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CN118488834A - 细菌源性脂质组合物和其用途 - Google Patents

细菌源性脂质组合物和其用途 Download PDF

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CN118488834A
CN118488834A CN202280082224.4A CN202280082224A CN118488834A CN 118488834 A CN118488834 A CN 118488834A CN 202280082224 A CN202280082224 A CN 202280082224A CN 118488834 A CN118488834 A CN 118488834A
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bacterial
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lipid
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S·帕特尔
A·豪
张晓雪
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Sail Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本文公开了细菌源性脂质组合物，所述细菌源性脂质组合物包括(a)细菌组分，所述细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质；以及(b)可电离脂质。本公开还包含一种用于制备制备细菌源性脂质组合物的方法，所述方法包括：在存在(b)可电离脂质的情况下重构(a)包括从细菌来源提取的一种或多种脂质的细菌组分，以产生所述细菌源性脂质组合物；以及将一种或多种异源功能剂装载到所述细菌源性脂质组合物中。

Description

细菌源性脂质组合物和其用途
相关申请交叉引用
本申请要求于2021年11月23日提交的美国临时申请第63/282,304号的优先权的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文。
背景技术
异源功能剂(如治疗剂或免疫剂)的递送可能受到药剂可以穿透细胞屏障并由此有效地作用于生物体的程度的限制。因此，本领域持续需要开发新型递送系统，其可以有效地递送异源功能剂并促进药剂的细胞摄取。
发明内容
一方面，本文提供了一种细菌源性脂质组合物，所述细菌源性脂质组合物包括(a)细菌组分，所述细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质；以及(b)可电离脂质。
另一方面，本文提供了一种细菌源性脂质组合物，所述细菌源性脂质组合物包括多种脂质重构的细菌组分，其中所述脂质重构的细菌组分是通过包括以下步骤的方法产生的：(a)提供多种经纯化的细菌脂质；(b)处理所述多种经纯化的细菌脂质以产生脂质膜；(c)在选自由以下组成的组的有机溶剂中重构所述脂质膜，由此产生脂质溶液：乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1-丁醇、二甲基亚砜、乙腈:乙醇、乙腈:甲醇、丙酮:甲醇、甲基叔丁基醚:丙醇、四氢呋喃:甲醇、二甲基亚砜:甲醇和二甲基甲酰胺:甲醇；以及(d)在包括水相的微流体装置中处理步骤(c)的所述脂质溶液，由此产生所述细菌源性脂质组合物。
另一方面，本文提供了一种用于制备细菌源性脂质组合物的方法。所述方法包括在存在(b)可电离脂质的情况下重构包括从细菌来源提取的一种或多种脂质的(a)细菌组分，以产生所述细菌源性脂质组合物。所述方法进一步包括用一种或多种异源功能剂装载到所述细菌源性脂质组合物中。所述可电离脂质具有以下所列特性中的两种或更多种：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P比率。
在一些替代性实施例中，所述可电离脂质具有以下所列特性中的两种或更多种：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少3的N:P比率。
另一方面，本文提供了一种用于将细菌源性脂质组合物递送到靶细胞的方法，所述方法包括将包括以下的细菌源性脂质组合物引入到所述靶细胞：(a)细菌组分，所述细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质；以及(b)可电离脂质。
在一些实施例中，重构步骤包括在存在所述可电离脂质(b)的情况下重构包括所述细菌组分(a)的经纯化的细菌脂质的膜，以产生所述细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，所述细菌来源选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、项圈藻属(Anabaena)、产水菌属(Aquifex)、固氮弧菌属(Azoarcus)、固氮菌属(Azotobacter)、博代氏杆菌属(Bordetella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、伯克氏菌属(Burkholderia)、韧皮部杆菌属(Candidatus)、色杆菌属(Chromobacterium)、鳄球藻属(Crocosphaera)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、脱硫小杆菌属(Desulfotalea)、欧文氏菌属(Erwinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、粘杆菌属(Gloeobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、磁螺菌属(Magnetospirillum)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基球菌属(Methylococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、念珠藻属(Nostoc)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、单胞菌属(Polaromonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、红长命菌属(Rubrivivax)、沙门氏菌属(Salmonella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、志贺氏菌属(Shigella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、热粘球菌属(Thermosynechococcus)、热袍菌属(Thermotoga)、栖热菌属(Thermus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、束毛藻属(Trichodesmium)、弧菌属(Vibrio)、魏格沃斯菌属(Wigglesworthia)、沃廉菌属(Wolinella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳杆菌属、穆尔氏菌属(Moorella)、大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、共生菌属(Symbiobacterium)和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)。在一个实施例中，所述细菌来源是埃希氏杆菌属(例如，大肠杆菌(E.coli))。在一个实施例中，所述细菌来源是沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium))。
在一些实施例中，所述细菌组分包括分离的细菌胞外囊泡。
在一些实施例中，所述细菌组分是通过在存在所述可电离脂质的情况下重构包括所述细菌组分的膜来修饰的。
在一些实施例中，所述细菌组分是通过用所述可电离脂质重构包括所述细菌组分的经纯化的细菌脂质的膜来修饰的。
在一些实施例中，所述可电离脂质具有选自由以下组成的组的一种或多种特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P比率。
在一些替代性实施例中，所述可电离脂质具有选自由以下组成的组的特性中的一种或多种特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少3的N:P比率。
在一些实施例中，所述可电离脂质选自由以下组成的组：1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315。在一个实施例中，所述可电离脂质是C12-200。
在一些实施例中，所述可电离脂质是其中R是C8-C14烷基。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物进一步包括固醇。因此，所述细菌组分的重构(reconstruction或reconstitution)是在存在可电离脂质和固醇的情况下进行的。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物进一步包括聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。因此，所述细菌组分的重构(reconstruction或reconstitution)是在存在可电离脂质和PEG化脂质(或PEG-脂质缀合物)的情况下进行的。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物进一步包括固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。因此，所述细菌组分的重构(reconstruction或reconstitution)是在存在可电离脂质、固醇和PEG化脂质(或PEG-脂质缀合物)的情况下进行的。
在一些实施例中，所述固醇是胆固醇或谷甾醇。
在一些实施例中，所述PEG-脂质缀合物是C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k。在一些实施例中，所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG或PEG-PE。在一些实施例中，所述PEG-DMG是PEG2000-DMG或PEG2000-PE。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括：
约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质；
约20mol％至约60mol％的所述细菌组分(例如，所提取的细菌脂质)；
约7mol％至约45mol％的所述固醇；以及
约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括：
约30mol％至约40mol％的所述可电离脂质；
约20mol％至约50mol％的所述细菌组分(例如，所提取的细菌脂质)；
约12mol％至约43mol％的所述固醇；以及
约1.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括：
约35mol％的所述可电离脂质；
约50mol％的所述细菌组分(例如，所提取的细菌脂质)；
约12.5mol％的所述固醇；以及
约2.5mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35:50:12.5:2.5的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35:20:42.5:2.5的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括：
从埃希氏杆菌属(例如，大肠杆菌)或沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌)提取的脂质；
C12-200；
胆固醇；以及
DMPE-PEG2k。
在一个实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括：
从大肠杆菌提取的极性脂质；
C12-200；
胆固醇；以及
DMPE-PEG2k。所述细菌源性脂质组合物可以包括摩尔比为约35:50:12.5:2.5或约35:20:42.5:2.5的C12-200:大肠杆菌极性脂质:胆固醇:DMPE-PEG2k。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物是选自由以下组成的组的亲脂性部分：脂质复合物、脂质体、脂质纳米颗粒、基于聚合物的载剂、外泌体、层状体、胶束和乳液。在一个实施例中，所述细菌源性脂质组合物是选自由以下组成的组的脂质体：阳离子脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、单层脂质体、多层脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体和多囊泡脂质体。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物是脂质纳米颗粒。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的大小小于约200nm。在一个实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的大小小于约150nm。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的大小小于约100nm。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的大小为约55nm至约95nm。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的大小为约85nm至约95nm。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的大小为约85nm至约90nm。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的平均多分散性指数(PDI)在约0.1到约0.5的范围内。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的平均PDI在约0.1至约0.4的范围内。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物的颗粒的平均PDI在约0.2至约0.3的范围内。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括一种或多种异源功能剂。在一些实施例中，所述异源功能剂由所述细菌源性脂质组合物包封。在一些实施例中，所述异源功能剂包埋在所述细菌源性脂质组合物的表面上。在一些实施例中，所述异源功能剂与所述细菌源性脂质组合物的表面缀合。
在一些实施例中，所述异源功能剂是多核苷酸。在一些实施例中，所述多核苷酸选mRNA、siRNA或siRNA前体、微小RNA(miRNA)或miRNA前体、质粒、Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、短发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁定核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶、脱氧核酶(DNA酶)、适体、环状RNA(circRNA)、向导RNA(gRNA)或编码这些RNA中的任一者的DNA分子。在一些实施例中，所述多核苷酸是mRNA。在一些实施例中，所述mRNA源自DNA分子或RNA分子(例如，自我复制的RNA分子)。在一些实施例中，所述多核苷酸是siRNA或其前体。在一些实施例中，所述多核苷酸是质粒。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物对所述多核苷酸的包封效率为至少约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％。在一个实施例中，所述细菌源性脂质组合物对所述多核苷酸的包封效率为至少约90％。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比为约50:1至约10:1。在一些实施例中，所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比为约44:1至约24:1。在一些实施例中，所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比为约40:1至约28:1。在一些实施例中，所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比为约38:1至约30:1。在一些实施例中，所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂(例如，多核苷酸)重量比为约37:1至约33:1。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物被调配用于递送到动物或人。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物被调配用于递送到植物。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物是由包括脂质挤出的方法产生的。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物是通过一种方法产生的，所述方法包括在包括水相的微流体装置中处理包括来自所述细菌源性脂质组合物的所述脂质的溶液，由此产生所述细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，所述异源功能剂通过水相被调配到所述细菌源性脂质组合物中。在一些实施例中，所述水相和所述脂质溶液(有机相)以3:1体积比混合。
在一些实施例中，所述水相包括所述多核苷酸。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物，例如水相进一步包括HEPES或TRIS缓冲液。所述HEPES或TRIS缓冲液的pH可以为约7.0至约8.5。所述HEPES或TRIS缓冲液的浓度可为约7mg/mL至约15mg/mL。所述水相可以进一步包括约2.0mg/mL至约4.0mg/mL的NaCl。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物，例如所述水相包括水、PBS或柠檬酸盐缓冲液。在一个实施例中，所述水相包括pH为约3.2的柠檬酸盐缓冲液。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物进一步包括一种或多种冷冻保护剂。所述一种或多种冷冻保护剂可以是蔗糖、甘油或其组合。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括蔗糖，例如浓度为约70mg/mL至约110mg/mL。在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括甘油，例如浓度为约50mg/mL至约70mg/mL。在一个实施例中，所述细菌源性脂质组合物包括蔗糖(例如，浓度为约70mg/mL至约110mg/mL)和甘油(例如，浓度为约50mg/mL至约70mg/mL)的组合。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物是冷冻干燥的或经冻干的组合物。冷冻干燥的或经冻干的细菌源性脂质组合物可以包括一种或多种冻干保护剂。经冻干的细菌源性脂质组合物可以包括泊洛沙姆、山梨酸钾、蔗糖或其任何组合。在一个实施例中，经冻干的细菌源性脂质组合物包括泊洛沙姆(例如，约0.01％w/w至约1.0％w/w的泊洛沙姆)。在一个实施例中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
在一些实施例中，所述细菌源性脂质组合物是经冻干的组合物。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.01％w/w至约1.0％w/w的异源功能剂(例如，多核苷酸)。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约1.0％w/w至约5.0％w/w的脂质。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.5％w/w至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.75％w/w至约2.75％w/w的NaCl。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约85％w/w至约95％w/w的糖，例如，蔗糖。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.01％w/w至约1.0％w/w的泊洛沙姆(例如，约0.01至约1.0％w/w的泊洛沙姆)，如泊洛沙姆188。在一些实施例中，所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约1.0％w/w至约5.0％w/w的山梨酸钾。
定义
如本文所使用的，术语“有效量”、“有效浓度”或“对……有效的浓度”是指细菌源性脂质组合物或核酸组合物的足以在靶生物体内或在靶生物体上产生所陈述结果或达到目标水平(例如，预定或阈值水平)的量。
如本文所使用的，术语“治疗剂”是指可以作用于动物例如哺乳动物(例如，人类)、动物病原体或病原体载体的药剂，例如抗真菌剂、抗菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或昆虫驱除剂。
