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CN118853601A - 谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1;2a在油菜氮高效育种中的应用 - Google Patents

谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1;2a在油菜氮高效育种中的应用 Download PDF

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CN118853601A
CN118853601A CN202410659009.7A CN202410659009A CN118853601A CN 118853601 A CN118853601 A CN 118853601A CN 202410659009 A CN202410659009 A CN 202410659009A CN 118853601 A CN118853601 A CN 118853601A
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rapeseed
nitrogen
glutamine synthetase
gene
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丁广大
张�浩
石磊
王创
张雯
任璐璐
井一丹
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Huazhong Agricultural University
Original Assignee
Huazhong Agricultural University
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Abstract

本发明提供了谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1；2a在油菜氮高效育种中的应用。谷氨酰胺合成酶及与其相关的生物材料的下述任一应用：提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；制备提高油菜氮吸收和/或利用效率的产品；提高油菜氮含量；制备提高调控油菜氮含量的产品；提高油菜的生物量和/或产量；制备提高油菜的生物量和/或产量的产品。

Description

谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1；2a在油菜氮高效育种中的 应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1；2a在油菜氮高效育种中的应用。
背景技术
氮作为氨基酸、核酸、叶绿素和其他生命活动中重要物质的组成成分，是作物生长发育所必需的大量营养元素，对保障作物的产量和品质具有重要作用。油菜作为我国主要油料作物之一，其在生产过程中需要大量的氮肥供应，而其利用率相对低下，由此除了增加农业生产成本，还造成了严重的环境污染和资源浪费。因此，需要从根本上解决我国油菜氮利用率低的问题，充分挖掘其氮利用的遗传潜力，培育氮高效品种是目前亟待解决的难题。油菜属于喜硝作物，其氮效率主要分为氮素吸收效率和氮素利用效率，具有较为复杂的基因调控网络。
发明内容
发明人对油菜氮高效和低效品种的重测序和转录组分析发现谷氨酰胺合成酶编码基因在油菜氮高效和低效品种间存在显著的表达差异，可能在不同品种间具有明显的氮效率调控差异。因此，为解决背景技术中存在的问题，本发明提供了一种谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1；2a在油菜氮高效育种中的应用，该谷氨酰胺合成酶可以促进氮的吸收和利用效率，且其基因BnaGLN1；2a的优异单倍型可以作为分子辅助标记，用于油菜氮高效品种的筛选。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
第一方面，本发明提供了谷氨酰胺合成酶的下述任一应用：
A1)提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；
A2)制备提高油菜氮吸收和/或利用效率的产品；
A3)提高油菜氮含量；
A4)制备提高油菜氮含量的产品；
A5)提高油菜的生物量和/或产量；
A6)制备提高油菜的生物量和/或产量的产品；
所述谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
第二方面，本发明提供了与上述谷氨酰胺合成酶相关的生物材料的下述任一应用：
A1)提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；
A2)制备提高油菜中氮的吸收和/或利用效率的产品；
A3)提高油菜氮含量；
A4)制备提高油菜氮含量的产品；
A5)提高油菜的生物量和/或产量；
A6)制备提高油菜的生物量和/或产量的产品；
所述生物材料为下述中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述谷氨酰胺合成酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜细胞系；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜组织；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜器官。
按上述方案，B1)中所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
第三方面，本发明提供了下述任一方法：
D1)培育提高氮吸收和/或氮利用效率的油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮的吸收和/或氮利用效率提高；
D2)培育提高氮含量油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮含量提高；
D3)培育提高生物量和/或产量的油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮含量提高。
