CN119552167A - 一类用于抑制prmt5的化合物及其药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一类具有甲基转移酶抑制活性的化合物，具体地，本发明提供了一种式I所示的具有PRMT5抑制活性的化合物。所述的化合物可以被用于制备治疗PRMT5活性相关的疾病的药物组合物。

Description

一类用于抑制PRMT5的化合物及其药物组合物

技术领域

本发明涉及药物化合物领域，具体地，本发明提供了一类用于抑制PRMT5的化合物，及其用于药物组合物的用途。

背景技术

基因表达的表观遗传调控是蛋白质产生和细胞分化的重要生物学决定因素，在许多人类疾病中起着重要的致病作用。

表观遗传调控涉及遗传物质的可遗传修饰而不改变其核苷酸序列。通常，表观遗传调控由DNA和蛋白质(例如组蛋白)的选择性和可逆修饰(例如甲基化)介导，这些修饰控制染色质转录活性和非活性状态之间的构象转变。这些共价修饰可以由甲基转移酶(例如PRMT5)等酶控制，其中许多与可能导致人类疾病的特定遗传改变有关。PRMT5在增殖性疾病、代谢性疾病和血液疾病等疾病中发挥作用。

PRMT5是一种已知的细胞必需基因，条件性PRMT5敲除和siRNA敲除研究表明，正常组织中的PRMT5抑制与一系列疾病相关(例如，全血细胞减少症、不孕症、骨骼肌丧失、心脏肥大)。因此，需要新的策略来利用这种代谢脆弱性并优先针对MTAP缺失肿瘤中的PRMT5，同时在正常组织中保留PRMT5(MTAPWT)。用MTA协同小分子抑制剂靶向PRMT5可以优先靶向PRMT5的MTA结合状态，富含MTAP缺失肿瘤细胞，同时提供优于MTAP完整且MTA水平低的正常细胞的治疗指数。

因此，本领域需要提供新的靶向MTAP缺失肿瘤中的PRMT5的小分子化合物。

发明内容

本发明的目的是提供一类新的靶向MTAP缺失肿瘤中的PRMT5的小分子化合物。

本发明的第一方面，提供了一种如下式I所示的化合物，或其药学上可接受的盐：

其中，

A环为取代或未取代的5元杂环或5元杂芳环；

R₁选自下组：未取代或卤代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的-(CH₂)_m-Ar；且所述的Ar选自下组：苯环、5-6元的杂芳环；m为0、1或2；

R₂选自下组：取代或未取代的苯环、取代或未取代的5-6元的杂芳环；

R₃选自下组：H、未取代或卤代的C₁-C₆烷基；

R₄选自下组：H、卤素；

除非特别说明，上述各式中，所述的取代指对应基团上的氢原子被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、未取代或卤代的C₁-C₆烷基。

在另一优选例中，所述的为选自下组的结构：、。

在另一优选例中，所述的Ar选自下组：。

在另一优选例中，所述的R₂选自下组：取代或未取代的苯环、取代或未取代的、取代或未取代的。

在另一优选例中，所述的R₄为H或F。

在另一优选例中，m为1。

在另一优选例中，所述的化合物选自下组：

、、、、、、。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂、佐剂、辅料和/或稀释剂。

在本发明第三方面，提供了一种如第一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防与PRMT5的基因水平异常或表达异常(如对应的核酸突变、缺失，或所述的甲基转移酶产生异位或融合或过高表达)相关的疾病的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的疾病为恶性肿瘤或癌症，可选自下组：卵巢癌、肺癌、淋巴癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、黑色素瘤、恶性外周神经鞘瘤（MPNST)、食道癌（例如，食道鳞状细胞癌或食道腺癌）、膀胱癌（例如，膀胱癌、尿路上皮癌）、间皮瘤、非小细胞肺癌（NSCLC；例如肺鳞癌或肺腺癌）、星形细胞瘤、未分化多形性肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、白血病、头颈癌、胃腺癌、粘液纤维肉瘤、胆管肉瘤以及脑癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、子宫内膜癌、泌尿道癌、肝癌、软组织癌、胸膜癌和大肠癌或肉瘤。

本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的如前述任一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂、佐剂、辅料和/或稀释剂。