如本文所使用的，术语“异源”是指对于细菌源性脂质组合物被递送到的生物体是外源的药剂。
如本文所使用的，术语“功能剂”是指使用体内或体外方法与细菌源性脂质组合物(例如，装载到细菌源性脂质组合物中或其上(例如，由细菌源性脂质组合物包封、包埋在其中或与其缀合)缔合或可与之缔合并且能够实现所陈述结果(例如，增加或减少植物、植物害虫、植物共生体、动物(例如，人类)病原体或动物病原体载体的适应性)的药剂(例如，农业剂(例如，杀虫剂、施肥剂、除草剂、植物改良剂)或治疗剂(例如，抗真菌剂、抗菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或昆虫驱除剂)。在一些实施例中，所述异源功能剂是多核苷酸。
如本文所定义的，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换，并且是指直链或支链、单链或双链的RNA或DNA或其杂合体，不管长度如何(例如，至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、100个、150个、200个、250个、500个、1000个或更多个核酸)。该术语还涵盖RNA/DNA杂合体。核苷酸通常通过磷酸二酯键连接在核酸中，但术语“核酸”还涵盖具有其它类型的键联或主链(例如磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、O-甲基氨基磷酸酯、吗啉代、锁核酸(LNA)、甘油核酸(GNA)、苏糖核酸(TNA)和肽核酸(PNA)键联或主链等)的核酸类似物。核酸可以是单链的、双链的或含有单链和双链序列的部分。核酸可以含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何组合，以及碱基的任何组合，包含例如腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和经修饰或非规范的碱基(包含例如次黄嘌呤、黄嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5,6-二氢尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶)。
如本文所使用的，术语“肽”、“蛋白质”或“多肽”涵盖天然或非天然存在的氨基酸(D-氨基酸或L-氨基酸)的任何链，不管长度如何(例如至少2、3、4、5、6、7、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、100个或更多个氨基酸)、存在或不存在翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)或存在例如一个或多个与肽共价连接的非氨基酰基(例如糖、脂质等)，并且包含例如天然蛋白质、合成或重组多肽和肽、杂合分子、类肽或拟肽。
如本文所使用的，两个序列之间的“一致性百分比”是通过BLAST 2.0算法确定的，所述算法描述于Altschul等人,(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》215:403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National CenterforBiotechnology Information)公开获得。
如本文所使用的，术语“未经修饰的细菌组分”是指包含细菌组分(例如，经分离的细菌胞外囊泡或所提取的细菌脂质)的组合物，所述细菌组分缺乏能够增加细菌组分的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)的异源细胞摄取剂。
如本文所使用的，细菌组分的术语“经修饰的”或“修饰”是指细菌源性脂质组合物，所述细菌源性脂质组合物包含细菌组分和一种或多种异源药剂(例如，一种或多种外源性脂质，如可电离脂质、固醇和/或PEG化脂质)，所述异源药剂相较于未经修饰的细菌组分能够增加细菌源性脂质组合物或其部分或组分的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)；能够通过细菌源性脂质组合物实现或增加异源功能剂(例如，农业剂或治疗剂)到细胞的递送和/或能够实现或增加外源功能剂(例如，农业剂或治疗剂)的装载(例如，装载效率或装载能力)。细菌组分可以在体外或体内进行修饰。
如本文所使用的，术语“细胞摄取”是指细胞，如动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞对细菌源性脂质组合物或其部分或组分(例如，由细菌源性脂质组合物携带的多核苷酸)的摄取。例如，摄取可以涉及将细菌源性脂质组合物或其一部分组分从细胞外环境转移到细胞膜、细胞壁、胞外基质中或穿过所述细胞膜、所述细胞壁、所述胞外基质或转移到细胞的胞内环境中)。细菌源性脂质组合物的细胞摄取可以经由主动或被动细胞机制发生。细胞摄取包含整个细菌源性脂质组合物被细胞摄取，例如通过内吞作用摄取的方面。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸在内吞作用和内体逃逸之后暴露于靶细胞的细胞质。在一些实施例中，相对于未经修饰的细菌组分(例如，所提取的细菌脂质)，包括可电离脂质的细菌源性脂质组合物，例如包括可电离脂质和固醇和/或PEG化脂质的细菌源性脂质组合物具有增加的内体逃逸率。细胞摄取还包含细菌源性脂质组合物与靶细胞的膜融合的方面。在一些实施例中，一种或多种多核苷酸在膜融合之后暴露于靶细胞的细胞质。在一些实施例中，相对于未被可电离脂质修饰的细菌组分，细菌源性脂质组合物与靶细胞的膜的融合速率增加(例如，更易促融合)。
如本文所使用的，术语“细胞穿透剂”是指以相对于尚未与药剂接触的细胞，以促进细胞摄取增加的方式改变细胞(例如，动物细胞、植物细胞、细菌细胞或真菌细胞)的细胞壁、胞外基质或细胞膜的特性(例如，穿透性)的药剂。
本文描述了包括脂质重构的细菌组分的细菌源性脂质组合物。细菌组分已经来源于源自细菌来源(例如，从细菌来源富集、分离或纯化)的脂质结构(例如，脂质双层、单层、多层结构；例如，囊泡脂质结构)，其中所述脂质结构被破坏(例如，被脂质提取破坏)，并使用标准方法在液相(例如，含有货物的液相)中重新组装或重构，例如，通过包括脂质膜水合和/或溶剂注射的方法重构，以产生脂质重构的细菌组分，如本文所描述的。如果需要，所述方法可以进一步包括超声处理、冷冻/解冻处理和/或脂质挤出，例如，以减小重构的细菌源性脂质组合物的大小。可替代地，细菌源性脂质组合物可以使用微流体装置(如IGNITETM微流体仪器(精密纳米系统有限公司(PrecisionNanoSystems)))产生。
如本文所使用的，术语“细菌胞外囊泡”、“细菌EV”或“EV”是指天然存在于细菌中的封闭脂质双层结构。任选地，细菌EV包含一种或多种细菌EV标志物。如本文所使用的，术语“细菌EV标志物”是指与细菌天然缔合的组分，如细菌蛋白质、细菌核酸、细菌小分子、细菌脂质或其组合。
如本文所使用的，术语“阳离子脂质”是指带正电的两亲性分子(例如，脂质或类脂质)，其含有阳离子基团(例如，阳离子头基)。
如本文所使用的，术语“可电离脂质”是指含有基团(例如，头基)的两亲性分子(例如，脂质或类脂质，例如，合成脂质或类脂质)，所述基团在给定条件(例如，pH)下可以被电离，例如，解离以产生一种或多种带电物种。
出人意料地发现，包括具有多个不饱和位点例如至少两个或三个不饱和位点的烷基链的可电离脂质尤其适用于形成膜流动性增加的脂质颗粒。适于本文使用的许多可电离脂质和相关类似物已在美国专利公开第20060083780号和第20060240554号；美国专利第5,208,036号；第5,264,618号；第5,279,833号；第5,283,185号；第5,753,613号；和第5,785,992号；以及PCT公开第WO 96/10390号中描述，所述文献的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，可电离脂质是可电离的，使得所述脂质可以根据pH解离而以带正电荷形式存在。可电离脂质的电离影响包括所述可电离脂质的脂质纳米颗粒在不同pH条件下的表面电荷。脂质纳米颗粒的表面电荷进而可能影响其血浆蛋白吸收、血液清除和组织分布(Semple,S.C.等人,《高级药物递送综述(Adv.Drug Deliv Rev)》32:3-17(1998))以及其形成内体溶解的非双层结构的能力(Hafez,I.M.等人,《基因疗法(Gene Ther)》8:1188-1196(2001))，前述各者可能影响核酸的细胞内递送。
在一些实施例中，可电离脂质是例如在生理pH(例如pH约7)下通常呈中性，但在酸性pH或碱性pH下可以携带一个或多个净电荷的脂质。在一个实施例中，可电离脂质是在pH约7下通常呈中性，但在酸性pH下可以携带一个或多个净电荷的脂质。在一个实施例中，可电离脂质是在pH约7下通常呈中性，但在碱性pH下可以携带一个或多个净电荷的脂质。
在一些实施例中，可电离脂质不包含在生理pH(例如pH约7)下通常携带一个或多个净电荷的那些阳离子脂质或阴离子脂质。
如本文所使用的，术语“类脂质”是指具有脂质的一种或多种特性的分子。
如本文所使用的，术语“稳定的细菌源性脂质调配物”是指这样一种细菌源性脂质组合物，在一定时间段(例如，至少24小时、至少48小时、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少30天、至少60天或至少90天)内相对于细菌源性脂质调配物的颗粒的数量(例如，在产生或调配时)，任选地在限定的温度范围下(例如，温度为至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)、至少20℃(如，至少20℃、21℃、22℃或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃或15℃)或至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃或0℃)或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃或-30℃)，其保留细菌源性脂质组合物的颗粒的至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的初始数量(例如，每mL溶液的颗粒)；或者相对于细菌源性脂质组合物的初始活性(例如，在产生或调配时)，任选地在限定的温度范围下(例如，温度为至少24℃(例如，至少24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃)、至少20℃(如，至少20℃、21℃、22℃或23℃)、至少4℃(例如，至少5℃、10℃或15℃)或至少-20℃(例如，至少-20℃、-15℃、-10℃、-5℃或0℃)或-80℃(例如，至少-80℃、-70℃、-60℃、-50℃、-40℃或-30℃)，其保留至少5％(例如，至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％)的其活性(例如，细胞壁穿透活性和/或在细菌源性脂质组合物内调配的mRNA的活性)。
如本文所使用的，术语“被调配以用于递送到动物”是指细菌源性脂质组合物，其包含药学上可接受的载剂。如本文所使用的，“药学上可接受的”载剂或赋形剂是适于施用于动物(例如，人类)，例如，对动物(例如，人类)没有过度不良副作用的载剂或赋形剂。
附图说明
图1是示出通过用可电离脂质修饰所提取的细菌脂质来制备细菌源性脂质组合物的工作流程的方案。
图2示出了如实例2和5所描述的构成示例性细菌源性脂质组合物(BacLC)的各种组分的摩尔比与构成常规脂质纳米颗粒组合物(LNP)的各种组分的摩尔比。
图3A示出了根据实例2和5制备的示例性细菌源性脂质组合物(大肠杆菌BacLC)的颗粒相较于常规脂质纳米颗粒组合物(LNP)的颗粒的大小和多分散性。图3B示出了根据实例5制备的大肠杆菌BacLC/mRNA调配物的颗粒相较于比较调配物(LNP/mRNA)的颗粒的包封效率。
图4示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)的小鼠相比，在小鼠中单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司(Avanti))/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 1μg)之后，在第12天时在100μL小鼠血液中产生IFNg的抗原特异性T细胞的数量。对照是PBS。
图5示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)的小鼠相比，在小鼠中单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 1μg)之后，在第12天时小鼠的血浆中对SARS-CoV-2的S1抗原具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。
图6示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)的小鼠相比，在小鼠中单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司(Avanti))/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 1μg)之后，在第28天时小鼠中每106个脾细胞中产生细胞因子IFNg的SARS-CoV-2S特异性T细胞的数量。对照是PBS。
图7示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第12天时小鼠中每106个脾细胞中产生细胞因子IFNg的SARS-CoV-2S特异性T细胞的数量。对照是PBS。
图8示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第12天时小鼠血浆中对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。
图9示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第28天时小鼠血浆中对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。
图10A-10B示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第28天时小鼠血浆中分别对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)(图10A)或S-蛋白(图10B)具有特异性的抗体(IgA)的水平。对照是PBS。
图10C-10D示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第28天时小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中分别对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)(图10C)或S-蛋白(图10D)具有特异性的抗体(IgA)的水平。对照是PBS。
图11示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有HAmRNA 10μg)之后，在第14天时小鼠中每106个脾细胞产生细胞因子IFNg的流感HA特异性T细胞的数量。对照是PBS。
图12示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有血凝素(HA)mRNA 10μg)之后，在第14天时小鼠血浆中对流感的HA具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。
图13A-13C示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有CRE mRNA 10μg)之后，在第6天时Ai9小鼠的脾中分别地tdTomato+淋巴细胞(图13A)、髓系细胞(图13B)和非免疫细胞(图13C)的频率。对照是PBS。
图14A-14C示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有CRE mRNA 10μg)之后，在第6天时Ai9小鼠的淋巴结中分别地tdTomato+淋巴细胞(图14A)、髓系细胞(图14B)和非免疫细胞(图14C)的频率。对照是PBS。
图15A-C示出了在小鼠静脉内施用一定剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)之后，在4-6小时小鼠的全身(图15A)、肝(图15B)和脾(图15C)的辐射。图15D示出了在小鼠静脉内施用一定剂量的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)之后，在4-6小时脾与肝的辐射比。
图16A-C示出了在小鼠静脉内施用一定剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avaanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)之后，在4-6小时小鼠的肠系膜淋巴结(图16A)、胃(图16B)和肠系膜脂肪垫(图16D)的辐射。
具体实施方式
本文的特征在于细菌源性脂质组合物，所述细菌源性脂质组合物含有(a)细菌组分，所述细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质；以及(b)可电离脂质，所述可电离脂质可以增加细菌组分的细胞摄取。这些细菌源性脂质组合物可以与一种或多种异源功能剂，如多核苷酸一起调配，并且可以用作这些异源功能剂(例如，多核苷酸)的递送媒剂。
细菌组分
细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质。
细菌组分可以具有脂质结构(例如，脂质双层、单层或多层结构)，其包含细菌胞外囊泡(EV)或其区段、部分或提取物(例如，脂质提取物)。
细菌组分包括分离的细菌胞外囊泡。细菌EV是指天然存在于细菌中的封闭脂质双层结构。细菌EV源自包括细菌脂质的细菌，并且还可以包括纳米颗粒中所含的细菌蛋白质和/或细菌核酸和/或碳水化合物部分。细菌EV可以含有1种、2种、3种、4种、5种、10种或多于10种不同的脂质物种。
如本文所使用的，术语“细菌”广义地是指原核生物体，包含革兰氏阳性和革兰氏阴性生物体的结构域。合适的细菌来源包含埃希氏杆菌属、不动杆菌属、农杆菌属、项圈藻属、产水菌属、固氮弧菌属、固氮菌属、博代氏杆菌属、慢生根瘤菌属、布鲁氏菌属、布赫纳氏菌属、伯克氏菌属、韧皮部杆菌属、色杆菌属、鳄球藻属、脱氯单胞菌属、脱亚硫酸菌属、脱硫小杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、粘杆菌属、葡糖杆菌属、螺杆菌属、军团菌属、磁螺菌属、中慢生根瘤菌属、甲基球菌属、奈瑟氏菌属、亚硝化单胞菌属、念珠藻属、发光杆菌属、光杆状菌属、单胞菌属、原绿球藻属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、罗尔斯通菌属、红长命菌属、沙门氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、中华根瘤菌属、聚球藻属、集胞藻属、热粘球菌属、热袍菌属、栖热菌属、硫杆菌属、束毛藻属、弧菌属、魏格沃斯菌属、沃廉菌属、黄单胞菌属、木杆菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、异常球菌属、微小杆菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌属、穆尔氏菌属、大洋芽胞杆菌属、共生菌属和热厌氧杆菌属。
在一个实施例中，所述细菌来源是埃希氏杆菌属(例如，大肠杆菌)。在一个实施例中，所述细菌来源是沙门氏菌(例如，鼠伤寒沙门氏菌)。
在一些实施例中，细菌来源属于放线菌门(Actinobacteria)或变形菌门(Proteobacteria)，如伯克氏菌科(Burkholderiaceae)、黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、微杆菌科(Microbacteriaceae)和根瘤菌科(Rhizobiaceae)家族。
在一些实施例中，细菌来源是农杆菌(Agrobacterium spp.)、中华根瘤菌(Sinorhizobium sp.(＝剑菌(Ensifer sp.))、中慢生根瘤菌(Mesorhizobium,sp.)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium sp.)、固氮菌(Azobacter sp.)、叶瘤杆菌(Phyllobacter sp.)、中华根瘤菌(＝剑菌)、中慢生根瘤菌、固氮根瘤菌(Azorhizobium sp.)、慢生根瘤菌或根瘤菌(Rhizobium sp.)。
在一些实施例中，细菌来源是燕麦食酸菌亚种(Acidovorax avenae subsp.)、伯克氏菌(Burkholderia spp.)、韧皮部杆菌(Liberibacter spp.)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)、欧文氏菌(Erwinia spp.)、丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae subsp.)、链霉菌(Streptomyces spp.)、地毯草黄单胞菌亚种(Xanthomonasaxonopodis subsp.)、野油菜黄单胞菌香蕉致病变种(Xanthomonas campestrispv.musacearum)、野油菜黄单胞菌桃李致病变种(Xanthomonas campestris pv.Pruni((＝树生黄单胞杆菌桃李致病变种(Xanthomonas arboricola pv.pruni))、草莓黄单胞菌(Xanthomonas fragariae.)、半透明黄单胞菌亚种(Xanthomonas translucens supsp.(＝野油菜黄单胞菌大麦致病变种(Xanthomonas campestris pv.hordei))、稻黄单胞菌亚种(Xanthomonas oryzae supsp.)、稻黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzae(＝野油菜黄单胞菌水稻致病变种(Xanthomonas campestrispv.oryzae)或稻黄单胞菌条斑病致病变种(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola(＝野油菜黄单胞菌条斑病致病变种(Xanthomonas campestris pv.oryzicola))。