按上述方案，D1)-D3)所述方法通过向油菜中导入上述谷氨酰胺合成酶的编码基因并使编码基因得到表达实现。
按上述方案，所述编码基因为编码上述谷氨酰胺合成酶的核酸分子。
按上述方案，D1)-D3)所述方法具体为：将SEQ ID NO:2所示的核酸分子插入过表达载体中，构建重组表达载体，再利用转化方法使目标片段转化到油菜中，培育获得转基因植株。
按上述方案，转化方法为农杆菌转化法，将重组表达载体转入农杆菌并转化油菜。
按上述方案，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
按上述方案，将含有重组表达载体的农杆菌GV3101的菌液侵染油菜的下胚轴。
按上述方案，重组表达载体的构建方法为：通过无缝克隆技术将扩增后的目的片段与PMDC83-GFP载体融合形成35S-BnaGLN1；2a-GFP(酶切位点为KpnⅠ)。
第四方面，本发明提供了上述谷氨酰胺合成酶基因在油菜氮高效育种中的应用。
按上述方案，所述谷氨酰胺合成酶基因具有4种单倍型，包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的Hap1、Hap2、Hap3和Hap4，所述单倍型均包括8个显著SNP，基于油菜参考基因组第4.1版，8个SNP位点分别位于2号染色体的第6637711、6637782、6638039、6638041、6638119、6639122、6639192和6639500个位点上，其中序列为SEQ ID NO:6的Hap4为其优异单倍型。
第五方面，本发明提供了一种油菜氮高效品种的筛选方法，检测谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a的表达水平；
或，扩增谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a，判断其单倍型类型，若为SEQ ID NO:6所示的优异单倍型，则为油菜氮高效品种。
本发明的有益效果是：
谷氨酰胺合成酶及其基因BnaGLN1；2a在油菜氮高效育种中的应用，该谷氨酰胺合成酶超表达后较野生型显著提高了植株的生物量，促进了硝酸盐的吸收还原及铵同化；
基因BnaGLN1；2a序列在油菜自然群体存在显著变异，氯酸盐敏感基因型的表达水平显著高于不敏感基因型；在高氮条件下，具有高BnaGLN1；2a表达水平的氯酸盐敏感基因型品种较不敏感基因型品种的产量、氮效率及农艺性状均具有明显优势。因此，本申请提供的基因BnaGLN1；2a的优异单倍型可作为分子辅助标记，从而应用于油菜氮高效品种的筛选和培育。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的基因BnaGLN1；2a表达模式分析；其中，A为油菜经7天正常硝酸盐和低硝酸盐浓度处理后基因BnaGLN1；2a的相对mRNA表达结果；B为油菜在正常硝酸盐和低硝酸盐浓度处理不同时间点下基因BnaGLN1；2a的相对mRNA表达结果；C为油菜基因BnaGLN1；2a在烟草表皮细胞和拟南芥原生质体中的亚细胞定位分析；D为油菜基因BnaGLN1；2a在拟南芥中异源表达的组织定位分析；
图2为本发明实施例提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的生长表型分析；其中，A和B为基因BnaGLN1；2a超表达材料鉴定，C为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的生长表型；D为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上物生物量；E为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的根系生物量；
图3为本发明实施例提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的氮相关指标分析；其中，A和D为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部氮浓度和含量；B和E为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的根系氮浓度和含量；C为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的氮转运系数分析；F为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的氮吸收效率分析；
图4为本发明实施例提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的氮代谢过程相关指标分析。其中，A和D为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部和根系谷氨酰胺合成酶活性；B和E为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部和根系游离铵浓度分析；C和F为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部和根系谷氨酸浓度测定；
图5为本发明实施例提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的硝酸盐吸收还原途径相关指标分析。其中，A和B为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部和根系游离硝浓度分析；C和D为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部和根系硝酸盐还原酶活性分析；E为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的硝酸盐吸收速率测定；F为油菜野生型和基因BnaGLN1；2a超表达材料在正常和低硝酸盐条件下的地上部和根系中硝酸盐转运蛋白和硝酸盐还原酶相关编码基因的表达水平分析；
图6为本发明实施例提供的不同氯酸盐敏感性极端品种根系蛋白组分析；其中，A为氯酸盐敏感性极端品种在正常和低硝酸盐条件下的蛋白组PCA分析；B为差异蛋白统计；C为上调差异蛋白KEGG富集分析；D为差异蛋白中硝酸盐转运和利用相关蛋白表达丰度；
