CN103665127A - 一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用。本发明提供的水稻分蘖相关蛋白，由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或者将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物分蘖相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。将所述蛋白的编码基因导入不同背景的育种材料中，可以培育出分枝数得到一定程度增加的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

Description

一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于遗传育种领域，涉及一种水稻分蘖相关蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

原始农业起源于对许多植物种类的人工驯化和自然植物资源的开发利用。人类经历了近1万年才使全球的食物总量在1960年达到每年10亿吨，但在随后短短40年的时间中，即到2000年，这一数字就已经达到了每年20亿吨。这样巨大的成就应该归功于众多育种家和植物遗传学家在坚持不断的进行作物的遗传改良，提高了作物的产量，从而得以满足人口增长的不断需求。但近二十年来，我国的水稻产量出现了徘徊不前的局面。究其原因，在很大程度上是由于前两次育种突破均为亚种内品种间杂交育种，亚种内的种质资源和育种潜力均得到了较充分的利用和挖掘，亚种内育种产生新突破的难度已经较大。因此，想要在水稻产量上取得新的重大突破，必须另辟蹊径。

近些年，为了进一步的提高水稻产量，“理想株型”的概念被多数育种家和水稻遗传学家所提及。这是一条进一步提高水稻产量的新思路，它的育种目标在于培育出少蘖、粗杆、大穗的高生物产量的水稻新品种。水稻株型的形成主要取决于植株高度、分蘖数目、分蘖角度以及穗部形态等因素，而适宜的分蘖力可提高群体生物产量，同时分蘖也是产量形成的基础。大量试验表明分蘖力过弱往往自动调解能力差，在早期不易形成生物产量高的群体，导致生物产量低，限制经济产量的提高；而分蘖力过强，易造成茎秆细弱，抗倒伏能力降低，也对生产不利，这就要求分蘖力适度。因此，对水稻分蘖的控制是实现“理想株型”的重要前提。

近期，对多个水稻矮化多分蘖突变体的研究表明，一种新的植物激素——独脚金内酯在抑制水稻分蘖生长的过程中起着很重要的作用，但对这一激素的作用机理的了解还甚少，因此深入研究这一激素在调控植物分蘖方面的作用机理，将为其在农业生产中的应用提供更广泛的前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种水稻分蘖相关蛋白。

本发明的另一目的是提供该蛋白的编码基因。

本发明的又一目的是提供该蛋白及其编码基因的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明提供的水稻分蘖相关蛋白，来源于稻属水稻（Oryza sativa var.农林8号），是如下（a）或（b）所述的蛋白质：

（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将SEQ ID NO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物分蘖相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1蛋白融合标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（a）中的序列可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到；上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码上述水稻分蘖相关蛋白的基因D53也属于本发明的保护范围。

所述基因优选如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码植物分蘖相关蛋白的DNA分子。

4、含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体或可用于植物瞬时转化载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导（Ti）质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒（CaMV）的35S启动子、玉米的泛素（Ubiquitin）启动子和水稻的肌动蛋白（Actin1）启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（β-葡糖醛酸酶GUS基因、萤光素酶LUC基因或绿色荧光蛋白GFP基因等）、具有抗性的抗生素标记物（氨苄霉素Amp标记物或卡那霉素Kan标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除草剂基因Bar）等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体优选在pCUbi1390载体的酶切位点PstI和BamHI之间插入本发明所述基因D53得到的重组质粒。所述重组表达载体具体为pCUbi1390-D53。含有以上所述基因（D53）的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因D53全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明所述蛋白，所述基因D53，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在培育多分蘖水稻中的应用。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将编码所述蛋白的基因导入植物细胞，可获转基因细胞系及转基因植株。携带有所述基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：烟草、百脉根、拟南芥、水稻、小麦、玉米、黄瓜、番茄、杨树、草坪草、苜宿等。

一种利用转基因技术增加水稻分蘖的新方法，是将所述基因D53导入不同背景的植物中，得到分枝数在一定程度上增加的转基因植物；优选将所述基因D53通过所述重组表达载体导入不同背景的植物中。

一种利用转基因技术减少水稻分蘖的新方法，是抑制目的植物中所述基因D53的表达，得到分枝数在一定程度上减少的转基因植物；所述目的植物为携带所述基因D53的植物。抑制目的植物中所述基因D53的表达可采用RNAi技术，通过构建针对D53的干扰载体实现。

