CN113215210B - 一种采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法，包括步骤：1)取大肠埃希氏菌发酵液，加热升温至65～95℃，调节pH至1.0～3.5，进行水解反应，得到水解液；2)取步骤1)所得水解液，经过滤、浓缩、结晶、烘干，得到所述唾液酸。该方法相比现有技术更简单，所制备的唾液酸纯度高，产率更高。

Description

一种采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法

技术领域

本发明涉及唾液酸制备技术领域，尤其是一种采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法。

背景技术

唾液酸(sialic acid，SA)是一类酸性氨基糖，在脊椎动物体内，唾液酸由肝脏合成，以聚合物、复合物形式结合在细胞表面，对于大脑发育、免疫调节、抗菌抗病毒、抗氧化和美白、肠道菌群定植等具有重要作用。动物乳中含有大量的唾液酸，其中人乳中的唾液酸含量在初乳中可以达到1.5g/L或更高，唾液酸对幼儿发育尤其重要。对缺乏唾液酸的人群，适量补充外源唾液酸非常必要。

人体自身合成的唾液酸均为N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，NeuAc)，NeuAc分子中具有吡喃糖结构，分子式为C₁₁H₁₉NO₉，全名是5-氨基-3,5-二脱氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖，分子量为309.3，极易溶于水，而不易溶于乙醇等有机溶剂，在水溶液中呈现酸性，2％的水溶液pH约为1.8～2.3。燕窝中含有丰富NeuAc，干重含量可达到5％～10％，因此，燕窝是传统的滋补佳品。NeuAc的体内合成路径明确，目前已经可以利用重组菌来生产NeuAc合成的关键酶，进而合成NeuAc；也可以直接重组菌种通过发酵获得NeuAc。另外，自然界中的大肠埃希氏菌K1、K92、K235等，能够合成聚唾液酸(poly Sialic acid，PSA)。大肠埃希氏菌K235产生的PSA是NeuAc以糖苷键链接而成的同聚物，通过自然菌种发酵产生PSA，再进一步水解提纯获得唾液酸单体，是发酵法制备唾液酸的有效方法。由于NeuAc是唾液酸家族中最常见的糖类，因此，在未特别说明的情况下，唾液酸特指NeuAc。

天然或诱变来源的大肠埃希氏菌发酵液中的唾液酸以聚唾液酸的形式存在。发酵液中聚唾液酸分离及唾液酸单体的提纯，一般将发酵液中的菌体等不溶性杂质先行分离，得到富含PSA的溶液或PSA纯品，再进一步水解分离提纯获得SA产品。文献^[1]“大肠杆菌发酵液中唾液酸的提取”和文献^[2]“聚唾液酸的水解与唾液酸的纯化”的方法：将发酵液加入一定量氯化钙饱和溶液，离心(去除菌体)，超滤浓缩，95％乙醇沉淀，75％乙醇洗涤，干燥得到PSA粗品。该粗品溶解，水解(将PSA水解成SA单体)，中和，离心，离子交换层析，冷冻干燥获得唾液酸成品。文献^[3]将发酵液经离心去除菌体，再用大量乙醇使聚唾液酸析出，干燥后用水复溶，再用硅藻土助滤获得滤液，用乙醇沉淀PSA，并干燥精制得PSA，PSA溶解后进行水解，脱色，结晶，获得唾液酸产品。专利CN101195661B，CN103361283B，CN104628794B等则将发酵液中的菌体去除后，直接提取精制PSA，最终获得PSA的产品，但不是唾液酸单体。总之，现有技术中制备唾液酸的方法过于复杂，所得唾液酸的纯度较低，产率一般。

参考文献：

1.吴剑荣等,大肠杆菌发酵液中唾液酸的提取.中国医药工业杂志,2003.34(1):p.8-10.

2.赵慧等,聚唾液酸的水解与唾液酸的纯化.无锡轻工大学学报,2004.23(4):p.16-19.

3.郑志永等,唾液酸溶析结晶工艺的研究.食品与发酵工业,2006.32(5):p.58-61.

