调节pH至2.8-4.2，充分搅匀后于2-8℃静置不低于1h，然后离心收集上清液；
（3）将步骤（2）得到的上清液用NaOH溶液回调pH至中性，向料液中加入磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，再加入氯化钠、醋酸钠、氯化钙，充分搅拌均匀后加入冰醋酸调节pH至5.3-5.5，加入无水乙醇，静置不低于3h后，离心收集上清液；
（4）将步骤（3）得到的上清液用孔径为100-300 KD膜超滤得到第二超滤浓缩液，超滤所用注射用水体积为上清液体积的8倍以上；
（5）将步骤（4）中得到的第二超滤浓缩液冻干，得到肺炎链球菌荚膜多糖。
作为示例，在本发明的另一些具体实施方式中，所述纯化包括如下步骤：
（1）将β-丙内酯处理收集的上清液用孔径为100KD膜进行超滤得到第一超滤浓缩液；
（2）在第一超滤浓缩液中加入终浓度80-200mmol/L的CaCl2溶液，用酸液调节pH为2.4-3.6，于2~8℃静置1h以上，然后离心收集上清液，用碱液回调pH至7.00-7.50，再次离心收集上清液；
（3）将步骤（2）得到的上清液用孔径为100KD膜进行超滤得到多糖超滤浓缩液；
（4）将步骤（3）得到的多糖超滤浓缩液进行冻干，得到肺炎链球菌荚膜多糖。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例和对比例中荚膜多糖收率的计算方法如下：
DOC处理完全裂解细胞，荚膜多糖全部释放计为100%，以DOC处理发酵液中多糖总量为基础计算采用BPL或甲醛处理发酵液时，荚膜多糖的收率：
BPL或甲醛处理时多糖收率=BPL或甲醛处理发酵液中多糖总量/DOC处理发酵液中多糖总量。
实施例1 肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法（1）
本实施例提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，并以5型肺炎链球菌的发酵培养物为原料制备荚膜多糖，具体方法如下：
在培养至发酵对数生长后期的5型肺炎练球菌发酵液中加入BPL至终浓度分别为0.05%（实施例1-001批）、0.1%（实施例1-002批）、0.2%（实施例1-003批），搅拌均匀后，于2-8℃孵育12 h；将处理后的发酵液以8000rpm离心30 min，收集上清液；对上清液进行纯化以制备精制多糖，具体纯化工艺如下：
将上清液用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到浓缩液，将浓缩液进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射用水体积为浓缩液体积的4-6倍，此步获得第一超滤浓缩液；
向第一超滤浓缩液中加入冰醋酸调节pH至4.0，充分搅匀后于2-8℃静置1h，然后离心收集上清液，即为第一上清液；
将第一上清液用5M NaOH溶液回调pH至7.0，按料液体积加入磷酸氢二钠至浓度为10mmol/L、磷酸二氢钠（一水）至浓度为10mmol/L、氯化钠至浓度为0.15mol/L、无水醋酸钠至浓度为0.3mol/L、氯化钙（二水）至浓度为0.25mol/L，充分搅拌均匀后加冰醋酸调节pH至5.3-5.5，按料液体积加入20%（v/v）的无水乙醇，搅拌均匀后于2-8℃静置3h，然后离心收集上清液，即为第二上清液；
将第二上清液用孔径为100KD膜包进行定容置换，置换用溶液为注射用水，注射用水体积为上清液体积的8倍以上，将料液进行超滤浓缩得到荚膜多糖原液。
将荚膜多糖原液进行冻干，冻干结束收集精制多糖。
对比例1
本对比例以5型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例1的原料相同，培养至发酵对数生长后期的5型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例1、对比例1和对比例2）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例1的区别仅在于：将BPL替换为0.1%DOC。
对比例2
本对比例以5型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例1的原料相同，培养至发酵对数生长后期的5型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例1、对比例1和对比例2）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例1的区别仅在于：将BPL替换为1%甲醛。
实验例1
对实施例1和对比例1-2的制备方法的多糖收率以及制得精制荚膜多糖的杂质含量等指标进行检测，具体如下：
荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法（3.3.2）进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0704）进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则3103）进行；糖醛酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；氨基己糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；荚膜多糖分子量大小的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。
相关检定结果见表1和表2。
表1 实施例1及对比例1、2制得荚膜多糖的质量控制指标
注：对比例1-001批、002批、003批为三次平行实验，分别与实施例1-001批、002批、003批平行对比，其他对比例类推。
表2 实施例1及对比例1、2处理发酵液的多糖含量及回收率
