CN112574255B

CN112574255B - 一类基于有机胂的cdk抑制剂及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN112574255B
Application number: CN201910925781.8A
Authority: CN
Inventors: 谭立; 李盈; 周少青; 庄光磊
Original assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Organic Chemistry of CAS
Priority date: 2019-09-27
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2024-05-10
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: WO2021057867A1; CN112574255A

Abstract

本发明提供了一类基于有机胂的CDK抑制剂及其制备方法和用途。具体地，提供了式I化合物，或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；及其制备方法和用应用，式中各基团的定义详见说明书。

Description

一类基于有机胂的CDK抑制剂及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及一类基于有机胂的细胞周期依赖性激酶(CDK)抑制剂及其制备方法和用途。

背景技术

在过去二十年间，在化疗药物被广泛应用于癌症研究的同时，靶向药物的研制与应用也如火如荼。在与癌症发生、恶化密切相关的各种蛋白中，激酶蛋白家族中的多个成员都已被验证为有效的治疗靶点，数十个靶向性激酶抑制剂也已被批准用于癌症治疗。

2014年，Gray等人报道了基于CDK7激酶域ATP结合口袋外、C端基序上的半胱氨酸残基Cys312，利用取代的丙烯酰胺作为亲电基团，研制了首个CDK7的共价抑制剂THZ1。除了抑制CDK7以外，THZ1也抑制具有类似半胱氨酸残基的CDK12/13。通过对CDK7/12/13的抑制，THZ1能够在低浓度下有效抑制RNA聚合酶II的激活，进而抑制癌细胞中超级调控子的转录启动，最终有效地抑制癌细胞的生长，并在T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、小细胞肺癌(SCLC)、神经母细胞瘤、三阴性乳腺癌等多种肿瘤模型中都展示了很好的疗效。然而，THZ1的脱靶效应显著，其药代动力学性质也不理想。

2016年，Gray等人在THZ1的基础上研制出高特异性的CDK12/13抑制剂THZ531，后者能够特异性地诱导一些肿瘤细胞发生凋亡，但是仍存在药代动力学上的缺点，其中包括如生物利用度低、半衰期短等。

Syros公司在THZ1的基础上改进得到特异性更佳的SY-1365，当前正处于治疗实体瘤的临床试验一期。药代性质上的限制，使得SY-1365被通过静脉注射的方式给药。

因此，本领域急需提供选择性高、安全性高、和/或药代动力学性质更好的CDK抑制剂。

发明内容

本发明的目的是提供选择性高、安全性高、和/或药代动力学性质更好的CDK抑制剂。本发明的抑制剂是一类基于有机胂的CDK抑制剂。

本发明第一方面，提供了一种式I化合物，或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；

其中，

X₁、X₂各自独立地选自下组：无、O、S、NR₈、CH₂；

R₈选自下组：H、取代或未取代的C1-C6烷基；

R₁、R₂各自独立地选自下组：H、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、-CO-Rd，其中，Rd为取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基；或R₁、R₂与相邻的X₁、X₂和As共同形成取代或未取代的4至8元杂环，所述杂环含有一个As杂原子以及0-3个选自N、O和S的杂原子；

R₃为H、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C3-C10环烷基；

n₁为0、1、2、3或4；

各个R₄独立地选自：H、D、OH、氨基、硝基、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C1-C6烷氧基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、取代或未取代的C3-C10环烷基；

L₁、L₂和L₃各自独立地选自下组：无、-(Z)m-；且L₁和L₂不同时为无；其中，各Z独立地选自：C1-C6亚烷基、-NR₆-,-NR₆-R₇-、-O-、-CO-，m为1、2、3或4；

各R₆独立地选自下组：H、取代或未取代的C1-C4烷基；

R₇为取代或未取代的C1-C8亚烷基；

A选自下组：无、取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5-10元杂芳基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基；

B选自下组：取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5-10元杂芳基；

C选自下组：H、OH、-N(Ra)Rb、取代或未取代的C6-C10芳基、取代或未取代的5-10元杂芳基、取代或未取代的C3-C10环烷基、取代或未取代的3-10元杂环烷基；

除非特别说明，所述的“取代”指基团上的氢原子被一个或者多个(例如2个、3个、4个等)选自下组的取代基所取代：卤素、氘代、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、卤代的C1-C6烷基、卤代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷基S(＝O)₂-、氧代(＝O)、-CN、-OH、-N(Ra)Rb、羧基、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C1-C6胺基、C6-C10芳基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-12元杂环基、-(CH₂)-C6-C10芳基、-(CH₂)-(具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基)，且所述的取代基选自下组：卤素、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烷氧基、氧代、-CN、-NH₂、-OH、C6-C10芳基、C1-C6胺基、C2-C6酰胺基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基；

其中,Ra和Rb各自独立地选自下组：H、取代或未取代的C1-C4烷基；或Ra、Rb与和它们相连的氮原子共同形成取代或未取代的具有至少1个(如1、2、3个)N杂原子和0-2个选自O、S的杂原子的3-10元杂环烷基。

在另一优选例中，对于R₃，所述的取代取代指具有选自A组的一个或多个取代基：卤素、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C6环烷基、-OH、-N(Ra)Rb。

在另一优选例中，R₁、R₂共同形成取代或未取代的-(CH₂)n₂-结构；其中，n₂为1、2或3。

在另一优选例中，位于2、3或4位。

在另一优选例中，所述的式I化合物具有I-a所示的结构：

在另一优选例中，为

在另一优选例中，所述的化合物中，R₁、R₂、R₃、R₄、n₁、L₁、L₂、L₃、A、B和C中任一个分别为表1中所述具体化合物中所对应的基团。

在另一优选例中，所述式I化合物选自下表：

本发明第二方面，提供了一种药物组合物，包括；

(a)治疗有效量的如本发明第一方面所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；和(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物还包含一种或多种抗癌剂和/或免疫抑制剂，优选地，所述抗癌剂和/或免疫抑制剂选自下组：PARP1/2抑制剂、诱导癌细胞DNA损伤的化疗药物、DNA烷基化类化疗药物、DNA或RNA合成抑制剂、EGFR、ALK或FGFR酪氨酸受体激酶抑制剂、KRAS、MEK或ERK肿瘤信号通路抑制剂、肿瘤免疫疗法药物(如PD-1抗体、PD-L₁抗体等)。

在另一优选例中，所述药物组合物还包含有一种或多种抗癌剂和/或免疫抑制剂，优选地，所述抗癌剂和/或免疫抑制剂选自下组：奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕尼、甲氨蝶呤、卡培他滨、吉西他滨、去氧氟尿苷、培美曲塞二钠、帕唑帕尼、伊马替尼、埃罗替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、赫赛汀、贝伐单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、紫杉醇、长春瑞滨、多西他赛、多柔比星、羟基喜树碱、丝裂霉素、表柔比星、吡柔比星、博来霉素、来曲唑、他莫西芬、氟维司群、曲谱瑞林、氟他胺、亮丙瑞林、阿那曲唑、异环磷酰胺、白消安、环磷酰胺、卡莫司汀、尼莫司汀、司莫司汀、氮芥、马法兰、瘤可宁、卡铂、顺铂、奥沙利铂、络铂、拓扑特肯、喜树碱、拓扑替康、依维莫司、西罗莫斯、特癌适、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、硫唑嘌呤、菌素D、柔红霉素、阿霉素、米托蒽醌、争光霉素、普卡霉素或氨鲁米特。

本发明第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物或如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，用于制备治疗和/或预防与CDK12和/或CDK13活性或表达量相关的疾病或病症的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病或病症为癌症。

在另一优选例中，所述的癌症选自下组：T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、小细胞肺癌(SCLC)、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴癌(NHL)、多发性骨髓瘤、卵巢癌、尤文氏肉瘤(Ewing'ssarcoma)、皮肤癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、脑瘤、鳞状上皮细胞癌、腹膜癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。

在另一优选例中，所述的癌症是选自下组的激酶高表达型癌症：CDK12、CDK13、KRAS、或其组合。

在另一优选例中，所述的癌症是非CDK7高表达型的。

本发明第四方面，提供一种如本发明第一方面所述的式I化合物的制备方法，包括步骤：

(a)将在惰性溶剂中，使得式A4和式A5化合物进行反应，从而形成式I化合物：

式中，

Z选自：卤素、-OMs、-OTs、-OTf、-OAc或-OAr；

X₁、X₂、R₁、R₂、R₃、R₄、L₁、L₂、L₃、A、B、C、和n1的定义如本发明第一方面中所述。

本发明第五方面，提供了一种式I化合物的制备方法，包括步骤：

(b)将在惰性溶剂中，使得式A6和式A7化合物进行反应，从而形成式I化合物：

式中，

X₁、X₂、R₁、R₂、R₃、R₄、L₁、L₂、L₃、A、B、C、和n₁的定义如本发明第一方面所述。

本发明第六方面，提供了一种中间体化合物，所述中间体化合物具有选自：A1、A2、A3或A4的结构式：

其中，Z选自：H、卤素、-OMs、-OTs、-OTf、-OAc或-OAr；

本发明第七方面，提供了一种A1、A2、A3或A4化合物的用途，用于制备化合物I。

本发明第八方面，提供了一种CDK12和/或CDK13抑制剂，包括：

如本发明第一方面所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物或如本发明第二方面所述的药物组合物。

本发明第九方面，提供了一种体外选择性抑制细胞周期依赖性激酶的方法，包括步骤：

将细胞周期依赖性激酶与如本发明第一方面所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物或如本发明第二方面所述的药物组合物接触，从而选择性地抑制所述的细胞周期依赖性激酶。

在另一优选例中，所述方法是非治疗和非诊断性的。

在另一优选例中，所述细胞周期依赖性激酶CDK选自下组：CDK12、CDK13，或其组合，较佳地，CDK12和CDK13。

在另一优选例中，所述的“选择性地抑制”指所述化合物对靶向CDK(如CDK12和/或CDK13)的抑制活性E1与对非靶向的激酶(如CDK7或选自表4的其他的非靶向的激酶)的抑制活性E2的之比(E1/E2)≥2，较佳地≥5，更佳地≥10。

在另一优选例中，所述的抑制活性E为EC₅₀的倒数。

本发明第十方面，提供了一种体外抑制肿瘤细胞生长或增殖的方法，包括步骤，

将肿瘤细胞与如本发明第一方面所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物或如本发明第二方面所述的药物组合物接触。

在另一优选例中，所述方法是非治疗非诊断性的。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了代表性化合物对H3122(A)或A549(B)细胞中Pol II的Ser2和Ser5位点磷酸化的影响。