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种唾液酸的制备方法，该方法更简单，所制备的唾液酸纯度高，产率更高。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法，包括如下步骤：

1)取大肠埃希氏菌发酵液，加热升温至65～95℃，调节pH至1.0～3.5，进行水解反应，得到水解液；

2)取步骤1)所得水解液，经过滤、浓缩、结晶、烘干，得到所述唾液酸(单体)。

优选地，所述步骤2)中过滤包括如下步骤：

S1、调节pH至中性，首次过滤，收集过滤清液，进行超滤，收集滤出液；

S2、取步骤S1收集的滤出液，调节pH至碱性，搅拌均匀后过滤，收集清液；

S3、取步骤S2收集的清液调节pH至中性，进行纳滤并收集截留液。

需要说明的是，经过步骤1)聚唾液酸水解成为唾液酸，大肠埃希氏菌菌体也被裂解；所述步骤S2中优选采用NaOH调节pH；所述步骤S3的截留液优选采用专利CN109180745A步骤7的方法，进行浓缩、结晶、烘干，最后得到的唾液酸单体纯度高于98％。

优选地，所述步骤1)中，加热升温至85℃，用盐酸调节pH至1.5。需要说明的是，步骤1)发酵液未经除菌，直接进行聚唾液酸的水解分离，是本申请的创新点之一，由此，节省了一道重要的工序，进而降低了制备成本。

优选地，所述步骤S1中首次过滤收集清液后调整温度至36～45℃。

优选地，所述步骤S1中超滤采用的超滤膜的截留分子量为1000～5000Da。需要说明的是，在步骤S1中，陶瓷膜过滤为去除菌体碎片和不溶性杂质，超滤为去除大分子物质；由于PSA的聚合度是不均一的，其分子量范围也有很大，直接水解之后，PSA水解为SA单体，SA单体的分子量为309.3，可以很容易透过10～50nm的陶瓷膜和1000～5000Da的超滤膜；如果不直接水解，则10～50nm陶瓷膜既截留了菌体，也大量截留了PSA，提高陶瓷膜孔径，PSA截留量下降，但是菌体会大量透过；1000～5000Da的超滤膜是为了去除大分子物质，但也能够截留PSA，PSA水解之后，则SA单体在上述2种过滤条件下，均有较好的收率。

优选地，所述步骤S1～S3任一步骤间可加入活性炭，并过滤；更优选地，活性炭加入量为所述滤出液质量的0.5～5％。

优选地，所述步骤S2中调节pH前将温度调整至25～35℃，pH调节至10～12。

优选地，所述步骤S3中纳滤采用的纳滤膜截留分子量为300～800Da。需要说明的是，由于多次的酸碱调节，溶液中会积累大量的小分子盐，该步骤为了去除小分子盐类。

优选地，所述步骤S1和S2中的过滤选用陶瓷膜，陶瓷膜的孔径为10～50nm。需要说明的是，在步骤S2中调pH，以及使用10～50nm陶瓷膜过滤是去除碱变性分子的有效手段，因为发酵液直接水解使菌体大量破碎，会释放大量的蛋白质、核酸等，在酸水解和过滤时，已经将大量的酸变性分子除去。

优选地，所述步骤S1中，陶瓷膜孔径为30nm，降温至45℃后进行超滤，超滤膜的截留分子量为3000Da。

优选地，所述步骤S2前，加入活性炭，并过滤，活性炭的加入量为滤出液质量的2％；

所述步骤S2中，降温至30℃后调节pH至11.5，陶瓷膜的孔径为30nm；

所述步骤S3中，纳滤采用的纳滤膜截留分子量为500Da。

综上所述，本发明的有益效果为：

本发明的从大肠埃希氏菌(又叫大肠杆菌)发酵液中分离提取唾液酸(SA)的方法与现有技术相比有根本性的差异，本发明中发酵液未经除菌分离步骤，在大肠杆菌菌体存在的情况下，直接水解PSA变为SA，水解过程中菌体也一并裂解，再进一步分离提纯，最终得到SA的纯度≥98％；本发明的方法工艺更简单，收率更稳定，适宜于大规模生产。