可以使用的细菌物种和/或菌株的另外实例包含美国专利申请公开第2020/0254028号的表1-2中列出的细菌物种和/或菌株，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
细菌组分可以包含细菌EV或其区段、部分或提取物。在一些实施例中，细菌EV的直径为约5-1000nm。例如，细菌组分可以包含平均直径为以下的细菌EV、或其区段、部分或提取物：约5-50nm、约50-100nm、约100-150nm、约150-200nm、约200-250nm、约250-300nm、约300-350nm、约350-400nm、约400-450nm、约450-500nm、约500-550nm、约550-600nm、约600-650nm、约650-700nm、约700-750nm、约750-800nm、约800-850nm、约850-900nm、约900-950nm、约950-1000nm、约1000-1250nm、约1250-1500nm、约1500-1750nm或约1750-2000nm。例如，细菌组分可以包含平均直径为以下的细菌EV、或其区段、部分或提取物：约5-950nm、约5-900nm、约5-850nm、约5-800nm、约5-750nm、约5-700nm、约5-650nm、约5-600nm、约5-550nm、约5-500nm、约5-450nm、约5-400nm、约5-350nm、约5-300nm、约5-250nm、约5-200nm、约5-150nm、约5-100nm、约5-50nm或约5-25nm。在某些情况下，细菌组分可以包含平均直径为以下的细菌EV、或其区段、部分或提取物：约50-200nm、约50-300nm、约200-500nm或约30-150nm。可以使用本领域中的多种标准方法(例如，动态光散射方法)来测量细菌EV或其区段、部分或提取物的颗粒直径。
在一些情况下，细菌组分可以包含平均表面积为至少77nm2(例如，至少77nm2、至少100nm2、至少1000nm2、至少1x 104nm2、至少1x 105nm2、至少1x 106nm2或至少2x 106nm2)的细菌EV或其区段、部分或提取物。在一些情况下，细菌组分可以包含平均表面积为77nm2至3.2x 106nm2(例如，77-100nm2、100-1000nm2、1000-1x 104nm2、1x 104-1x 105nm2、1x 105-1x106nm2或1x 106-3.2x 106nm2)的细菌EV或其区段、部分或提取物。
在一些情况下，细菌组分可以包含平均体积为至少65nm3(例如，至少65nm3、至少100nm3、至少1000nm3、至少1x 104nm3、至少1x 105nm3、至少1x 106nm3、至少1x 107nm3、至少1x 108nm3、至少2x 108nm3、至少3x 108nm3、至少4x 108nm3或至少5x 108nm3)的细菌EV或其区段、部分或提取物。在一些情况下，细菌组分可以包含平均体积为至少65nm3至5.3x108nm3(例如，65-100nm3、100-1000nm3、1000-1x 104nm3、1x 104-1x 105nm3、1x 105-1x106nm3、1x 106-1x 107nm3、1x 107-1x 108nm3、1x108-5.3x 108nm3)的细菌EV或其区段、部分或提取物。
在一些情况下，细菌组分可以包含完整的细菌EV。可替代地，细菌组分可以包含细菌EV的囊泡的全表面积的区段、部分或提取物(例如，包含囊泡的全表面积的小于100％(例如，小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于10％、小于5％或小于1％)的区段、部分或提取物)。区段、部分或提取物可以具有任何形状，如周向区段、球形区段(例如，半球形)、曲线区段、直线区段或扁平区段。在区段为囊泡的球形区段的情况下，球形区段可以表示沿一对平行线分裂球形囊泡产生的球形区段，或者沿一对非平行线分裂球形囊泡产生的球形区段。因此，细菌组分可以包含多个完整的细菌EV、多个细菌EV区段、部分或提取物，或者完整的EV和区段的混合物。本领域技术人员将了解，完整与分割的细菌EV的比率将取决于所使用的特定分离方法。例如，与非破坏性提取方法，如真空渗透相比，将细菌或其部分研磨或共混可以产生含有更高百分比的细菌EV区段、部分或提取物的细菌组分。
在细菌组分包含细菌EV的区段、部分或提取物的情况下，EV区段、部分或提取物的平均表面积可以小于完整囊泡的平均表面积，例如，平均表面积小于77nm2、100nm2、1000nm2、1x 104nm2、1x 105nm2、1x 106nm2或3.2x 106nm2)。在一些情况下，细菌组分可以包含平均体积小于完整囊泡的平均体积的细菌EV、或其区段、部分或提取物，例如，平均体积小于65nm3、100nm3、1000nm3、1x 104nm3、1x 105nm3、1x 106nm3、1x 107nm3、1x 108nm3或5.3x108nm3)。
细菌组分包含从细菌来源提取的一种或多种脂质。在一些实施例中，细菌组分可以包含至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或大于99％的从细菌来源提取的脂质。细菌组分可以包含细菌EV区段和/或所提取的脂质或其混合物。
细菌组分的产生
细菌组分可以由天然存在于细菌中的细菌EV或其区段、部分或提取物(例如，脂质提取物)产生。一种用于产生细菌组分的示例性方法包含(a)提供来自细菌的初始样品；以及(b)从初始样品中分离粗细菌级分，其中相对于初始样品中的水平，所述粗细菌级分的来自细菌的至少一种污染物或不期望的组分的水平降低。所述方法可以进一步包含另外的步骤(c)，所述步骤包括纯化粗细菌级分，由此产生纯细菌组分，相对于粗EV级分中的水平，所述纯细菌组分的来自细菌的至少一种污染物或不期望的组分的水平降低。
在一些情况下，可以通过包含以下步骤的方法从细菌来源中分离细菌组分：(a)提供来自细菌的初始样品；(b)从所述初始样品中分离粗细菌级分，其中相对于初始样品中的水平，所述粗细菌级分的来自细菌的至少一种污染物或不期望组分的水平降低(例如，水平降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％或100％)；以及(c)纯化粗细菌级分，由此产生纯细菌组分，相对于所述粗EV级分中的水平，所述纯细菌组分的来自细菌的至少一种污染物或不期望组分的水平降低(例如，水平降低至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、98％、99％或100％的水平)。
细菌组分(例如，细菌脂质)可以通过全细胞提取产生。例如，细胞首先被破坏，并且然后胞内和细胞膜/细胞壁相关的脂质以及胞外烃可以与细胞质量分离，如通过使用离心。在一些实施例中，在使细菌的细胞溶解之后提取细菌中产生的胞内脂质。提取细菌脂质的另外方法可以在美国专利第8,592,188号中找到，所述美国专利通过引用整体并入本文。
细菌组分可以通过多种方法由细菌来源产生。例如，细菌EV可以通过破坏性(例如，细菌的研磨或共混)或非破坏性(细菌的洗涤或真空渗透)方法与细菌分离。例如，细菌可以是真空渗透的、经研磨的、共混的或其组合，以从细菌中分离EV。例如，分离步骤可以涉及(例如，用囊泡分离缓冲液)真空渗透细菌。可替代地，分离步骤可以涉及将细菌研磨或共混以释放EV。
在分离细菌EV时，细菌组分可以分离或收集成粗细菌级分(例如，质外体级分)。例如，分离步骤可以涉及使用离心(例如，差速离心或超速离心)和/或过滤将细菌组分分离成粗细菌级分，以将含细菌的级分与包含细菌组织碎片或细胞的大污染物分离。如此，如与来自细菌的初始样品相比，粗细菌级分的大污染物数量将减少。取决于所使用的方法，如与来自细菌的初始样品相比，粗细菌级分可以另外地包括降低的水平的细菌细胞器。
在一些情况下，分离步骤可以涉及离心(例如，差速离心或超离心)和/或过滤。
粗细菌级分可以通过另外的纯化方法进一步纯化。例如，粗细菌级分可以通过超速离心，例如使用密度梯度(碘克沙醇(iodixanol)或蔗糖)和/或使用去除经聚集的组分的其它方法(例如，沉淀或尺寸排阻色谱)来纯化。相对于在早期分离步骤期间产生的一个或多个级分，或相对于预先确立的阈值水平，例如商业释放规格，所得纯细菌组分的来自细菌来源的污染物或其它不期望的组分(例如，蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体，游离脂蛋白、脂蛋白结构、细胞核、细胞壁组分、细胞器或其组合)的水平可以降低。例如，相对于初始样品中的水平，纯细菌组分的水平可以降低(例如，降低约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％或降低约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍或超过100x倍)，或者基本上不含污染物或其它不期望的组分(例如，蛋白质聚集体、核酸聚集体、蛋白质-核酸聚集体，游离脂蛋白、脂蛋白结构、细胞核、细胞壁组分、细胞器或其组合)。
例如，可以从细菌组分中去除蛋白质聚集体。例如，细菌组分可以通过一定范围的pH(例如，如使用pH探针测量)取出以沉淀出溶液中的蛋白质聚集体。可以通过添加例如氢氧化钠或盐酸将pH调节至例如pH 3、pH 5、pH 7、pH 9或pH 11。一旦溶液处于指定pH下，就可以过滤以去除微粒。可替代地，细菌组分可以通过添加带电聚合物，如Polymin-P或Praestol 2640进行絮凝。简单来说，将Polymin-P或Praestol 2640添加到溶液中并且用叶轮混合。然后可以过滤溶液以去除微粒。可替代地，可以通过增加盐浓度来溶解聚集体。例如，可以将NaCl添加到细菌组分中，直到其达到例如1mol/L。然后可以过滤溶液以分离细菌组分。可替代地，通过提高温度来溶解聚集体。例如，可以在混合的情况下加热细菌组分，直至溶液达到例如50℃的均匀的温度，持续5分钟。然后可以过滤细菌组分混合物。可替代地，根据标准程序，可以通过排阻色谱柱从细菌组分溶液中分离可溶性污染物，其中细菌脂质在第一级分中洗脱，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率可以通过BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较去除蛋白质聚集体前后的蛋白质浓度来确定。
可替代地，从细菌来源提取的细菌脂质可以从可商购获得的来源获得。
本文所描述的产生方法中的任一种可以补充有本领域中已知的任何定量或定性方法，以在产生过程的任何步骤中表征或鉴定细菌组分(例如，从细菌来源提取的细菌脂质)。例如，细菌组分(例如，从细菌来源提取的细菌脂质)可以通过多种分析方法来表征，以估计产率、浓度、纯度、组成或大小，通过本领域已知的能够进行可视化、定量或定性表征(例如，组成的鉴定)的多种方法，如显微镜(例如，透射电子显微镜)、动态光散射、纳米颗粒跟踪、光谱法(例如，傅立叶变换红外分析(Fouriertransforminfrared analysis))或质谱法(蛋白质和脂质分析)来表征。
在产生过程期间，可以任选地制备细菌组分(例如，从细菌来源提取的细菌脂质)以使得细菌组分的浓度相对于对照或初始样品中的水平增加(例如，增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％；或者增加约2x倍、4x倍、5x倍、10x倍、20x倍、25x倍、50x倍、75x倍、100x倍或超过100x倍)。细菌组分可以占细菌源性脂质组合物的约0.1％至约100％，例如，约0.01％至约100％、约1％至约99.9％、约0.1％至约10％、约1％至约25％、约10％至约50％、约50％至约99％或约75％至约100％。
细菌源性脂质组合物-细菌组分的脂质修饰
细菌源性脂质组合物包括(a)细菌组分；以及(b)可电离脂质。可电离脂质和/或其它外源性脂质用于修饰细菌组分。
修饰是指修饰含有源自细菌来源(例如，从细菌来源富集、分离或纯化)的脂质结构(例如，脂质双层、单层、多层结构；例如，囊泡脂质结构)的细菌组分，其中所述脂质结构被破坏(例如，被脂质提取破坏)，并使用标准方法在液相(例如，含有货物的液相)中重新组装或重构，例如，通过包括脂质膜水合和/或溶剂注射的方法重构，以产生细菌源性脂质组合物，如本文所描述的。在一些实施例中，所述细菌组分是通过在存在所述可电离脂质的情况下重构包括所述细菌组分的膜来修饰的。
在一些实施例中，所述细菌组分是通过用所述可电离脂质重构包括所述细菌组分的经纯化的细菌脂质的膜来修饰的。
可替代地，细菌源性脂质组合物可以使用微流体装置(如IGNITETM微流体仪器(精密纳米系统有限公司))产生。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物是通过包括以下步骤的过程产生的：(a)提供细菌组分(例如，如上文所描述的纯化的细菌组分)；(b)处理细菌组分以产生脂质膜；(c)在有机溶剂或溶剂组合中重构脂质膜，由此产生脂质溶液；以及(d)在存在可电离脂质的情况下，在包括水相的微流体装置中处理步骤(c)的脂质溶液，由此产生细菌源性脂质组合物。
在一些情况下，处理细菌组分以产生脂质膜包含使用Bligh-Dyer方法提取脂质(Bligh和Dyer,《生物化学与生理学杂志(JBiolchem Physiol)》,37:911-917,1959)，所述文献方法通过引用整体并入本文。所提取的脂质可以作为储备溶液，例如氯仿:甲醇溶液提供。产生脂质膜可以包括例如用惰性气体(例如，氮气)流蒸发溶剂。
如果需要，所述方法可以进一步包括超声处理、冷冻/解冻处理和/或脂质挤出，例如，以减小重构的细菌源性脂质组合物的大小。
细菌脂质
细菌源性脂质组合物可以包括10％至100％源自来自细菌来源的脂质结构的脂质，例如，其可以含有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％源自来自细菌来源的脂质结构(例如，大肠杆菌)的脂质。细菌源性脂质组合物可以包括存在于来自细菌源性脂质组合物(例如，大肠杆菌)的脂质结构中的全部或一部分脂质物种，例如，其可以含有至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％存在于来自细菌来源的脂质结构中的脂质物种。细菌源性脂质组合物可以不包括、可以包括一部分或全部存在于来自细菌来源的脂质结构中的蛋白质物种，例如，其可以含有0％、小于1％、小于5％、小于10％、小于15％、小于20％、小于30％、小于40％、小于50％、小于60％、小于70％、小于80％、小于90％、小于100％或100％存在于来自细菌来源的脂质结构中的蛋白质物种。在一些情况下，细菌源性脂质组合物的脂质双层不含蛋白质。在一些情况下，相对于来自细菌来源的脂质结构，细菌源性脂质组合物的脂质结构含有减少量的蛋白质。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物的细菌脂质从埃希氏杆菌属(例如，大肠杆菌)或沙门氏菌属(例如，鼠伤寒沙门氏菌)中提取。
外源性脂质
细菌组分可以被修饰以含有异源药剂(例如，细胞穿透剂)，所述异源药剂能够相对于未经修饰的细菌组分增加细胞摄取(例如，动物细胞摄取(例如，哺乳动物细胞摄取，例如，人类细胞摄取)、植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)。例如，经修饰的细菌组分可以包含细胞渗透剂(例如，用所述细胞渗透剂装载，例如，包封所述细胞渗透剂或与所述细胞渗透剂缀合)或与所述细胞渗透剂(例如，悬浮或重悬于包括所述细胞渗透剂的溶液中)，如可电离脂质一起调配。经修饰的细菌组分中的每一个可以包括至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％的可电离脂质。
细菌源性脂质组合物可以包含一种或多种外源性脂质，例如，对细菌是外源性的脂质(例如，来源于不是产生细菌组分的细菌的来源)。细菌源性脂质组合物的脂质组合物可以包含0％、小于1％、或至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、或超过95％的外源性脂质。在一些实例中，外源性脂质(例如，可电离脂质)的添加量为制剂中的总脂质的25％或40％(w/w)。在一些实例中，外源性脂质在步骤(b)之前添加到制剂中，例如在步骤(b)之前与所提取的细菌脂质混合。
示例性外源性脂质包含可电离脂质。
外源性脂质还可以包含阳离子脂质。
在一些情况下，外源性脂质可以是可电离脂质或阳离子脂质，其选自1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、DLin-MC3-DMA(MC3)、二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DODAP)、DC-胆固醇、DOTAP、乙基PC、GL67、DLin-KC2-DMA(KC2)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(莫德纳公司(Moderna))、阳离子磺酰胺氨基脂质、两亲性两性离子氨基脂质、DODAC、DOBAQ、YSK05、DOBAT、DOBAQ、DOPAT、DOMPAQ、DOAAQ、DMAP-BLP、DLinDMA、DODMA、DOTMA、DSDMA、DOSPA、DODAC、DOBAQ、DMRIE、DOTAP-胆固醇、GL67A和98N12-5以及其组合。
在一些实施例中，外源性脂质可以是选自C12-200、MC3、DODAP、DC-胆固醇、DOTAP、乙基PC、GL67、KC2、MD1、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(莫德纳公司)、阳离子磺酰胺氨基脂质和两亲性两性离子氨基脂质以及其组合的可电离脂质或阳离子脂质。在一些实施例中，可电离脂质选自C12-200、MC3、DODAP和DC-胆固醇或其组合。在一些情况下，可电离脂质是可电离脂质。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)或4-(二甲氨基)丁酸(6Z,9Z,28Z,31Z)-三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯、DLin-MC3-DMA(MC3)。在某些情况下，外源性脂质是阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是DC-胆固醇或二油酰基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％的可电离脂质。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括至少0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或超过90％的可电离脂质，例如，1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的可电离脂质，例如约30％-75％的可电离脂质(例如，约30％-75％的可电离脂质)，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括25％C12-200，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括35％C12-200，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括50％C12-200，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括40％MC3，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括50％C12-200，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括20％或40％DC-胆固醇，以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括25％或40％DOTAP，以mol％为单位。
药剂可以增加细菌源性脂质组合物作为整体的摄取，或者可以增加由细菌源性脂质组合物携带的细菌源性脂质组合物的一部分或组分(例如，异源功能剂)的摄取。细胞摄取增加的程度可以根据递送组合物的细菌、细菌源性脂质组合物以及对细菌源性脂质组合物进行的其它修饰而变化。例如，相对于未经修饰的细菌组分，细菌源性脂质组合物的细胞摄取(例如，动物细胞摄取、植物细胞摄取、细菌细胞摄取或真菌细胞摄取)可以增加至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在一些情况下，增加的细胞摄取是未经修饰的细菌组分的增加的细胞摄取的至少2倍、4倍、5倍、10倍、100倍或1000倍。
在一些实施例中，与尚未用可电离脂质修饰的细菌源性脂质组合物相比，已经用可电离脂质修饰的细菌源性脂质组合物更高效地包封带负电荷的多核苷酸。在一些方面中，相对于尚未用可电离脂质修饰的细菌源性脂质组合物，已经用可电离脂质修饰的细菌源性脂质组合物的生物分布有所改变。在一些方面中，相对于尚未用可电离脂质修饰的细菌源性脂质组合物，已经用可电离脂质修饰的细菌源性脂质组合物改变(例如，增加)与靶细胞的内体膜的融合。
可电离脂质
在一些实施例中，可电离脂质具有以下列出的特性中的至少一种(例如，一种、两种、三种、四种或全部五种)：
(i)至少2个可电离胺(例如，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或多于6个可电离胺，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个可电离胺)；
(ii)至少3个脂质尾部(例如，至少3个、至少4个、至少5个、至少6个或多于6个脂质尾部，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个或多于12个脂质尾部)，其中脂质尾部中的每一个的长度独立地为至少6个碳原子(例如，长度为至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个或多于18个碳原子，例如长度为6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或多于25个碳原子)；