结果表明，BPL处理（实施例1）后多糖总量达到DOC（对比例1）处理后多糖总量的70%以上，甲醛处理（对比例2）后多糖总量只有DOC处理后多糖总量的40%左右；与DOC处理相比，BPL处理与甲醛处理获得的精制多糖中杂质蛋白含量下降幅度可达到30%以上，其质量显著优于DOC处理获得精制多糖，同时BPL处理获得精制多糖的蛋白含量与甲醛处理获得精制多糖的蛋白含量无显著差异。因此，BPL作为肺炎链球菌杀菌剂即可获得高质量的精制多糖，又可以获得相对较高的多糖回收率。
实施例2 肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法（2）
本实施例提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，并以10A型肺炎链球菌的发酵培养物为原料制备荚膜多糖，具体方法如下：
在培养至发酵对数生长后期的10A型肺炎链球菌发酵液中加入BPL至终浓度0.05%（实施例2-001批），0.1%（实施例2-002批），0.2%（实施例2-003批），搅拌均匀后，于2-8℃孵育8 h；将处理后的发酵液以8000rpm离心30 min，收集上清液；对上清液进行纯化以制备精制多糖，具体纯化工艺如下：
将上清液用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到浓缩液，将浓缩液进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射用水体积为浓缩液体积的4-6倍，此步获得第一超滤浓缩液；
向第一超滤浓缩液中加入冰醋酸调节pH至4.0，充分搅匀后于2-8℃静置1h，然后离心收集上清液，即为第一上清液；
将第一上清液用5M NaOH溶液回调pH至7.0，按料液体积加入磷酸氢二钠至浓度为10mmol/L、磷酸二氢钠（一水）至浓度为10mmol/L、氯化钠至浓度为0.9mol/L、无水醋酸钠至浓度为1.2mol/L、氯化钙（二水）至浓度为0.25mol/L，充分搅拌均匀后加冰醋酸调节pH至5.3-5.5，按料液体积加入30%（v/v）的无水乙醇，搅拌均匀后于2-8℃静置3h，然后离心收集上清液，即为第二上清液；
将第二上清液用孔径为100KD膜包进行定容置换，置换用溶液为注射用水，注射用水体积为上清液体积的8倍以上，将料液进行超滤浓缩得到荚膜多糖原液。
将荚膜多糖原液进行冻干，冻干结束收集精制多糖。
对比例3
本对比例以10A型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例2的原料相同，培养至发酵对数生长后期的5型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例2、对比例3和对比例4）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例2的区别仅在于：将BPL替换为0.1%DOC。
对比例4
本对比例以10A型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例2的原料相同，培养至发酵对数生长后期的5型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例2、对比例3和对比例4）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例2的区别仅在于：将BPL替换为1%甲醛。
实验例2
对实施例2和对比例3-4的制备方法的多糖收率以及制得精制荚膜多糖的杂质含量等指标进行检测，具体如下：
荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法（3.3.2）进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0704）进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则3103）进行；氨基己糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；荚膜多糖分子量大小的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。
相关检定结果见表3和表4。
表3 实施例2及对比例3、4制得荚膜多糖的质量控制指标
表4 实施例2及对比例3、4处理发酵液的多糖含量及回收率
结果表明，BPL处理（实施例2）后多糖总量达到DOC处理（对比例3）后多糖总量的70%左右，甲醛处理（对比例4）后多糖总量只有DOC处理后多糖总量的45%左右；与DOC处理相比，BPL处理与甲醛处理获得的精制多糖的杂质蛋白含量下降幅度可达到72%以上，其质量显著优于DOC处理获得精制多糖，同时BPL处理获得精制多糖的杂质蛋白含量与甲醛处理获得精制多糖的蛋白含量无显著差。因此，BPL作为肺炎链球菌杀菌剂即可获得高质量的精制多糖，又可以获得相对较高的多糖回收率。
实施例3 肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法（3）
本实施例提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，并以14型肺炎链球菌的发酵培养物为原料制备荚膜多糖，具体方法如下：
在培养至发酵对数生长后期的14型肺炎链球菌发酵液中加入BPL至终浓度0.05%（实施例3-001批），0.1%（实施例3-002批），0.2%（实施例3-003批），搅拌均匀后，于2-8℃孵育10 h；将处理后的发酵液以8000rpm离心30 min，收集上清液；对上清液进行纯化以制备精制多糖，具体纯化工艺如下：
将上清液用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到浓缩液，将浓缩液进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射用水体积为浓缩液体积的4-6倍，此步获得第一超滤浓缩液；
向第一超滤浓缩液中加入冰醋酸调节pH至4.0，充分搅匀后于2-8℃静置1h，然后离心收集上清液，即为第一上清液；