图2显示了代表性化合物如ZSQ5-38、ZSQ8-36等在1μM浓度下对THZ1-biotin共价结合H3122细胞中CDK7或12的竞争性影响。

图3显示了代表性化合物如ZSQ8-36和ZSQ14-66等在不同浓度下对CDK7或12催化Pol II CTD Ser5位点磷酸化修饰的影响。

图4显示了代表性化合物ZSQ5-38和ZSQ8-36在血浆中的浓度时间曲线，以及药代动力学参数。

图5显示了代表性化合物ZSQ5-38和ZSQ8-36在1μM浓度下对多种细胞株生长增殖的抑制效果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，出乎意料地开发了一类对CDK12/13具有高抑制性活性，而对CDK7无抑制活性或低抑制活性的化合物。本发明化合物为式I所示的基于有机胂的细胞周期依赖性激酶抑制剂，在本发明化合物结构中，有机胂基团(moiety)为与CDK12/13的活性位点发生共价作用的部分，因而可提供优异的抑制活性和更佳的特异性。实验结果表明，本发明化合物具有出乎意料的靶向CDK12/13的优异特异性，并且安全性高，毒副作用少。此外，本发明化合物还具有优异的药代动力学性质，半衰期长，适合成药。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。

术语

除非另有表述，术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指具有指定碳原子数的直链或支链烃基(即，C1-8表示1-8个碳)。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。

除非另有表述，术语“烯基”指具有一个或多个双键的不饱和烷基。类似地，术语“炔基”指具有一个或多个三键的不饱和烷基。此类不饱和烷基的例子包括乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2,4-戊二烯基、3-(1,4-戊二烯基)、乙炔基、1-和3-丙炔基、3-丁炔基和更高级的同系物和异构体。

除非另有表述，术语“环烷基”是指具有指定环原子数(例如，C_3-10环烷基)并且完全饱和的或在环顶之间具有不超过一个双键的烃环。“环烷基”也指双环和多环烃环，例如双环[2.2.1]庚烷、双环[2.2.2]辛烷等。

除非另有表述，术语“杂环烷基”是指含有一至五个选自N、O和S的杂原子的环烷基，其中氮和硫原子任选被氧化，且氮原子任选被季铵化。杂环烷基可以是单环、双环或多环体系。杂环烷基的非限制性例子包括吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、丁内酰胺、戊内酰胺、咪唑烷酮、乙内酰脲、二氧戊环、苯邻二甲酰亚胺、哌啶、1,4-二噁烷、吗啉、硫代吗啉、硫代吗啉-S-氧化物、硫代吗啉-S,S-氧化物、哌嗪、吡喃、吡啶酮、3-吡咯啉、噻喃、吡喃酮、四氢呋喃、四氢噻吩、奎宁环等。杂环烷基可以经环碳或杂原子连接于分子的其余部分。对于诸如环烷基烷基和杂环烷基烷基的术语，是指环烷基或杂环烷基通过烷基或亚烷基连接体连接到分子的其余部分。例如，环丁基甲基-是连接到分子其余部分的亚甲基连接基上的环丁基环。

除非另有表述，术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分是指衍生自烷烃的二价基团，例如-CH₂CH₂CH₂CH₂-。烷基(或亚烷基)通常具有1-24个碳原子，其中本发明优选具有10个或更少碳原子(如1、2、3、4、5或6个)的那些基团。“低级烷基”或“低级亚烷基”是较短链烷基或亚烷基，通常具有4个或更少的碳原子。类似地，“亚烯基”或“亚炔基”分别指具有双键或三键的不饱和形式的“亚烷基”。

除非另有表述，术语"烷氧基"或“烷基氧基”、"烷氨基""或“烷基氨基”和"烷硫基"或“烷基硫基”(或硫代烷氧基)以其常规意义使用，指代分别经氧原子、氨基或硫原子连接于分子的其余部分的那些烷基。此外，对于二烷基氨基，烷基部分可以相同或不同，也可和与各烷基相连的氮原子组合形成3-7元环。

除非另有表述，术语“卤代”或“卤素”本身或作为另一取代基的一部分是指氟、氯、溴、或碘原子。此外，诸如“卤代烷基”等术语表示包括单卤代烷基或多卤代烷基。例如，术语“C_1-4卤代烷基”表示包括三氟甲基、2,2,2-三氟乙基、4-氯丁基、3-溴丙基等。

除非另有表述，术语“芳基”表示多不饱和的(通常芳香性)的烃基，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(最多三环)。术语"杂芳基"是指含有1至5个选自N、O、和S的杂原子的芳基(或环)，其可以是单环或稠合在一起或共价连接的多环(双环、最多三环)其中氮和硫原子任选被氧化，氮原子任选被季铵化。杂芳基可通过杂原子连接于分子的其余部分。芳基的非限制性例子包括苯基、萘基和联苯基，而杂芳基的非限制性例子包括吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、嘧啶基、三嗪基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噌啉基、酞嗪基、苯并三嗪基(benzotriazin基)、嘌呤基、苯并咪唑基、苯并吡唑基、苯并三唑基、苯并异噁唑基、异苯并呋喃基(isobenzofur基)、异吲哚基、中氮茚基、苯并三嗪基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吡唑并嘧啶基、咪唑并吡啶、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、喹啉基、异喹啉基、异噻唑基、吡唑基、吲唑基、蝶啶基、咪唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、噻二唑基、吡咯基、噻唑基、呋喃基、噻吩基等等。以上芳基和杂芳基环系统各自的取代基选自下述可接受的取代基的组。

如本文所用，术语“杂原子”意在包括氧(O)、氮(N)、硫(S)和硅(Si)。

对于本文提供的化合物，从取代基(通常为R基团)到芳香环(例如苯，吡啶等)的中心的键将被理解为是指在芳香环的任何可用顶点提供连接的键。在一些实施例中，该描述也包括稠合在芳环上的环上的连接。例如，绘制到吲哚苯部分的中心的键将表示与吲哚的六元或五元环部分的任何可用顶点连接的键。

除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为R构型或S构型，或R构型和S构型的混合物。

本发明的某些化合物拥有不对称碳原子(光学中心)或双键；消旋体、非对映体、几何异构体、区域异构体和单独的异构体(例如，分离的对映体)均应包括在本发明范围内。当本文提供的化合物具有确定的立体化学(表示为R或S，或具有虚线或楔形键指明)时，被本领域技术人员将理解那些化合物为基本上不含其他异构体(例如至少80％，90％，95％，98％，99％和至多100％不含其他异构体)。

在本文中，除特别说明之处，术语“取代”指基团上的一个或多个氢原子被选自下组的取代基取代：卤素、氘代、C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、C1-C6烷氧基、卤代的C1-C6烷基、卤代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷基S(＝O)₂-、氧代(＝O)、-CN、-OH、-N(R_a)R_b、羧基、或取代或未取代的选自下组的基团：C1-C6烷基、C3-C8环烷基、C1-C6胺基、C6-C10芳基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-12元杂环基、-(CH₂)-C6-C10芳基、-(CH₂)-(具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基)，且所述的取代基选自下组：卤素、C1-C6烷基、C1-C6炔基、C1-C6烷氧基、氧代、-CN、-NH₂、-OH、C6-C10芳基、C1-C6胺基、C2-C6酰胺基、具有1-3个选自N、S和O的杂原子的5-10元杂芳基。

如本文所用，术语“含有”、“包含”或“包括”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

如本文所用，术语“治疗有效剂量”是指药物的任何如下所述的量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用该量的药物时，可促进疾病消退，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能。本发明药物的“治疗有效剂量”也包括“预防有效剂量”，“预防有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当将该量的药物单独施用或者与另一种治疗剂组合施用于具有发生疾病的风险或者遭受疾病复发的受试者时，可抑制疾病的发生或复发。

如本文所用，“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。一类优选的盐是本发明化合物与碱形成的盐。适合形成盐的碱包括但并不限于：氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、磷酸钠等无机碱，氨水、三乙胺、二乙胺、哌嗪等有机碱。

本发明中的一些化合物可能用水或各种有机溶剂结晶或重结晶，在这种情况下，可能形成各种溶剂化物。本发明的溶剂合物包括化学计量的溶剂化物如水合物等，也包括在用低压升华干燥法制备时形成的包含可变量水的化合物。

本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体被定义为其中至少一个原子被具有相同原子数但原子质量不同于自然界中常见的原子质量的原子替代的那些。可并入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，分别例如²H、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。本发明的一些同位素变体，例如，其中并入放射性同位素(例如³H或¹⁴C)的那些，被用于药物和/或底物组织分布研究。氚代的，即，³H，和碳-14，即，¹⁴C，同位素是特别优选的，因为它们易于制备和检测。此外，用同位素(例如氘，即，²H)的取代，可提供由增加的代谢稳定性引起的一些治疗优势，例如，增加的体内半衰期或降低的剂量需求并因此在一些情况下可能是优选的。本发明化合物的同位素变体通常可通过常规操作制备，例如使用适当的同位素变体的合适试剂，通过示例性的方法或下文实验部分中描述的制备。

表示与其他原子的连接。

如本文所用，“治疗”是指减轻、延缓进展、衰减、预防，或维持现有疾病或病症(例如癌症)。治疗还包括将疾病或病症的一个或多个症状治愈、预防其发展或减轻到某种程度。

如本文所用，“患者”是指一种动物，最好为哺乳动物，更好的为人。术语“哺乳动物”是指温血脊椎类哺乳动物，包括如猫、狗、兔、熊、狐狸、狼、猴子、鹿、鼠、猪和人类。

如本文所用，“ZSQ-5-38”与“ZSQ5-38”、“ZSQ538”可互换使用，表示ZSQ-5-38化合物，类似编号使用规则相同。

活性成分

如本文所用，“本发明化合物”指式I化合物，或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物；

制备方法

本发明提供了式I化合物的制备方法，本发明中的化合物可以通过多种合成操作制备，这些化合物的示例性制备方法可以包括(但不限于)下文所述的流程。

较佳地，本发明式I化合物可以通过以下方案及实施例中所述的示例性方法以及本领域技术人员所用的相关公开文献操作完成。

在具体操作过程中，可以根据需要对方法中的步骤进行扩展或合并。

步骤i：将A1以的亚砷酸官能团以酯或酰胺的方式保护，可以使用乙二硫醇、乙二醇等作为保护试剂。

步骤ii：通过S_N2取代反应在A2的胺基引入R₃取代基，可以使用R3-卤素，在碱性条件下(如氢化钠)反应。

步骤iii：在A3的苯环胺基发生酰化反应引入L1基团，可通过(但并不限于)三氯氧磷试剂催化。

步骤iv：通过酰化反应、成脲反应或S_N2取代，将A5的A官能团位点与A4的L₁进行连接。

以上各步骤中的反应均是本领域技术人员已知的常规反应。如无特殊说明，合成路线中所使用的试剂和原料化合物均可市购得到，或本领域技术人员根据所设计的不同化合物结构参考已知方法制备得到。

药物组合物和施用方法

由于本发明化合物具有优异的对细胞周期依赖性激酶(CDK)的抑制活性，因此本发明化合物及其药学上可接受盐，水合物或溶剂合物，以及含有本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防以及缓解与CDK活性或表达量相关的疾病或病症。