有益效果：

本发明提供了一个新的水稻分蘖相关蛋白及其编码基因，该水稻分蘖相关蛋白参与植物独脚金内酯激素信号的调控。抑制该蛋白编码基因的表达可导致水稻分蘖数的减少，从而可以培育出低分枝数、高杆、大穗的转基因植物。将所述蛋白的编码基因导入不同背景的育种材料中，可以培育出分枝数得到一定程度增加的转基因植物。所述蛋白及其编码基因可以应用于植物遗传改良。

附图说明

图1野生型品种农林8号与矮化多分蘖突变体d53的表型比较。

a.野生型农林8号和d53突变体苗期表型比较；b.野生型农林8号与d53突变体成熟期表型比较；c.野生型与d53突变体分蘖数动态比较；d.野生型与d53突变体株高构成比较。

图2d53突变基因的半显性效应。a.野生型、杂合F₁和d53突变体植株总体表型比较；b.野生型、杂合F₁和d53突变体植株剑叶表型比较；c.野生型、杂合F₁和d53突变体植株第一节间茎秆横切表型比较；d.野生型、杂合F₁和d53突变体植株主穗表型比较；e.野生型、杂合F₁和d53突变体植株株高定量比较；f.野生型、杂合F₁和d53突变体植株分蘖数定量比较；g.野生型、杂合F₁和d53突变体植株第三茎秆直径定量比较；h.野生型农林8号与d53突变体杂交F₂群体遗传分离分析。

图3d53突变体对独脚金内酯激素处理不敏感。a.野生型、d53、d14和d27突变体经独脚金内酯激素处理2周后表型比较；b.野生型、d53、d14和d27突变体经独脚金内酯激素处理5周后表型比较；c.野生型、d53和d27突变体内源独脚金内酯激素含量测定比较；d.野生型、d53、d14和d27突变体经独脚金内酯激素处理2周后侧芽长度定量统计比较；e.野生型、d53、d14和d27突变体经独脚金内酯激素处理5周后分蘖数定量统计比较。

图4D53基因的精细定位、图位克隆和表达分析。a.D53基因精细定位图；b.野生型农林8号和d53突变体D53基因核苷酸和氨基酸差异比较；c.D53基因组织表达定量比较；d.独脚金内酯激素诱导D53基因表达随时间变化分析。

图5D53基因过表达转基因植株表型鉴定。a.野生型背景下过表达正常D53蛋白和突变d53蛋白转基因植株表型比较；b.野生型背景下过表达正常D53蛋白和突变d53蛋白转基因植株D53基因表达比较；c.野生型背景下过表达正常D53蛋白和突变d53蛋白转基因植株分蘖数统计比较。

图6干扰D53基因转基因植株表型鉴定。a.d53突变体背景下干扰D53基因表达转基因植株表型比较；b.d53突变体背景下干扰D53基因表达转基因植株分蘖数统计比较。

图7双元载体pCUbi1390图谱

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、植物分蘖相关蛋白及其编码基因的发现

一、水稻矮化多分蘖突变体d53的表型鉴定及遗传分析

1.d53突变体的来源

原始突变株系KL908是由日本学者从农林8号经γ射线辐射诱变而来，并于1988年由南京农业大学朱立宏教授从日本九州大学引进至国内，经多代筛选获得纯合突变体，后命名为dwarf53（d53）。

2.d53突变体的表型鉴定

分蘖数动态测量：播种1周后每隔1周记数一次，每次记数30株，连续计数10周；分蘖数静态测量：在成熟期将整株水稻拔出，清洗基部节间淤泥，对一次分蘖、二次分蘖、三次分蘖和四次分蘖分别进行计数；分蘖芽长度测量：水稻幼苗期将各叶鞘剥除，露出包裹在叶腋处的分蘖芽，在体式镜下测量其长度；株高测量：在成熟期测量地面至最高穗顶的长度。

该突变体在幼苗期表现为侧芽生长加快。4叶期时，d53表现出苗高矮化，不完全叶处腋芽形成第一个分蘖，第1叶处腋芽也已形成正常分蘖，而在野生型农林8号中不完全叶腋芽可能因为营养分配等原因停止生长，趋于退化，不能形成正常的可见分蘖，但第1叶处的分蘖已经形成（图1a）。成熟期时，d53突变体较野生型植株表现株高矮化（约为野生型的60%）、分蘖增加（约为野生型的3倍）（图1b）。从播种后1周开始对野生型和突变体的总分蘖数进行动态测量后发现，随着时间的推移，d53突变体的分蘖数一直高于野生型农林8号（图1c）。从株高构成来看，d53穗长和各节间长度均缩短（图1d）。因此，综合来看，d53突变体主要表现为分蘖芽休眠性被解除，活力旺盛，生长速度加快。