将第一上清液用5M NaOH溶液回调pH至7.0，按料液体积加入磷酸氢二钠至浓度为10mmol/L、磷酸二氢钠（一水）至浓度为10mmol/L、氯化钠至浓度为2.5mol/L、无水醋酸钠至浓度为0.9mol/L、氯化钙（二水）至浓度为0.35mol/L，充分搅拌均匀后加冰醋酸调节pH至5.3-5.5，按料液体积加入25%（v/v）的无水乙醇，搅拌均匀后于2-8℃静置3h，然后离心收集上清液，即为第二上清液；
将第二上清液用孔径为100KD膜包进行定容置换，置换用溶液为注射用水，注射用水体积为上清液体积的8倍以上，将料液进行超滤浓缩得到荚膜多糖原液。
将荚膜多糖原液进行冻干，冻干结束收集精制多糖。
对比例5
本对比例以14型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例3的原料相同，培养至发酵对数生长后期的14型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例3、对比例5和对比例6）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例3的区别仅在于：将BPL替换为0.1%DOC。
对比例6
本对比例以14型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例3的原料相同，培养至发酵对数生长后期的14型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例3、对比例5和对比例6）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例3的区别仅在于：将BPL替换为1%甲醛。
实验例3
对实施例3和对比例5-6的制备方法的多糖收率以及制得精制荚膜多糖的杂质含量等指标进行检测，具体如下：
荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法（3.3.2）进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0704）进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则3103）进行；氨基己糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；荚膜多糖分子量大小的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。相关检定结果见表5和表6。
表5 实施例3及对比例5、6制得荚膜多糖的质量控制指标
表6 实施例3及对比例5、6处理发酵液的多糖含量及回收率
结果表明，BPL处理（实施例3）后多糖总量达到DOC处理（对比例5）后多糖总量的70%左右，甲醛处理（对比例6）后多糖总量只有DOC处理后多糖总量的47%左右BPL处理获得精制多糖的蛋白含量与甲醛处理获得精制多糖的蛋白含量无显著差异，但与DOC处理相比，BPL处理获得精制多糖的蛋白含量下降幅度可达到57%以上，其质量显著优于DOC处理获得精制多糖。因此，BPL作为肺炎链球菌杀菌剂即可获得高质量的精制多糖，又可以获得相对较高的多糖回收率。
实施例4 肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法（4）
本实施例提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，并以7F型肺炎链球菌的发酵培养物为原料制备荚膜多糖，具体方法如下：
在培养至发酵对数生长后期的7F型肺炎链球菌发酵液中加入BPL至终浓度0.05%（实施例4-001批），0.1%（实施例4-002批），0.2%（实施例4-003批），搅拌均匀后，于2-8℃孵育16h；将处理后的发酵液以8000rpm离心30 min，收集上清液；对上清液进行纯化以制备精制多糖，具体纯化工艺如下：
将上清液用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到浓缩液，将浓缩液进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射用水体积为浓缩液体积的4-6倍，此步获得第一超滤浓缩液；
向第一超滤浓缩液中加入冰醋酸调节pH至4.0，充分搅匀后于2-8℃静置1h，然后离心收集上清液，即为第一上清液；
将第一上清液用5M NaOH溶液回调pH至7.0，按料液体积加入磷酸氢二钠至浓度为10mmol/L、磷酸二氢钠（一水）至浓度为10mmol/L、氯化钠至浓度为0.3mol/L、无水醋酸钠至浓度为1.2mol/L、氯化钙（二水）至浓度为0.2mol/L，充分搅拌均匀后加冰醋酸调节pH至5.3-5.5，按料液体积加入25%（v/v）的无水乙醇，搅拌均匀后于2-8℃静置3h，然后离心收集上清液，即为第二上清液；
将第二上清液用孔径为100KD膜包进行定容置换，置换用溶液为注射用水，注射用水体积为上清液体积的8倍以上，将料液进行超滤浓缩得到荚膜多糖原液。
将荚膜多糖原液进行冻干，冻干结束收集精制多糖。
对比例7
本对比例以7F型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例4的原料相同，培养至发酵对数生长后期的7F型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例4、对比例7和对比例8）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例4的区别仅在于：将BPL替换为0.1%DOC。
对比例8
本对比例以7F型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例4的原料相同，培养至发酵对数生长后期的7F型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例4、对比例7和对比例8）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例4的区别仅在于：将BPL替换为1%甲醛。