优选地，本发明化合物可用于治疗癌症。代表性的癌症包括(但并不限于)：T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、小细胞肺癌(SCLC)、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠癌、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴癌(NHL)、多发性骨髓瘤、卵巢癌、尤文氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、皮肤癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、膀胱癌、脑瘤、鳞状上皮细胞癌、腹膜癌、乳腺癌、头颈癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、直肠癌、食管腺癌、食管鳞状细胞癌、原位癌、淋巴瘤、神经纤维瘤、甲状腺癌、骨癌、脑癌、结肠癌、睾丸癌、胃肠道间质瘤、肥大细胞肿瘤、多发性骨髓瘤、黑色素瘤、胶质瘤或肉瘤。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明化合物/剂，更佳地，含有10-500mg本发明化合物/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。

“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。如抗癌剂，(例如，PARP1/2抑制剂(奥拉帕尼(Olaparid)、卢卡帕尼(Rucaparib)或尼拉帕尼(Niraparib)等)、诱导癌细胞DNA损伤的化疗药物(顺铂、卡铂或奥沙利铂等)、DNA烷基化类化疗药物(尼莫司汀等)、DNA或RNA合成抑制剂(吉西他滨等)、EGFR、ALK或FGFR等酪氨酸受体激酶抑制剂、KRAS、MEK或ERK等肿瘤信号通路抑制剂、肿瘤免疫疗法药物(PD-1抗体、PD-L₁抗体等)；在某些实施方式中，向患癌对象联合给予本发明的化合物和其它传统癌治疗物，例如，放疗或手术。放疗是本领域熟知的并且包括X射线治疗，例如伽马放射，和放射药物治疗。

在某些实施方式中，本发明的CDK抑制剂在相同或分开的制剂中与作为联合治疗方案的部分的其它试剂同时使用，或与所述其它试剂依次使用。

式I化合物或式I化合物的组合物的治疗有效剂量的一般范围将是：约1-2000mg/天、约10-约1000mg/天、约10-约500mg/天、约10-约250mg/天、约10-约100mg/天，或约10-约50mg/天。治疗有效剂量将以一个或多个剂量给予。然而，应理解，对于任何特定患者的本发明化合物的特定剂量将取决于多种因素，例如，待治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况、饮食、个体响应，给予时间、待治疗的疾病的严重性、施用的具体化合物的活性、剂型、应用模式和伴用药物。给定情况的治疗有效量能用常规实验测定，并在临床医生或医师能力和判断范围内。在任何情况中，所述化合物或组合物将基于患者的个体情况以多个剂量给予并以允许递送治疗有效量的方式给予。

本发明的主要优点包括：

1.在本发明化合物首次将有机胂基团(moiety)作为与CDK12/13的活性位点发生共价作用的部分，因而提供了优异的抑制活性和更佳的特异性。

2.对CDK12、13的抑制活性优于现有抑制剂，能够有力的抑制癌细胞的生长增殖。

3.对细胞内其他激酶抑制不明显，选择性高，靶向性好，安全性好，在有效浓度下无明显毒副作用；

4.具有理想的药代动力学性质：半衰期长，药物浓度-时间曲线下面积(AUC)高。

5.本发明的化合物与CDK12、13的结合为不可逆结合，其药效时长更长，疗效更持久。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

化合物ZSQ-5-38的合成路线

化合物(4-氨基苯基)亚胂酸(ZSQ-1-18)的合成

将4-氨基苯胂酸(108.5g,500mmol)溶于300ml乙醇中，混合溶液加热至回流。将苯肼(92ml，1mol)逐滴加入(超过1h)，加入过程中有大量氮气产生，当氮气产生减缓时，继续回流搅拌1.5h。混合溶液经过减压蒸馏浓缩，加入氢氧化钠溶液(40g溶于400ml水中)，乙醚400ml。分液，水相加入饱和氯化铵溶液(400ml)置于0℃下搅拌1h，有大量白色固体析出。过滤得白色针状固体，真空干燥得40g产物，产率40％。

化合物4-(1，3，2-二硫杂胂戊环-2-基)苯胺(ZSQ-1-23)的合成

将ZSQ-1-18(40g，199mmol)溶解在200ml无水乙醇中并加热至回流。然后，在30min内将乙二硫醇(20ml，240mmol)滴加到该混合溶液中，并继续加热和搅拌30min。随后，将混合物在冰水中冷却并过滤，得到粗产物，将其从乙醇中重结晶，得到白色固体42g，产率81％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-溴乙酰胺(ZSQ-5-4)的合成

将ZSQ-1-23(1.03g，4mmol)和三乙胺(0.83ml，6mmol)溶于20ml干燥的DCM溶液中，置于0℃下搅拌。逐滴加入溴乙酰溴(0.38ml，4.4mmol)超过15min，并在0℃下继续搅拌1h。将混合物用DCM(20ml)稀释，用2M稀盐酸溶液(30ml)，水(50ml)，饱和碳酸氢钠溶液(30ml)，饱和氯化钠溶液(30ml)依次洗涤，DCM萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(4:1)洗脱，得到黄色固体1.02g，产率67％。

化合物3-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1H-吲哚(ZSQ-3-76)的合成

在0℃下，在30min内将甲基溴化镁(1M的四氢呋喃溶液，100ml，100mmol)滴加到吲哚(11.7g，100mmol)的THF(60ml)溶液中。将溶液在0℃下继续搅拌30min。逐滴加入2,4,5-三氯嘧啶(5.73ml，50mmol)，得到黄色溶液。移去冰浴，将溶液在室温下搅拌1h，得到红色溶液。将混合溶液升温至60℃继续搅拌1.5h。混合物冷却至室温，滴加乙酸(100ml)，加入水(100ml)和THF(20ml)，并将混合物继续在60℃下搅拌20min，得到两相溶液。分层，并将石油醚(100ml)加入到有机溶液中，导致固体结晶。过滤收集固体，用石油醚(20ml)洗涤，并在真空干燥，得到7.02g黄色固体，产率53％。

化合物3-(2,5-二氯嘧啶-4-基)-1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚(ZSQ-5-26)的合成

将ZSQ-3-76(5.28g，20mmol)，NaOH(1.2g，30mmol)和Bu₄NHSO₄(5.8g，10mmol)溶于100ml二氯甲烷中，室温下逐滴加入苯磺酰氯(3.84ml，30mmol)。将反应混合物在室温下继续搅拌3h。将混合物用水(100ml)淬灭并用DCM(50ml×3)萃取。合并的有机层经无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(8:1)洗脱，得到6.79g白色固体，产率84％。

化合物(R)-3-((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-8-30)的合成

将ZSQ-5-26(606mg，1.5mmol)，(R)-1-Boc-3-氨基哌啶(300mg，1.5mmol)和DIPEA(0.74ml，4.5mmol)混合溶于3ml N-甲基吡咯烷酮中。混合溶液置于135℃加热搅拌3h。将冷却的溶液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:9)洗脱，得到802mg黄棕色粉末，产率94％。

化合物(R)-5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-N-(哌啶-3-基)嘧啶-2-胺(ZSQ-8-31)的合成

将ZSQ-8-30(802mg，1.4mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到620mg黄棕色粉末，产率94％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-8-34)的合成

在室温下，将ZSQ-8-31(140mg，0.3mmol)，DIPEA(0.15ml，0.9mmol)和ZSQ-5-4(114mg，0.3mmol)溶于5ml THF溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(4:1)洗脱，得到209mg白色粉末，产率9 1％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-8-36)的合成

将ZSQ-8-34(209mg，0.27mmol)，无水碳酸钾(113mg，0.82mmol)溶于5ml无水甲醇和5ml无水THF的混合溶液中，置于室温混合搅拌3h。反应完成后用TFA调PH至弱酸性，反应液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到123mg黄色粉末，产率73％。

化合物(R)-(4-(2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-5-38)的合成

将ZSQ-8-36(123mg，0.19mmol)，三水合高氯酸汞(71mg，0.157mmol)溶于3ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:4)洗脱，得到102mg黄色粉末，产率92％。

实施例2：

化合物ZSQ-5-70的合成路线

化合物(3-(2-((4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)氨基)-2-氧代乙基)-苯基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-5-57-1)的合成

将ZSQ-1-23(272mg，1.05mmol)，3-叔丁氧羰基氨基苯乙酸(251mg，1mmol)，HATU(570mg，1.5mmol)和DIPEA(496ul，3mmol)溶于5ml DCM中，置于室温混合搅拌4h。反应完成后依次用H₂O(20ml×2)，饱和NaCl溶液(20ml)洗涤，用20ml DCM萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得到白色固体412mg，产率83％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-氨基苯基)乙酰胺(ZSQ-5-57-2)的合成

将ZSQ-5-57-1(412mg，0.83mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:7)洗脱，得到290mg白色固体，产率89％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰胺(ZSQ-5-63)的合成

将ZSQ-5-26(202mg，0.5mmol)，ZSQ-5-57-2(196mg，0.5mmol)和一水合对甲苯磺酸(285mg，1.5mmol)混合溶于2ml N-甲基吡咯烷酮中。混合溶液置于135℃加热搅拌2h。将冷却的溶液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:9)洗脱，得到86mg黄色粉末，产率22％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰胺(ZSQ-5-66)的合成

将ZSQ-5-63(86mg，0.11mmol)，无水碳酸钾(47mg，0.33mmol)溶3ml无水甲醇和3ml无水THF的混合溶液中，置于室温混合搅拌4h。反应完成后用TFA调PH至弱酸性，反应液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到31mg黄色粉末，产率45％。

化合物(4-(2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)乙酰氨基)-苯基)亚胂酸(ZSQ-5-70)的合成

将ZSQ-5-66(31mg，0.05mmol)，三水合高氯酸汞(18mg，0.04mmol)溶于2ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:4)洗脱，得到21mg黄色粉末，产率75％。

实施例3

化合物ZSQ-7-84的合成路线

化合物3-(((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-7-72)的合成

将ZSQ-5-26(606mg，1.5mmol)，1-Boc-3-氨甲基哌啶(354mg，1.65mmol)和DIPEA(0.74ml，4.5mmol)混合溶于3ml N-甲基吡咯烷酮中。混合溶液置于135℃加热搅拌3h。将冷却的溶液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:9)洗脱，得到630mg黄色固体，产率72％。

化合物5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-N-(哌啶-3-基甲基)-嘧啶-2-胺(ZSQ-7-76)的合成

将ZSQ-7-72(630mg，1.08mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到501mg黄褐色固体，产率96％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酰胺(ZSQ-7-80)的合成

将ZSQ-1-23(130mg，0.5mmol)，二(三氯甲基)碳酸酯(59mg，0.2mmol)溶于5ml THF中，置于0℃下搅拌，将DIPEA(207ul，1.25mmol)逐滴加入，加完后混合溶液继续在0℃下搅拌1h。将ZSQ-7-76(241mg，0.5mmol)加入，加完后在0℃继续搅拌0.5h后移至室温搅拌2h。反应完成后依次用2N稀盐酸溶液(20ml)、饱和碳酸氢钠溶液(20ml)，饱和氯化钠溶液(20ml)洗涤，用40ml DCM萃取，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并经过浓缩。用硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(2:1)洗脱，得到178mg白色粉末，产率46％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)-嘧啶-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酰胺(ZSQ-7-83)的合成