图7为本发明实施例提供的505份油菜自然品种基因BnaGLN1；2a的遗传变异分析结果。其中，A-D为基因BnaGLN1；2a在505份油菜重测序自然品种中的候选基因关联分析；E为基因BnaGLN1；2a在单倍型分析；E为基因BnaGLN1；2a在氯酸盐敏感性极端品种地上部的表达水平分析；F为基因BnaGLN1；2a在氯酸盐敏感性极端品种根系中的表达水平分析；
图8为本发明实施例5中在210kg/ha N条件下，提供的氯酸盐敏感性品种在不同氮浓度下的田间表现；
图9为本发明实施例5中在70kg/ha N条件下，提供的氯酸盐敏感性品种在不同氮浓度下的田间表现。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
在本申请中，术语“基因”是指表达特定蛋白质或功能RNA分子的核酸片段，该核酸片段可包含位于编码序列之前的调节序列(5’非编码区)和之后的调节序列(3’非编码区)。
在本申请中，术语“表达载体”是指在克隆载体基本骨架(空骨架)的基础上增加表达元件(如启动子、RBS、终止子等)，使目的基因能够表达的载体。
在本申请中，术语“infusion无缝克隆”是指在表达载体构建中的一种无酶连接技术，主要来源于infusion酶的发现，infusion酶能够识别线性化的DNA片段5’-3’末端任意16碱基，使其形成粘性末端。目标质粒通过酶切或者PCR线性化后，也能被infusion酶识别。只需要载体和基因形成的黏性末端互补，通过退火的过程就能完成载体的构建。
在本申请中，术语“核酸分子”是指RNA或DNA的聚合物，它是单链或双链的，任选地包含合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的核酸分子可由cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段构成。
实施例提供了油菜种的一种谷氨酰胺合成酶，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其CDS序列如SEQ ID NO:2所示，其编码基因为BnaGLN1；2a，位于油菜的第A02号染色体上，在NCBI中的ID号为XP_009127474。
SEQ ID NO:1
MSLLTDLVNLDLSDNTEKIIAEYIWVGGSGMDMRSKARTLPGPVTDPSKLPKWNYDGSSTGQAPGEDSEVILYPQAIFKDPFRRGNNILVMCDTYTPAGEPIPTNKRHAAAQIFSNPDVVAEVPWYGIEQEYTLLQKDVNWPVGWPIGGFPGPQGPYYCSVGADKSFGRDIVDAHYKACLYAGINISGINGEVMPGQWEFQVGPSVGISAADEVWIARFILERITEIAGVVVSFDPKPIPGDWNGAGAHTNYSTKSMREEGGYEIIKKAIDKLGLRHKEHISAYGEGNERRLTGHHETADINTFKWGVANRGASIRVGRDTEKEGKGYFEDRRPASNMDPYTVTSMIAETTLLWNP
本发明提供的谷氨酰胺合成酶及其编码基因BnaGLN1；2a的基因名称均来源于油菜数据库(https://yanglab.hzau.edu.cn/)，具体来源于野生型的油菜Westar10。
为了测定BnaGLN1；2a及其编码的谷氨酰胺合成酶对油菜氮效率的影响及其在遗传育种的作用，发明人将BnaGLN1；2a进行超表达后，相较于野生型，超表达植株中硝酸盐的吸收、还原及铵同化得到提高，氮含量、生物量及油菜产量得到提高。
由此，发明人提供了上述谷氨酰胺合成酶或调控所述谷氨酰胺合成酶活性或含量的物质的下述任一应用：
A1)提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；
A2)制备提高油菜氮吸收和/或利用效率的产品；
A3)提高油菜氮含量；
A4)制备提高油菜氮含量的产品；
A5)提高油菜的生物量和/或产量；
A6)制备提高油菜的生物量和/或产量的产品；
上述谷氨酰胺合成酶可以为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，也可以将SEQ ID NO:1所示序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质，或者在上述蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白。
上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质可以人工合成，也可以先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质可以通过将SEQ ID NO:2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连接标签序列得到。其中SEQ ID NO:2所示的DNA序列编码SEQ ID NO:1所示的蛋白质。
本发明还提供了与上述谷氨酰胺合成酶相关的生物材料的下述任一应用：
A1)提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；
A2)制备提高油菜中氮的吸收和/或利用效率的产品；
A3)提高油菜氮含量；
A4)制备提高油菜氮含量的产品；
A5)提高油菜的生物量和/或产量；
A6)制备提高油菜的生物量和/或产量的产品；
所述生物材料为下述中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述谷氨酰胺合成酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜细胞系；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜组织；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜器官。