实验例4
对实施例4和对比例7-8的制备方法的多糖收率以及制得精制荚膜多糖的杂质含量等指标进行检测，具体如下：
荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法（3.3.2）进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0704）进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则3103）进行；甲基戊糖含量的检定《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；荚膜多糖分子大小量的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。相关检定结果见表7和表8。
表7 实施例4及对比例7、8制得荚膜多糖的质量控制指标
表8 实施例4及对比例7、8处理发酵液的多糖含量及回收率
结果表明，BPL处理（实施例4）后多糖总量达到DOC处理（对比例7）后多糖总量的73%左右，甲醛处理（对比例8）后多糖总量只有DOC处理后多糖总量的47%左右；BPL处理获得精制多糖的蛋白含量与甲醛处理获得精制多糖的蛋白含量无显著差异，但与DOC处理相比，BPL处理获得精制多糖的蛋白含量下降幅度达到57%以上，其质量显著优于DOC处理获得精制多糖。因此，BPL作为肺炎链球菌杀菌剂即可获得高质量的精制多糖，又可以获得相对较高的多糖回收率。
实施例5 肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法（5）
本实施例提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，并以15B型肺炎链球菌的发酵培养物为原料制备荚膜多糖，具体方法如下：
在培养至发酵对数生长后期的15B型肺炎链球菌发酵液中加入BPL至终浓度0.05%（实施例5-001批），0.1%（实施例5-002批），0.2%（实施例5-003批），搅拌均匀后，于2-8℃孵育14 h；将处理后的发酵液以8000rpm离心30 min，收集上清液；对上清液进行纯化以制备精制多糖，具体纯化工艺如下：
将上清液用孔径为100KD膜包超滤浓缩得到浓缩液，将浓缩液进行定容置换，置换用溶液为注射用水，所用注射用水体积为浓缩液体积的4-6倍，此步获得第一超滤浓缩液；
向第一超滤浓缩液中加入冰醋酸调节pH至4.0，充分搅匀后于2-8℃静置1h，然后离心收集上清液，即为第一上清液；
将第一上清液用5M NaOH溶液回调pH至7.0，按料液体积加入磷酸氢二钠至浓度为10mmol/L、磷酸二氢钠（一水）至浓度为10mmol/L、氯化钠至浓度为0.15mol/L、无水醋酸钠至浓度为0.9mol/L、氯化钙（二水）至浓度为0.15mol/L，充分搅拌均匀后加冰醋酸调节pH至5.3-5.5，按料液体积加入30%（v/v）的无水乙醇，搅拌均匀后于2-8℃静置3h，然后离心收集上清液，即为第二上清液；
将第二上清液用孔径为100KD膜包进行定容置换，置换用溶液为注射用水，注射用水体积为上清液体积的8倍以上，将料液进行超滤浓缩得到荚膜多糖原液。
将荚膜多糖原液进行冻干，冻干结束收集精制多糖。
对比例9
本对比例以15B型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例5的原料相同，培养至发酵对数生长后期的15B型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例5、对比例9和对比例10）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例5的区别仅在于：将BPL替换为0.1%DOC。
对比例10
本对比例以15B型肺炎链球菌的发酵培养物为原料（与实施例5的原料相同，培养至发酵对数生长后期的15B型肺炎链球菌发酵液，均分为三份，分别用于实施例5、对比例9和对比例10）制备荚膜多糖，其使用的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法与实施例5的区别仅在于：将BPL替换为1%甲醛。
实验例5
对实施例5和对比例9-10的制备方法的多糖收率以及制得精制荚膜多糖的杂质含量等指标进行检测，具体如下：
荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法（3.3.2）进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0704）进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则3103）进行；氨基己糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；荚膜多糖分子量大小的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。相关检定结果见表9和表10。
表9 实施例5及对比例9、10制得荚膜多糖的质量控制指标
表10 实施例5及对比例9、10处理发酵液的多糖含量及回收率
结果表明，BPL处理（实施例5）后多糖总量达到DOC处理（对比例9）后多糖总量的68%左右，甲醛处理（对比例10）后多糖总量只有DOC处理后多糖总量的49%左右；BPL处理获得精制多糖的蛋白含量与甲醛处理获得精制多糖的蛋白含量无显著差异，但与DOC处理相比，BPL处理获得精制多糖的蛋白含量下降幅度可达到62%以上，其质量显著优于DOC处理获得精制多糖。因此，BPL作为肺炎链球菌杀菌剂即可获得高质量的精制多糖，又可以获得相对较高的多糖回收率。
综上所述，采用β-丙内酯处理肺炎链球菌制备的肺炎链球菌荚膜多糖，蛋白去除率显著高于DOC处理，与甲醛处理基本持平，但多糖的释放量明显高于甲醛处理，且制得荚膜多糖的各项质量指标均符合中国药典标准的要求。