将ZSQ-7-80(178mg，0.23mmol)，无水碳酸钾(96mg，0.69mmol)溶5ml无水甲醇和5ml无水THF的混合溶液中，置于室温混合搅拌3h。反应完成后用TFA调PH至弱酸性，反应液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:7)洗脱，得到124mg黄色粉末，产率86％。

化合物(4-(3-(((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酰胺基)苯基)亚胂酸(ZSQ-7-84)的合成

将ZSQ-7-83(124mg，0.2mmol)，三水合高氯酸汞(71mg，0.16mmol)溶于3ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:4)洗脱，得到78mg黄色粉末，产率70％。

实施例4

化合物ZSQ-7-105的合成路线

化合物2-甲酰基-3-甲基丁腈(ZSQ-7-74)的合成

将2M的二异丙基氨基锂溶液(27.5ml，55mmol)混合于50ml干燥的THF中，置于-78℃中搅拌，将异戊腈(5.24ml，50mmol)逐滴加入，加完后继续搅拌30min，将甲酸乙酯(4.85ml，60mmol)混合于25ml干燥的THF中，在-78℃下逐滴加入到混合溶液中(超过30min)，加完后继续搅拌45min后移至室温，搅拌14h。反应完成后加入10ml H₂O淬灭，将混合溶液浓缩，加入稀盐酸溶液调PH至3，然后用EA萃取(20ml×3)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，抽干得5g棕褐色油状粗产物。

化合物4-异丙基-1H-吡唑-3-胺(ZSQ-7-81)的合成

将ZSQ-7-74(5g，45mmol)，水合肼(3.27ml，67.5mmol)和乙酸(5ml，89mmol)混合于75ml无水乙醇中，在封管中加热并搅拌16h。反应完成后将混合溶液浓缩剩下1/3，用饱和碳酸氢钠溶液(40ml)洗(调至PH为碱性)，DCM(30ml×2)萃取，再用饱和氯化钠溶液洗(40ml)。合并有机相用无水硫酸钠干燥，滤液浓缩抽干，没有进一步纯化，得黄色固体6.7g。

化合物3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(ZSQ-7-85)的合成

将ZSQ-7-81(1.25g，10mmol)溶于装有30ml干燥的乙醇的封管中，加入20％的乙醇钠溶液(3.74g，11mmol)，将混合溶液加热到回流温度，搅拌22h。反应完成后浓缩反应液，加水(20ml)稀释，用稀盐酸溶液调PH到3左右，有大量固体析出，过滤并用水洗多次。得黄色粉末，烘干后得1.29g白色粉末，产率66％。

化合物5,7-di氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶(ZSQ-7-88)的合成

将ZSQ-7-85(1.29g，6.67mmol)和N,N-二甲基苯胺(84ul，0.67mmol)混合于装有15ml的三氯氧磷的封管中，加热到115℃过夜回流搅拌。反应完成后混合溶液浓缩，剩下的溶液逐滴滴入冰水中，并用DCM萃取多次，再用饱和氯化钠溶液(30ml)洗，合并有机相。用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(4:1)洗脱，得黄色固体950mg，产率62％。

化合物N-苄基-5-氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(ZSQ-7-90)的合成

将ZSQ-7-88(950mg，4.13mmol)，DIPEA(1.36ml，8.26mmol)和苄胺(0.9ml，8.26mmol)溶于50ml无水乙醇中，加热到85℃搅拌过夜。反应完成后将反应液浓缩，用水(30ml×2)洗，EA(30ml)萃取，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得白色固体1.16g，产率93％。

化合物苄基(5-氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)-氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-7-94)的合成

将ZSQ-7-90(902mg，3mmol)，4-二甲氨基吡啶(37mg，0.3mmol)和二碳酸二叔丁酯(897ul，3.9mmol)混合溶于15ml THF中，室温混合搅拌12h。反应完成后用H₂O(20ml×2)洗，EA萃取(30ml)，再用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(8:1)洗脱，得淡黄色片状固体1.20g，产率99％。

化合物3-(((7-(苄基(叔丁氧基羰基)氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)甲基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-7-96)的合成

将化合物ZSQ-7-94(400mg，1mmol)，1-Boc-3-氨甲基哌啶(236mg，1.1mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(46mg，0.05mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(93mg，0.15mmol)和叔丁醇钠(106mg，1.1mmol)混合于3ml甲苯中，在氮气气氛下加热至95℃搅拌16h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(40ml)，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得黄棕色粉末554mg，产率95％。

化合物N⁷-苄基-3-异丙基-N⁵-(哌啶-3-基甲基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二胺(ZSQ-7-98)的合成

将ZSQ-7-96(554mg，0.96mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到360mg白色固体，产率99％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(((7-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)甲基)哌啶-1-甲酰胺(ZSQ-7-99)的合成

将ZSQ-1-23(130mg，0.5mmol)，二(三氯甲基)碳酸酯(59mg，0.2mmol)溶于5ml THF中，置于0℃下搅拌，将DIPEA(207ul，1.25mmol)逐滴加入，加完后混合溶液继续在0℃下搅拌1h。将ZSQ-7-98(189mg，0.5mmol)加入，加完后在0℃继续搅拌0.5h后移至室温搅拌2h。反应完成后依次用2N稀盐酸溶液(20ml)、饱和碳酸氢钠溶液(20ml)，饱和氯化钠溶液(20ml)洗涤，用40ml DCM萃取，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并经过浓缩。用硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(1:1)洗脱，得到162mg白色粉末，产率49％。

化合物(4-(3-(((7-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)-甲基)哌啶-1-甲酰胺基)苯基)亚胂酸(ZSQ-7-105)的合成

将ZSQ-7-99(80mg，0.12mmol)，三水合高氯酸汞(38mg，0.08mmol)溶于2ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到56mg白色粉末，产率78％。

实施例5

化合物ZSQ-8-12的合成路线

化合物3-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)苯甲酸苄酯(ZSQ-7-104)的合成

将3-(N-Boc-氨甲基)苯甲酸(1.0g，4mmol)和碳酸钾(1.10g，8mmol)溶于10ml DMF中，在室温下搅拌20min后将苄溴(522ul，4.4mmol)逐滴加入，加完后继续室温搅拌6h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩。经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得1.2g白色固体，产率88％。

化合物3-(氨基甲基)苯甲酸苄酯(ZSQ-8-1)的合成

将ZSQ-7-104(1.2g，3.5mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到800mg白色固体，产率95％。

化合物3-(((7-(苄基(叔丁氧基羰基)氨基)-3-异丙基吡咯并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)甲基)苯甲酸苄酯(ZSQ-8-3)的合成

将化合物ZSQ-7-94(200mg，0.5mmol)，ZSQ-8-1(133mg，0.55mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(23mg，0.025mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(47mg，0.075mmol)和叔丁醇钠(58mg，0.6mmol)混合于2ml甲苯中，在氮气气氛下加热至95℃搅拌16h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(40ml)，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(4:1)洗脱，得淡黄色粉末154mg，产率51％。

化合物3-(((7-(苄基(叔丁氧基羰基)氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]-嘧啶-5-基)氨基)甲基)苯甲酸(ZSQ-8-6)的合成

将ZSQ-8-3(154mg，0.25mmol)和Pd/C(100mg)混合于10ml甲醇中，室温氢化搅拌6h。反应完成后用硅藻土过滤，甲醇洗，滤液浓缩后经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:7)洗脱，得到116mg黄色油状产物，产率90％

化合物(5-((3-((4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2基)苯基)氨基甲酰基)苄基)氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)(苄基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-8-8)的合成

将ZSQ-8-6(116mg，0.22mmol)和ZSQ-1-23(70mg，0.27mmol)溶于3ml干燥的吡啶中，混合溶液置于0℃搅拌，三氯氧磷(42ul，0.45mmol)逐滴加入到混合溶液中(超过10min)，加完后0℃继续搅拌1h后移至室温搅拌2h。反应完成后用稀盐酸溶液酸化，加水洗(30ml×3)，用EA萃取，再用饱和氯化钠溶液洗。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤后浓缩。用硅胶柱层析分离纯化，PE/EA(4:1)洗脱冲出吡啶盐，再用DCM/CH₃OH(NH₃)(10:1)洗脱，得黄色粉末92mg，产率54％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(((7-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)甲基)苯甲酰胺(ZSQ-8-9)的合成

将ZSQ-8-8(92mg，0.12mmol)和0.5ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:7)洗脱，得到64.8mg白色固体，产率82％。

化合物(4-(3-(((7-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)甲基)苯甲酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-8-12)的合成

将ZSQ-8-9(64.8mg，0.099mmol)，三水合高氯酸汞(33mg，0.074mmol)溶于2mlDMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到45mg白色粉末，产率76％。

实施例6

化合物ZSQ-9-73的合成路线

化合物(R)-3-((7-(苄基(叔丁氧基羰基)氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-9-48)的合成

将化合物ZSQ-7-94(200mg，0.5mmol)，(R)-1-Boc-3-氨基哌啶(110mg，0.55mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(23mg，0.025mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(47mg，0.075mmol)和叔丁醇钠(53mg，0.55mmol)混合于2ml甲苯中，在氮气气氛下加热至95℃搅拌16h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(40ml)，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得红棕色固体242.5mg，产率85％。

化合物(R)-N⁷-苄基-3-异丙基-N⁵-(哌啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二胺(ZSQ-9-55)的合成

将ZSQ-9-48(242mg，0.43mmol)和0.8ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到150mg白色固体，产率96％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((7-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-9-60)的合成

在室温下，将ZSQ-9-55(150mg，0.41mmol)，DIPEA(0.20ml，1.23mmol)和ZSQ-5-4(155mg，0.41mmol)溶于7ml THF溶液中，混合溶液在室温下搅拌3h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(1:1)洗脱，得到133.3mg黄色固体，产率49％。

化合物(R)-(4-(2-(3-((7-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-9-73)的合成

将ZSQ-8-9(66mg，0.1mmol)三水合高氯酸汞(36mg，0.08mmol)溶于2ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到49.5mg黄色固体，产率82％。

实施例7

化合物ZSQ-10-98的合成路线

化合物(3-((4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2基)苯基)氨基甲酰基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-7-71)的合成

将ZSQ-1-23(1.03g，4mmol)，3-(N-Boc-氨甲基)苯甲酸(1.00g，4mmol)，HATU(3.04g，8mmol)和DIPEA(1.98ml，12mmol)溶于20ml DCM中，置于室温混合搅拌4h。反应完成后依次用H₂O(20ml×2)，饱和NaCl溶液(20ml)洗涤，用20ml DCM萃取，合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(4:1)洗脱，得到淡黄色粉末990mg，产率50％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(氨基甲基)苯甲酰胺(ZSQ-7-75)的合成

将ZSQ-7-71(990mg，2.01mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到651mg白色固体，产率82％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(((5-氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)甲基)苯甲酰胺(ZSQ-10-91)的合成

将ZSQ-7-88(318mg，1.39mmol)，DIPEA(0.46ml，2.78mmol)和ZSQ-7-75(544mg，1.39mmol)溶于6ml无水乙醇中，加热到85℃搅拌过夜。反应完成后将反应液浓缩，用水(30ml×2)洗，EA(30ml)萃取，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得棕色固体588mg，产率72％。