(iii)约4.5至约7.5的酸解离常数(pKa)(例如，pKa为约4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5(例如，pKa为约6.5至约7.5(例如，pKa为约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5))；
(iv)可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P(可电离脂质的胺:mRNA的磷酸盐)比率。
在一些实施例中，BacLC的N/P比率为约12至约17，例如N/P比率为约15±1，或N/P比率为约15±0.5。在一些实施例中，N/P比率为约15。可替代地，可电离脂质的特征在于N/P比率为约3至约10，例如N/P比率为约6±1，或者N/P比率为约为6±0.5。在一些实施例中，N/P比率为约6。
在一些实施例中，所述可电离脂质不是选自由以下组成的组：1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5(莫德纳公司)和98N12-5。
在一些实施例中，所述可电离脂质选自由以下组成的组：1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315。
在一些实施例中，所述可电离脂质是可电离胺和杂有机基团。在一些实施例中，杂有机基团是羟基。在一些实施例中，杂有机基团包括氢键供体。在一些实施例中，杂有机基团包括氢键受体。在一些实施例中，杂有机基团是-OH、-SH、-(CO)H、-CO2H、-NH2、-CONH2、任选地经取代的C1-C6烷氧基或氟。
在一些实施例中，可电离脂质是可电离胺和由至少两个原子的链分离的杂有机基团。
在一些实施例中，可电离脂质由下式I表示：
其中R是C8-C14烷基。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物的脂质膜包括至少35％的式I脂质，例如式I脂质的至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或超过90％，例如式Ⅰ脂质的35％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％的可电离脂质。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括至少0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或超过90％的可电离脂质，例如，1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％的可电离脂质，例如约25％-75％的可电离脂质(例如，约25％-75％的可电离脂质)，均以mol％为单位。
本文所描述的可电离脂质可以包含本文所描述的用一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个、5个或6个)脂质尾部取代的胺核心。在一些实施例中，本文所描述的可电离脂质包含至少3个脂质尾部。脂质尾部可以是C8-C18烃(例如，C6-C18烷基或C6-C18烷酰基)。胺核心可以在氮原子处被一个或多个脂质尾部取代(例如，连接到氮原子的一个氢原子可以被脂质尾部置换)。
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
在一些实施例中，胺核心具有以下结构：
细菌源性脂质组合物可以进一步含有阳离子脂质。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2016/118725中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2016/118724中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含式为14,25-十八烷基15,18,21,24-四氮杂-十八烷的脂质以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2013/063468和WO 2016/205691中所描述的脂质，所述国际专利公开中的每个国际专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐，其中RL的每个实例独立地是任选地经取代的C6-C40烯基。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2015/184256中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐，其中每个X独立地是O或S；每个Y独立地是O或S；每个m独立地是0至20；每个n独立地是1至6；每个RA独立地是氢、任选地经取代的C1-50烷基、任选地经取代的C2-50烯基、任选地经取代的C2-50炔基、任选地经取代的C3-10碳环基、任选地经取代的3-14元杂环基、任选地经取代的C6-14芳基、任选地经取代的5-14元杂芳基或卤素；并且每个RB独立地是氢、任选地经取代的C1-50烷基、任选地经取代的C2-50烯基、任选地经取代的C2-50炔基、任选地经取代的C3-10碳环基、任选地经取代的3-14元杂环基、任选地经取代的C6-14芳基、任选地经取代的5-14元杂芳基或卤素。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质“靶标23”：
(靶标23)以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2016/004202中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
或其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如美国临时专利申请序列号62/758,179中所描述的脂质，所述美国临时专利申请通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐，其中每个R1和R2独立地是H或C1-C6脂肪族；每个m独立地是具有1至4的值的整数；每个A独立地是共价键或亚芳基；每个L1独立地是酯、硫酯、二硫化物或酸酐基团；每个L2独立地是C2-C10脂肪族；每个X1独立地是H或OH；并且每个R3独立地是C6-C20脂肪族。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如J.McClellan,M.C.King,《细胞(Cell)》2010,141,210-217和Whitehead等人,《自然通讯(Nature Communications)》(2014)5:4277中所描述的脂质，所述文献通过引用整体并入本文。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物的脂质和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2015/199952中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2017/004143中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2017/075531中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下式的脂质：
或其药学上可接受的盐，其中L1或L2中的一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-；并且L1或L2中的另一个是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-或直接键；G1和G2各自独立地是未经取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；Ra是H或C1-C12烷基；R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；R4是C1-C12烷基；R5是H或C1-C6烷基；并且x是0、1或2。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2017/117528中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2017/049245中所描述的脂质，所述国际专利公开通过引用整体并入本文。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物的脂质和其制备和使用方法包含具有以下式之一的化合物：
以及其药学上可接受的盐。对于这四个式中的任一者，R4独立地选自-(CH2)nQ和-(CH2)nCHQR；Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH2)nN(R)2、-OC(O)R、-CX3、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)2R、-N(H)S(O)2R、-N(R)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(R)2、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(R)2、-N(H)C(S)N(H)(R)和杂环；并且n是1、2或3。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
用于细菌源性脂质组合物的其它合适的脂质和其制备和使用方法包含如国际专利公开WO 2017/173054和WO 2015/095340中所描述的脂质，所述国际专利公开中的每个国际专利公开通过引用整体并入本文。在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在某些实施例中，细菌源性脂质组合物和其制备和使用方法包含具有以下的化合物结构的脂质：
以及其药学上可接受的盐。
在一些实施例中，本文所描述的细菌源性脂质组合物可以包含如以下中所描述的可电离脂质，可以如以下中所描述的调配，或可以包括或由如以下中所描述的组合物组成，其中的每一者通过引用整体并入本文：WO2016118724、WO2016118725、WO2016187531、WO2017176974、WO2018078053、WO2019027999、WO2019036030、WO2019089828、WO2019099501、WO2020072605、WO2020081938、WO2020118041、WO2020146805或WO2020219876。
其它脂质和其它药剂
外源性脂质可以是细胞穿透剂，可以能够增加细菌源性脂质组合物向细胞递送多肽和/或可以能够增加多肽的装载(例如，装载效率或装载能力)。另外的示例性外源性脂质包含固醇和PEG化脂质。
细菌源性脂质组合物可以包含其它组分(例如，脂质，例如，固醇，例如，胆固醇；或小分子)以进一步改变细菌源性脂质组合物的功能和结构特性。例如，细菌源性脂质组合物可以进一步包含增加细菌源性脂质组合物的稳定性的稳定分子(例如，在室温下稳定至少一天，和/或在4℃下稳定至少一周)。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物进一步包含固醇，例如谷固醇、二氢谷甾醇、β-谷甾醇、7α-羟基胆固醇、孕烯醇酮、胆固醇(例如，绵羊胆固醇或从植物中分离的胆固醇)、豆甾醇、菜油甾醇、岩藻甾醇或任何甾醇的类似物(例如糖苷、酯或肽)。在一些实例中，外源性固醇在步骤(b)之前添加到制剂中，例如在步骤(b)之前与所提取的细菌脂质混合。外源性固醇的添加量可以为例如制剂中的总脂质和固醇的1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或超过90％(w/w)。
在一些实施例中，所述固醇是胆固醇或谷甾醇。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括摩尔比为至少1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或超过60％的固醇(例如，胆固醇或谷甾醇)，例如，1％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％或50％-60％的固醇。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35％-50％的固醇(例如，胆固醇或谷甾醇)，例如，约36％、38.5％、42.5％或46.5％的固醇。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约20％-40％的固醇。
在一些实施例中，相对于尚未用固醇修饰的细菌源性脂质组合物，已经用固醇修饰的细菌源性脂质组合物的稳定性改变(例如，稳定性增加)。在一些方面中，相对于尚未用固醇修饰的细菌源性脂质组合物，已经用固醇修饰的细菌源性脂质组合物与靶细胞的膜的融合率更高。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括外源性脂质和外源性固醇。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物进一步包含PEG化脂质。聚乙二醇(PEG)长度可以在1kDa与10kDa之间变化；在一些方面中，PEG的长度为2kDa。在一些实施例中，PEG化脂质是C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包括至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.1％、2.2％、2.3％、2.4％、2.5％、2.6％、2.7％、2.8％、2.9％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％或超过50％的PEG化脂质(例如，C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k)，例如，0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-1.5％、1.5％-2.5％、2.5％-3.5％、3.5％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％或30％-50％的PEG化脂质，均以mol％为单位。在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括约0.1％-10％的PEG化脂质(例如，C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k)，例如，约1％-3％的PEG化脂质，例如约1.5％或约2.5％的PEG化脂质，均以mol％为单位。
在一些实施例中，相对于尚未用PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物，已经用PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物的稳定性改变(例如，稳定性增加)。在一些实施例中，相对于尚未用PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物，已经用PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物的粒径改变。在一些实施例中，与尚未用PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物相比，已经用PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物不太可能被吞噬。PEG化脂质的添加还可以影响GI道中的稳定性并且增强颗粒穿过粘液的迁移。PEG可以用作连接靶向部分的方法。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括可电离脂质(例如，C12-200或MC3)和固醇(例如，胆固醇或谷甾醇)和PEG化脂质(例如，C14-PEG2k、C18-PEG2k或DMPE-PEG2k)中的一者或两者。在实施例中，细菌源性脂质组合物包括约5％-50％的细菌源性脂质组合物(例如，约10％-20％的细菌源性脂质，例如，约10％、12.5％、16％或20％的细菌源性脂质)；约30％-75％的可电离脂质(例如，约35％或约50％的可电离脂质)；约35％-50％的固醇(例如，约36％、38.5％、42.5％或46.5％的固醇)；以及约0.1％-10％的PEG化脂质(例如，约1％-3％的PEG化脂质，例如，约1.5％或约2.5％的PEG化脂质)，均以mol％为单位。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约5％-60％的细菌源性脂质(例如，约10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％或50％-60％的细菌源性脂质，例如，约10％、12.5％、16％、20％、30％、40％、50％或60％的细菌源性脂质)；约25％-75％的可电离脂质(例如，约35％或约50％的可电离脂质)；约10％-50％的固醇(例如，约10％、12.5％、14％、16％、18％、20％、36％、38.5％、42.5％或46.5％的固醇)；以及约0.1％-10％的PEG化脂质(例如，约0.5％-5％的PEG化脂质，例如，约1％-3％的PEG化脂质或约1.5％或约2.5％的PEG化脂质)。
在一些实施例中，可电离脂质、细菌源性脂质、固醇和PEG化脂质分别占细菌源性脂质组合物中的脂质的约25％-75％、约20％-60％、约10％-45％和约0.5％-5％。
在一些实施例中，可电离脂质、细菌源性脂质、固醇和PEG化脂质分别占细菌源性脂质组合物中的脂质的约30％-75％、约20％-50％、约10％-45％和约1％-5％。
在一些实施例中，可电离脂质、细菌源性脂质、固醇和PEG化脂质分别占细菌源性脂质组合物中的脂质的约35％-75％、约20％-50％、约10％-45％和约1％-5％。
在一些实施例中，可电离脂质、细菌源性脂质、固醇和PEG化脂质以约35:50:12.5:2.5的摩尔比调配。
在一些实施例中，可电离脂质、细菌源性脂质、固醇和PEG化脂质以约35:50:11.5:3.5的摩尔比调配。
在一些实施例中，可电离脂质、细菌源性脂质、固醇和PEG化脂质以约35:20:42.5:2.5的摩尔比调配。
在一些实施例中，与尚未用可电离脂质(和/或阳离子脂质)和固醇和/或PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物相比，已经用可电离脂质(和/或阳离子脂质)和固醇和/或PEG化脂质修饰的细菌源性脂质组合物更高效地包封带负电荷的货物(例如，核酸)。细菌源性脂质组合物对货物(例如，异源功能剂，如核酸，例如RNA或DNA)的包封效率可以为至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％或大于99％，例如其包封效率可以为5％-30％、30％-50％、50％-70％、70％-80％、80％-90％、90％-95％或95％-100％。
细菌源性脂质组合物的细胞摄取可以通过本领域已知的各种方法来测量。例如，细菌源性脂质组合物或其组分可以用标志物(例如，荧光标志物)标记，所述标志物可以在分离的细胞中检测以确认摄取。
在一些实施例中，本文所提供的细菌源性脂质组合物包括两种或更多种不同的细菌组分，例如源自两种或更多种不同的细菌来源的细菌组分。在一些实施例中，本文所提供的细菌源性脂质组合物包括两种或更多种不同类型的修饰，例如，不同类型和/或比率的可电离脂质、固醇和/或PEG化脂质。
在一些情况下，脂质膜溶解于其中的有机溶剂是二甲基甲酰胺:甲醇(DMF:MeOH)。可替代地，有机溶剂或溶剂组合可以是例如乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1-丁醇、二甲基亚砜、乙腈:乙醇、乙腈:甲醇、丙酮:甲醇、甲基叔丁基醚:丙醇、四氢呋喃:甲醇、二甲亚砜:甲醇或二甲基甲酰胺:甲醇。
水相可以是任何合适的溶液，例如柠檬酸盐缓冲液(例如，pH为约3.2的柠檬酸盐缓冲液)、水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。水相可以进一步包括异源功能剂(例如，农业剂或治疗剂)或小分子。
脂质溶液和水相可以任何合适的比率在微流体装置中混合。在一些实例中，水相和脂质溶液以3:1的体积比混合。
细菌源性脂质组合物可以任选地包含另外的药剂，例如细胞穿透剂、治疗剂、多核苷酸、多肽或小分子。细菌源性脂质组合物可以多种方式携带另外的药剂或与其缔合，以使异源功能剂能够递送到靶细胞，例如，通过包封异源功能剂、将异源功能剂并入在脂质双层结构中或将异源功能剂与脂质双层结构的表面缔合(例如，通过缀合)。异源功能剂可以在体内或体外(例如，在组织培养、细胞培养或合成并入中)并入到细菌源性脂质组合物中。
ζ电位
包括可电离脂质(例如，C12-200或MC3)和任选地阳离子脂质(例如，DC-胆固醇或DOTAP)的细菌源性脂质组合物在没有货物的情况下的ζ电位可以例如大于-30mV，在没有货物的情况下的ζ电位可以大于-20mV、大于-5mV、大于0mV或约30mv。在一些实例中，细菌源性脂质组合物在没有货物的情况下可以具有负ζ电位，例如ζ电位小于0mV、小于-10mV、小于-20mV、小于-30mV、小于-40mV或小于-50mV。在一些实例中，细菌源性脂质组合物在没有货物的情况下可以具有正ζ电位，例如ζ电位大于0mV、大于10mV、大于20mV、大于30mV、大于40mV或大于50mV。在一些实例中，细菌源性脂质组合物的ζ电位为约0。
细菌源性脂质组合物的ζ电位可以使用本领域已知的任何方法进行测量。ζ电位通常是间接测量的，例如，使用理论模型根据使用本领域中已知的方法和技术，例如电泳迁移率或动态电泳迁移率获得的数据进行计算。电泳迁移率通常使用微电泳、电泳光散射或可调电阻脉冲感测来测量。电泳光散射是基于动态光散射。通常，可通过动态光散射(DLS)测量，也称为光子相关光谱法或准弹性光散射获得ζ电位。