本发明的第五方面，提供了一种如前述任一方面所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防与PRMT5的基因水平异常或表达异常(如对应的核酸突变、缺失，或所述的甲基转移酶产生异位或融合或过高表达)相关的疾病的药物中的用途。

在另一优选例中，所述的疾病选自下组：所述疾病或病症卵巢癌、肺癌、淋巴癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、黑色素瘤、胃癌、胰腺癌或膀胱癌。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现，在PRMT5调节剂化合物中引入特定取代基（联芳基取代基）情况下，化合物的细胞增殖抑制效果有明显提升，且选择性改善，在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

在本发明中，所述卤素为F、Cl、Br或I。

在本发明中，除非特别指出，所用术语具有本领域技术人员公知的一般含义。本发明中，如果没有特别指明，所有化学式意在涵盖可能的任何光学或几何异构体(例如R型、S型或外消旋体，或者烯烃的顺反异构体等)。

在本发明中，术语“C1-C6烷基”是指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基，非限制性地包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基和已基等；优选乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。

在本发明中，术语“芳香杂环”或“杂芳基”具有相同的含义，指包含一个到多个杂原子的杂芳族基团。这里所指的杂原子包括氧、硫和氮。例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡唑基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。杂芳基可以是任选取代的或未取代的。

药物组合物和施用方法

由于本发明化合物具有优异的甲基转移酶抑制的活性，因此本发明化合物及其各种晶型，药学上可接受的无机或有机盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解由于甲基转移酶(例如PRMT5)的活性或表达量异常引起的相关疾病。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有5-200mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温®)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a) 填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b) 粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c) 保湿剂，例如，甘油；(d) 崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e) 缓溶剂，例如石蜡；(f) 吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g) 润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h) 吸附剂，例如，高岭土；和(i) 润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。在一些优选的实施方式中，本发明的化合物可以与其他小分子化合物一同形成PROTAC，或者与其他大分子化合物例如单抗共同形成ADC施用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选5～500mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

各个缩写的定义如下表1所示：

表1

原料可以通过商业途径获得或者通过本领域已经已知或者公开的方法制备获得。

中间体和化合物的纯化采用正相或反向色谱法或者重结晶等常规的化学实验操作进行。正相色谱法为预装填硅胶色谱柱或者制备薄层色谱。硅胶色谱柱主要为玻璃柱或者快速制备色谱仪。正相色谱法的流动相从石油醚/乙酸乙酯，二氯甲烷/甲醇或者其它合适的溶剂中选择及配比进行洗脱。反相制备液相色谱采用C18柱，用制备型液相色谱仪或者快速制备色谱仪进行，214nM和254nM或者制备型液相色谱-质谱联用仪器检测，以含0.1%盐酸的水/乙腈、水/乙腈、含0.1%碳酸氢铵的水/乙腈、含0.1%甲酸的水/乙腈、含0.1%氨水/乙腈、含0.1%三氟乙酸的水/乙腈或者其它合适的溶剂体系作为流动相进行梯度洗脱。

中间体和化合物结构表征采用核磁共振(NMR)和质谱(LCMS)的方法。核磁共振所用到的核磁共振波谱仪为Bruker Ascend400或者Varian 400或者ZKNJ BIXI-1 300MHz或者Bruker Avance III 400 MHz或者Bruker AVANCE Neo 400 MHz。所用溶剂为氘代二甲亚砜、氘代氯仿、氘代甲醇或者其它标注的氘代溶剂。光谱数据以模式报告：化学位移 δ(峰裂数，耦合常数J(Hz)，氢数目)。四甲基硅烷作为化学位移的内标，并把它的化学位移定为零(δ，0 ppm)。一些缩写的含义为：s(单峰), d (双重峰), t(三重峰), q(四重峰), m(多重峰), br(宽峰)。