化合物(3-((4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)氨基甲酰基)苄基)(5-氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-10-92)的合成

将ZSQ-10-91(588mg，1mmol)，4-二甲氨基吡啶(24mg，0.2mmol)和二碳酸二叔丁酯(300ul，1.3mmol)混合溶于5ml THF中，室温混合搅拌12h。反应完成后用H₂O(20ml×2)洗，EA萃取(30ml)，再用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(7:1)洗脱，得黄色固体524mg，产率76％。

化合物(3-((4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)氨基甲酰基)苄基)(5-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-10-93)的合成

将化合物ZSQ-10-93(274mg，0.4mmol)，苄胺(52ul，0.48mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(18mg，0.02mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(37mg，0.06mmol)和叔丁醇钠(46mg，0.48mmol)混合于2ml甲苯中，在氮气气氛下加热至95℃搅拌16h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(40ml)，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得白色粉末40mg，产率13％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-3-(((5-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)甲基)苯甲酰胺(ZSQ-10-95)的合成

将ZSQ-10-93(40mg，0.05mmol)和0.5ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:7)洗脱，得到23mg白色固体，产率69％。

化合物(4-(3-(((5-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)甲基)苯甲酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-10-98)的合成

将ZSQ-10-95(23mg，0.035mmol)，三水合高氯酸汞(12mg，0.028mmol)溶于2mlDMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到17mg白色固体，产率85％。

实施例8

化合物ZSQ-12-3的合成路线

化合物(R)-3-((5-氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-11-64)的合成

将ZSQ-7-88(345mg，1.5mmol)，DIPEA(0.49ml，3.0mmol)和(R)-1-Boc-3-氨基哌啶(450mg，2.25mmol)溶于6ml无水乙醇中，加热到85℃搅拌过夜。反应完成后将反应液浓缩，用水(30ml×2)洗，EA(30ml)萃取，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(4:1)洗脱，得白色粉末571mg，产率96％。

化合物(R)-3-((叔丁氧基羰基)(5-氯-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-11-89)的合成

将ZSQ-10-64(571mg，1.45mmol)，4-二甲氨基吡啶(35mg，0.20mmol)和二碳酸二叔丁酯(434ul，1.89mmol)混合溶于6ml THF中，室温混合搅拌12h。反应完成后用H₂O(20ml×2)洗，EA萃取(30ml)，再用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(8:1)洗脱，得白色固体670mg，产率93％。

化合物(R)-3-((5-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)(叔丁氧基羰基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-11-94)的合成

将化合物ZSQ-11-89(494mg，1.0mmol)，苄胺(131ul，1.2mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(46mg，0.05mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(93mg，0.15mmol)和叔丁醇钠(115mg，1.2mmol)混合于5ml甲苯中，在氮气气氛下加热至95℃搅拌16h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(40ml)，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得红褐色固体524mg，产率93％。

化合物(R)-N⁵-苄基-3-异丙基-N⁷-(哌啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二胺(ZSQ-11-96)的合成

将ZSQ-11-94(524mg，0.93mmol)和1ml三氟乙酸混合于6ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到322mg白色固体，产率95％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-11-104)的合成

在室温下，将ZSQ-11-96(182mg，0.5mmol)，K₂CO₃(166mg，1.2mmol)和ZSQ-5-4(190mg，0.5mmol)溶于4ml CH₃CN溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(4:1)洗脱，得到205mg白色粉末，产率62％。

化合物(R)-(4-(2-(3-((5-(苄基氨基)-3-异丙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-12-3)的合成

将ZSQ-11-104(66mg，0.10mmol)，三水合高氯酸汞(36mg，0.08mmol)溶于3ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到49mg白色固体，产率81％。

实施例9

化合物ZSQ-13-92的合成路线

化合物3-(2-氯-5-碘嘧啶-4-基)-1H-吲哚(ZSQ-12-59)的合成

在0℃下，在30min内将甲基溴化镁(1M的四氢呋喃溶液，70ml，70mmol)滴加到吲哚(8.26g，70mmol)的THF(50ml)溶液中。将溶液在0℃下继续搅拌30min。逐滴加入2,4-二氯-5-碘嘧啶(2.74g，35mmol)，得到黄色溶液。移去冰浴，将溶液在室温度下搅拌1h，得到红色溶液。将混合溶液升温至60℃继续搅拌1.5h。混合物冷却至室温，滴加乙酸(70ml)。加入水(70ml)和THF(30ml)，并将混合物继续在60℃下搅拌20min，得到两相溶液。分层，并将石油醚(100ml)加入到有机溶液中，导致固体结晶。过滤收集固体，用石油醚(20ml)洗涤，并在真空干燥，得到2.5g黄色固体，产率20％。

化合物3-(2-氯-5-碘嘧啶-4-基)-1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚(ZSQ-13-76)的合成

将ZSQ-13-59(1.06g，3mmol)，NaOH(180mg，4.5mmol)和Bu₄NHSO₄(871mg，1.5mmol)溶于20ml DCM中，室温下逐滴加入苯磺酰氯(576ul，4.5mmol)。将反应混合物在室温下继续搅拌4h。将混合物用水(30ml)淬灭并用DCM(20ml×3)萃取。合并的有机层经无水Na₂SO₄干燥，过滤，浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(4:1)洗脱，得到850mg白色固体，产率57％。

化合物3-(2-氯-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧啶-4-基)-1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚(ZSQ-13-77)的合成

将化合物ZSQ-13-76(850mg，1.72mmol)，三甲基硅基乙炔(364ul，2.58mmol)，碘化亚铜(32mg，0.17mmol)，1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(73mg，0.10mmol)和三乙胺(478ul，3.44mmol)混合于10ml干燥的四氢呋喃溶液中，在氮气气氛下加热至50℃搅拌12h。反应完成后用2M稀盐酸溶液洗(30ml×2)洗，DCM萃取(50ml)，再依次用水洗(30ml)，饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(4:1)洗脱，得白色固体380mg，产率47％。

化合物(R)-3-((4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-13-86)的合成

将ZSQ-13-77(380mg，0.817mmol)，(R)-1-Boc-3-氨基哌啶(172mg，0.858mmol)和DIPEA(0.4ml，2.451mmol)混合溶于3ml N-甲基吡咯烷酮中。混合溶液置于135℃加热搅拌3h。将冷却的溶液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:9)洗脱，得到448mg棕色粉末，产率87％。

化合物(R)-5-乙炔基-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)-N-(哌啶-3-基)嘧啶-2-胺(ZSQ-13-87)的合成

将ZSQ-13-86(448mg，0.71mmol)和1ml三氟乙酸混合于6ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到105mg黄褐色固体，产率32％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-乙炔基-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-13-88)的合成

在室温下，将ZSQ-13-87(105mg，0.23mmol)，DIPEA(0.11ml，0.69mmol)和ZSQ-5-4(91mg，0.24mmol)溶于4ml THF溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(2:1)洗脱，得到75mg白色粉末，产率43％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-乙炔基-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-13-91)的合成

将ZSQ-13-88(75mg，0.1mmol)，无水碳酸钾(41mg，0.3mmol)溶于2ml无水甲醇和2ml无水THF的混合溶液中，置于室温混合搅拌4h。反应完成后用TFA调PH至弱酸性，反应液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到52mg黄色粉末，产率85％。

化合物(R)-(4-(2-(3-((5-乙炔基-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-13-92)的合成

将ZSQ-13-91(52mg，0.08mmol)，三水合高氯酸汞(30mg，0.06mmol)溶于3ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到40mg黄色固体，产率88％。

实施例10

化合物ZSQ-14-23的合成路线

化合物4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-N-(丙-2-炔-1-基)苯胺(ZSQ-14-7)的合成

将化合物ZSQ-1-23(1.03mg，4mmol)，3-溴丙炔(379ul，4.4mmol)和无水碳酸钾(829mg，6.0mmol)混合于8ml DMF溶液中，室温混合搅拌12h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(30ml)。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(7:1)洗脱，得黄色固体850mg，产率72％

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-溴-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺(ZSQ-14-10)的合成

将ZSQ-14-7(850mg，2.86mmol)和DIPEA(7.15ml，3.14mmol)溶于20ml干燥的DCM溶液中，置于0℃下搅拌。逐滴加入溴乙酰溴(0.27ml，3.14mmol)超过15min，并在0℃下继续搅拌1h。将混合物用DCM(20ml)稀释，用2N稀盐酸溶液(30ml)，水(50ml)，饱和碳酸氢钠溶液(30ml)，饱和食盐水(30ml)依次洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤除去溶剂。硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(1:4)洗脱，得到为黄色固体338mg，产率28％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺(ZSQ-14-13)的合成

在室温下，将ZSQ-14-10(93mg，0.20mmol)，DIPEA(0.10ml，0.60mmol)和ZSQ-5-4(88mg，0.21mmol)溶于2ml THF溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(3:1)洗脱，得到95mg黄色固体，产率59％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺(ZSQ-14-18)的合成

将ZSQ-14-13(95mg，0.12mmol)，无水碳酸钾(66mg，0.48mmol)溶于2ml无水甲醇和2ml无水THF的混合溶液中，置于室温混合搅拌4h。反应完成后用TFA调PH至弱酸性，反应液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到50mg黄色粉末，产率63％。

化合物(R)-(4-(2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-14-23)的合成

将ZSQ-14-18(50mg，0.07mmol)，三水合高氯酸汞(27mg，0.06mmol)溶于3ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到35mg黄色固体，产率83％。

实施例11

化合物ZSQ-15-99的合成路线

化合物2-甲酰基丁腈(ZSQ-14-104)的合成

将2M的二异丙基氨基锂溶液(27.5ml，55mmol)混合于50ml干燥的THF中，置于-78℃中搅拌，将丁腈(4.35ml，50mmol)逐滴加入，加完后继续搅拌30min，将甲酸乙酯(4.85ml，60mmol)混合于25ml干燥的THF中，在-78℃下逐滴加入到混合溶液中(超过30min)，加完后继续搅拌45min后移至室温，搅拌14h。反应完成后加入10ml H₂O淬灭，将混合溶液浓缩，加入稀盐酸溶液调PH至3，然后用EA萃取(20ml×3)，有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，抽干得4.82g黄色油状粗产物

化合物4-乙基-1H-吡唑-3-胺(ZSQ-15-1)的合成

将ZSQ-14-104(4.82g，49.6mmol)，水合肼(3.61ml，74.4mmol)和乙酸(5.67ml，99.2mmol)混合于75ml无水乙醇中，在封管中加热并搅拌16h。反应完成后将混合溶液浓缩剩下1/3，用饱和碳酸氢钠溶液(40ml)洗(调至PH为碱性)，DCM(30ml×2)萃取，再用饱和氯化钠溶液洗(40ml)。合并有机相用无水硫酸钠干燥，滤液浓缩抽干，没有进一步纯化，得黄色固体4.88g。