细菌EV-标志物
细菌源性脂质组合物中的细菌组分(例如，细菌脂质)和其制备和使用方法可以具有一系列标志物，其将细菌组分鉴定为正在产生。如本文所使用的，术语“细菌EV-标志物”是指与细菌EV天然缔合并且并入到细菌EV中或其上的组分，如细菌蛋白、细菌核酸、细菌小分子、细菌脂质或其组合。
药剂的装载
细菌源性脂质组合物可以包含异源功能剂，例如细胞穿透剂和/或异源农业剂(例如，杀虫剂、施肥剂、除草剂、植物改良剂)、异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗菌剂、杀毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或昆虫驱除剂)，如本文所描述的那些。
细菌源性脂质组合物可以通过多种方式携带此类药剂或与此类药剂缔合，以使药剂能够递送到靶生物体(例如，靶动物、植物、细菌或真菌)，例如，通过包封药剂、将药剂并入在脂质双层结构中或将药剂与细菌源性脂质组合物的脂质双层结构的表面缔合(例如，通过缀合)。在一些情况下，异源功能剂(例如，细胞穿透剂)包含在由细菌源性脂质组合物调配物制成的调配物中，如本文所描述的。
异源功能剂可以通过本领域已知的允许细菌源性脂质组合物与药剂之间的直接或间接缔合的任何方法并入或装载到细菌源性脂质组合物中或装载到其上。可以通过体内或体外(例如，在组织培养或细胞培养中)，或通过体内和体外两种方法将药剂并入在细菌源性脂质组合物中。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物是在体外装载的。异源功能剂可以使用但不限于物理、化学和/或生物方法(例如，在组织培养或细胞培养中)装载到细菌源性脂质组合物上或装载到其中(例如，可以通过所述细菌源性脂质组合物包封)。例如，可以通过电穿孔、超声处理、被动扩散、搅拌、脂质提取或挤出中的一种或多种将药剂引入到细菌源性脂质组合物中。在一些情况下，使用微流体装置，例如使用在有机相中提供脂质，在水相中提供药剂，并且在微流体装置中合并有机相和水相以产生包括异源功能剂的细菌源性脂质组合物的方法，将药剂并入到细菌源性脂质组合物中。可以使用多种方法来评估装载的细菌源性脂质组合物，以确认装载的药剂的存在或水平，如HPLC(例如，评估小分子)、免疫印迹(例如，评价蛋白质)；和/或定量PCR(例如，评估核苷酸)。然而，本领域技术人员应当理解，将所关注的异源功能剂装载到细菌源性脂质组合物中不限于上述方法。
在一些情况下，异源功能剂可以与细菌源性脂质组合物缀合，其中药剂与细菌源性脂质组合物间接或直接地连接或接合。例如，一种或多种药剂可以与细菌源性脂质组合物化学地连接，使得所述一种或多种药剂与细菌源性脂质组合物的脂质双层直接接合(例如，通过共价键或离子键)。在一些情况下，各种药剂与细菌源性脂质组合物的缀合可以通过首先将所述一种或多种药剂与适当的交联剂(例如，N-乙基碳化二亚胺(“EDC”)，其通常用作与伯胺进行酰胺键合的羧基激活剂并且还与磷酸基团反应)在合适的溶剂中混合来实现。在足以允许药剂与交联剂连接的温育时间段之后，交联剂/药剂混合物然后可以与细菌源性脂质组合物合并，并且在另一温育时间段之后，经历蔗糖梯度(例如，以及8％、30％、45％和60％蔗糖梯度)，以将游离药剂和游离细菌源性脂质组合物和与细菌源性脂质组合物缀合的药剂分离。作为将混合物与蔗糖梯度组合以及伴随的离心步骤的一部分，与药剂缀合的细菌源性脂质组合物随后被视为蔗糖梯度中的一条带，使得随后可以收集、洗涤经缀合的细菌源性脂质组合物并且将其溶解于合适的溶液中以供使用。
在一些情况下，在递送细菌源性脂质组合物之前和之后，将细菌源性脂质组合物与异源功能剂稳定地缔合。在其它情况下，将细菌源性脂质组合物与药剂缔合，使得药剂在递送细菌源性脂质组合物之后从细菌源性脂质组合物中解离。
取决于特定药剂或用途，可以装载细菌源性脂质组合物，或者可以将细菌源性脂质组合物与各种浓度的异源功能剂一起调配。例如，在一些情况下，将细菌源性脂质组合物装载或调配成包含以下约0.001wt％、0.01wt％、0.1wt％、1.0wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％、10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、40wt％、50wt％、60wt％、70wt％、80wt％、90wt％或95wt％(或介于约0.001wt％与95wt％之间的任何范围)或更多wt％的药剂。在一些情况下，将细菌源性脂质组合物装载或调配成包含约95wt％、90wt％、80wt％、70wt％、60wt％、50wt％、40wt％、30wt％、20wt％、15wt％、10wt％、9wt％、8wt％、7wt％、6wt％、5wt％、4wt％、3wt％、2wt％、1.0wt％、0.1wt％、0.01wt％、0.001wt％(或0.001wt％与约95wt％之间的任何范围)或更少wt％的药剂。例如，细菌源性脂质组合物可以包含约0.001wt％至约0.01wt％、约0.01wt％至约0.1wt％、约0.1wt％至约1wt％、约1wt％至约5wt％、或约5wt％至约10wt％、约10wt％至约20wt％的药剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物可以装载或调配有约1、5、10、50、100、200或500、1,000、2,000(或介于约1与2,000之间的任何范围)或更多μg/ml的药剂。细菌源性脂质组合物可以装载或调配有约2,000、1,000、500、200、100、50或10、5、1(或介于约1与2,000之间的任何范围)或更多μg/ml的药剂。
在一些情况下，将细菌源性脂质组合物装载或调配成包含至少0.001wt％、至少0.01wt％、至少0.1wt％、至少1.0wt％、至少2wt％、至少3wt％、至少4wt％、至少5wt％、至少6wt％、至少7wt％、至少8wt％、至少9wt％、至少10wt％、至少15wt％、至少20wt％、至少30wt％、至少40wt％、至少50wt％、至少60wt％、至少70wt％、至少80wt％、至少90wt％或至少95wt％的异源功能剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物可以装载或调配有至少1μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少50μg/ml、至少100μg/ml、至少200μg/ml、至少500μg/ml、至少1,000μg/ml、至少2,000μg/ml的药剂。
在一些情况下，通过将细菌源性脂质组合物悬浮于包括药剂或由所述药剂组成的溶液中，例如通过剧烈混合，将细菌源性脂质组合物与异源功能剂调配。药剂(例如，细胞穿透剂，例如核酸、酶、洗涤剂、离子液体、含氟液体或两性离子液体或可电离脂质)可以占溶液的例如少于1％或至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。
调配物
农业调配物
本文所描述的细菌源性脂质组合物可以被调配成农业组合物。
为了便于施加、处理、运输、储存和有效活性，细菌源性脂质组合物可以与其它物质一起调配。细菌源性脂质组合物可以被调配成例如诱饵、经浓缩的乳液、灰尘、可乳化浓缩物、熏蒸剂、凝胶、颗粒剂、微胶囊、种子处理、悬浮浓缩物、悬浮乳液、片剂、水溶性液体、水可分散颗粒剂或干悬浮剂、可湿性粉末和超低体积溶液。关于调配物类型的另外的信息，参见《杀害虫剂调配物类型和国际编码系统目录(Catalogue ofPesticide FormulationTypes and International Coding System)》技术专著第2期,国际作物生命出版社(CropLife International)第5版(2002)。
细菌源性脂质组合物可以作为由此类药剂的经浓缩的调配物制备的水性悬浮液或乳液施加。此类水溶性、水可悬浮或可乳化调配物是固体，通常称为可湿性粉末，或水可分散颗粒剂，或通常称为可乳化浓缩物的液体，或水性悬浮液。可以压实以形成水可分散颗粒剂的可湿性粉末包括细菌源性脂质组合物、载剂和表面活性剂的紧密混合物。载剂通常选自凹凸棒石粘土、蒙脱石粘土、硅藻土或经纯化的硅酸盐。有效的表面活性剂，包含约0.5％至约10％的可湿性粉末，存在于磺化木质素、经缩合的萘磺酸盐、萘磺酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸盐和非离子表面活性剂，如烷基酚的环氧乙烷加合物中。
可乳化浓缩物可以包括适当浓度的细菌源性脂质组合物，如约50至约500克/升溶解于载剂中的液体，所述载剂是水混溶性溶剂或水不混溶性有机溶剂与乳化剂的混合物。可用的有机溶剂包含芳香族化合物，特别是二甲苯和石油级分，特别是石油的高沸腾萘和烯烃部分，如重质芳香族石脑油。还可以使用其它有机溶剂，如萜烯溶剂，包含松香衍生物、脂肪族酮，如环己酮和络合醇，如2-乙氧基乙醇。用于可乳化浓缩物的合适乳化剂选自常规阴离子和非离子表面活性剂。
水性悬浮液包括以范围为约5重量％至约50重量％的浓度分散于水性载剂中的水不溶性细菌源性脂质组合物的悬浮液。通过精细研磨组合物并将其剧烈混合到包含水和表面活性剂的载剂中来制备悬浮液。还可以添加成分，如无机盐和合成或天然树胶，以增加水性载剂的密度和粘度。
细菌源性脂质组合物还可以作为颗粒组合物施加，其特别适用于施加到土壤。颗粒组合物通常含有约0.5重量％至约10重量％的细菌源性脂质组合物，分散于包括粘土或类似物质的载剂中。此类组合物通常通过将调配物溶解于合适的溶剂中并将其施加到已以范围为约0.5至约3mm的合适粒径预先形成的颗粒载剂上来制备。此类组合物还可以通过制备载剂和化合物的面团或糊状物并破碎和干燥以获得期望的颗粒状粒径来调配。
通过将粉末形式的细菌源性脂质组合物与合适的灰尘农业载剂，如高岭土、经研磨的火山岩等紧密混合来制备含有细菌源性脂质组合物的灰尘。灰尘可以适当地含有约1％至约10％的小包。其可以作为拌种剂或作为叶面喷肥用吹尘机施加。
同样实际的是，将溶液形式的本发明调配物施加到适当的有机溶剂中，通常是石油，如广泛用于农业化学的喷雾油。
细菌源性脂质组合物还可以气溶胶组合物的形式施加。在此类组合物中，小包溶解或分散在作为压力生成推进剂混合物的载剂中。气溶胶组合物被包装在容器中，混合物通过雾化阀从所述容器中分配。
另一个实施例是水包油乳液，其中所述乳液包括油状小球，所述油状小球各自具有层状液晶涂层并且分散于水相中，其中每个油状小球包括至少一种具有农业活性的化合物，并且单独涂覆有单层状层或寡层状层，所述单层状层或寡层状层包含：(1)至少一种非离子亲脂性表面活性剂，(2)至少一种非离子亲水性表面活性剂和(3)至少一种离子表面活性剂，其中球的平均粒径小于800纳米。关于实施例的另外的信息公开于2007年2月1日公布的美国专利公开20070027034中。为了便于使用，此实施例将被称为“OIWE”。
另外，通常，当上文所公开的分子用于调配物中时，此类调配物还可以含有其它组分。这些组分包含但不限于(这是非详尽和非相互排斥的列表)润湿剂、扩散剂、贴纸、渗透剂、缓冲液、螯合剂、漂移还原剂、相容剂、消泡剂、清洁剂和乳化剂。立即描述几个组分。
润湿剂是一种物质，当添加到液体中时，通过降低液体与在其上扩散的表面之间的界面张力来增加液体的扩散或渗透能力。润湿剂在农用化学调配物中用于两种主要功能：在处理和制造期间，以增加粉末在水中的润湿速率以制备可溶性液体或悬浮液浓缩物的浓缩物；以及在喷雾罐中将产物与水混合期间，以减少可湿性粉末的润湿时间并提高水到水可分散颗粒剂中的渗透。在可润湿粉末、悬浮液浓缩物和水可分散颗粒剂调配物中使用的润湿剂的实例为：月桂基硫酸钠；二辛基磺基琥珀酸钠；烷基苯酚乙氧基化物；和脂肪族醇乙氧基化物。
分散剂是吸附到颗粒的表面上并有助于保持颗粒分散状态并防止颗粒再聚集的物质。将分散剂添加到农用化学调配物中以促进在制造期间的分散和悬浮，并且确保颗粒在喷雾罐中再分散到水中。其广泛用于可湿性粉末、悬浮液浓缩物和水可分散颗粒剂中。用作分散剂的表面活性剂具有强吸附到颗粒表面上的能力，并且提供对颗粒再聚集的带电或空间屏障。最常用的表面活性剂是阴离子、非离子或两种类型的混合物。对于可湿性粉末调配物，最常见分散剂是木质素磺酸钠。对于悬浮液浓缩物，使用聚电解质，如萘磺酸钠甲醛缩合物获得非常好的吸附和稳定。还使用三苯乙烯苯酚乙氧基化物磷酸酯(tristyrylphenol ethoxylate phosphate ester)。非离子，如烷基芳基环氧乙烷缩合物和EO-PO嵌段共聚物有时与阴离子合并作为悬浮液浓缩物的分散剂。近年来，已经开发了新型的非常高分子量的聚合物表面活性剂作为分散剂。这些具有非常长的疏水性“主链”和形成“梳状”表面活性剂的“齿”的大量环氧乙烷链。这些高分子量聚合物可以为悬浮液浓缩物提供非常好的长期稳定性，因为疏水性主链在颗粒表面上具有许多锚定点。在农用化学调配物中使用的分散剂的实例是：木质磺酸钠；萘磺酸钠甲醛缩合物；三苯乙烯基苯酚乙氧基化物磷酸酯；脂族醇乙氧基化物；烷基乙氧基化物；EO-PO(环氧乙烷-环氧丙烷)嵌段共聚物；以及接枝共聚物。
乳化剂是稳定一个液相中的液滴在另一液相中的悬浮液的物质。在没有乳化剂的情况下，两种液体将分离成两种不混溶的液相。最常用的乳化剂共混物含有具有十二个或更多个环氧乙烷单元的烷基苯酚或脂族醇和十二烷基苯磺酸的油溶性钙盐。8至18的亲水亲油平衡(“HLB”)值范围通常将提供良好的稳定乳液。有时可以通过添加少量EO-PO嵌段共聚物表面活性剂来提高乳液稳定性。
增溶剂是表面活性剂，其将在水中以高于临界胶束浓度的浓度形成胶束。胶束然后能够溶解或增溶胶束的疏水性部分内部的水不溶性材料。通常用于增溶的表面活性剂的类型是非离子、脱水山梨糖醇单油酸酯、脱水山梨糖醇单油酸酯乙氧基化物和油酸甲酯。
表面活性剂有时单独使用或与如矿物油或植物油的其它添加剂一起使用作为喷雾罐混合物的佐剂，以改善细菌源性脂质组合物在靶标上的生物学性能。用于生物增强的表面活性剂的类型通常取决于细菌源性脂质组合物的性质和作用模式。然而，其通常是非离子的，如：烷基乙氧基化物；直链脂肪族醇乙氧基化物；脂肪族胺乙氧基化物。
农业调配物中的载剂或稀释剂是添加到细菌源性脂质组合物中以产生期望强度的产物的材料。载剂通常是具有高吸收容量的材料，而稀释剂通常是具有低吸收容量的材料。载剂和稀释剂用于灰尘、可湿性粉末、颗粒剂和水可分散颗粒剂的调配中。
有机溶剂主要用于可乳化浓缩物、水包油乳液、硫化物和超低体积调配物的调配物中，并且在较小程度上用于颗粒状调配物中。有时使用溶剂的混合物。第一主要溶剂组是脂肪族石蜡油，如煤油或精制石蜡。第二主要(和最常见)组包括芳香族溶剂，如二甲苯以及C9和C10芳香族溶剂的较高分子量部分。当调配物乳化成水时，氯化烃可用作助溶剂以防止细菌源性脂质组合物的结晶。醇有时用作助溶剂以增加溶剂能力。其它溶剂可以包含植物油、种子油以及植物油和种子油的酯。
增稠剂或胶凝剂主要用于悬浮液浓缩物、乳液和悬浮乳液的调配中，以改变液体的流变学或流动特性并防止分散颗粒或液滴的分离和沉降。增稠剂、胶凝剂和防沉降剂通常分为两个类别，即水不溶性微粒和水溶性聚合物。有可能使用粘土和二氧化硅产生悬浮液浓缩物调配物。这些类型的材料的实例包含但不限于蒙脱石、膨润土、硅酸镁铝和凹凸棒石。水溶性多糖已用作增稠胶凝剂多年。最常用的多糖的类型是种子和海藻的天然提取物，或者是纤维素的合成衍生物。这些类型的材料的实例包含但不限于瓜尔胶；刺槐豆胶；卡拉胶；藻酸盐；甲基纤维素；羧甲基纤维素钠(SCMC)；羟乙基纤维素(HEC)。其它类型的抗沉降剂基于经改性的淀粉、聚丙烯酸酯、聚乙烯醇和聚环氧乙烷。另一种良好的抗沉降剂是黄原胶。
微生物可能导致经调配的产物的腐败。因此，保存剂用于消除或降低其效果。此类药剂的实例包含但不限于：丙酸和其钠盐；山梨酸和其钠盐或钾盐；苯甲酸和其钠盐；对羟基苯甲酸钠盐；对羟基苯甲酸甲酯；和1,2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)。
表面活性剂的存在通常导致基于水的调配物在产生中的混合操作期间以及通过喷雾罐施加期间发泡。为了减少发泡倾向，通常在产生阶段期间或在填充到瓶中之前添加消泡剂。通常，存在两种类型的消泡剂，即硅酮和非硅酮。硅酮通常是二甲基聚硅氧烷的水乳液，而非硅酮消泡剂是水不溶性油，如辛醇和壬醇或二氧化硅。在这两种情况下，消泡剂的功能是使表面活性剂从空气-水界面中移位。
“绿色”剂(例如，佐剂、表面活性剂、溶剂)可以减少作物保护调配物的总体环境足迹。绿色剂是可生物降解的，并且通常源自天然和/或可持续来源，例如植物和动物来源。具体实例是：植物油、种子油和其酯，以及烷氧基化的烷基聚葡糖苷。
在一些情况中，所述细菌源性脂质组合物可以是冷冻干燥的或经冻干的。参见美国专利第4,311,712号。细菌源性脂质组合物随后可以在与水或另一种液体接触时重构。根据本文所描述的调配物，可以将其它组分添加到经冻干或重构的细菌源性脂质组合物中，例如其它异源功能剂、农业上可接受的载剂或其它材料。
组合物的其它任选的特征包含保护细菌源性脂质组合物免受UV和/或酸性条件影响的载剂或递送媒剂。在一些情况下，递送媒剂含有pH缓冲液。在一些情况下，所述组合物被调配成pH在约4.5至约9.0的范围内，包含例如pH在5.0至约8.0、约6.5至约7.5或约6.5至约7.0中的约任一种的范围内。
关于农业调配物的另外的信息，请参考由D.A.Knowles编辑的“《农用化学调配物的化学与技术(Chemistry and Technology ofAgrochemical Formulations)》”,克鲁维尔学术出版社(KluwerAcademic Publishers)的版权1998。还参见A.S.Perry,I.Yamamoto,I.Ishaaya和R.Perry的“《农业和环境中的杀虫剂—回顾和前景(Insecticides inAgriculture and Environment—Retrospects and Prospects)》”,施普林格出版社(Springer-Verlag)的版权1998。
药物调配物
细菌源性脂质组合物被调配成药物组合物(即，细菌源性脂质组合物)，例如用于施用于动物(例如，人类)。药物组合物可以与药学上可接受的稀释剂、载剂和/或赋形剂一起施用于动物(例如，人类)。视施用模式和剂量而定，本文描述的方法的药物组合物将被配制成合适的药物组合物以允许容易递送。视需要，单剂量可以呈单位剂型。
细菌源性脂质组合物可以被调配用于例如动物的口服施用、静脉内施用(例如，注射或输注)、肌肉内或皮下施用。对于可注射调配物，本领域已知各种有效的药物载剂(参见例如《雷明顿：药学科学与实践(Remington:the Science and Practice ofPharmacy)》,第22版,(2012)和《ASHP可注射药物手册(ASHP Handbook on injectable Drugs)》,第18版,(2014))。
合适的药学上可接受的载剂和赋形剂在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒性。可接受的载剂和赋形剂可以包含：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐、HEPES和TAE；抗氧化剂，如抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，如氯化六烃季铵、十八基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵；蛋白质，如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸；以及碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨糖醇。细菌源性脂质组合物可以根据常规药物实践调配。调配物中的化合物的浓度将根据许多因素变化，包含要施用的活性剂(例如，细菌源性脂质组合物和核酸)的剂量和施用途径。
对于口服施用于动物，细菌源性脂质组合物可以以口服调配物的形式制备。用于口服使用的调配物可以包含含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的一种或多种活性成分的片剂、囊片、胶囊、糖浆或口服液体剂型。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、淀粉(包含马铃薯淀粉)、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；粒化剂和崩解剂(例如纤维素衍生物(包含微晶纤维素)、淀粉(包含马铃薯淀粉)、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐或海藻酸)；粘合剂(例如蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、阿拉伯胶、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预胶凝化淀粉、微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和防粘剂(例如硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石)。其它药学上可接受的赋形剂可以是着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂、缓冲剂等。用于口服使用的调配物还可以可咀嚼片剂、非可咀嚼片剂、囊片、胶囊(例如硬明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂混合，或软明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质混合)的形式以单位剂型提供。本文所公开的组合物还可以进一步包含速释、延长释放或延迟释放调配物。
对于肠胃外施用于动物，细菌源性脂质组合物可以液体溶液或悬浮液的形式调配并且通过肠胃外途径(例如，皮下、静脉内或肌肉内)施用。药物组合物可以被调配用于注射或输注。用于肠胃外施用的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒剂来配制。药学上可接受的媒剂包含(但不限于)无菌水、生理盐水或细胞培养基(例如，达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、α改良伊格尔培养基(α-MEM)和F-12培养基)。调配方法是本领域中已知的，参见例如Gibson(编)《药物预调配和调配(Pharmaceutical Preformulation and Formulation)》(第2版)泰勒和弗朗西斯出版集团CRC出版社(Taylor&Francis Group,CRC Press)(2009)。