具体实施方式

在一些实施例中，本发明提供了一种聚唾液酸发酵液直接水解提取唾液酸的方法，包括如下步骤：

步骤1)大肠埃希氏菌发酵获得发酵液，加热升温至65至95℃，用盐酸或其他强酸，调节pH至1.0～3.5，搅拌下维持2～8h。将PSA水解成为SA，菌体也被裂解。

步骤2)步骤1的水解液调节pH至中性，趁热用陶瓷膜过滤，过滤孔径为10～50nm，收集过滤清液，降温至36～45℃，用1000～5000Da的超滤膜超滤，收集滤出液。

步骤3)步骤2收集的清液，加入占清液质量0.5％～5％的活性炭，搅拌0.5～2.0h，过滤收集清液。

步骤4)步骤3收集的清液，降温至25～35℃，用NaOH调节pH10～12，搅拌0.5～2.0h，用10～50nm的陶瓷膜过滤，收集清液。

步骤5)步骤4收集的清液用盐酸调节pH至中性，300～800Da纳滤膜纳滤，收集截留液。

步骤6)步骤5的截留液按照专利CN109180745A步骤7的方法，进行浓缩，浓缩液中产品得率比常规方法明显提高，再进行结晶、烘干，得到高纯度的SA单体。采用该方法制备唾液酸，其过程相比现有技术更简单，产品得率(即收率)稳定在65％以上。

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。如无特别说明，本发明中的方法均为常规方法。如无特别说明，本发明中的试剂、物质、菌体的浓度均为质量浓度。

实施例1

本发明中采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法的一种实施例，包括步骤：取富含聚唾液酸的大肠杆菌发酵液45.3kg，其中湿菌体含量28.7％，PSA净含量638g。用盐酸调节pH至1.5，搅拌加热至85℃，水解4.5h，用氢氧化钠溶液调pH至中性，趁热用30nm陶瓷膜过滤，收集清液。降温至45℃，用3000Da超滤膜超滤收集清液。加入2％的活性炭搅拌脱色0.5h，过滤收集清液。降温至30℃，用氢氧化钠调节pH至11.5，搅拌0.5h，用30nm陶瓷膜过滤收集清液。调节pH至中性，用500Da的纳滤膜纳滤收集截留液。截留液浓缩至SA含量561g/L，浓缩液中SA的净含量535g。用盐酸调节浓缩液pH至1.0，4～8℃放置20h，析出大量晶体，晶体分离洗涤烘干后，测得唾液酸433g，含量为98.5％，收率67.9％。

实施例2

本发明中采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法的一种实施例，包括步骤：取富含聚唾液酸的大肠杆菌发酵液39kg，其中湿菌体含量25.9％，PSA净含量584g。用盐酸调节pH至1，搅拌加热至95℃，水解2h，用氢氧化钠溶液调pH至中性，趁热用50nm陶瓷膜过滤，收集清液。降温至42℃，用5000Da超滤膜超滤收集清液。加入清液质量0.5％的活性炭搅拌脱色2h，过滤收集清液。降温至35℃，用氢氧化钠调节pH至10，搅拌1h，用10nm陶瓷膜过滤收集清液。调节pH至中性，用800Da的纳滤膜纳滤收集截留液。用盐酸调节浓缩液pH至1.0，4～8℃放置20h，析出大量晶体，晶体分离洗涤烘干后，即得唾液酸单体384g，含量98.3％，收率65.8％。

实施例3

本发明中采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法的一种实施例，包括步骤：取富含聚唾液酸的大肠杆菌发酵液57kg，其中湿菌体含量24.2％，PSA净含量761g。用盐酸调节pH至3.5，搅拌加热至65℃，水解8h，用氢氧化钠溶液调pH至中性，趁热用10nm陶瓷膜过滤，收集清液。降温至36℃，用1000Da超滤膜超滤收集清液。加入清液质量5.0％的活性炭搅拌脱色1h，过滤收集清液。降温至25℃，用氢氧化钠调节pH至12，搅拌2h，用50nm陶瓷膜过滤收集清液。调节pH至中性，用300Da的纳滤膜纳滤收集截留液。用盐酸调节浓缩液pH至1.0，4～8℃放置20h，析出大量晶体，晶体分离洗涤烘干后，即得唾液酸单体498g，含量98.4％，收率65.4％。