实施例6 肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法（6）
本实施例提供一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，并以14型肺炎链球菌的发酵培养物为原料制备荚膜多糖，具体方法如下：
在培养至发酵对数生长后期的14型肺炎链球菌发酵液中加入β-丙内酯至终浓度为0.1%，搅拌均匀后，于4℃孵育12h，然后12000g离心30 min，收集上清液；对上清液进行纯化以制备精制多糖，具体纯化工艺如下：
（1）将得到的上清液用孔径为100KD膜进行超滤得到超滤浓缩液，浓缩后体积为上清液体积的1/5～1/4，超滤所用纯化水体积为浓缩液体积的5倍以上；
（2）向步骤（1）得到的超滤浓缩液中分别加入终浓度80mmol/L(14-2308001)、120mmol/L(14-2308002)、200mmol/L(14-2308003)的CaCl2溶液，充分搅匀后调节pH为3.00±0.1，充分搅匀后于2~8℃静置5h，然后12000g离心30 min，收集上清液，用NaOH回调pH至7.00-7.50，再次12000g离心30 min，收集上清液；
（3）将步骤（2）得到的上清液用孔径为100KD膜进行超滤得到多糖超滤浓缩液，超滤所用注射用水体积为上清液体积的10倍以上；
（4）将步骤（3）得到的超滤浓缩液进行冻干，结束后收集精制多糖。
实验例6
对实施例6的制备方法制得的14型肺炎链球菌荚膜多糖进行检定，具体如下：
荚膜多糖含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中速率比浊法（3.3.2）进行；蛋白含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；核酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；总氮含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0704）进行；磷含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则3103）进行；糖醛酸含量的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0731）进行；甲基戊糖的检定依据《中华人民共和国药典》2020版三部中（通则0401）进行；荚膜多糖分子大小的测定依据《中华人民共和国药典》2020版三部3.1.2.10中第一法进行。相关检定结果见表11。
表11 14型肺炎链球菌荚膜多糖的质量控制指标
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述方法包括：采用β-丙内酯对肺炎链球菌的发酵培养物进行处理，分离并收集上清液，将所述上清液进行纯化，收集荚膜多糖；
其中，所述β-丙内酯作为促使菌体释放荚膜多糖的试剂，所述处理的温度为2-8℃。
2.根据权利要求1所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述β-丙内酯在处理体系中的终浓度不低于0.01%。
3.根据权利要求2所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述处理的时间为8-16h。
4.根据权利要求1~3任一项所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述纯化包括蛋白去除和核酸去除；
和/或，所述纯化包括选自超滤、酸沉淀、盐沉淀、有机溶剂沉淀、层析中的一种或多种。
5.根据权利要求4所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述纯化包括：将所述上清液进行超滤，得到第一超滤浓缩液；将所述第一超滤浓缩液进行第一沉淀处理，分离上清液得到第一上清液；将所述第一上清液进行第二沉淀处理，分离上清液得到第二上清液；
其中，所述第一沉淀处理为在pH为2.8-4.2条件下进行；
所述第二沉淀处理使用的沉淀剂包括低级醇。
6.根据权利要求5所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述第二沉淀处理使用的沉淀剂包括磷酸缓冲盐、钠盐、钙盐和低级醇。
7.根据权利要求6所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述磷酸缓冲盐包括磷酸氢二钠和/或磷酸二氢钠；
和/或，所述钠盐包括氯化钠和/或醋酸钠；
和/或，所述钙盐包括氯化钙；
和/或，所述低级醇包括乙醇。
8.根据权利要求5~7任一项所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述纯化还包括：将所述第二上清液进行超滤，得到第二超滤浓缩液。
9.权利要求1~8任一项所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法制备得到的肺炎链球菌荚膜多糖。
10.权利要求1~8任一项所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法或权利要求9所述的肺炎链球菌荚膜多糖在制备含肺炎链球菌荚膜多糖产品中的应用。
11.一种肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗，其特征在于，所述疫苗包含权利要求9所述的肺炎链球菌荚膜多糖。
12.一种肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1~8任一项所述的肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法制备得到肺炎链球菌荚膜多糖，以所述肺炎链球菌荚膜多糖为免疫原制备肺炎链球菌荚膜多糖疫苗或肺炎链球菌荚膜多糖结合疫苗。
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