异源功能剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含异源功能剂，如异源功能性剂(例如，异源农业剂(例如，杀虫剂、施肥剂、除草剂、植物改良剂)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或昆虫驱除剂)。例如，细菌源性脂质组合物可以包封异源功能剂。可替代地，异源功能剂可以包埋在细菌源性脂质组合物的表面上或与所述表面缀合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的异源功能剂。异源功能剂可以在制造过程期间的任何步骤添加，从而有效地将药剂引入到细菌源性脂质组合物中。
在某些情况下，可以修饰异源功能剂(例如，异源农业剂(例如，杀虫剂、施肥剂、除草剂、植物改良剂、异源核酸、异源多肽或异源小分子)或异源治疗剂(例如，抗真菌剂、抗菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或昆虫驱除剂))。例如，修饰可以是化学修饰，例如与标志物，例如荧光标志物或放射性标志物缀合。在其它实例中，修饰可以包含与增强药剂，例如脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)或阳离子部分的稳定性、递送、靶向、生物利用度或半衰期的部分的缀合或操作连接。
异源功能剂的实例概述如下。
异源农业剂
细菌源性脂质组合物可以包含异源农业剂(例如，影响植物或与植物缔合的生物体并且可以装载到细菌源性脂质组合物中的药剂)，如杀虫剂、除草剂、施肥剂或植物改良剂。
例如，在一些情况下，细菌源性脂质组合物可以包含杀虫剂。杀虫剂可以是抗真菌剂、抗菌剂、杀虫剂、杀软体动物剂、杀线虫剂、杀病毒剂或其组合。杀虫剂可以是化学药剂，如本领域熟知的那些。可替代地或另外地，杀虫剂可以是肽、多肽、核酸、多核苷酸或小分子。杀虫剂可以是可以降低多种植物害虫的适应性的药剂，或者可以是靶向一种或多种特定靶标植物害虫(例如，植物害虫的特定物种或属)的药剂。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物可以包含一种或多种异源施肥剂。异源施肥剂的实例包含植物营养素或植物生长调控剂，如本领域众所周知的那些。可替代地或另外地，施肥剂可以是肽、多肽、核酸或多核苷酸，其可以增加植物共生体的适应性。施肥剂可以是可以增加多种植物或植物共生体的适应性的药剂，或者可以是靶向一种或多种特定靶标植物或植物共生体(例如，植物或植物共生体的特定物种或属)的药剂。
在其它情况下，细菌源性脂质组合物可以包含一种或多种异源植物改良剂。在一些情况下，植物改良剂可以包含肽或核酸。
抗菌剂
本文所描述的细菌源性脂质组合物可以进一步包含抗菌剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的抗菌剂。例如，抗菌剂可以降低细菌植物害虫(例如，细菌植物病原体)的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含抗生素的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标害虫或受其侵染的植物接触：(a)在目标害虫内部或目标害虫上达到抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低目标害虫的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，抗菌剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语“抗菌剂”是指杀伤或抑制细菌，如植物病原细菌的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的材料，并包含杀菌剂(例如，消毒剂化合物、防腐化合物或抗生素)或抑菌剂(例如，化合物或抗生素)。杀菌抗生素杀伤细菌，而抑菌抗生素仅减慢其生长或繁殖。
杀菌剂可以包含消毒剂、防腐剂或抗生素。最常用的消毒剂可以包括：活性氯(即，次氯酸盐(例如，次氯酸钠)、氯胺、二氯异氰尿酸盐和三氯异氰尿酸盐、湿氯、二氧化氯等)、活性氧(过氧化物，如过氧乙酸、过硫酸钾、过硼酸钠、过碳酸钠和过水脲)、碘(碘聚维酮(聚维酮-碘、必妥碘(betadine))、卢戈氏溶液(Lugol's solution)、碘酊、碘化非离子表面活性剂)、经浓缩的醇(主要是乙醇、1-丙醇，也称为正丙醇和2-丙醇，称为异丙醇和其混合物；进一步地，使用2-苯氧基乙醇和1-苯氧基丙醇和2-苯氧基丙醇)、酚类物质(如苯酚(也称为羧酸)、甲酚(称为Lysole与液体钾皂的组合)、卤化(氯化、溴化)苯酚，如六氯苯、三氯生、三氯苯酚、三溴苯酚、五氯苯酚、二溴和其盐)、阳离子表面活性剂，如一些季铵阳离子(如苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵或氯化铵、双十烷基二甲基氯化铵、十六烷基氯化吡啶鎓、苄索氯铵)和其它、非季化合物，如氯己定、葡糖胺、二盐酸盐奥替尼啶(octenidinedihydrochloride)等)、强氧化剂，如臭氧和高锰酸盐溶液；重金属和其盐，如胶体银、硝酸银、氯化汞、苯基汞盐、硫酸铜、氧化铜-氯化物、氢氧化铜、辛酸铜、氯氧硫酸铜(copperoxychloride sulfate)、硫酸铜、五水合硫酸铜等。重金属和其盐是最有毒并且对环境有害的杀菌剂，并且因此，其使用受到强烈压制或取消；进一步地，还适当地浓缩强酸(磷酸、硝酸、硫酸、氨基硫酸、甲苯磺酸)和碱(氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙)。
作为防腐剂(即，可以用于人或动物身体、皮肤、粘膜、伤口等的杀菌剂)，在适当的条件下(主要是对人/动物的浓度、pH、温度和毒性)可以使用上述消毒剂中的几种。其中，重要的是：适当稀释的氯制剂(即Daquin溶液、0.5％次氯酸钠或次氯酸钾溶液，pH调节至pH为7-8，或0.5％-1％苯磺基氯胺钠(氯胺B)溶液)；一些碘制剂，如各种盖伦(软膏、溶液、创口贴)中的碘代聚维酮，过去也有卢戈氏溶液、过氧化物作为过水脲溶液和pH缓冲的0.1％-0.25％过氧乙酸溶液；含或不含防腐剂添加剂的醇，主要用于皮肤防腐；弱有机酸，如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸；一些酚类化合物，如六氯苯、三氯生和二溴；以及阳离子活性化合物，如0.05％-0.5％的苯扎氯铵、0.5-4％的氯己定、0.1-2％的奥替尼啶溶液。
细菌源性脂质组合物可以包含抗生素。可以使用本领域中已知的任何抗生素。通常基于抗生素的作用机制、化学结构或活性谱范围对抗生素进行分类。
本文所描述的抗生素可以靶向任何细菌功能或生长过程，并且可以是抑菌的(例如，减慢或防止细菌生长)或杀菌的(例如，杀伤细菌)。在一些情况下，抗生素是杀菌抗生素。在一些情况下，杀菌抗生素是靶向细菌细胞壁的抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的抗生素(例如，多粘菌素)；或抑制必需细菌酶的抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素、喹诺酮和磺酰胺)。在一些情况下，杀菌抗生素是氨基糖苷(例如，春日霉素)。在一些情况下，抗生素是抑菌抗生素。在一些情况下，抑菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可酰胺类和四环素类)。本文可以使用的另外的种类的抗生素包含环状脂肽(如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮(如利奈唑胺)或闰年霉素(如非达霉素)。抗生素的实例包含利福平、环丙沙星、多西环素、氨苄西林和多粘菌素B。本文所描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特定类型的细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。可替代地，抗生素可以是靶向广泛范围的细菌的广谱抗生素。
抗生素的其它非限制性实例在WO 2021/041301的表1中找到，所述文献通过引用整体并入本文。本领域技术人员将理解，组合物中的每种抗生素的合适浓度取决于如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
抗真菌剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含抗真菌剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的抗真菌剂。例如，抗真菌剂可以降低真菌植物害虫的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含抗真菌剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标真菌害虫或受其侵染的植物接触：(a)在目标真菌内部或目标真菌上达到抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低目标真菌的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，抗真菌剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语“杀真菌剂”或“抗真菌剂”是指杀伤或抑制真菌，如植物病原真菌的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的物质。许多不同类型的抗真菌剂已商业生产。抗真菌剂的非限制性实例包含：嘧菌酯(azoxystrobin)、代森锰锌(mancozeb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、灭菌丹(folpet)、戊唑醇(tebuconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、克菌丹(captan)、乙嘧酚磺酸酯(bupirimate)或乙膦酸-Al。另外的示例性杀真菌剂包含但不限于嗜球果伞素类(strobilurins)、嘧菌酯、地莫菌胺嘧菌酯(dimoxystrobin)、烯肟菌酯(enestroburin)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、甲氧胺菌灵(kresoxim-methyl)、苯氧菌胺(metominostrobin)、啶氧菌酯(picoxystrobin)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、肟菌酯(trifloxystrobin)、肟醚菌胺(orysastrobin)、甲酰胺、羧酰苯胺、苯霜灵(benalaxyl)、苯霜灵-M(benalaxyl-M)、麦锈灵(benodanil)、萎锈灵(carboxin)、灭锈胺(mebenil)、灭普宁(mepronil)、甲呋酰胺(fenfuram)、环酰菌胺(fenhexamid)、福多果定(flutolanil)、呋霜灵(furalaxyl)、二甲呋酰胺(furcarbanil)、福拉比(furametpyr)、甲霜灵(metalaxyl)、甲霜灵-M(metalaxyl-M)(精甲霜灵(mefenoxam))、三甲呋菌胺(methfuroxam)、噻菌胺(metsulfovax)、呋酰胺(ofurace)、欧杀斯(oxadixyl)、氧化萎锈灵(oxycarboxin)、吡噻菌胺(penthiopyrad)、比锈灵(pyracarbolid)、水杨酰苯胺(salicylanilide)、克枯烂(tecloftalam)、赛氟灭(thifluzamide)、汰敌宁(tiadinil)、N-联苯酰胺(N-biphenylamides)、联苯吡菌胺(bixafen)、啶酰菌胺(boscalid)、羧酸吗啉(carboxylic acid morpholides)、达灭芬(dimethomorph)、氟吗啉(flumorph)、苯甲酰胺、氟酰菌胺(flumetover)、氟吡菌胺(fluopicolide)(氟吡菌胺(picobenzamid))、座赛胺(zoxamide)、甲酰胺、环丙酰菌胺(carpropamid)、二氯西莫(diclocymet)、双炔酰菌胺(mandipropamid)、硅噻菌胺(silthiofam)、唑类、三唑、比多农(bitertanol)、糠菌唑(bromuconazole)、环丙唑醇(cyproconazole)、苯醚甲环唑(difenoconazole)、烯唑醇(diniconazole)、恩康唑(enilconazole)、氟环唑(epoxiconazole)、芬克座(fenbuconazole)、氟硅唑(flusilazol)、氟喹唑(fluquinconazole)、粉唑醇(flutriafol)、己唑醇(hexaconazole)、亚胺唑(imibenconazole)、种菌唑(ipconazole)、叶菌唑(metconazole)、腈菌唑(myclobutanil)、戊菌唑(penconazole)、丙环唑(propiconazole)、丙硫菌唑(prothioconazole)、硅氟唑(simeconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、四氟醚唑(tetraconazole)、三唑醇(triadimenol)、三唑酮(triadimefon)、灭菌唑(triticonazole)、咪唑类、氰霜唑(cyazofamid)、伊米萨利(imazalil)、稻瘟酯(pefurazoate)、咪鲜胺(prochloraz)、赛福座(triflumizole)、苯并咪唑、苯菌灵(benomyl)、噻唑菌胺(carbendazim)、麦穗宁(fuberidazole)、噻苯咪唑(thiabendazole)、噻唑菌胺(ethaboxam)、依得利(etridiazole)、恶霉灵(hymexazol)、含氮杂环基化合物、吡啶、吡啶类氟啶胺(fuazinam)、比芬诺(pyrifenox)、嘧啶、乙嘧酚磺酸酯(bupirimate)、嘧菌环胺(cyprodinil)、嘧菌腙(ferimzone)、氯苯嘧啶醇(fenarimol)、嘧菌胺(mepanipyrim)、氟苯嘧啶醇(nuarimol)、嘧霉胺(pyrimethanil)、哌嗪(piperazines)、赛福宁(triforine)、吡咯、咯菌腈(fludioxonil)、拌种咯(fenpiclonil)、吗啉、阿迪吗啉(aldimorph)、吗菌灵(dodemorph)、丁苯吗啉(fenpropimorph)、十三吗啉(tridemorph)、二甲酰亚胺、依普同(iprodione)、扑灭宁(procymidone)、农利灵(vinclozolin)、阿拉酸式苯-S-甲酯(acibenzolar-S-methyl)、敌菌灵(anilazine)、克菌丹、敌菌丹(captafol)、棉隆(dazomet)、哒菌酮(diclomezine)、稻瘟酰胺(fenoxanil)、福尔培(folpet)、苯锈啶(fenpropidine)、噁唑菌酮(famoxadone)、咪唑菌酮(fenamidone)、辛噻酮(octhilinone)、噻菌灵(probenazole)、丙氧喹啉(proquinazid)、咯喹酮(pyroquilon)、喹氧灵(quinoxyfen)、三环唑(tricyclazole)、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸酯、福美铁(ferbam)、代森锰锌、代森锰(maneb)、代森联(metiram)、威百亩(metam)、丙森锌(propineb)、塞仑(thiram)、代森锌(zineb)、福美锌(ziram)、乙霉威(diethofencarb)、苯噢菌胺(flubenthiavalicarb)、缬霉威(iprovalicarb)、霜霉威(propamocarb)、胍、多果定(dodine)、克热净(iminoctadine)、双胍盐(guazatine)、春日霉素、多氧菌素(polyoxins)、链霉素(streptomycin)、井冈霉素A(validamycin A)、有机金属化合物、三苯锡盐(fentinsalts)、含硫杂环基化合物、稻瘟灵、二噻农(dithianone)、有机磷化合物、克瘟散(edifenphos)、乙膦酸(fosetyl)、乙膦酸-铝(fosetyl-aluminum)、异稻瘟净(iprobenfos)、吡嘧磷(pyrazophos)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、有机氯化合物、甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、百菌清(chlorothalonil)、抑菌灵(dichlofluanid)、对甲抑菌灵(tolylfluanid)、磺菌胺(flusulfamide)、四氯苯酞(phthalide)、六氯苯(hexachlorobenzene)、宾克隆(pencycuron)、五氯硝基苯(quintozene)、硝基苯基衍生物、乐杀螨(binapacryl)、敌螨普(dinocap)、消螨通(dinobuton)、螺环菌胺(spiroxamine)、环氟菌胺(cyflufenamid)、霜脲氰(cymoxanil)、灭芬农(metrafenon)、N-2-氰基苯基-3,4-二氯异噻唑-5-甲酰胺(异噻菌胺)、N-(3',4',5'-三氟联苯基-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、3-[5-(4-氯苯基)-2,3-二甲基异噁唑啉-3-基]-吡啶、N-(3',4'-二氯-4-氟联苯基-2-基)-3-二氟甲基-1-甲基吡唑-4-甲酰胺、5-氯-7-(4-甲基哌啶-1-基)-6-(2,4,6-三氟苯基)-[1,2,4]三唑并[1,5-a]嘧啶、2-丁氧基-6-碘-3-丙基色烯-4-酮、N,N-二甲基-3-(3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-磺酰基)-[1,2,4]三唑-1-磺酰胺、甲基-(2-氯-5-[1-(3-甲基苄氧基亚氨基)-乙基]苄基)氨基甲酸酯、甲基-(2-氯-5-[1-(6-甲基吡啶-2-基甲氧基-亚氨基)乙基]苄基)氨基甲酸甲酯、3-(4-氯苯基)-3-(2-异丙氧基羰基氨基-3-甲基丁酰基-氨基)丙酸甲酯、N-(1-(1-(4-氰基苯基)乙磺酰基)丁-2-基)氨基甲酸4-氟苯酯、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-甲磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(2-(4-[3-(4-氯苯基)丙-2-炔氧基]-3-甲氧基苯基)乙基)-2-乙磺酰基氨基-3-甲基丁酰胺、N-(4'-溴联苯基-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4'-三氟甲基联苯基-2-基)-4-二氟甲基-2-甲基噻唑-5-甲酰胺、N-(4'-氯-3'-氟联苯基-2-基)-4-二氟甲基2-甲基噻唑-5-甲酰胺或2-(邻-((2,5-二甲基苯氧基-亚甲基)苯基)-3-甲氧基丙烯酸甲酯。本领域技术人员将理解，组合物中的每种抗真菌剂的合适浓度取决于如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
杀虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含杀虫剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的杀虫剂。例如，杀虫剂可以降低昆虫植物害虫的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含杀虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标昆虫害虫或受其侵染的植物接触：(a)在目标昆虫内部或目标昆虫上达到杀虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低目标昆虫的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，杀虫剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语杀虫剂(“insecticide”或“insecticidal agent”)是指杀伤或抑制昆虫，如农业昆虫害虫的生长、增殖、繁殖或传播的物质。杀虫剂的非限制性实例在WO 2021/041301的表2中找到，所述文献通过引用整体并入本文。合适的杀虫剂的另外的非限制性实例包含生物制品、激素或信息素，如印楝素(azadirachtin)、芽孢杆菌(Bacillus species)、白僵菌(Beauveria species)、可得蒙(codlemone)、绿僵菌(Metarrhizium species)、拟青霉菌(Paecilomyces species)、杆状杆菌亚种(thuringiensis)和轮枝菌(Verticillium species)以及具有未知或非特定作用机制的活性化合物，如熏蒸剂(如磷化铝、甲基溴和磺酰氟)和选择性进食抑制剂(如冰晶石、氟啶虫酰胺和吡蚜酮)。本领域技术人员将理解，组合物中的每种杀虫剂的合适浓度取决于如功效、杀虫剂的稳定性、不同杀虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