化合物3-乙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5,7-二醇(ZSQ-15-2)的合成

将ZSQ-15-1(4.88g，43mmol)溶于装有80ml干燥的乙醇的封管中，加入20％的乙醇钠溶液(16g，47.5mmol)，将混合溶液加热到回流温度，搅拌22h。反应完成后浓缩反应液，加水(50ml)稀释，用稀盐酸溶液调PH到3左右，有大量固体析出，过滤并用水洗多次。得黄色粉末，烘干后得2.98g白色粉末。

化合物5,7-二氯-3-乙基吡唑并[1,5-a]嘧啶(ZSQ-15-4)的合成

将ZSQ-15-2(2.98g，16.6mmol)和N,N-二甲基苯胺(250ul，2.01mmol)混合于装有45ml的三氯氧磷的封管中，加热到115℃过夜回流搅拌。反应完成后混合溶液浓缩，剩下的溶液逐滴滴入冰水中，并用DCM萃取多次，再用饱和氯化钠溶液(30ml)洗，合并有机相。用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得白色针状粉末2.33g，产率65％。

化合物5-氯-3-乙基-N-(4-甲氧基苄基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-胺(ZSQ-15-72)的合成

将ZSQ-15-4(432mg，2.0mmol)，DIPEA(4.96ml，3.0mmol)和4-甲氧基苄胺(0.52ml，4.0mmol)溶于8ml无水乙醇中，加热到85℃搅拌过夜。反应完成后将反应液浓缩，用水(30ml×2)洗，EA(30ml)萃取，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩后经硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得白色固体631mg，产率99％。

化合物(5-氯-3-乙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)(4-甲氧基苄基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-15-74)的合成

将ZSQ-15-72(631mg，2mmol)，4-二甲氨基吡啶(48mg，0.4mmol)和二碳酸二叔丁酯(598ul，2.6mmol)混合溶于8ml THF中，室温混合搅拌12h。反应完成后用H₂O(20ml×2)洗，EA萃取(30ml)，再用饱和碳酸氢钠溶液(30ml)洗。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(8:1)洗脱，得黄色固体830mg，产率99％。

化合物(3-乙基-5-(2-(2-羟基乙基)哌啶-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)(4-甲氧基苄基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-15-83)的合成

将化合物ZSQ-15-74(416mg，1.0mmol)，2-哌啶乙醇(165mg，1.0mmol)，三(二亚苄基丙酮)二钯(46mg，0.05mmol)，1,1'-联萘-2,2'-双二苯膦(93mg，0.15mmol)和叔丁醇钠(106mg，1.1mmol)混合于3ml甲苯中，在氮气气氛下加热至95℃搅拌16h。反应完成后用H₂O(30ml×3)洗，EA萃取(40ml)，再用饱和氯化钠溶液洗(30ml)。合并有机相，用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(8:1)洗脱，得红色固体350mg，产率68％。

化合物2-(1-(7-氨基-3-乙基吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌啶-2-基)乙-1-醇(ZSQ-15-97)的合成

将化合物ZSQ-15-97(283mg，0.69mmol)溶于2ml浓盐酸和2ml DCM的混合溶液中，室温搅拌6h。反应完成后将反应液浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/CH₃OH(NH₃)(5:1)洗脱，得白色固体115mg，产率57％。

化合物N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-((3-乙基-5-(2-(2-羟基乙基)哌啶-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)乙酰胺(ZSQ-15-98)的合成

在室温下，将ZSQ-15-97(115mg，0.4mmol)，碳酸钾(138mg，1.0mmol)，碘化钾(33mg，0.2mmol)和ZSQ-5-4(228mg，0.6mmol)溶于1.5ml CH₃CN/1.5ml DMF溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用TFA酸化，经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:9)洗脱，得到153mg粉色固体，产率65％。

化合物(4-(2-((3-乙基-5-(2-(2-羟基乙基)哌啶-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-基)氨基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-15-99)的合成

将ZSQ-15-98(50mg，0.10mmol)，三水合高氯酸汞(36mg，0.08mmol)溶于2ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到28mg黄色固体，产率53％。

实施例12

化合物ZSQ-14-66的合成路线

化合物异丙基(2-硝基苯基)硫烷(ZSQ-14-27)的合成

将1-氟-2-硝基苯(14g，100mmol)，异丙硫醇(10.2ml，110mmol)，无水碳酸钾(27.6g，200mmol)混合溶于100ml无水DMF中，置于110℃搅拌12h。反应完成后经过减压浓缩反应液，依次用100ml水，100ml饱和氯化钠溶液洗，并用EA萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(7:1)洗脱，得黄色油状产物18g，产率91％。

化合物1-(异丙基磺酰基)-2-硝基苯(ZSQ-14-35)的合成

将化合物ZSQ-14-27(9.85g，50mmol)溶于100ml甲醇中，置于0℃搅拌。将过氧单磺酸钾(15.37g，250mmol)溶于100ml水中，在0℃下逐滴加入到混合溶液中，加完后继续0℃搅拌1h后移至室温搅拌24h。反应完成后经减压蒸馏除去甲醇，依次用50ml水，50ml饱和氯化钠溶液洗，并用EA萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩，干燥得亮黄色油状液体8.3g，产率72％。

化合物2-(异丙基磺酰基)苯胺(ZSQ-14-48)的合成

将化合物ZSQ-14-35(2.29g，10mmol)溶于20ml甲醇中，加入Pd/C(200mg)，在氢气气氛下室温混合搅拌12h。反应完成后经过硅藻土过滤，用DCM洗。滤液浓缩经油泵抽干，得白色固体1.99g，产率99％。

化合物2,5-二氯-N-(2-(异丙基磺酰基)苯基)嘧啶-4-胺(ZSQ-14-49)的合成

将NaH(600mg，15mmol)溶于干燥的60ml DMF中，置于0℃下搅拌。将ZSQ-14-48(1.99g，10mmol)溶于5ml干燥得DMF中，逐滴加入上述混合溶液中(超过10min)。加完继续0℃下搅拌0.5h后，逐滴加入2,4,5-三氯嘧啶(2.29ml，20mmol)，搅拌1h后移至室温过夜搅拌。反应完成后加20ml水淬灭，经过减压蒸馏浓缩除去DMF。依次用100ml水，100ml饱和碳酸氢钠溶液，100ml饱和氯化钠溶液洗，并用EA萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(3:1)洗脱，得白色固体1.2g，产率35％。

化合物(R)-3-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(ZSQ-14-54)的合成

将ZSQ-14-49(173mg，0.5mmol)，(R)-1-Boc-3-氨基哌啶(100mg，0.5mmol)和DIPEA(248ul，1.5mmol)混合溶于2ml N-甲基吡咯烷酮中。混合溶液置于135℃加热搅拌3h。将冷却的溶液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:9)洗脱，得到232mg淡黄色固体，产率91％。

化合物(R)-5-氯-N⁴-(2-(异丙基磺酰基)苯基)-N²-(哌啶-3-基)嘧啶-2,4-二胺(ZSQ-14-58)的合成

将ZSQ-14-54(232mg，0.45mmol)和1ml三氟乙酸混合于5ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(3:1)洗脱，得到180mg淡黄色固体，产率97％。

化合物(R)-N-(4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯基)-2-(3-((5-氯-4-((2-(异丙基-磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-14-60)的合成

在室温下，将ZSQ-14-58(82mg，0.2mmol)，DIPEA(0.13ml，0.8mmol)和ZSQ-5-4(76mg，0.2mmol)溶于3ml THF溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(3:1)洗脱，得到79mg黄色固体，产率56％。

化合物(R)-(4-(2-(3-((5-氯-4-((2-(异丙基磺酰基)苯基)氨基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰氨基)苯基)亚胂酸(ZSQ-14-66)的合成

将ZSQ-14-60(36mg，0.05mmol)，三水合高氯酸汞(18mg，0.04mmol)溶于2ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:3)洗脱，得到24mg黄色固体，产率75％。

合成方案13

化合物ZSQ-16-91的合成路线

化合物(4-羟基-3-硝基苯基)亚胂酸(ZSQ-16-8)的合成

将3-硝基-4-羟基苯胂酸(26.3g,100mmol)溶于80ml甲醇中，混合溶液加热至回流。将苯肼(19.6ml，200mol)逐滴加入(超过1h)，加入过程中有大量氮气产生，当氮气产生减缓时，继续回流搅拌1.5h。混合溶液经过减压蒸馏浓缩，加入氢氧化钠溶液(12g溶于200ml水中)，乙醚200ml。分液，水相加入2N的稀盐酸溶液搅拌(100ml)1h，用EA萃取(200ml×3)。有机相用无水硫酸钠干燥后浓缩经油泵抽干，没有纯化进行下一步反应。

化合物4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-硝基苯酚(ZSQ-16-14)的合成

将ZSQ-16-8(24.7g，100mmol)溶解在100ml甲醇中并加热至回流。然后，在30min内将乙二硫醇(10ml，120mmol)滴加到该混合溶液中，并继续加热和搅拌30min。随后将混合溶液浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(10:1)洗脱，得黄色固体粗产物。用THF溶解，再经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(8:1)洗脱，得到黄色固体产物9g，产率29.5％。

化合物2-氨基-4-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)苯酚(ZSQ-16-90)的合成

将ZSQ-16-14(9.3g，30mmol)溶于乙醇/乙酸乙酯(10:1，100ml)的混合溶液中，加入氯化亚锡(13.5g，60mmol)，混合溶液置于75℃回流搅拌48h。反应完成后，将反应液浓缩后水洗(100×3ml)，EA(100ml)萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(8:1)洗脱，得黄色固体粗产物340mg，产率4％。

化合物(5-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-羟基苯基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-16-1)的合成

将ZSQ-16-90(120mg，0.72mmol)，和二碳酸二叔丁酯(200ul，0.87mmol)混合溶于4ml THF中，室温混合搅拌24h。反应完成后用H₂O(50ml×2)洗，EA萃取(50ml)。有机相用无水硫酸钠干燥，过滤浓缩并经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(6:1)洗脱，得白色固体120mg，产率43％。

化合物(5-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-甲氧基苯基)氨基甲酸叔丁酯(ZSQ-16-68)的合成

将化合物ZSQ-16-1(120mg，0.32mmol)，碘甲烷(24ul，0.38mmol)，无水碳酸钾(88mg，0.64mmol)，碘化钾(10mg，0.06mmol)混合于2ml乙腈中，置于室温混合搅拌。待反应完成后直接将反应液浓缩，经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(6:1)洗脱，得白色固体90mg，产率72％。

化合物5-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-甲氧基苯胺(ZSQ-16-76)的合成

将ZSQ-16-68(90mg，0.23mmol)和0.3ml三氟乙酸混合于3ml DCM中，室温过夜搅拌。反应完成后反应液浓缩并经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:6)洗脱，得到52mg白色固体，产率78％。

化合物N-(5-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-甲氧基苯基)-2-溴乙酰胺(ZSQ-16-86)的合成