按上述方案，B1)中所述核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的DNA分子，或者与SEQ ID NO:2所示核苷酸具有85％以上统一性，且编码谷氨酰胺合成酶的DNA分子，或者在严格条件下与上述核苷酸序列杂交，且编码谷氨酰胺合成酶的DNA分子。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA，所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的谷氨酰胺合成酶的核苷酸序列85％或者更高同一性的核苷酸，只要编码谷氨酰胺合成酶且具有谷氨酰胺合成酶的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。同一性包括与本发明的谷氨酰胺合成酶编码核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列，同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价，使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，诱导型启动子。
本发明的实施例中使用的启动子为花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S。
可以使用现有的表达载体构建含有BnaGLN1；2a基因表达盒的重组载体，所述载体可以为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
本发明实施例中使用的载体为PMDC83-GFP载体，构建的重组表达载体为PMDC83-BnaGLN1；2a-GFP。
35S-BnaGLN1；2a-GFP为在PMDC83-GFP载体的KpnⅠ酶切位点处插入SEQ ID NO:2所示的谷氨酰胺合成酶的编码基因得到的重组表达载体。
PMDC83-BnaGLN1；2a-GFP能在35S启动子的驱动下过表达BnaGLN1；2a基因编码的谷氨酰胺合成酶。
本发明还提供了下述任一方法：
D1)培育提高氮吸收和/或氮利用效率的油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮的吸收和/或氮利用效率提高；
D2)培育提高氮含量油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮含量提高；
D3)培育提高生物量和/或产量的油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮含量提高。
在一些具体实施例中，D1)-D3)所述方法通过向油菜中导入上述谷氨酰胺合成酶的编码基因并使编码基因得到表达实现。
在一些具体实施例中，所述编码基因为编码上述谷氨酰胺合成酶的核酸分子。
在一些具体实施例中，上述谷氨酰胺合成酶的编码基因可先进行如下修饰，再导入油菜中，以达到更好的表达效果：如可以进行密码子优化，或修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列以使翻译有效起始，引入增强子序列等。
所述谷氨酰胺合成酶的编码基因可以利用含有所述谷氨酰胺合成酶的编码基因的重组表达载体导入油菜，所述重组表达载体具体可以为所述35S-BnaGLN1；2a-GFP。
在一些具体实施例中，D1)-D3)所述方法具体为：将SEQ ID NO:2所示的核酸分子插入过表达载体中，构建重组表达载体，再利用转化方法使目标片段转化到油菜中，培育获得转基因植株。
在一些具体实施例中，转化方法为农杆菌转化法，将重组表达载体转入农杆菌并转化油菜。
在一些具体实施例中，所述农杆菌为农杆菌GV3101。
在一些具体实施例中，将含有重组表达载体的农杆菌GV3101的菌液侵染油菜的下胚轴。
为了探究油菜的氮利用效率，对氯酸盐敏感基因型品种和氯酸盐不敏感基因型品种根系进行蛋白组分析，氯酸盐是硝酸盐的类似物，和硝酸盐共用一个吸收利用通路，因此氯酸盐吸收多的品种相对于硝酸盐吸收利用高，也就是硝酸盐敏感品种。
BnaGLN1；2a序列在油菜自然群体中存在显著变异，对氯酸盐敏感基因型品种和氯酸盐不敏感基因型品种根系进行蛋白组分析显示氯酸盐敏感基因型品种中BnaGLN1；2a的表达水平显著高于不敏感基因型品种，在高氮条件下，具有高BnaGLN1；2a表达水平的氯酸盐敏感基因型品种较不敏感基因型品种的产量、氮效率及农艺性状均有明显优势，因此，BnaGLN1；2a的优异单倍型可以作为分子辅助标记，应用于油菜氮高效品种的培育。
上述谷氨酰胺合成酶基因油4种单倍型，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示，所述单倍型均包括8个显著SNP，基于油菜参考基因组第4.1版，8个SNP位点分别位于2号染色体的第6637711、6637782、6638039、6638041、6638119、6639122、6639192和6639500个位点上，其中SEQ ID NO:6为其优异单倍型。
上述SEQ ID NO:6所示的优异单倍型可以用于油菜氮高效品种的筛选，扩增谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a判断其单倍型类型，若为SEQ ID NO:6所示的优异单倍型，则为油菜氮高效品种。
当然，检测谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a的表达水平也可以用于油菜氮高效品种的筛选。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等，主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克等编著，科学出版社进行，必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行，必要时可通过简单试验予以调整。
植株及载体：野生型油菜种Westar10、载体PMDC83-GFP；
阿夫道宁营养液配方如下表1所示。
表1
实施例1基因BnaGLN1；2a的表达模式分析
(1)油菜不同硝酸盐浓度培养条件
挑选饱满一致的野生型油菜种“Westar10”用自来水浸泡2h去水后转入4℃纯化4h放于30℃培养箱破壳，将发芽一致的种子在0.5M CaCl2的纯水中生长5天后挑选长势一致的幼苗在含有6mM NO3 -的阿夫道营养液中缓苗6天，之后进行0mM、0.1mM、0.3mM、0.5mM、1mM、3mM和6mM NO3 -处理7天，每三天更换一次营养液。按地上部和根系两个部位进行取样并储存在-80℃冰箱中待提取RNA进行表达水平测定，结果如图1A所示。
(2)油菜不同硝酸盐浓度时间点培养条件