杀线虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含杀线虫剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的杀线虫剂。例如，杀线虫剂可以降低线虫植物害虫的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含杀线虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标线虫害虫或受其侵染的植物接触：(a)在目标线虫内部或目标昆虫上达到杀线虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低目标线虫的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，杀线虫剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语杀线虫剂(“nematicide”或“nematicidal agent”)是指杀伤或抑制线虫，如农业线虫害虫的生长、增殖、繁殖或传播的物质。杀线虫剂的非限制性实例在WO 2021/041301的表3中找到，所述文献通过引用整体并入本文。本领域技术人员将理解，组合物中的每种杀线虫剂的合适浓度取决于如功效、杀线虫剂的稳定性、不同杀线虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
杀软体动物剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含杀软体动物剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的杀软体动物剂。例如，杀软体动物剂可以降低软体动物植物害虫的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含杀软体动物剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标软体动物害虫或受其侵染的植物接触：(a)在目标软体动物内部或目标软体动物上达到杀软体动物剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低目标软体动物的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，杀软体动物剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语杀软体动物剂(“molluscicide”或“molluscicidalagent”)是指杀伤或抑制软体动物，如农业软体动物害虫的生长、增殖、繁殖或传播的物质。许多化学品可以用作杀软体动物剂，包含金属盐，如磷酸铁(III)、硫酸铝和EDTA铁钠、[3][4]、金属醛、甲氧羰基或乙酰胆碱酯酶抑制剂。本领域技术人员将理解，组合物中的每种杀软体动物剂的合适浓度取决于如功效、杀软体动物剂的稳定性、不同杀软体动物剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
杀病毒剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含杀病毒剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的杀病毒剂。例如，杀病毒剂可以降低病毒植物病原体的适应性(例如，减少或消除所述病毒植物病原体)。包含如本文所描述的杀病毒剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标病毒或受其侵染的植物接触：(a)达到杀病毒剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)减少或消除目标病毒。对于本文所描述的方法中的任何方法，本文所描述的杀病毒剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语“杀病毒剂”或“抗病毒剂”是指杀伤或抑制病毒，如农业病毒病原体的生长、增殖、繁殖、发育或传播的物质。多种药剂可以用作杀病毒剂，包含化学品或生物药剂(例如，核酸，例如，dsRNA)。本领域技术人员将理解，组合物中的每种杀病毒剂的合适浓度取决于如功效、杀病毒剂的稳定性、不同杀病毒剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
除草剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的除草剂。例如，除草剂可以降低杂草的适应性(例如，减少或消除所述杂草)。包含除草剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标杂草接触：(a)在植物上达到除草剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低杂草的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，除草剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
如本文所使用的，术语“除草剂”是指杀伤或抑制杂草的生长、增殖、繁殖或传播的物质。许多化学物质可以用作除草剂，包含草丁膦(Glufosinate)、喔草酯(Propaquizafop)、苯嗪草酮(Metamitron)、吡草胺(Metazachlor)、二甲戊乐灵(Pendimethalin)、氟噻草胺(Flufenacet)、吡氟酰草胺(Diflufenican)、广灭灵(Clomazone)、烟嘧磺隆(Nicosulfuron)、硝磺草酮(Mesotrione)、唑啉草酯(Pinoxaden)、磺草酮(Sulcotrione)、苄草丹(Prosulfocarb)、甲磺草胺(Sulfentrazone)、治草醚(Bifenox)、喹草酸(Quinmerac)、野麦畏(Triallate)、特丁津(Terbuthylazine)、阿特拉津(Atrazine)、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、敌草隆(Diuron)、氟乐灵(Trifluralin)或绿麦隆(Chlorotoluron)。除草剂的另外的实例包含但不限于苯甲酸除草剂，如麦草畏酯类；苯氧基烷酸除草剂，如2,4-D、MCPA和2,4-DB酯类；芳氧基苯氧基丙酸除草剂，如炔草酯(clodinafop)、氰氟草酯(cyhalofop)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、吡氟禾草灵(fluazifop)、氟吡甲禾灵(haloxyfop)和喹禾灵(quizalofop)酯类；吡啶羧酸除草剂，如氯氨吡啶酸(aminopyralid)、毒莠定(picloram)和二氯吡啶酸(clopyralid)酯类；嘧啶羧酸除草剂，如氯丙嘧啶酸(aminocyclopyrachlor)酯类；吡啶氧基烷酸除草剂，如氟草烟和定草酯；以及羟基苄腈除草剂，如溴草腈和碘草腈酯类；芳基吡啶羧酸的酯类，并且芳基吡啶羧酸的通用结构公开于美国专利第7,314,849号、美国专利第7,300,907号和美国专利第7,642,220号中，所述文献中的每个文献通过引用整体并入本文。在某些实施例中，除草剂可选自由以下组成的组：2,4-D、2,4-DB、乙草胺(acetochlor)、三氟羧草醚(acifluorfen)、甲草胺(alachlor)、莠灭净(ametryn)、杀草强(amitrole)、黄草灵(asulam)、阿特拉津、唑啶草酮(azafenidin)、氟草氨(benefin)、苄嘧磺隆(bensulfuron)、地散磷(bensulide)、噻草平(bentazon)、除草定(bromacil)、溴苯腈(bromoxynil)、苏达灭(butylate)、唑草酮(carfentrazone)、草灭平(chloramben)、氯嘧磺隆(chlorimuron)、氯苯胺灵(chlorproham)、氯磺隆(chlorsulfuron)、烯草酮(clethodim)、异噁草酮(clomazone)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯酯磺草胺(cloransulam)、草净津(cyanazine)、草灭特(cycloate)、DCPA、甜菜安(desmedipham)、敌草腈(dichlobenil)、氯甲草(diclofop)、双氯磺草胺(diclosulam)、乙酰甲草胺(diethatyl)、野燕枯(difenzoquat)、二氟吡隆(diflufenzopyr)、精二甲吩草胺(dimethenamid-p)、敌草快(diquat)、敌草隆(diuron)、DSMA、草藻灭(endothall)、EPTC、丁氟消草(ethalfluralin)、胺苯磺隆(ethametsulfuron)、乙呋草磺(ethofumesate)、噁唑禾草灵(fenoxaprop)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P)、氟酮磺隆(flucarbazone)、氟噻草胺(flufenacet)、氟唑啶草(flumetsulam)、氟烯草酸(flumiclorac)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、伏草隆(fluometuron)、氟草烟(fluroxypyr)、嗪草酸(fluthiacet)、氟磺胺草醚(fomesafen)、甲酰胺磺隆(foramsulfuron)、草丁膦(glufosinate)、草甘膦(glyphosate)、吡氯磺隆(halosulfuron)、氟吡甲禾灵、六嗪酮(hexazinone)、咪草酯(imazamethabenz)、咪草啶酸(imazamox)、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草喹(imazaquin)、咪草烟(imazethapyr)、异噁酰草胺(isoxaben)、异噁氟草酮(isoxaflutole)、乳氟禾草灵(lactofen)、利谷隆(linuron)、MCPA、MCPB、甲基磺草酮(mesotrione)、灭草唑(methazole)、异丙甲草胺(metolachlor-s)、嗪草酮(metribuzin)、甲磺隆(metsulfuron)、草达灭(molinate)、MSMA、敌草胺(napropamide)、萘草胺(naptalam)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、达草灭(norflurazon)、黄草消(oryzalin)、噁草灵(oxadiazon)、环氧嘧磺隆(oxasulfuron)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、百草枯(paraquat)、克草猛(pebulate)、壬酸(pelargonic acid)、胺硝草(pendimethalin)、甜菜宁(phenmedipham)、氨氯吡啶酸(picloram)、氟嘧磺隆(primisulfuron)、氨氟乐灵(prodiamine)、扑草净(prometryn)、拿草特(pronamide)、毒草安(propachlor)、敌稗(propanil)、氟丙磺隆(prosulfuron)、杀草敏(pyrazon)、达草特(pyridate)、嘧硫草醚(pyrithiobac)、二氯喹啉酸(quinclorac)、喹禾灵(quizalofop)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、稀禾定(sethoxydim)、环草隆(siduron)、西玛津(simazine)、磺胺草唑(sulfentrazone)、嘧磺隆(sulfometuron)、乙磺磺隆(sulfosulfuron)、丁唑隆(tebuthiuron)、特草定(terbacil)、噻草啶(thiazopyr)、噻磺隆(thifensulfuron)、禾草丹(thiobencarb)、肟草酮(tralkoxydim)、野麦畏(triallate)、醚苯磺隆(triasulfuron)、苯磺隆(tribenuron)、绿草定(triclopyr)、氟乐灵(trifluralin)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron)、灭草猛(vernolate)。本领域技术人员将理解，组合物中的每种除草剂的合适浓度取决于如功效、除草剂的稳定性、不同除草剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
驱虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含驱虫剂。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的驱虫剂。例如，驱虫剂可以驱除本文所描述的害虫中的任何害虫(例如，昆虫、线虫或软体动物)；微生物(例如，植物病原体或内生菌，如细菌、真菌或病毒)；或杂草。包含驱虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与目标植物或受其侵染的植物接触：(a)达到驱虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)相对于未经处理的植物，降低植物上的害虫水平。对于本文所描述的方法中的任何方法，驱虫剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。
在一些情况下，驱虫剂是昆虫驱虫剂。众所周知的昆虫驱除剂的一些实例包含：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁基-2-烯)四氢糠醛(MGK驱虫剂11)；丁氧基聚丙二醇；N-丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮(Indalone))；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(驱虫特(Tabatrex))；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；驱蚊灵；双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸(内,内)-二甲酯；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612)；异辛可部酸二正丙酯(MGK驱虫剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇和N,N-二乙基琥珀酸正丙酯。其它驱虫剂包含香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、草酸正丁基甲苯甲醛和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer《化学技术百科全书(Encyclopedia ofChemical Technology)》,第2版,第11卷:724-728；和《简明化学词典(The Condensed Chemical Dictionary)》,第8版,第756页)。
昆虫驱除剂可以是合成的或非合成的昆虫驱除剂。合成昆虫驱除剂的实例包含邻氨基苯甲酸甲酯和其它基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱除剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、碳酸二甲酯、邻苯二甲酸二甲酯、艾卡瑞丁(icaridin)(即派卡瑞丁(picaridin)、Bayrepel和KBR 3023)、避虫酮(例如，如在“6-2-2”混合物中使用的(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸、乙酯)、甲氧苄氟菊酯、苄氯菊酯、SS220或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱除剂的实例包含紫珠(紫珠(Callicarpa))叶、桦树树皮、沼泽桃金娘(bog myrtle)(香杨梅(MyricaGale))、猫薄荷油(例如，猫薄荷酮)、香茅油、柠檬桉树的精油(柠檬桉(Corymbiacitridora)；例如，对薄荷烷-3,8-二醇(PMD))、印楝油、柠檬草、来自互叶千层叶的茶树油、烟草或其提取物。
施肥剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含异源施肥剂。在一些情况下，异源施肥剂与细菌源性脂质组合物缔合。例如，细菌源性脂质组合物可以包封异源施肥剂。另外地或可替代地，异源施肥剂可以包埋在细菌源性脂质组合物的表面上或与所述表面缀合。
异源施肥剂的实例包含植物营养素或植物生长调控剂，如本领域众所周知的那些。可替代地或另外地，施肥剂可以是肽、多肽、核酸或多核苷酸，其可以增加植物共生体的适应性。施肥剂可以是可以增加多种植物或植物共生体的适应性的药剂，或者可以是靶向一种或多种特定靶标植物或植物共生体(例如，植物或植物共生体的特定物种或属)的药剂。
在一些情况下，可以对异源施肥剂进行修饰。例如，修饰可以是化学修饰，例如与标志物，例如荧光标志物或放射性标志物缀合。在其它实例中，修饰可以包含与增强药剂，例如脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)、阳离子部分的稳定性、递送、靶向、生物利用度或半衰期的部分的缀合或操作连接。
在一些情况下，异源施肥剂包含施加到土壤或植物组织以供应对植物生长至关重要的一种或多种植物营养素的任何天然或合成来源的材料。植物营养素可以包含大量营养素、微量营养素或其组合。植物大量营养素包含氮、磷、钾、钙、镁和/或硫。植物微量营养素包含铜、铁、锰、钼、锌、硼、硅、钴和/或钒。植物营养素肥料的实例包含氮肥，所述氮肥包含但不限于脲、硝酸铵、硫酸铵、无压氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、硫包衣脲、脲-甲醛、IBDU、聚合物包衣的脲、硝酸钙、脲醛或亚甲基脲、磷肥，如磷酸二铵、磷酸一铵、聚磷酸铵、经浓缩的过磷酸钙和三过磷酸钙或钾肥，如氯化钾、硫酸钾、硫酸镁钾、硝酸钾。此类组合物可作为游离盐或离子存在于组合物内。肥料可以通过其组分中的一种或多种，如氮、磷或钾的含量指定。肥料中的这些元素的含量可以通过N-P-K值表示(其中N＝按重量百分比计的氮含量，P＝按重量百分比计的磷含量，并且K＝按重量百分比计的钾含量)。
另一方面，无机肥料由非生命材料制成，并且包含例如硝酸铵、硫酸铵、脲、氯化钾、钾碱、磷酸铵、无水氨和其它磷酸盐。无机肥料易于商购获得，并且含有植物可立即获得的可溶形式的营养素。无机肥料通常便宜，对于期望元素具有低单位成本。本领域技术人员将理解，可以计算施肥剂中的给定元素的精确量并将其施用于植物或土壤。
肥料可以进一步分类为有机肥料或无机肥料。有机肥料包含具有具有碳骨架的分子骨架的肥料，如在源自有生命物质的组合物中。有机肥料由源自有生命事物的材料制成。动物粪便、堆肥、骨粉、羽毛粉和血粉是常见的有机肥料的实例。另一方面，有机肥料通常不能立即用于植物，并且需要土壤微生物体在由植物使用之前将肥料组分分解成更简单的结构。另外，有机肥料不仅可以引起如用常见无机肥料观察到的植物生长应答，而且天然有机肥料还可以刺激土壤微生物群体生长和活动。增加的土壤微生物群体(例如，植物共生体)可能对土壤的物理和化学特性具有显著的有益效果，以及增加抗病性和抗虫性。
一方面，包含植物营养素的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与植物接触：(a)在植物内部或植物上达到植物营养素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)相对于未经处理的植物，增加植物的适应性。
另一方面，包含植物营养素的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与植物共生体接触：(a)在植物共生体(例如，细菌或真菌内共生体)内部或植物共生体上达到植物营养素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)相对于未经处理的植物共生体，增加植物共生体的适应性。
异源施肥剂可以包含植物生长调控剂。示例性植物生长调控剂包含生长素、细胞分裂素、赤霉素和脱落酸。在一些情况下，植物生长调控剂为脱落酸、amidochlor、环丙嘧啶醇(ancymidol)、6-苄基氨基嘌呤、芸苔素内酯(brassinolide)、地乐胺(butralin)、矮壮素(chlormequat/chlormequat chloride)、氯化胆碱、环丙酰草胺(cyclanilide)、丁酰肼(daminozide)、敌草克(dikegulac)、噻节因(dimethipin)、2,6-二甲基嘌呤、乙烯利(ethephon)、氟节胺(flumetralin)、呋嘧醇(flurprimidol)、嗪草酸(fluthiacet)、氯吡苯脲(forchlorfenuron)、赤霉酸(gibberellic acids)、抗倒胺(inabenfide)、吲哚-3-乙酸、马来酰肼(maleic hydrazide)、氟磺酰草胺(mefluidide)、助壮素(mepiquat/mepiquatchloride)、萘乙酸、N-6-苄基腺嘌呤、多效唑(paclobutrazol)、调环酸(prohexadione)(调环酸钙(prohexadione-calcium))、茉莉酮(prohydrojasmon)、苯基噻二唑脲(thidiazuron)、抑芽唑(triapenthenol)、三硫代磷酸三丁酯、2,3,5-三碘苯甲酸、抗倒酯乙基(trinexapac-ethy)和烯效唑(uniconazole)。US2012/0108431中描述了可以并入种子涂层组合物的其它植物生长调控剂，所述文献通过引用整体并入。
植物改良剂
本文所描述的细菌源性脂质组合物包含一种或多种异源植物改良剂。例如，细菌源性脂质组合物可以包封异源植物改良剂。可替代地或另外地，异源植物改良剂可以包埋在细菌源性脂质组合物的表面上或与所述表面缀合。
在一些情况下，植物改良剂可以包含肽或核酸。植物改良剂可以是增加多种植物的适应性的药剂，或者可以是靶向一种或多种特定植物(例如，植物的特定物种或属)的药剂。另外地，在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的植物改良剂。
进一步地，在一些情况下，异源植物改良剂(例如，包含核酸分子或肽的药剂)可以被修饰。例如，修饰可以是化学修饰，例如与标志物，例如荧光标志物或放射性标志物缀合。在其它实例中，修饰可以包含与增强药剂，例如脂质、聚糖、聚合物(例如，PEG)、阳离子部分的稳定性、递送、靶向、生物利用度或半衰期的部分的缀合或操作连接。
多肽