将ZSQ-16-76(289mg，1.0mmol)和DIPEA(0.41ml，2.5mmol)溶于5ml干燥的DCM溶液中，置于0℃下搅拌。逐滴加入溴乙酰溴(0.1ml，1.1mmol)超过10min，并在0℃下继续搅拌1h后移至室温搅拌2h。将混合物用DCM(20ml)稀释，水(50ml)洗涤，DCM萃取，合并有机相，经无水硫酸钠干燥，过滤并浓缩。经过硅胶柱层析分离纯化，用PE/EA(5:1)洗脱，得到黄色固体110mg，产率27％。

化合物(R)-N-(5-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-甲氧基苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1-(苯基磺酰基)-1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-16-87)的合成

在室温下，将ZSQ-16-68(110mg，0.26mmol)，DIPEA(0.13ml，0.80mmol)和ZSQ-5-4(138mg，0.29mmol)溶于3ml THF溶液中，混合溶液在室温下搅拌4h。然后用2N的稀盐酸溶液(20ml)洗，并用EA(3×30ml)萃取，之后用水(2×20ml)洗涤。合并有机相，用Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，通过硅胶柱层析分离纯化，用DCM/EA(3:1)洗脱，得到177mg白色固粉末，产率83％。

化合物(R)-N-(5-(1,3,2-二硫杂胂戊环-2-基)-2-甲氧基苯基)-2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰胺(ZSQ-16-88)的合成

将ZSQ-16-87(177mg，0.22mmol)，无水碳酸钾(92mg，0.66mmol)溶于1.5ml无水甲醇和1.5ml无水THF的混合溶液中，置于室温混合搅拌4h。反应完成后用TFA调PH至弱酸性，反应液直接经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:8)洗脱，得到121mg淡黄色固体，产率84％。

化合物(R)-(3-(2-(3-((5-氯-4-(1H-吲哚-3-基)嘧啶-2-基)氨基)哌啶-1-基)乙酰氨基)-4-甲氧基苯基)亚胂酸(ZSQ-16-91)的合成

将ZSQ-16-88(66mg，0.1mmol)，三水合高氯酸汞(36mg，0.08mmol)溶于2ml DMSO中，混合溶液在室温下搅拌10min，立即经过C18反相柱层析分离纯化，用H₂O/CH₃CN(1:5)洗脱，得到46mg黄色固体，产率76％。

表1

活性测试例1 CDK抑制剂对癌细胞生长抑制活性测试

所采用的的生物测试方案为：化合物对急性淋巴细胞白血病细胞株Jurkat和非小细胞肺癌细胞株H3122细胞生长活性的影响。

为了在细胞水平上验证本发明中的化合物对癌细胞的生长抑制作用，选取Jurkat细胞(血液癌症，悬浮型)和H3122细胞(实体瘤，贴壁型)，通过检测化学发光值来计算细胞活力，从而得出化合物抑制癌细胞生长的生物活性。

方法：体外培养Jurkat或H3122细胞，生长至对数生长期后，收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，调整细胞浓度至2.5×10⁵/mL(Jurkat)或1.5×10⁵/mL(H3122)，将细胞接种至384孔板中，每孔40μl。在相应的孔中加入不同浓度的化合物或DMSO各5μL，放置细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养72h后，每孔加入15μl Cell Titer-Glo溶液，室温孵育30min，检测化学发光值(luminescence)以衡量细胞内ATP水平。以未刺激DMSO对照孔为100％细胞活力。运用Prism Graphpad统计软件计算化合物IC₅₀值。

表2 CDK抑制剂对癌细胞株生长抑制活性测试结果

活性测试例2 CDK抑制剂对非小细胞肺癌细胞株生长抑制活性测试

所采用的的生物测试方案为：化合物对多种非小细胞肺癌细胞株各自生长活性的影响。

为了在细胞水平上验证本发明中的代表性化合物对依赖不同驱动基因生长存活的非小细胞肺癌细胞株的生长抑制作用，分别选取H3122、H1299、H1975、H2077、H358、EBC-1、H23、PC9和A549细胞，通过检测化学发光值来计算细胞活力，从而得出化合物抑制癌细胞生长的生物活性，并与已报道CDK抑制剂THZ1和THZ531进行比较。

方法：体外培养各种非小细胞肺癌细胞，生长至对数生长期后，消化并收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，调整细胞浓度至1.5×10⁵/mL，将细胞接种至384孔板中，每孔40μl。在相应的孔中加入不同浓度的化合物或DMSO各5μL，放置细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养72h后，每孔加入15μl Cell Titer-Glo溶液，室温孵育30min，检测化学发光值(luminescence)以衡量细胞内ATP水平。以未刺激DMSO对照孔为100％细胞活力。运用PrismGraphpad统计软件计算化合物IC₅₀值。

表3 CDK抑制剂对不同非小细胞肺癌细胞株生长抑制活性测试结果

有表3可知，本发明的代表化合物在多种非小细胞肺癌细胞株上都展现出了与THZ531相当甚至至更好的生长抑制活性。

活性测试例3 CDK抑制剂对癌细胞中CDK7/12/13激酶活性的影响

在多种癌细胞中，RNA聚合酶II(Pol II)通过超级增强子与CDK7、12、13和BRD4等转录因子形成转录复合物，促进MYC、RUNX₁等致癌基因的高表达，进而维持癌细胞的存活与增殖。在Pol II转录复合物中，CDK7、12、13共同负责对Pol II C端结构域(CTD)重复序列中的Ser5位点持续磷酸化，以确保Pol II转录程序的正常启动；而CDK12、13则负责对Pol IICTD重复序列中的Ser2位点持续磷酸化，以确保转录延伸过程以及DNA损伤修复的正确进行。因此，当CDK12、13同时被抑制时，Ser2位点的磷酸化水平将被抑制；当CDK7、12、13同时被抑制时，Ser5位点的磷酸化水平也将被抑制。

实验条件及过程：体外培养H3122或A549细胞，生长至对数生长期后，消化并收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。在12孔细胞培养板中，每孔加入1ml细胞，每孔加入1μL不同浓度药物的DMSO溶液，以THZ1、THZ531或DMSO对照，放置细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养8小时后，使用预冷PBS溶液清洗两遍，吸去溶液，向孔中加入200μL RIPA细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，转移至样品管中置于4℃摇床裂解30min后，15000rpm 4℃离心15min，取上清的细胞裂解液。使用BCA蛋白定量试剂盒检测每组蛋白含量，并使用PIPA裂解液调齐蛋白量，使终体积为100μL。样品进行western-blot鉴定。

Western-blot：向100μL细胞裂解液中加入25μL 5X蛋白loading buffer，95℃加热10min。待样品冷却后，使用SDS-PAGE(9％)凝胶60V进行电泳，30min后切换至120V直至前沿条带电泳至凝胶底端。使用turbo半干转系统，恒定电流0.2A转移80分钟，将凝胶中的蛋白转移至孔径大小为0.2μL的PC膜上。转移后的PC膜置于5％脱脂奶粉(TBST溶液)封闭2h，使用相应的一抗在4℃孵育12h。TBST清洗3次，每次10min。使用相应二抗室温孵育2h。TBST清洗三次，每次10min。使用ECL发光液孵育并检测发光信号。

图1显示了代表性化合物对H3122(A)或A549(B)细胞中Pol II的Ser2和Ser5位点磷酸化的影响。实验结果表明：

ZSQ5-38、ZSQ8-36和ZSQ9-75等化合物能够在1μM浓度下有效抑制Ser2位点的磷酸化，但不抑制Ser5位点的磷酸化；

ZSQ5-38、ZSQ17-22等化合物展示出优于THZ531的抑制活性；

THZ1同时抑制了两个位点的磷酸化。

这说明ZSQ5-38、ZSQ8-36和ZSQ9-75等化合物能够有效抑制癌细胞中CDK12、13的激酶活性，而不抑制CDK7。

活性测试例4 CDK抑制剂与H3122细胞中CDK的不可逆结合

在本实施例中，测试本发明的CDK抑制剂是否与CDK7、12或13发生不可逆地结合。

THZ1或THZ531等共价型抑制剂能够与CDK7、12或13结合口袋中的特定半胱氨酸残基形成共价键，进而与CDK7、12或13不可逆地结合。已报道的THZ1-biotin是THZ1的衍生物，也能与细胞裂解液中的CDK7、12和13形成共价键，进而可通过链霉亲和素微珠(streptavidin beads)将CDK7、12和13富集。当THZ1、THZ531或ZSQ系列CDK抑制剂与CDK7、12或13不可逆地结合后，因为结合口袋已被占据，THZ1-biotin便不能再与CDK7、12或13结合。因此，基于THZ1-biotin和链霉亲和素微珠的竞争富集实验，能准确地测定CDK抑制剂是否与CDK7、12或13不可逆地结合。

实验条件及过程：体外培养H3122细胞，生长至对数生长期后，消化并收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，调整细胞浓度至1×10⁶/mL。在12孔细胞培养板中，每孔加入1ml细胞，每孔加入100nL浓度为10mM的代表性药物的DMSO溶液(终浓度1μM)，以THZ1、THZ531或DMSO对照，放置细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养4小时后，使用预冷PBS溶液清洗两遍，向孔中加入200μL NP40细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，4℃裂解30分钟。收集裂解液，以15000rpm 4℃离心15min，将上清液转移至样品管中，加入THZ1-biotin(终浓度为1μM)，置于4℃孵育过夜。加入10μL链霉亲和素微珠，置于室温结合2小时。微珠用1％NP40细胞裂解液洗10遍后，加入20μL 2％SDS裂解液裂解，95℃煮10分钟，上样，进行western-blot鉴定。

实验结果表明：

THZ1同时抑制了THZ1-biotin与CDK7、12和13的共价结合；THZ531对CDK7具有轻微的抑制；

而ZSQ5-38、ZSQ8-36、ZSQ9-75和ZSQ17-22等化合物能够在1μM浓度下，完全或近乎完全地抑制了THZ1-biotin与CDK12或13的共价结合，但几乎不影响THZ1-biotin与CDK7的共价结合，与THZ531相比，ZSQ5-38、ZSQ8-36、ZSQ9-75和ZSQ17-22等化合物对CDK7的影响更小，选择性更高；

这说明ZSQ化合物能够高效、高特异性地、不可逆地抑制癌细胞中CDK12、13的激酶活性。

活性测试例5 CDK抑制剂对CDK7、12体外激酶活性的影响

CDK7和12蛋白均能在体外催化磷酸化Pol II CTD的Ser5位点，因此，当CDK7或12的激酶活性被抑制时，Ser5位点的磷酸化修饰将减弱或丧失。

实验条件及过程：在293T细胞过表达3XFlag-CDK7或者3X-Flag-CDK12，48小时后使用预冷PBS溶液清洗两遍，加入1mL含蛋白酶抑制剂的RIPA buffer，4℃裂解1小时。收集裂解液，以15000rpm 4℃离心15min，将上清液转移至样品管中，加入20μL anti-Flag亲和凝胶，置于4℃孵育过夜。凝胶利用RIPAbuffer洗5遍，再用kinase buffer(50mM HEPESpH7.4，50mM KCl,10mM MgCl₂)洗3遍，加入100μL kinase buffer混匀，用于后续体外激酶反应。每孔加入10μL凝胶混合物，不同浓度的化合物，4℃孵育过夜。再加入1μg细菌表达纯化的GST-Pol II CTD蛋白和100μM ATP，37℃振荡反应1小时后，加入4％SDS loadingbuffer终止反应，95℃煮10分钟，western-blot鉴定。