LCMS光谱由配备SQ质谱检测器的Agilent1260–6120系统获取，使用WatersCORTECSC-18、2.7μm、4.6*30mm色谱柱（溶剂A：0.05%甲酸(FA)水溶液；溶剂B：0.05%FA乙腈(ACN)溶液；1.0分钟内从5%ACN变为95%ACN，保持1.0分钟，总共2.5分钟；流速：1.8mL/min；柱温40°C）或XSelectCSHC18、3.5μm、4.6*50mm色谱柱（溶剂A：0.05%NH₃水溶液；溶剂B：0.05%NH₃乙腈溶液；1.0分钟内从5%ACN变为95%ACN，保持1.0分钟，总计2.5分钟；流速：1.8mL/min；柱温40℃）。HPLC分析在Waters Acquity UPLCH-Class仪器上使用AcquityBEHC18、1.7μm、50*2.1mm柱进行（溶剂A：0.05%三氟乙酸(TFA)水溶液；溶剂B：0.05%TFA乙腈溶液；5%乙腈至95%乙腈需2.0分钟，保持0.5分钟，重新平衡至5%CAN需2.7分钟；流速：0.5mL/min；柱温45℃）。

实施例合成通用方法：

实施例1 化合物6的合成

步骤1：4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-甲醛的制备

将4-溴噻唑-2-甲醛(a)(135mg,703umol,1eq)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1-(三氟甲基)吡唑(202mg,773umol,1.1eq)溶于THF(2mL)和H₂O(0.4mL)中，然后加入K₃PO₄(448mg,2.11mmol,3eq)，脱气并用N₂吹扫3次，然后加入XPhosPdG3(59.5mg,70.3umol,0.1eq)，然后在N₂气氛下将混合物在80℃下搅拌16小时。LC-MS显示反应混合物已完成。残余物用20mLH₂O稀释，用乙酸乙酯（10mL*3）萃取。合并的有机层用15mL盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。残余物通过快速硅胶色谱法纯化（ISCO®；12gSepaFlash®硅胶快速色谱柱，洗脱液为0~7.5%乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，流速为30mL/min）。得到4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-甲醛(b)（75mg，300umol，产率42.73%，纯度99%），为白色固体。

LC-MS: Rt = 0.840 min, (ESI)m/z.[M+H]⁺247.9。

步骤2：2-甲基-N-[[4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺的制备

将4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-甲醛(b) (75 mg, 303.40 μmol, 1 eq)溶于MeOH (2 mL)中，在25℃下加入 2-甲基丙-1-胺 (44.4 mg, 606 μmol, 60.3 μL, 2eq) 溶液。加入后，在25℃下搅拌混合物16 小时。在5-20℃下1分钟内分批加入NaBH₄(11.5mg, 303 μmol, 1 eq)，然后在25℃下继续搅拌混合物2小时。LC-MS 显示反应混合物已完成。在 20℃下加入1 mL MeOH终止反应混合物，真空浓缩反应物得到残余物。将残余物溶解于DCM（15 mL）中，用NaHCO₃（10 mL）洗涤，然后用盐水（10 mL）洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤，真空浓缩。残余物通过快速硅胶色谱法纯化（ISCO®；12 g SepaFlash®硅胶快速色谱柱，洗脱液为0~20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱@35 mL/min）。得到2-甲基-N-[[4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺（c）（60 mg，197 umol，产率64.98％），为黄色固体。

LC-MS: Rt = 0.721 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺305.1。

步骤3：4-氨基-7-氟-N-异丁基-1-甲基-N-[[4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-基]甲基]吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰胺(化合物6)的制备

向2-甲基-N-[[4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺(c)(60mg,197μmol, 1.08eq)4-氨基-7-氟-1-甲基-吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰氯(64.3mg,183umol, 1eq, 2HCl)的THF(2mL)溶液中加入DIEA(118mg, 915umol, 159uL, 5eq)。将混合物在25℃下搅拌3小时。LC-MS显示反应混合物已完成。将反应混合物减压浓缩以除去溶剂。粗品经反相HPLC纯化(柱：Boston Prime C18150*30mm*5um；流动相：[水(氨水v/v)-ACN]；B%：37%-67%，8min)，得4-氨基-7-氟-N-异丁基-1-甲基-N-[[4-[1-(三氟甲基)吡唑-4-基]噻唑-2-基]甲基]吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰胺(化合物6)(21.9mg, 40.0umol，收率21.88%，纯度100%)，为白色固体。

LC-MS: Rt = 2.147 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺547.2

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm) 8.61-8.96 (m, 1 H), 8.18-8.47 (m, 2H), 7.88-8.18 (m, 2 H), 7.09-7.43 (m, 3 H), 4.71-5.23 (m, 2 H), 3.99-4.50 (m,3 H), 3.15-3.29 (m, 2 H), 1.79-2.28 (m, 1 H), 0.57-1.05 (m, 6 H)。