3.d53突变的遗传分析

将d53突变体与其野生型亲本农林8号杂交，F₁代经自交后获得F₂代群体。通过考察F₂代分离群体中各单株株高、分蘖、穗长以及茎秆直径等表型后发现，d53突变表型为半显性遗传（图2）。

4.d53突变体对独脚金内酯处理不敏感

由于d53突变体与水稻中已经发现的d系突变体具有相似的矮化多分蘖表型，因此我们推测d53可能也参与独脚金内酯途径。利用浓度为1μM GR24（独脚金内酯人工合成类似物）（Chiralix）的水培营养液培养水稻幼苗，将水稻幼苗在水培营养液中生长1周后转移至含有1μM GR24的水培营养液中，每周更换1次营养液，连续培养2-5周，最后对分蘖芽或分蘖数进行计数。以不加1μM GR24的并在相同生长条件下的水培苗并用独脚金内酯激素合成与信号缺失突变体d27和d14作为处理对照。

水培种植：用于测量内源独脚金内酯激素含量和激素处理的苗用水培方法种植。将水稻培养在光温湿可控的培养箱（Ruihua）内。光照时间：8时至22时，光照强度：250μmol.m^-2.s^-1，温度：白天30℃，夜晚25℃，湿度：70%。水培营养液母液配方如下：

每种编号的母液稀释1000倍（1ml/l），pH值在5.8-6.2范围内，培养液每周更换一次。

水稻根系分泌的内源独脚金内酯激素含量测定：方法参照Yoneyama et al.(2008)，略有修改。（1）收集不同品种水稻幼苗（各30株）等量的水稻水培营养液；（2）用乙酸乙酯萃取抽提2次；（3）乙酸乙酯相用0.2M K₂HPO₄漂洗，用无水Na₂SO₄干燥，并在真空中浓缩；（4）萃取物溶解于50%(v/v)的乙腈中，并用LC/MS-MS（三重四极杆串联液相色谱质谱技术）进行分析。

处理2周后发现，野生型的第一叶叶腋分蘖芽生长受到明显的抑制；在d27突变体中，由于外源激素对分蘖芽的抑制作用使突变体恢复到野生型的表型，其不完全叶和第一叶腋芽生长都受到明显的抑制；但在d14和d53突变体中进行处理后并没有出现这样的抑制表型（图1a，d）。此外，对处理5周后的水稻植株进行统计后发现，d27突变体无论在分蘖数还是在株高都已经恢复到野生型的表型，而d14和d53依然保持突变表型（图1b，e）。我们进一步对野生型农林8号和d53突变体中根系分泌的内源独脚金内酯激素进行定量测定。结果表明在d53突变体中内源独脚金内酯激素大量积累，是野生型的7.4倍，而在对照独脚金内酯激素合成突变体d27中，我们几乎检测不到这种内源激素的含量（图1c）。综合这些结果表明，d53是一个独脚金内酯信号途径缺陷突变体。

实施例2、D53基因的精细定位、图位克隆与表达分析

1.D53基因的精细定位和图位克隆：利用d53突变体和爪哇品种Ketan Nangka杂交后得到的F₂代分离群体对D53基因进行精细定位。首先我们从实验室已有的公共引物中筛选了d53和Ketan Nangka之间存在多态的SSR标记，按多态标记之间间隔不小于20cM的标准，挑选了均匀分布于12条染色体上的242个多态性标记进行初步连锁分析。我们利用F₂群体中20个高杆少分蘖表型单株进行初步连锁，d53和Ketan Nangka作为对照。如果20个隐性极端单株（高杆少分蘖植株）均表现或大多表现突变体d53的带型，少数单株表现为杂合带型，我们就认为该标记与目的基因存在连锁关系。结果通过分析我们发现第11染色体短臂末端上两个SSR标记W1（引物序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5）和W2（引物序列如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7）与目的基因间存在连锁关系。随后，我们在这两个标记之间的3个BAC克隆上又分别设计了一些在两亲本间存在带型差异的多态性标记。最终利用2893个极端个体（高杆少分蘖植株）将目的基因定位于标记Z7（引物序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9）和Z3（引物序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11）间，两个标记发生交换的单株分别有4株和2株（图4a）。