实验结果表明：

ZSQ5-38、ZSQ8-36等化合物能够在低浓度下，完全或近乎完全地抑制了CDK12催化Pol II CTD Ser5位点的磷酸化修饰，但不影响CDK7催化Pol II CTD Ser5位点的磷酸化修饰，与THZ531表型一致；

与此相对的是，THZ1同时抑制了CDK7和12催化底物的磷酸化修饰；

ZSQ14-66在250nM浓度对CDK7和12催化底物的磷酸化都有明显抑制，而ZSQ14-60在500nM浓度部分地抑制了CDK7催化底物的磷酸化。

这说明多个ZSQ化合物能够高效、特异性地CDK12的激酶活性。

活性测试例6 CDK抑制剂对激酶组的选择性

所采用的的生物测试方案为：化合物对激酶组体外酶活性的影响。

为了在蛋白水平上验证本发明中的化合物对激酶组的选择性，选取代表化合物ZSQ5-36、ZSQ8-36，利用P³³同位素标记的ATP和放射性激酶活性测试手段，得出化合物对370种激酶蛋白催化底物磷酸化的抑制水平。

方法：放射性激酶组活性测试。化合物与蛋白混合室温预孵育1小时,再加入P³³-ATP反应2小时,将反应混合物点在P81离子交换层析纸上，利用膜过滤法检测激酶活性。化合物的测试终浓度为1μM，2副孔重复，以单加DMSO组为100％激酶活性计算加药处理组活性。

表4 CDK抑制剂对370种不同激酶的选择性

从表4可以看出，代表化合物在1μM浓度下，仅将少数几个激酶的酶活性抑制至50％以下；与此相对的是，代表化合物在500nM浓度下即能够完全抑制CDK12的激酶活性(活性测试例5)。

研究表明，THZ531在1μM浓度下与不同激酶的结合能力如表5，得分(Score)表示未与化合物结合的蛋白(即激酶活性未被抑制的蛋白)的百分比，可以看出，THZ531对RSK2、STK16等激酶有很强的结合，而本发明的化合物对这些激酶的活性基本无影响，这提示本发明的化合物具有与现有CDK12/13抑制剂的激酶组选择性有所不同，在应用中可能具有更好的选择性和安全性。

表5

活性测试例7 CDK抑制剂的药代动力学性质

在本实施例中，在小鼠活体上的药物代谢测试，并在活体上验证本发明中的化合物对激酶组的选择性。

方法如下；选取代表化合物ZSQ5-38、ZSQ8-36，利用腹腔注射(10mg/kg)的单次给药方式，测试化合物在小鼠(n＝3)上的药代动力学性质。

结果表明，ZSQ5-38和ZSQ8-36在单次用药后，在小鼠体内迅速达到峰值，并能稳定保持中等的药物浓度，且展示出很长的半衰期(ZSQ5-38和ZSQ8-36的T_1/2为17.3和9.8)。

此外，在已完成活体测试中，尚未观测到明显的毒副作用，小鼠的正常组织或细胞也未观测到坏死现象，这提示，本发明化合物具有高安全性。

活性测试例8 CDK抑制剂对多种具有KRAS突变的肺癌细胞株的生长抑制活性测试

在本实施例中，在细胞水平上验证本发明中的代表性化合物ZSQ5-38和ZSQ8-36对依赖KRAS基因生长存活的、或是具有KRAS激活性点突变的肺癌细胞株的生长抑制作用。分别选取H441、H460等17种细胞，通过结晶紫染色手段来观测细胞克隆数目，从而得出化合物抑制癌细胞生长的生物活性。

方法：体外培养各种肺癌细胞，生长至对数生长期后，消化并收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，调整细胞浓度至1.5×10⁵/mL，将细胞接种至12孔板中，每孔1ml。在相应的孔中加入不同浓度的化合物或DMSO各5μL，放置细胞培养箱(37℃，5％CO₂)中培养一周后(期间更换一次培养基)，每孔加入4％的PFA溶液固定20分钟，再加入0.1％的结晶紫溶液染色20分钟，PBS洗两遍，扫描成像，以未刺激DMSO对照孔为100％细胞活力。

图5显示了代表性化合物ZSQ5-38和ZSQ8-36在1μM浓度下能够完全或有效抑制大多数细胞株的生长增殖，在300nM浓度下即能完全或有效地抑制SW1573、H460等几种细胞株的生长增殖。

讨论

在与癌症发生、恶化密切相关的各种蛋白中，激酶蛋白家族中的多个成员都已被验证为有效的治疗靶点。不少已被验证或潜在的激酶靶点，都在其酶催化位点附近具有反应性巯基，进而为共价型激酶抑制剂的研制提供了可能性。而细胞周期依赖性激酶(CDK)家族中的CDK7、12和13正属于这一类激酶靶点。

CDK(cyclin dependent kinases)家族激酶是属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族中的十几个成员，其中部分成员参与细胞周期调节的关键激酶。根据CDKs功能的不同，可以将其主要分为两大类：CDK1、2、4和6参与细胞周期调控；CDK7-13则参与转录调节。

CDK7-cyclin H、CDK8-cyclin C、CDK9-cyclin T及CDK12/13-cyclin K均通过调节RNA聚合酶Ⅱ的磷酸化，来调节转录过程的起始(initiation)或延伸(elongation)，促使后者经由超级增强子(super-enhancer)高表达多种促癌基因(如MYC、RUNX等)，进而维持在癌细胞的生长与存活。

CDK12是调控癌细胞中DNA损伤修复的重要组件，CDK12的失活能与DNA损伤修复抑制剂(如PARP抑制剂奥拉帕尼)产生协同致使效果，还能增强免疫细胞在实体瘤中的浸润—进而促进肿瘤免疫疗法的疗效。

CDK13是CDK12的同源蛋白，结构与CDK12非常近似，仅有少数氨基酸残基与CDK12不同，其已知功能与CDK12等同。

CDK7是调控促癌基因转录起始的重要转录因子，同时调控细胞周期的正常运行。文献报道抑制CDK7可能对正常细胞的分化产生不良影响。

本发明提供了选择性抑制CDK12和/或13，而对CDK7无抑制或弱抑制的式I化合物。研究表明，同时抑制CDK7、12、13将同时阻断转录的激活和延伸，只抑制CDK12、13则只影响转录过程的延伸。同时抑制多个CDK对正常细胞生长存活的副作用较大。对于癌细胞来说，通常其本身基因不稳定、对DNA损伤修复机制更依赖，因此选择性抑制CDK12、13就足够促使肿瘤细胞发生凋亡。

另一方面，现有的CDK7/12/13三重抑制剂THZ1除了抑制这三个CDK之外，还抑制很多其他激酶，导致毒副作用；改进后的SY-1365则主要抑制CDK7，对CDK12、13的抑制效果较弱；而不抑制或基本不抑制CDK7的CDK12/13双重抑制剂具有明显优于三重抑制剂的靶向选择性(见活性测试例6)，不同基因亚型的肿瘤对其敏感性也不同于CDK7抑制剂。

本发明所发明的CDK抑制剂是优化获得的靶向抑制剂，在本发明化合物结构中，有机胂基团(moiety)为与CDK12/13的活性位点发生共价作用的部分，因而可提供优异的抑制活性和更佳的特异性，从实验数据上看，本发明特异性地结合于CDK12、CDK13等特定的激酶，不结合或基本不结合于CDK7或其他经测试的300多种激酶，并且，在不同的细胞株之间已经展现出了很好的选择性，因此具有远优于现有的胂化物的安全性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种式I化合物，或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐；

其中，

为

R₃为H、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基；

n₁为1或2；

各个R₄独立地选自：H、D、未取代的C1-C6烷基、未取代的C1-C6烷氧基；

L₁、L₂和L₃各自独立地选自下组：无、-(Z)m-；且L₁和L₂不同时为无；其中，各Z独立地选自：C1-C6亚烷基、-NR₆-,-NR₆-R₇-，m为1、2、3或4；

各R₆独立地选自下组：H、取代或未取代的C1-C4烷基；

R₇为取代或未取代的C1-C8亚烷基；

A选自下组：无、取代或未取代的苯基、取代或未取代的C3-C6环烷基、取代或未取代的3-6元杂环烷基；

B选自下组：取代或未取代的5-10元杂芳基；

C选自下组：取代或未取代的苯基、取代或未取代的5-10元杂芳基、取代或未取代的3-10元杂环烷基；

其中，所述的“取代”指基团上的氢原子被一个或者多个选自下组的取代基所取代：卤素、氘代、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、卤代的C1-C6烷基、卤代的C1-C6烷氧基、C1-C6烷基S(＝O)₂-、氧代(＝O)、-CN、-OH、羧基、或取代的C1-C6烷基且所述的取代基选自下组：氧代、-CN、-NH₂、-OH、C2-C6酰胺基。

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，R₃为H、取代或未取代的C1-C6烷基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C6炔基；所述的“取代”指基团上的氢原子被一个或者多个选自下组的取代基所取代：卤素、氘代、C1-C6烷基；

n₁为1或2；

各R₆独立地选自下组：H、未取代的C1-C4烷基；

R₇为未取代的C1-C4亚烷基；

A选自下组：无、未取代的苯基、未取代的环己基、未取代的哌啶基；

B选自下组：取代或未取代的嘧啶基或吡唑并嘧啶基，所述的“取代”指基团上的氢原子被一个或者多个选自下组的取代基所取代：卤素、氘代、C1-C6烷基；

C选自下组：取代或未取代的苯基、取代或未取代的吲哚基、取代或未取代的哌啶基；所述的“取代”指基团上的氢原子被一个或者多个选自下组的取代基所取代：卤素、氘代、C1-C6烷基、卤代的C1-C6烷基、C1-C6烷基S(＝O)₂-、-OH、-OH取代的C1-C6烷基。

3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，位于2、3或4位。

4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述的式I化合物具有I-a所示的结构：

5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述式I化合物选自下表：

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括；

(a)治疗有效量的如权利要求1所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐；和(b)药学上可接受的载体。

7.一种如权利要求1所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐或如权利要求6所述的药物组合物的用途，用于制备治疗和/或预防与CDK12和/或CDK13活性或表达量相关的疾病或病症的药物组合物。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述疾病或病症为癌症。

9.一种如权利要求1所述的式I化合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：

式中，

Z选自：卤素、-OMs、-Ots、-Otf、-Oac或-OAr；

X₁、X₂、R₁、R₂、R₃、R₄、L₁、L₂、L₃、A、B、C、和n1的定义如权利要求1中所述。

10.一种CDK12和/或CDK13抑制剂，包括：

如权利要求1所述的式I化合物、或其立体异构体或互变异构体、或其药学上可接受的盐或如权利要求6所述的药物组合物。