挑选饱满一致的野生型油菜种“Westar10”用自来水浸泡2h去水后转入4℃纯化4h放于30℃培养箱破壳，将发芽一致的种子在0.5M CaCl2的纯水中生长5天后挑选长势一致的幼苗在含有6mM NO3 -的阿夫道营养液中缓苗6天，之后进行6mM和0mM NO3 -处理，其中处理9天后对0mM NO3 -重新供应6mM NO3 -,每三天更换一次营养液，分别于0h、6h、12h、18h、24h、3d、5d、7d、9d、R1d(0mM NO3 -重新供应6mM NO3 -1d)和R3d(0mM NO3 -重新供应6mM NO3 -3d)时间点按地上部和根系两个部位进行取样并储存在-80℃冰箱中待提取RNA进行表达水平测定，结果如图1B所示。
(3)基因BnaGLN1；2a的亚细胞定位分析
在油菜数据库(https://yanglab.hzau.edu.cn/)中搜索基因BnaGLN1；2a的CDS序列并设计引物进行扩增1071bp的目的片段，引物分别为F1和R1，通过Infusion无缝克隆技术将目的片段与PMDC83-GFP载体融合形成35S::BnaGLN1；2a-GFP(酶切位点为KpnⅠ)。对于烟草表皮细胞体系，将35S::BnaGLN1；2a-GFP质粒转入农杆菌GV3101后注入烟草叶片中，培养24～48h后撕取烟草叶片表皮细胞在体视显微镜下观察其亚细胞定位；对于拟南芥原生质体体系中，提取生长健康的拟南芥叶片原生质体并通过PEG转化法将通过质粒大提技术得到高质量高浓度的35S-BnaGLN1；2a-GFP质粒转入其中，静置培养10h后在共聚焦显微镜下观察BnaA02.GLN1；2的亚细胞定位情况。
其中，
CDS序列如下：
ATGAGTCTTCTGACCGATCTCGTTAACCTTGACCTCTCAGACAACACTGAGAAAATCATCGCTGAATACATATGGGTTGGTGGTTCAGGAATGGATATGAGAAGCAAAGCCAGGACTCTCCCTGGACCTGTGACCGATCCATCAAAGCTCCCAAAATGGAATTATGATGGTTCAAGCACTGGCCAAGCTCCTGGTGAAGACAGTGAAGTGATCTTATACCCTCAAGCGATTTTCAAAGATCCGTTCCGTAGAGGCAACAACATTCTTGTCATGTGTGATACTTACACCCCTGCGGGTGAACCAATCCCTACGAACAAGAGACATGCTGCAGCTCAGATCTTTAGCAACCCTGATGTTGTTGCTGAAGTGCCATGGTATGGAATCGAACAAGAATACACTCTGTTGCAGAAAGATGTGAATTGGCCTGTCGGATGGCCCATTGGTGGATTCCCCGGCCCTCAGGGACCATACTACTGCAGTGTTGGAGCTGACAAATCTTTTGGAAGAGACATTGTTGATGCTCACTACAAGGCTTGTTTGTATGCTGGAATTAACATCAGTGGAATCAATGGAGAAGTCATGCCTGGTCAGTGGGAGTTCCAAGTCGGACCGTCGGTTGGTATCTCAGCTGCTGATGAAGTGTGGATTGCTCGTTTTATTTTGGAGAGGATCACAGAGATTGCTGGTGTGGTTGTATCTTTTGACCCAAAACCAATTCCGGGTGACTGGAACGGAGCTGGTGCTCACACCAATTACAGTACTAAATCGATGAGGGAGGAAGGAGGATACGAGATAATCAAGAAGGCAATTGATAAGCTCGGACTGAGACACAAGGAGCACATTTCTGCTTACGGTGAAGGCAACGAGCGTCGTCTCACTGGACACCATGAAACTGCTGATATCAACACTTTCAAATGGGGTGTTGCAAACCGTGGAGCATCAATCCGTGTAGGACGTGACACGGAGAAGGAAGGGAAAGGATACTTTGAGGATAGGAGGCCAGCTTCCAACATGGACCCTTACACTGTAACTTCCATGATTGCAGAGACTACACTTCTTTGGAATCCTTGA(SEQ ID NO:2)
F1：TCTGTAACCATGAGTCTTCTGAC(SEQ ID NO:7)；
R1：AAGGATTCCAAAGAAGTGTAGTCTCTGCA(SEQ ID NO:8)
(4)基因BnaGLN1；2a的组织定位分析
在油菜数据库(https://yanglab.hzau.edu.cn/)中搜索基因BnaGLN1；2a的启动子上游2000bp序列并设计引物进行目的片段扩增，引物分别为F2和R2。通过Infusion无缝克隆技术将目的片段与PBI121-GUS载体融合形成pBnaGLN1；2a::GUS(酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ)并转入到农杆菌GV3101中进行植物侵染。基于拟南芥蘸花法用携带pBnaGLN1；2a::GUS质粒的农杆菌对其进行侵染，并将得到的种子播在Kana抗性的1/2MS培养基中进行阳性苗筛选直至得到纯和株系。最后，将纯和株系种子播于1/2MS培养基中培养10天后移入正常阿夫道宁营养液处理7天后将植株放入GUS染液中在37℃保温6-12h，弃去GUS染液用75％酒精脱至无色后在显微镜下进行观察记录。
F2:GATTGGTTTGTAGGTGA(SEQ ID NO:9)
R2:GGTTACAGAGAAAATGAC(SEQ ID NO:10)
基因BnaGLN1；2a的表达模式分析结果如图1所示，图1A表明油菜基因BnaGLN1；2a在根系中的表达水平随硝酸盐浓度的提高而逐渐被诱导，地上部响应不明显并且其表达水平在一定硝酸盐浓度条件下显著低于根系；图1B结果与前面一致，油菜BnaGLN1；2a在根中表达水平显著高于地上部且受到硝酸盐显著诱导，而地上部在不同时间点以及重新供应硝酸盐条件下均无响应；图1C为基因BnaGLN1；2a在烟草叶片表皮细胞以及拟南芥原生质体中的亚细胞定位，结果均能够与指示细胞定位的Marker(用PM999-Mcherry载体，主要定位细胞质)共定位；图1D的组织定位表明基因主要在除根尖外的其他根部位均有表达，在叶片中有较低的表达水平。
实施例2油菜中BnaGLN1；2a超表达株系构建以及硝酸盐表型分析
(1)基因BnaGLN1；2a超表达载体构建