PCR反应体系及条件：PCR反应体系(10μl)：DNA(20ng/ul)1ul，上游引物(2pmol/ul)1ul，下游引物(2pmol/ul)1ul，10×Buffer(MgCl₂free)1ul，dNTP(10mM)0.2ul，MgCl₂(25mM)0.6ul，rTaq(5u/ul)0.1ul，ddH₂O5.1ul，共10ul。PCR反应程序：94.0℃变性5min；94.0℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min，共循环35次；72℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在MJ Research PTC-225热循环仪中进行。

利用NCBI注释及RiceGAAS（http://ricegaas.dna.affrc.go.jp/）数据库，我们对标记Z7和Z3间34kb区间进行进行基因预测，结果发现存在3个候选基因（图4a）。对这3个候选基因的基因组和ORF分别测序后发现，相比于野生型其中一个基因的基因组序列发生了1个碱基的替换和15个碱基的缺失，从而导致该基因的ORF发生1个氨基酸的改变和5个氨基酸的缺失（图4b）。因此，初步判断这个发生氨基酸改变的基因很可能是D53基因。该ORF（SEQ IDNO.2）编码一个新的在结构上与I类Clp ATPase类似的表达蛋白（expression protein），序列如SEQ ID NO.1所示。

2.D53基因的表达：

检测D53基因各组织表达取样：选取野生型水稻品种农林8号不同发育时期的各个组织（幼苗期根和芽、分蘖期叶鞘和叶片以及抽穗期幼穗、茎和茎节），经液氮研磨后放入-80℃冷藏备用。结果表明，D53基因在不同水稻组织呈现普遍性表达（图4c）。

激素处理诱导D53基因表达取样：将1周大的野生型农林8号幼苗经独脚金内酯激素处理后，按不同处理时间点收集整个幼苗植株，经液氮研磨后放入-80℃冷藏备用，其中以不加激素的处理作为阴性对照。结果表明，D53基因受独脚金内酯激素诱导上调表达（图4d）。

RNA的提取和实时荧光定量（qPCR）分析：

（1）根据D53基因的cDNA序列，用Primer Premier5.0软件设计特异的qPCR引物D53-qRT（引物序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13）；

（2）使用RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒（Tiangen），提取野生型和不同转基因植株苗期或分蘖期的RNA；

（3）用DU800分光光度计（Bechman Instrument Inc.USA），检测RNA的浓度及质量；

（4）凝胶电泳检测RNA的完整性；

（5）取2μg RNA作为模板，使用PrimeScriptII1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），反转录出cDNA；

（6）Real-time PCR表达分析：配置好反应体系，扩增反应在7900HT Real-Time PCR（Applied Biosystems）仪进行。反应体系为：1.8μl cDNA模板，10μl SYBR Premix ExTaqII（2×），0.8μl D53-qRT Forward Primer（10μM），0.8μl D53-qRT Reverse Primer（10μM），6.8μl ddH₂O。反应程序为：95℃预变性30s；95℃5s，60℃30s，40个循环；待扩增反应结束后，使用7900HT Real-Time PCR（Applied Biosystems）仪自带的软件分析CT值，用OsUbiquitin基因的表达量作为内参，数据分析按相对定量方法计算（Livak.etal.,2001）。

实施例2、转基因植物的获得和鉴定

一、重组表达载体构建

（1）以野生型品种农林8号cDNA为模板，分别利用基因特异性引物D53-cDNA-F（SEQ IDNO.14）/D53-cDNA-R（SEQ ID NO.15）和D53-RNAi-F（SEQ ID NO.16）/D53-RNAi-R（SEQ IDNO.17）进行PCR扩增获得正常D53全长基因片段以及D53基因干扰片段，并将PCR产物回收纯化。以d53突变体的cDNA为模板，利用基因特异性引物D53-cDNA-F（SEQ ID NO.14）/D53-cDNA-R（SEQ ID NO.15）进行PCR扩增获得突变d53全长基因片段，并将PCR产物回收纯化。

（2）采用In-Fusion PCR Cloning System（TaKaRa）将PCR产物D53基因和突变d53基因克隆到双元载体pCUbi1390（图7）中，将D53基因干扰片段克隆到载体pLHRNAi（专利申请号:201110055864.X）中。重组反应体系(5μl)：PCR产物和酶切后的载体按1：1比例混合（共4μl），加入1μl In-Fusion HD后，50℃PCR反应20min，-20℃冷藏备用。