实施例2 化合物7的合成

步骤1：4-[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]噻唑-2-甲醛的制备

将4-溴噻唑-2-甲醛(a)(1g, 5.21mmol, 1eq)、[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]硼酸(1.49g, 7.81mmol, 1.5eq)溶于THF(20mL)和H₂O(4mL)中，然后加入K₃PO₄(3.32g,15.6mmol, 3eq)，脱气并用N₂吹扫3次，然后加入XPhos Pd G3(440mg, 520umol, 0.1eq)，然后在N₂气氛下将混合物在80℃下搅拌16小时。LC-MS显示反应混合物已完成。用30mLH₂O稀释残余物并用乙酸乙酯(20mL*3)萃取。合并的有机层用盐水30mL洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并在减压下浓缩以得到残余物。残余物通过快速硅胶色谱法纯化（ISCO®；12+40gSepaFlash®硅胶快速色谱柱，洗脱液为0~10.2%乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱，流速为40mL/min）。得到4-[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]噻唑-2-甲醛(b)（1.12 g，4.35 mmol，产率83.46%），为黄色固体。

LC-MS: Rt = 0.865 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺258.9;

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ (ppm) 10.06-10.13 (m, 1 H), 9.24-9.33 (m, 1H), 8.42-8.51 (m, 1 H), 8.11 (d, J = 1.00 Hz, 1 H), 7.82 (d, J = 8.25 Hz, 1H)。

步骤2：2-甲基-N-[[4-[6-（三氟甲基）-3-吡啶基]噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺的制备

将4-[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]噻唑-2-甲醛(b)(200 mg, 774 umol, 1 eq)溶于MeOH(4 mL)中，在25℃下搅拌，加入2-甲基丙-1-胺 (113 mg, 1.55 mmol, 153 uL, 2 eq)溶液。加入后，在25℃下搅拌混合物16小时。在5~20℃下，在2分钟内分批加入NaBH₄(29.3mg, 774 umol, 1 eq)，然后在25℃下继续搅拌混合物2小时。LC-MS显示反应混合物已完成。在20℃下加入2mL MeOH淬灭反应混合物，真空浓缩反应物得到残余物。将残余物溶解于DCM（30mL）中，用NaHCO₃（20mL）洗涤，然后用盐水（20mL）洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤，真空浓缩。残余物通过快速硅胶色谱法纯化（ISCO®；12g SepaFlash®硅胶快速色谱柱，洗脱液为0~20％乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱@35 mL/min）。得到2-甲基-N-[[4-[6-（三氟甲基）-3-吡啶基]噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺（c）（158 mg，475 umol，产率61.45％，纯度95％），为黄色固体。

LC-MS: Rt = 0.734 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺316.1

步骤3：4-氨基-7-氟-N-异丁基-1-甲基-N-[[4-[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]噻唑-2-基]甲基]吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰胺（化合物7）的制备

向2-甲基-N-[[4-[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺(c) (53.9mg, 171 umol, 1.2 eq)、4-氨基-7-氟-1-甲基-吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰氯(50.1 mg,142 umol, 1 eq, 2HCl)的THF(2 mL)溶液中加入DIEA(92.1 mg, 713 umol, 124 uL, 5eq)。将混合物在25 ℃下搅拌3小时。LC-MS显示反应混合物已完成。将反应混合物减压浓缩以除去THF。粗品经反相HPLC纯化(柱子:Boston Prime C18 150*30mm*5um;流动相:[水(氨水v/v)-ACN];B%:17%-47%,8min),得到4-氨基-7-氟-N-异丁基-1-甲基-N-[[4-[6-(三氟甲基)-3-吡啶基]噻唑-2-基]甲基]吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰胺(化合物7)(30mg，53.3umol，收率37.35%，纯度99%)，为白色固体。

LC-MS: Rt = 2.00 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺558.2。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm) 9.12-9.46 (m, 1 H), 8.48-8.64 (m, 1H), 8.33-8.46 (m, 1 H), 7.84-8.30 (m, 3 H), 7.17-7.44 (m, 3 H), 4.77-5.26 (m,2 H), 3.98-4.46 (m, 3 H), 3.41-3.52 (m, 2 H), 1.86-2.24 (m, 1 H), 0.55-1.11(m, 6 H) 。