在油菜数据库(https://yanglab.hzau.edu.cn/)中搜索基因的CDS序列并设计引物进行扩增1078bp的目的片段，引物序列同实施例1中的F1和R1。通过Infusion无缝克隆技术将目的片段与PMDC83-GFP载体融合形成35S：：BnaGLN1；2a-GFP(酶切位点为KpnⅠ),载体构建完成后将其转入农杆菌中待进行油菜下胚轴侵染；
(2)基因BnaGLN1；2a超表达载体在油菜中的侵染转化
利用携带35S::BnaGLN1；2a-GFP的农杆菌对油菜下胚轴进行侵染，具体步骤为：1)灭菌：挑选大小饱满的Weatar10种子用75％酒精浸泡1min；将浸泡过的种子用无菌水冲洗一遍，用适量的84消毒液(稀释3-4倍)灭菌15-20min；灭菌后在无菌工作台用无菌水冲洗8-10遍；2)播种：将灭菌好的种子播种在配置好的M0培养基中，每皿约30-50粒；之后暗处理培养5-6天至下胚轴到达一定高度，不宜太长；3)摇菌：根据下胚轴生长情况提前1天用无菌三角瓶或离心管于28℃、200rpm的摇床中进行培养。侵染时需将培养好的菌株(OD一般为0.4-0.6左右)于离心机6000rpm转速下离心10min，弃上清后加入与菌液同体积的DM重悬再次以相同条件离心，最后弃上清用DM重悬后稀释待用(菌液：DM＝1；10)；4)外植体制备与侵染：首先在无菌工作台中用无菌镊子和解剖刀切取油菜下胚轴至每个0.8-1cm，全程在M1液体培养基中操作；将制备好的菌液导入M1液体培养基中侵染20min，每5min摇晃一次，侵染结束转至M1固体培养基中暗光24℃培养，待2天后转入M2培养基光照培养(24℃，昼16h/夜8h)，两周后转入M3培养基中直至出现绿芽，期间2周更换一次培养基，最后转入M4培养基中生根；5)继代繁种：将生根苗放于室温中培养获得T0代种子并进行育种鉴定潮霉素标签和表达水平(设计定量引物进行表达水平测定，F：ACCGTCGGTTGGTATCTCAG(SEQ ID NO:11)，R：CCTTCCTCCCTCATCGATTT(SEQ ID NO:12))，筛选阳性苗后重复继代直至获得纯合株系。
(3)油菜中BnaGLN1；2a超表达株系响应硝酸盐表型分析
1)油菜中BnaGLN1；2a超表达株系硝酸盐代谢通路相关指标测定
挑选饱满一致的野生型“Westar10”和基因BnaGLN1；2a超表达株系种子，用自来水浸泡2h去水后转入4℃纯化四小时放于30℃培养箱破壳。将发芽一致的种子在0.5M CaCl2的纯水中生长5天后挑选长势一致的幼苗在含有6mM NO3 -的阿夫道宁营养液中缓苗6天，之后进行6mM和0.1mM NO3 -处理9-12天，取样时分地上部和根系进行相关指标测定，其中生物量、总氮浓度和含量需要干样，硝酸盐和游离铵浓度、硝酸盐还原酶和谷氨酰胺合成酶活性则需要鲜样。
图2为基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的生长表型分析，图2A、2B和2C表明油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系在6mM NO3 -条件下长势明显优于野生型，而在0.1mM NO3 -条件下无显著差异。正如图2D和2E所示，其在6mM NO3-条件下地上部和根系生物量较野生型平均显著上升了56.83％和67.49％。这些结果表明在基因BnaGLN1；2a在油菜中超表达后可显著促进植株在硝酸盐充足条件下的生长；
图3为本实施例中提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的氮相关指标分析，其中，3A和3D表明油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系在6mM NO3 -条件下的地上部氮含量显著高于野生型，氮浓度仅有OEA02-3株系达到显著水平；3B和3E表明，基因BnaGLN1；2a超表达株系的根系中氮浓度和含量在硝酸盐充足的条件下均显著高于野生型，同样在低硝酸盐处理条件下无差异；3C和3F计算了不同株系的氮转运系数和吸收效率，结果表明BnaGLN1；2a超表达株系和野生型仅在6mM条件下的氮吸收效率存在显著差异；
图4为本实施例中提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的氮代谢相关指标分析，其中，4A和4D表明油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系在6mM NO3 -条件下的地上部和根系谷氨酰胺合成酶活性显著高于野生型，而油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系游离铵浓度则由于同化速度加快而得到显著下降。对应的，油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系在6mM NO3 -条件下的铵同化产物谷氨酸得到显著升高(图4C和4F)，在0.1mM NO3 -条件下相关指标均无较大差异；
图5为本实施例提供的基因BnaGLN1；2a在油菜超表达经不同硝酸盐浓度处理后的硝酸盐吸收还原途径相关指标分析，5A和5B表明油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系在6mMNO3 -条件下地上部分硝酸盐浓度显著高于野生型，根系无显著差异。同时，图5C和5D为硝酸盐还原酶活性测定，在条件下无论油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系地上部还是根系均得到明显提高，对应的，基因BnaGLN1；2a超表达株系在6mM NO3 -条件下的铵同化产物谷氨酸得到显著升高；在0.1mM NO3 -条件下相关指标均无较大差异。
2)油菜中BnaGLN1；2a超表达株系硝酸盐吸收速率测定
挑选饱满一致的野生型“Westar10”和基因BnaGLN1；2a超表达株系种子，用自来水浸泡2h去水后转入4℃纯化四小时放于30℃培养箱破壳。将发芽一致的种子在0.5M CaCl2的纯水中生长5天后挑选长势一致的幼苗在含有6mM NO3 -的阿夫道宁营养液中缓苗6天，进行0mM NO3 -的饥饿处理3天经0.1mM CaSO4中清洗1min后分别转入6mM和0.1mM 15NO3 -的阿夫道宁营养液中处理10min。取样前再次将幼苗转入0.1mM CaSO4中清洗1min，烘干研磨过80-100目筛后用同位素比值质谱法分析15N的浓度。