对比例1

本对比例的采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法，包括步骤：取富含聚唾液酸的大肠杆菌发酵液50kg，含湿菌体约24.4％，PSA净含量433g。用200nm陶瓷膜过滤菌体，滤出液用10kDa超滤去除无机盐类等杂质，收集截留液为富含聚唾液酸溶液。截留液用盐酸调节pH至1.5，搅拌加热至85℃，水解4.5h，水解得到富含唾液酸单体溶液。加2％的活性炭搅拌脱色0.5h，过滤收集上清液，降温至30℃，用氢氧化钠溶液调节pH至11.5，搅拌0.5h，用30nm陶瓷膜过滤收集清液。调节pH至中性，用500Da的纳滤膜纳滤收集截留液。截留液浓缩至SA含量425.8g/L，浓缩液中SA的净含量303.5g。用盐酸调pH至1.0，4～8℃放置20h，析出大量晶体。晶体分离洗涤烘干后，测得唾液酸249g，含量为98.3％，收率为57.5％。

对比例2

本对比例的采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法，包括步骤：取富含聚唾液酸的大肠杆菌发酵液54kg，其中湿菌体含量18％，PSA净含量513g。用盐酸调节pH至1.5，搅拌加热至85℃，水解4.5h，用氢氧化钠溶液调pH至中性，趁热用30nm陶瓷膜过滤，收集清液。降温至45℃，加入2％的活性炭搅拌脱色0.5h，过滤收集清液。降温至30℃，用氢氧化钠调节pH至11.5，搅拌0.5h，用30nm陶瓷膜过滤收集清液。调节pH至中性，用500Da的纳滤膜纳滤收集截留液。截留液浓缩至SA含量370g/L，浓缩液中SA的净含量378.6g。溶液粘稠，无法结晶。

对比例3

本对比例的采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法，包括步骤：取富含聚唾液酸的大肠杆菌发酵液52kg，其中湿菌体含量22.2％，PSA净含量585g。用盐酸调节pH至1.5，搅拌加热至85℃，水解4.5h，用氢氧化钠溶液调pH至中性，趁热用200nm陶瓷膜过滤，收集清液。降温至45℃，用3000Da超滤膜超滤收集清液。加入2％的活性炭搅拌脱色0.5h，过滤收集清液。降温至30℃，用氢氧化钠调节pH至11.5，搅拌0.5h，用200nm陶瓷膜过滤收集清液。调节pH至中性，用500Da的纳滤膜纳滤收集截留液。截留液浓缩至SA含量429.2g/L，浓缩液中SA的净含量377.3g。溶液粘稠，无法结晶。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种采用聚唾液酸发酵液制备唾液酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1）取大肠埃希氏菌发酵液，发酵液未经除菌，加热升温至65~95℃，调节pH至1.0~3.5，进行水解反应，得到水解液；

2）取步骤1）所得水解液，经过滤、浓缩、结晶、烘干，得到所述唾液酸；

所述步骤2）中过滤包括如下步骤：

S1、调节pH至中性，首次过滤，收集过滤清液，进行超滤，收集滤出液；

S2、取步骤S1收集的滤出液，调节pH至碱性，搅拌均匀后过滤，收集清液；

S3、取步骤S2收集的清液调节pH至中性，进行纳滤并收集截留液；

所述步骤S1和S2中的过滤选用陶瓷膜，陶瓷膜的孔径为10~50nm；

所述步骤S2中调节pH前将温度调整至25~35℃，pH调节至10~12；

所述步骤S3中纳滤采用的纳滤膜截留分子量为300~800Da；

所述步骤S1中，陶瓷膜孔径为30nm，降温至36~45℃后进行超滤，超滤膜的截留分子量为3000Da。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，加热升温至85℃，用盐酸调节pH至1.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中首次过滤收集清液后调整温度至45℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1~S3任一步骤间可加入活性炭，并过滤，活性炭加入量为所述滤出液质量的0.5~5%。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2前，加入活性炭，并过滤，活性炭的加入量为滤出液质量的2%；

所述步骤S2中，降温至30℃后调节pH至11.5，陶瓷膜的孔径为30nm；

所述步骤S3中，纳滤采用的纳滤膜截留分子量为500Da。