¹⁹F NMR (376 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm) -116.65 - -115.72 (m, 1 F) -66.27(br d, J = 13.7 Hz, 3 F)。

实施例3：化合物5的合成

步骤1：2-甲基-N-[[4-(6-甲基-3-吡啶基)噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺的制备

将4-(6-甲基-3-吡啶基)噻唑-2-甲醛(a)(200 mg, 979 umol, 1 eq)、2-甲基丙-1-胺(145 mg, 1.98 mmol, 197 uL, 2.02 eq)溶于MeOH(5 mL)中，在25~30℃下搅拌12小时。加入NaBH₄(52.2 mg, 1.38 mmol, 1.41 eq)，在25~30℃下搅拌4小时。LC-MS指示起始原料已消耗，检测到所需化合物。用AcOH(60 uL)淬灭反应，减压浓缩。将残余物分配在10%Na₂CO₃水溶液(25 mL)和CH₂Cl₂/EtOH(10:1, 25 mL)之间。分离各层，用CH₂Cl₂/EtOH（10:1，10 mL*3）萃取水相。合并的有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩，得到黄色固体P1。得到黄色固体粗品2-甲基-N-[[4-(6-甲基-3-吡啶基)噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺(b)（276 mg，粗品），无需进一步纯化即可用于下一步。

LC-MS: Rt = 1.796 min, (ESI)m/z. [M+H]⁺262.2;

步骤2：4-氨基-7-氟-N-异丁基-1-甲基-N-[[4-(6-甲基-3-吡啶基)噻唑-2-基]甲基]吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰胺（化合物5）的制备

向2-甲基-N-[[4-(6-甲基-3-吡啶基)噻唑-2-基]甲基]丙-1-胺(b)(50 mg, 191umol, 1 eq)和DIPEA(123 mg, 956 umol, 166 uL, 5 eq)的THF(5 mL)溶液中加入4-氨基-7-氟-1-甲基-吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰氯(65 mg, 184 umol, 0.97 eq, 2HCl)。将反应混合物在25~30℃下搅拌16小时。LC-MS指示起始原料已消耗并检测到所需化合物。将反应混合物减压浓缩。残余物经制备型HPLC纯化（碱性条件；色谱柱：Boston Prime C18150*30mm*5um；流动相：[水（氨水v/v）-ACN]；B%：38%-58%，9min）。将目标化合物的级分合并并冻干，得到白色固体P1。得到4-氨基-7-氟-N-异丁基-1-甲基-N-[[4-(6-甲基-3-吡啶基)噻唑-2-基]甲基]吡唑并[4,3-c]喹啉-8-甲酰胺（化合物5）（52mg，103.26umol，产率53.98%，纯度100%），为白色固体。

LC-MS: Rt = 1.712 min, (ESI)m/z. [M+H]⁺504.2;

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆)δ(ppm) 8.79-9.15 (m, 1H), 7.88-8.39 (m, 4H),7.04-7.47 (m, 4H), 4.60-5.25 (m, 2H), 3.82-4.49 (m, 3H), 3.15-3.34 (m, 2H),2.48 (s, 3H), 1.83-2.22 (m, 1H), 0.41-1.06 (m, 6H)

¹⁹F NMR (376.5 MHz, DMSO-d ₆)δ(ppm) -115.68, -116.40

实施例4 化合物3的合成

步骤1：1,3-二甲基-N-((4-(6-甲基吡啶-3-基)噻唑-2-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺的制备

将4-(6-甲基吡啶-3-基)噻唑-2-甲醛(a)(100mg，490μmol，1.0eq.)、1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺(b)(63mg，567μmol，1.2eq.)和HOAc(35mg，583μmol，1.19eq.)的混合物溶于DCM(6mL)中，在15~20℃下搅拌4小时。加入NaBH(OAc)₃(312mg，1.47mmol，3.01eq.)，在15~20℃下搅拌12小时。将反应混合物在40℃下再加热16小时。LCMS指示起始原料已消耗，检测到所需化合物。将反应混合物用H₂O和CH₂Cl₂稀释，用2MK₂CO₃水溶液碱化至pH=12，同时搅拌。分离各层，用CH₂Cl₂(10mL*3)萃取水相。合并的有机层用Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。残余物通过快速硅胶色谱纯化(ISCO®；12gSepaFlash®硅胶快速色谱柱，洗脱液为0~30%(EtOAc: EtOH=3:1)/5%Et₃N在石油醚中的梯度@30mL/min；石油醚：(乙酸乙酯：EtOH=3:1)，Rf=0.43)。将所需化合物的组分合并，减压浓缩，得到1,3-二甲基-N-((4-(6-甲基吡啶-3-基)噻唑-2-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(c)(117mg，产率79.82％)，为棕色固体。