图5E为对油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系的硝酸盐吸收速率测定，其在6mM NO3 -条件下同样显著高于野生型。
3)油菜中BnaGLN1；2a超表达株系中硝酸盐转运和还原酶活性相关基因表达水平测定
挑选饱满一致的野生型“Westar10”和基因BnaGLN1；2a超表达株系种子，用自来水浸泡2h去水后转入4℃纯化四小时放于30℃培养箱破壳。将发芽一致的种子在0.5M CaCl2的纯水中生长5天后挑选长势一致的幼苗在含有6mM NO3 -的阿夫道宁营养液中缓苗6天后分别转入6mM和0.1mM NO3 -条件下处理7天分地上部和根系收样，并提取总RNA待逆转录为cDNA测定相关基因(BnaA09.NPF6；3、BnaC08.NPF6；3a、BnaA09.NPF6；3b、BnaA07.NR1a、BnaA07.NR1、BnaA07.NR1b、BnaC06.NR1、BnaC06.NR1a)表达。
图5F为油菜基因BnaGLN1；2a超表达株系中相关基因表达水平，发现在6mM NO3 -条件下均得到显著提高。
实施例3油菜氯酸盐敏感性极端品种根系蛋白组分析
氯酸盐是硝酸盐的类似物，和硝酸盐共用同一个吸收利用通路，因此氯酸盐吸收多的品种相对于硝酸盐的吸收利用高，即为硝酸盐敏感品种。
前期筛选得到氯酸盐敏感基因型(CSG)和氯酸盐不敏感基因型(CIG)品种各三份。挑选饱满一致的氯酸盐敏感性极端品种种子用自来水浸泡2h去水后转入4℃纯化四小时放于30℃培养箱破壳。将发芽一致的种子在0.5M CaCl2的纯水中生长5天后挑选长势一致的幼苗在含有6mM NO3 -的阿夫道宁营养液中缓苗6天，之后进行6mM和0.1mM NO3 -处理7天，每三天更换一次营养液。对六份氯酸盐敏感性极极端品种根系取样并进行总蛋白提取，之后将三份氯酸盐敏感基因型品种和氯酸盐不敏感基因型品种根系分别等蛋白量混合进行测序。之后对测序数据进行PCA、差异蛋白数量和KEGG富集分析。
图6为本实施例提供的不同氯酸盐敏感性极端品种根系蛋白组分析，其中6A为氯酸盐敏感性极端品种在正常和低硝酸盐条件下的蛋白组PCA分析，结果表明无论在正常还是低硝酸盐条件(CK和LN)下两类氯酸盐敏感性极端品种存在显著分化。因此，在正常条件下共鉴定出CSG和CIG品种间分别存在554和400个上调和下调差异蛋白(图6B)，而在低硝酸盐条件下有526和344个。进一步对上调差异蛋白进行KEGG富集分析发现可富集到多个通路，其中包括ABC转运、氮代谢等(图6C)，图6D进一步提取关于硝酸盐转运和利用相关差异蛋白发现两类品种间存在显著差异，尤其是基因BnaGLN1；2a的表达产物在CSG内显著高于CIG。
实施例4基因BnaGLN1；2a遗传变异分析
前期已获得氯酸盐敏感性极端品种在不同硝酸盐水平处理下的RNA样品，对其进行基因BnaGLN1；2a表达水平差异分析。同时，基于已测定的505份重测序油菜自然品种的氯酸盐处理后相对鲜重(鉴定氮效率指标)，提取基因BnaGLN1；2a的基因序列全长和启动子前2000bp的差异SNP结合氯酸盐处理指标进行候选基因关联分析，并进一步划分单倍型并分析其指标差异。
图7为本实施例提供的基因BnaGLN1；2a的遗传变异分析结果，其中，图7A-D为基因BnaGLN1；2a在505份油菜重测序自然品种中的候选基因关联分析，检测到8个SNP位点，其中8个SNP位点分别位于2号染色体的第6637711、6637782、6638039、6638041、6638119、6639122、6639192和6639500个位点上，以基因ATG位置起算，8个SNP位点在基因结构上的位置分别为-760、-689、-432、-430、-352、651、721和1029bp位置，其中前5个SNP位点位于启动子上，第6个和第8个位于非编码区，第7个位点位于编码区，其优异SNP位点主要位于启动子区；进而可分为四种单倍型Hap1、Hap2、Hap3和Hap4，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，其中Hap4为最优单倍型，可作为优异单倍型进行遗传育种分析；图7E和7F分别为不同氯酸盐敏感性极端品种间基因BnaGLN1；2a的表达水平差异分析，表明无论在6mM还是0.1mM硝酸盐水平条件下CSG的根中表达水平均显著高于CIG。
Hap1：GGTACGCA(SEQ ID NO:3)
Hap2:GGTAGGCA(SEQ ID NO:4)
Hap3:TCGCCGCG(SEQ ID NO:5)
Hap4:TCTAGGCG(SEQ ID NO:6)
实施例5氯酸盐敏感性极端品种基于大田实验的产量和农艺性状分析
本试验在湖北省武汉市华中农业大学资源与环境学院基地进行，每个材料(CSG和CIG)共6行，厢宽1.8米左右，行距为0.2m，株距为0.15m，每穴点3粒种子，每行播种8-10穴。设置两个处理包括对照(210kg N/ha)和低氮(70kg N/ha)，每个处理设置3次重复，随机区组设计，试验田设置保护区，保护行至少1m。其中肥料用量如下：
图8为在210kg N/ha施肥水平下，氯酸盐敏感性极端品种的产量和农艺性状分析。其中，CSG的株高、角果数、角果长度和地上部生物量均显著高于CIG，并且前者单株产量和氮效率同样处于较高水平。图9为70kg N/ha施肥水平下，氯酸盐敏感性极端品种的产量和农艺性状分析，其中CSG和CIG无明显差异。这些数据可表明具有基因BnaGLN1；2a较高表达水平的CSG田间表现更优，即基因BnaGLN1；2a的种间变异及优异单倍型可用于氮高效遗传育种。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.谷氨酰胺合成酶的下述任一应用，其特征在于，
A1)提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；
A2)制备提高油菜氮吸收和/或利用效率的产品；
A3)提高油菜氮含量；
A4)制备提高油菜氮含量的产品；
A5)提高油菜的生物量和/或产量；
A6)制备提高油菜的生物量和/或产量的产品；
所述谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.与根据权利要求1所述的谷氨酰胺合成酶相关的生物材料的下述任一应用，其特征在于，
A1)提高油菜中氮的吸收和/或利用效率；
A2)制备提高油菜中氮的吸收和/或利用效率的产品；
A3)提高油菜氮含量；
A4)制备提高油菜氮含量的产品；
A5)提高油菜的生物量和/或产量；