（3）热激法大肠杆菌转化：将重组反应体系短暂离心后，混合与冰上融化的大肠杆菌DH5α感受态细胞（Tiangen），静止30min后，将体系置于37℃水浴锅中热激90s，再置于冰上冷却2min。加入无抗性LB液体培养基后，在37℃摇床180rpm/min培养1h后，将全部转化细胞均匀涂布在含50mg/l卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养16h后，挑取阳性克隆进行测序。测序完成后，将含有正确序列克隆的pCUbi1390-D53、pCUbi1390-d53和pLHRNAi-D53的重组表达载体保存待用。

二、重组农杆菌的获得

用热击法将上述pCUbi1390-D53、pCUbi1390-d53和pLHRNAi-D53的正确克隆重组质粒转化农杆菌EHA105菌株（Invitrogen），得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株命名为EH-pCUbi1390-D53、EH-pCUbi1390-d53和EH-pLHRNAi-D53。

三、转基因植物的获得

分别将EH-pCUbi1390-D53和EH-pCUbi1390-d53以及相应的空载体对照EH-pCUbi1390转化野生型品种Kitaake；EH-pLHRNAi-D53和空载体对照EH-pLHRNAi转化d53突变体具体方法为：

（1）28℃培养上述农杆菌重组菌株16h。收集菌体，并稀释到含有100μmol/l乙酰丁香酮的N₆液体培养基（Sigma）中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

（2）将培养至一个月的Kitaake水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤（1）的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入N₆固体共培养培养基（Sigma）中，24℃共培养3d；

（3）将步骤（2）的愈伤接种在含有100mg/l卡那霉素和利福平（Phyto TechnologyLaboratories）的N₆固体筛选培养基上第一次筛选（16d）；

（4）挑取健康愈伤转入含有100mg/l卡那霉素和利福平的N₆固体筛选培养基上第二次筛选，每15d继代一次；

（5）挑取健康愈伤转入含有50mg/l卡那霉素和利福平的N₆固体筛选培养基上第三次筛选，每15d继代一次；

（6）挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；得到分化成苗的T₀代转基因植株。

四、转基因植株的鉴定

（1）转基因植株叶片的潮霉素筛选鉴定

将水稻分蘖期转基因植株叶片（2-3cm）浸泡在浓度为1‰的潮霉素溶液里（同时添加浓度为的1‰的6-BA作为保鲜剂），3天后观察叶片表型变化情况。若叶片仍然保持鲜绿色，则说明该转基因植株为阳性；若叶片出现从边缘至中心的衰老黄化等表型，即可认定该转基因植株为阴性。同时用已知的阳性和阴性转基因植株叶片做平行对照。实验结果表明，我们的转基因阳性率达到70%左右。

（2）D53基因的表达水平鉴定

提取水稻转基因植株叶片RNA，利用D53基因特异性定量引物D53-qRT进行荧光定量PCR反应来检测不同转基因植株D53基因表达水平变化。结果表明，在转入pCUbi1390-D53和pCUbi1390-d53的过表达阳性转基因植株中D53和d53基因的表达水平与对照相比增加5-30倍（图5b）。RNA提取和qPCR的方法同上。

（3）转基因植株的表型鉴定

分别将T₀代转基因植株和受体亲本Kitaake和d53突变体种植在中国农业科学院作物所昌平实验基地。与转空载体对照转基因植株和受体亲本Kitaake相比，转pCUbi1390-D53和pCUbi1390-d53阳性植株均出现矮化多分蘖的表型（图5a,c），即说明超表达D53基因和d53基因均能够出现矮化多分蘖的表型；转pLHRNAi-D53转基因植株恢复了d53突变体的突变表型，即株高增加、分蘖减少（图6）。从而验证了转基因前的突变表型是由半显性突变d53基因造成的，即证明D53基因蛋白作为独脚金内酯信号途径的抑制子参与调控植物分枝（蘖）的生长发育。

Claims (9)

1.一种水稻分蘖相关蛋白，其特征在于：

（a）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成；或者

（b）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物分蘖相关的由SEQ ID NO.1衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1）或2）或3）或4）的DNA分子：

1）SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

2）SEQ ID NO.3所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码水稻分蘖相关蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCUbi1390载体的酶切位点PstI和BamHI之间插入权利要求2或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求2或3所述基因的全长及其任意片段的引物对。

7.权利要求1所述蛋白，权利要求2或3所述基因，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的任意一种在培育多分蘖水稻中的应用。

8.一种利用转基因技术增加水稻分蘖的新方法，是将权利要求2或3所述基因导入不同背景的植物中，得到分枝数增加的转基因植物。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入不同背景的植物中。

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