LC-MS: Rt = 0.49 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺ 300.1。

步骤2：4-氨基-N-(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)-N-((4-(6-甲基吡啶-3-基)噻唑-2-基)甲基)-1,3-二氢呋喃并[3,4-c]喹啉-8-甲酰胺 (化合物3) 的制备

将1,3-二甲基-N-((4-(6-甲基吡啶-3-基)噻唑-2-基)甲基)-1H-吡唑-4-胺(c)(80mg，267μmol，1.0eq.)、4-氨基-1,3-二氢呋喃并[3,4-c]喹啉-8-羧酸(INT14)(62mg，269μmol，1.0eq.)和NMI(67mg，814μmol，3.0eq)溶于NMP(10mL)中，加入TCFH(91mg，325μmol，1.2eq.)。将反应混合物在10~15℃下搅拌16小时。将反应在40℃下再加热16小时。LC-MS指示起始原料已消耗，检测到所需化合物。反应混合物经制备型高效液相色谱纯化（柱：BostonPrimeC18150*30mm*5um；流动相：[水（氨水v/v）-ACN]；梯度：23%-43%B，16分钟）。将所需化合物的馏分合并并冻干，得到4-氨基-N-(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)-N-((4-(6-甲基吡啶-3-基)噻唑-2-基)甲基)-1,3-二氢呋喃并[3,4-c]喹啉-8-甲酰胺(化合物3)(23mg，产率16.75%，纯度99.53%)，为白色固体。

LC-MS: Rt = 1.270 min, (ESI) m/z. [M+H]⁺512.1。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm) 8.98 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.20 (s,1H), 8.14 (dd, J = 2.2, 7.9 Hz, 1H), 7.73 (s, 1H), 7.44-7.53 (m, 2H), 7.35-7.42 (m, 1H), 7.32 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 6.75 (s, 2H), 5.19 (s, 4H), 4.97 (s,2H), 3.63 (s, 3H), 2.49 (s, 3H), 1.65 (s, 3H)。

采用类似实施例通用方法，合成得到下面化合物，表征结果如下：

表2

。

生物测试例1 PRMT5体外抑制活性实验

实验材料

PRMT5(Active Motif，目录号31921)，[³H]-SAM(PerkinElmer，目录号NET155V001MC)，SAM(Sigma，目录号A7007)，MTA(Sigma, 目录号D5011)，SAH(Sigma, 目录号A9384)，384孔板(Perkin Elmer, 目录号6007299)，Echo 550(生产厂家：Labcyte，型号：Echo 550)，384-well Flashplate(生产厂家：Perkin Elmer, 型号：SMP410A001PK)

实验方法

1. 酶反应过程

(1)配置1x assay buffer(modified Tris Buffer)。

(2)稀释化合物：化合物溶解在100% DMSO中，使用Echo 550将化合物溶液加入384孔板中。

(3)配置酶溶液：将PRMT5加入1x assay buffer配置酶溶液1；将PRMT5和 MTA加入1x assay buffer配置酶溶液2。

(4)配置底物溶液：将肽段和[3H]-SAM加入1x assay buffer。

(5)将15 μL酶溶液加入384孔板，阴性对照孔加入15 μL 1x assay buffer，室温孵育30分钟。

(6)每孔加入15 μL底物溶液，室温孵育90分钟。

(7)配置终止反应液：将预冷的SAM加入1x assay buffer。

(8)每孔加入10µL终止反应液终止反应。

(9)将25 µL/孔的混合溶液转移至Flashplate，室温孵育1小时。

(10)用dH₂O + 0.1% Tween-20溶液清洗Flashplate三次。

(11)用Microbeta读取放射值。

2. 数据分析

(1)根据公式1将原始数据换算成% inhibition:

公式1：% inhibition = (Max-Signal)/ (Max-Min) *100

(2)将% inhibition数据带入XL-Fit公式2，获得IC50值：

公式2：Y=Bottom + (Top-Bottom)/(1+(IC50/X)*HillSlope)

其中，Y是% inhibition，X是化合物浓度。经上述实验方法测得部分化合物生物活性。

生物测试例 HCT116、HCT116-MTAP-KO细胞体外抑制增殖实验

实验材料

HCT116细胞系购自中国科学院细胞库，利用CRISPR/Cas9技术敲除MTAP基因，获得HCT116-MTAP-KO细胞株。

McCoy's 5A培养基（Gibco，目录号16600082），胎牛血清（Gibco，目录号10099141C），盘尼西林-链霉素双抗（Gibco，目录号 15140122），胰酶（Gibco，目录号25200056），CellTiter-Glo检测试剂盒（Promega，目录号G7572），384孔透明平底黑壁细胞培养板（Corning，目录号3764），超微量加样仪（Tecan，目录号 D300e），多功能酶标仪（Biotek，目录号SynergyHTX）

实验方法

1. 细胞培养：HCT116和HCT116-MTAP-KO细胞培养条件为McCoy's 5A培养基+10%胎牛血清+1%盘尼西林-链霉素双抗；保证其始终处于对数生长期，细胞活率大于95%。

2. 化合物浓度梯度配制：待测化合物通过超微量加样仪加入384孔板中，从30 μM（HCT116细胞）或3 μM（HCT116-MTAP-KO细胞）开始，用DMSO进行3倍稀释，共9个浓度，设置三复孔。

3. 化合物处理细胞：将胰酶消化的HCT116或HCT116-MTAP-KO细胞悬液加入点好待测化合物的384孔板中，每孔40 μL，即每孔含100个细胞，DMSO终浓度为0.4%。将细胞培养板置于37摄氏度，5%二氧化碳培养箱中培养6天。

4. 检测：向细胞培养板中加入每孔20 μL的CellTiter-Glo试剂，室温振荡孵育30分钟。使用多功能酶标仪检测578 nm的发光信号。

5. 数据分析：

其中，第一列为细胞增殖抑制率HCT116 MTAP WT IC₅₀(nm)，第二列为细胞增殖抑制率HCT116-MTAP null IC₅₀(nm)

实施例及化合物活性测试结果如下表3：

表3

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种如下式I所示的化合物或其药学上可接受的盐：

；

其中，

A环为取代或未取代的5元杂环或5元杂芳环；

R₁选自下组：未取代或卤代的C₁-C₆烷基、取代或未取代的-(CH₂)_m-Ar；且所述的Ar选自下组：苯环、5-6元的杂芳环；m为0、1或2；

R₂选自下组：取代或未取代的苯环、取代或未取代的5-6元的杂芳环；

R₃选自下组：H、未取代或卤代的C₁-C₆烷基；

R₄选自下组：H、卤素；

除非特别说明，上述各式中，所述的取代指对应基团上的氢原子被一个或多个选自下组的取代基所取代：卤素、未取代或卤代的C₁-C₆烷基。

2.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的为选自下组的结构：。

3.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的Ar选自下组：。

4.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的R₂选自下组：取代或未取代的苯环、取代或未取代的、取代或未取代的。

5.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的R₄为H或F。

6.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，m为1。

7.如权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述的化合物选自下组：

、、、、、、。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有治疗有效量的如权利要求1-7任一所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及一种或多种可药用的载体、赋形剂、佐剂、辅料和/或稀释剂。

9.如权利要求1-7任一所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防与PRMT5的基因水平异常或表达异常相关的疾病的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的疾病为恶性肿瘤或癌症，可选自下组：卵巢癌、肺癌、淋巴癌、胶质母细胞瘤、结肠癌、黑色素瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、食道癌、膀胱癌、间皮瘤、非小细胞肺癌、星形细胞瘤、未分化多形性肉瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、白血病、头颈癌、胃腺癌、粘液纤维肉瘤、胆管肉瘤、脑癌、胃癌、肾癌、乳腺癌、子宫内膜癌、泌尿道癌、肝癌、软组织癌、胸膜癌和大肠癌或肉瘤。