A6)制备提高油菜的生物量和/或产量的产品；
所述生物材料为下述中的任一种：
B1)编码权利要求1中所述谷氨酰胺合成酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述重组载体的重组微生物；
B4)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜细胞系；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜组织；
B6)含有B1)所述核酸分子的转基因油菜器官。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，B1)中所述核酸分子的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。
4.下述任一方法，其特征在于，
D1)培育提高氮吸收和/或氮利用效率的油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮的吸收和/或氮利用效率提高；
D2)培育提高氮含量油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮含量提高；
D3)培育提高生物量和/或产量的油菜的方法，包括使油菜中表达权利要求1所述谷氨酰胺合成酶，或提高油菜中权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的含量，使油菜中氮含量提高。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，D1)-D3)所述方法通过向油菜中导入权利要求1所述谷氨酰胺合成酶的编码基因并使编码基因得到表达实现。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述编码基因为权利要求2中B1)所述的核酸分子。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将SEQ ID NO:2所示的核酸分子插入过表达载体中，构建重组表达载体，再利用转化方法使目标片段转化到油菜中，培育获得转基因植株。
8.谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a在油菜氮高效育种中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述谷氨酰胺合成酶基因具有4种单倍型，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示，所述单倍型均包括8个显著SNP，基于油菜参考基因组第4.1版，8个SNP位点分别位于2号染色体的第6637711、6637782、6638039、6638041、6638119、6639122、6639192和6639500个位点上，其中SEQ ID NO:6为其优异单倍型。
10.一种油菜氮高效品种的筛选方法，其特征在于，检测谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a的表达水平；
或，扩增谷氨酰胺合成酶基因BnaGLN1；2a，判断其单倍型类型，若为SEQ ID NO:6所示的优异单倍型，则为油菜氮高效品种。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102197137A (zh) * 2008-10-30 2011-09-21 先锋国际良种公司 对谷氨酰胺合成酶(gs)进行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒产量
US20160010102A1 (en) * 2013-03-06 2016-01-14 Bayer Cropscience Ag Plants having enhanced nitrogen use efficiency and methods of producing same
CN109182356A (zh) * 2018-09-02 2019-01-11 华中农业大学 具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用
CN115851758A (zh) * 2022-08-30 2023-03-28 湖北大学 油菜BnNRT2.3-like基因及其表达载体在促进植物氮利用中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102197137A (zh) * 2008-10-30 2011-09-21 先锋国际良种公司 对谷氨酰胺合成酶(gs)进行操作以改善高等植物中的氮利用效率和籽粒产量
US20160010102A1 (en) * 2013-03-06 2016-01-14 Bayer Cropscience Ag Plants having enhanced nitrogen use efficiency and methods of producing same
CN109182356A (zh) * 2018-09-02 2019-01-11 华中农业大学 具有亚磷酸脱氢酶催化活性的蛋白、编码基因及其应用
CN115851758A (zh) * 2022-08-30 2023-03-28 湖北大学 油菜BnNRT2.3-like基因及其表达载体在促进植物氮利用中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATHILDE ORSEL等: "Sixteen cytosolic glutamine synthetase genes identified in the Brassica napus L. genome are differentially regulated depending on nitrogen regimes and leaf senescence", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, vol. 65, no. 14, 31 July 2014 (2014-07-31) *

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