细菌源性脂质组合物可以包含多肽。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含多肽或其功能片段或衍生物。
多肽的实例包含酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣。
多肽可以包含天然存在的多肽或重组产生的变体。在一些情况下，多肽可以是功能片段或其变体(例如，酶活性片段或其变体)。例如，多肽可以是本文所描述的任何多肽的功能活性变体，其例如在指定区域或整个序列上与本文所描述的多肽或天然存在的多肽的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一些情况下，多肽可以与所关注的蛋白质具有至少50％(例如，至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％或更高)同一性。
多肽可以调配在细菌源性脂质组合物中。本文所公开的组合物可以包含任何数量或类型(例如，种类)的多肽，如1种多肽、2种、3种、4种、5种、10种、15种、20种或更多种多肽中的至少约任一种。组合物中的每种多肽的合适浓度取决于如功效、多肽的稳定性、组合物中的不同多肽的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。在一些情况下，液体组合物中的每种多肽为约0.1ng/mL至约100mg/mL。在一些情况下，固体组合物中的每种多肽为约0.1mg/g至约100mg/g。
制备多肽的方法是本领域常规的。通常参见Smales和James(编辑),治疗性蛋白质：方法和方案(Therapeutic Proteins:Methods and Protocols)(《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》),胡玛纳出版社(Humana Press)(2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑),《制药生物技术基础与应用(PharmaceuticalBiotechnology:Fundamentals and Applications)》,施普林格出版社(Springer)(2013)。
用于产生多肽的方法涉及植物细胞中的表达，尽管重组蛋白也可以在适当的启动子的控制下使用昆虫细胞、酵母、细菌、哺乳动物细胞或其它细胞产生。哺乳动物表达载体可以包括非转录元件如复制起点、合适启动子和增强子，以及其它5'或3'侧接非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及终止序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点可用于提供表达异源DNA序列所需的其它基因元件。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体描述于Green和Sambrook,《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》》(第四版),冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(2012)。
各种哺乳动物细胞培养系统可以用于表达和制造重组多肽药剂。哺乳动物表达系统的实例包含CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。用于产生蛋白质治疗剂的宿主细胞培养物的过程描述于例如Zhou和Kantardjieff(编辑),用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养物(Mammalian Cell Cultures forBiologics Manufacturing)(生物化学工程化/生物技术领域进展),施普林格出版社(2014)中。蛋白质纯化描述于Franks,《蛋白质生物技术：分离、表征和稳定(Protein Biotechnology:Isolation,Characterization,andStabilization)》,胡玛纳出版社(2013)；以及于Cutler,《蛋白质纯化方案(ProteinPurification Protocols)》(《分子生物学方法(Methods inMolecular Biology)》),胡玛纳出版社(2010)中。蛋白质治疗剂的调配描述于Meyer(编辑),《治疗性蛋白药品：在实验室、制造和临床中的调配的实用方法(Therapeutic Protein Drug Products:PracticalApproaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and theClinic)》,伍德海德出版系列(Woodhead Publishing Series)(2012)。
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含抗体或其抗原结合片段。例如，本文所描述的药剂可以是阻断或增强组分的活性和/或功能的抗体。抗体可以充当多肽(例如，酶或细胞受体)的拮抗剂或激动剂。针对靶抗原的抗体的制备和使用是本领域已知的。参见例如ZhiqiangAn(编辑),《治疗性单克隆抗体：从实验室到临床(TherapeuticMonoclonalAntibodies:From Bench to Clinic)》,第1版,Wiley,2009，并且还有Greenfield(编辑),《抗体：实验室手册(Antibodies:ALaboratory Manual)》,第2版,冷泉港实验室出版社,2013,用于制备重组抗体的方法，包含抗体工程化、使用简并寡核苷酸、5'-RACE、噬菌体展示和诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。
核酸
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含核酸(多核苷酸)。许多核酸可用于本文所描述的细菌源性脂质组合物和方法。细菌源性脂质组合物可以包含任何数量或类型(例如，种类)的异源核酸(例如，DNA分子(例如，质粒)或RNA分子，例如，mRNA、向导RNA(gRNA)或抑制性RNA分子或其前体(例如，siRNA、shRNA或miRNA或其任何前体)，或杂交DNA-RNA分子)，如核酸的至少约1类或变体，或核酸的2类、3类、4类、5类、10类、15类、20类或更多类或变体。组合物中的每种核酸的合适浓度取决于如功效、核酸的稳定性、不同核酸的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。本文中有用的核酸的实例包含DNA分子(例如，质粒)、mRNA、siRNA、Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、反义RNA、短干扰RNA(siRNA)或siRNA前体(例如，分子间或分子内杂交形成具有至少约20个连续碱基对的至少部分双链RNA的一条或多条RNA链)、短发夹(shRNA)、微小RNA(miRNA)或miRNA前体、不对称干扰RNA(aiRNA)、肽核酸(PNA)、吗啉基、锁定核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适体(DNA，RNA)、环状RNA(circRNA)、向导RNA(gRNA)或编码这些RNA中任一种的DNA分子。
编码肽的核酸
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含编码多肽的核酸。编码多肽的核酸的长度可以为约10至约50,000个核苷酸(nt)、约25至约100nt、约50至约150nt、约100至约200nt、约150至约250nt、约200至约300nt、约250至约350nt、约300至约500nt、约10至约1000nt、约50至约1000nt、约100至约1000nt、约1000至约2000nt、约2000至约3000nt、约3000至约4000nt、约4000至约5000nt、约5000至约6000nt、约6000至约7000nt、约7000至约8000nt、约8000至约9000nt、约9000至约10,000nt、约10,000至约15,000nt、约10,000至约20,000nt、约10,000至约25,000nt、约10,000至约30,000nt、约10,000至约40,000nt、约10,000至约45,000nt、约10,000至约50,000nt或其间的任何范围。
细菌源性脂质组合物还可以包含所关注的核酸序列的活性变体。在一些情况下，核酸的变体例如在指定区域或整个序列上与所关注的核酸的序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含由核酸变体编码的活性多肽。在一些情况下，由核酸变体编码的活性多肽例如在指定区域或整个序列上与所关注的多肽的序列或天然衍生的多肽序列具有至少70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
用于表达编码蛋白质的核酸的某些方法可以涉及在适当启动子的控制下在细胞中表达，所述细胞包含昆虫、酵母、植物、细菌或其它细胞。表达载体可以包含非转录元件，例如复制起点、合适的启动子和增强子以及其它5'或3'侧接非转录序列，以及5'或3'非翻译序列，例如必要的核糖体结合位点、多腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及终止序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和多腺苷酸化位点可用于提供表达异源DNA序列所需的其它基因元件。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的适当克隆和表达载体描述于Green等人,《分子克隆：实验室手册》,第四版,冷泉港实验室出版社,2012中。
使用重组方法的遗传修饰通常是本领域已知的。编码所需基因的核酸序列可以使用本领域中已知的重组方法获得，例如使用标准技术，通过从表达所述基因的细胞中筛选文库，通过从已知包含所述基因的载体衍生所述基因，或通过从含有所述基因的细胞和组织直接分离。或者，所关注的基因可以合成方式产生，而不是克隆产生。
天然或合成核酸的表达通常是通过将编码所关注的基因的核酸与启动子可操作地连接，并且将构建体并入表达载体中来实现。表达载体可适合在细菌中复制和表达。表达载体也可适合在真核生物中复制和整合。典型的克隆载体含有适用于表达所需核酸序列的转录与翻译终止子、起始序列和启动子。
另外的启动子元件(例如增强子)调节转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游30至110碱基对(bp)的区域中，但最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，使得当元件相对于彼此倒置或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加到相隔50bp，更远则活性开始下降。取决于启动子，似乎个别元件可以协同或独立地发挥作用以活化转录。
合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。这个启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一实例是延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，还可使用其它组成型启动子序列，包含但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus)立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)启动子，以及人类基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。
可替代地，启动子可以是诱导型启动子。使用诱导型启动子提供了能够在期望此类表达时开启与其操作性地连接的多核苷酸序列的表达或者在不期望表达时关闭所述表达的分子开关。诱导型启动子的实例包含但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
待引入的表达载体还可以含有可选标记物基因或报告基因中的任一者或两者，以促进从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群体中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选标记物可携带在单独的DNA片段上且用于共转染程序。可选标记物和报告基因均可侧接有适当的调节序列，以使得能够在宿主细胞中表达。有用的可选标记物包含例如抗生素抗性基因，例如neo等。
报告基因可用于鉴定潜在转化的细胞且评估调节序列的功能。一般来说，报告基因是如下基因：其不存在于受体来源中或不由受体来源表达，并且编码通过一些易于检测的特性(例如酶活性)来体现表达的多肽。在DNA已引入受体细胞之后的合适时间分析报告基因的表达。合适的报告基因可以包含编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei等人,《FEBS快报》479:79-82,2000)。合适的表达系统是众所周知的，且可使用已知技术制备或商购获得。一般来说，具有显示报告基因最高表达水平的最小5'侧接区的构建体被鉴定为启动子。这些启动子区可以连接至报告基因并且用于评估药剂调节启动子驱动的转录的能力。
在一些情况下，生物体可以被遗传修饰以改变一种或多种蛋白质的表达。一种或多种蛋白质的表达可以在特定时间(例如，生物体的发育或分化状态)内被修饰。在一种情况下，本发明包含改变一种或多种蛋白质，例如影响活性、结构或功能的蛋白质的表达的组合物。一种或多种蛋白质的表达可限于一个或多个特定位置或广泛分布于整个生物体中。
mRNA
细菌源性脂质组合物可以包含mRNA分子，例如编码多肽的mRNA分子。mRNA分子可以是合成且经修饰的(例如，以化学方式)。mRNA分子可以在体外化学合成或转录。mRNA分子可安置于质粒上，例如病毒载体、细菌载体或真核表达载体。在一些实例中，mRNA分子可以通过转染、电穿孔或转导(例如，腺病毒或慢病毒转导)递送到细胞。
在一些情况下，本文所描述的经修饰的所关注RNA药剂具有经修饰的核苷或核苷酸。这些修饰是已知的，并且描述于例如WO 2012/019168中。另外的修饰描述于例如WO2015/038892、WO 2015/038892、WO 2015/089511、WO 2015/196130、WO 2015/196118和WO2015/196128A2中，所述文献通过引用整体并入本文中。
在一些情况下，编码所关注的多肽的经修饰RNA具有一个或多个末端修饰，例如5'帽结构和/或poly-A尾(例如，长度在100至200个核苷酸之间)。5'帽结构可选自由以下组成的组：CapO、Capl、ARCA、肌苷、Nl-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。在一些情况下，经修饰的RNA还含有5'UTR和3'UTR，所述5'UTR包含至少一个Kozak序列。这些修饰是已知的并且描述于例如WO 2012/135805和WO2013/052523中，所述文献通过引用整体并入本文中。另外的末端修饰描述于例如WO 2014/164253和WO 2016/011306、WO 2012/045075和WO 2014/093924中，所述文献通过引用整体并入本文中。用于合成可以包含至少一个化学修饰的加帽RNA分子(例如，经修饰mRNA)的嵌合酶描述于WO 2014/028429中，所述文献通过引用整体并入本文中。
在一些情况下，经修饰的mRNA可以环化或串联，以产生翻译胜任的分子来辅助poly-A结合蛋白与5'端结合蛋白之间的相互作用。环化或串联的机制可以通过至少3种不同途径进行：1)化学催化；2)酶催化；和3)核酶催化。新形成的5'-/3'-连接可以是分子内或分子间的。这些修饰描述于例如WO 2013/151736中。
制备和纯化经修饰的RNA的方法是本领域中已知和公开的。例如，经修饰的RNA仅使用体外转录(IVT)酶合成来制备。制备IVT多核苷酸的方法是本领域中已知的，并且描述于WO 2013/151666、WO 2013/151668、WO 2013/151663、WO 2013/151669、WO 2013/151670、WO 2013/151664、WO 2013/151665、WO 2013/151671、WO 2013/151672、WO 2013/151667和WO 2013/151736中。纯化方法包含通过以下方式来纯化包含polyA尾的RNA转录物：使样品与连接到多个胸苷或其衍生物和/或多个尿嘧啶或其衍生物(polyT/U)的表面在使得RNA转录物结合至所述表面的条件下接触，且从所述表面洗脱经纯化的RNA转录物(WO 2014/152031)；使用离子(例如阴离子)交换色谱法，其允许经由可扩展的方法分离长度长达10,000个核苷酸的较长RNA(WO 2014/144767)；以及使经修饰的mRNA样品经受DNA酶处理(WO2014/152030)。
经修饰的RNA的调配物是已知的，并且描述于例如WO 2013/090648中。例如，调配物可以是但不限于纳米颗粒、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球体、类脂质、脂质复合物、脂质体、聚合物、碳水化合物(包含单糖)、阳离子脂质、纤维蛋白凝胶、纤维蛋白水凝胶、纤维蛋白胶、纤维蛋白粘合剂、纤维蛋白原、凝血酶、快速消除的脂质纳米颗粒(reLNP)及其组合。
编码人类疾病、抗体、病毒和多种体内环境领域中的多肽的经修饰的RNA是已知的，并且公开于例如国际公开第WO 2013/151666号、第WO 2013/151668号、第WO 2013/151663号、第WO 2013/151669号、第WO 2013/151670号、第WO 2013/151664号、第WO 2013/151665号、第WO 2013/151736号的表6；国际公开第WO 2013/151672号的表6和7；国际公开第WO 2013/151671号的表6、178和179；国际公开第WO 2013/151667号的表6、185和186中。前述任一者可以合成为IVT多核苷酸、嵌合多核苷酸或环状多核苷酸，并且各自可以包含一个或多个经修饰的核苷酸或末端修饰。
抑制性RNA
在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含抑制性RNA分子，例如，其通过RNA干扰(RNAi)途径发挥作用。在一些情况下，抑制性RNA分子降低基因表达水平和/或降低蛋白质水平。在一些情况下，抑制性RNA分子抑制基因表达。例如，抑制性RNA分子可以包含靶向基因的短干扰RNA或其前体、短发夹RNA和/或微小RNA或其前体。某些RNA分子可以通过RNA干扰(RNAi)的生物学过程抑制基因表达。RNAi分子包含RNA或RNA样结构，其通常含有15至50个碱基对(例如约18至25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列一致(或互补)或几乎一致(或基本上互补)的核碱基序列。RNAi分子包含但不限于：短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、短发夹RNA(shRNA)、部分双链体、dicer底物和多价RNA干扰(美国专利第8,084,599号、第8,349,809号、第8,513,207号和第9,200,276号)。shRNA是一种RNA分子，包含通过RNAi降低靶基因的表达的发夹弯。shRNA可以以质粒的形式，例如病毒或细菌载体，例如通过转染、电穿孔或转导递送到细胞中。微小RNA是长度通常为约21个或22个核苷酸的非编码RNA分子。miRNA与mRNA分子上的靶位点结合并使mRNA沉默，例如通过引起mRNA的切割、使mRNA不稳定或抑制mRNA的翻译。在一些情况下，抑制性RNA分子降低负功能调控因子的水平和/或活性。在其它情况下，抑制剂RNA分子降低正功能调控因子的抑制剂的水平和/或活性。抑制性RNA分子可以在体外化学合成或转录。
在一些情况下，核酸是DNA、RNA或PNA。在一些情况下，RNA是抑制性RNA。在一些情况下，抑制性RNA抑制基因表达。在一些情况下，核酸是增加以下的表达的mRNA、经修饰的mRNA或DNA分子：酶(例如，代谢重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣。在一些情况下，核酸是增加以下的表达的mRNA、经修饰的mRNA或DNA分子：酶(例如，代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶或泛素化蛋白)、成孔蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白(例如，CRISPR-Cas系统、TALEN或锌指)、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣。在一些方面，核酸编码酶、孔形成蛋白、信号传导配体、细胞穿透肽、转录因子、受体、抗体、纳米抗体、基因编辑蛋白、核糖蛋白、蛋白质适体或伴侣。在一些情况下，表达增加是相较于参考水平(例如，未经处理的受试者中的表达)的表达增加约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些情况下，表达增加是参考水平(例如，未经处理的受试者中的表达)的表达的约2x倍、约4x倍、约5x倍、约10x倍、约20x倍、约25x倍、约50x倍、约75x倍或约100x倍或更多倍。
在一些情况下，核酸是反义RNA、dsiRNA、siRNA、shRNA、miRNA、aiRNA、PNA、吗啉代、LNA、piRNA、核酶、DNA酶、适体(DNA、RNA)、circRNA、gRNA或DNA分子(例如，质粒)，其用于降低例如酶(代谢酶、重组酶、解旋酶、整合酶、RNA酶、DNA酶、聚合酶、泛素化蛋白、超氧化物管理酶或能量产生酶)、转录因子、分泌蛋白、结构因子(肌动蛋白、驱动蛋白或微管蛋白)、核糖蛋白、蛋白质适体、伴侣、受体、信号传导配体或转运蛋白。在一些情况下，表达降低是相较于参考水平(例如，未经处理的受试者中的表达)的表达降低约5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些情况下，表达降低是参考水平(例如，未经处理的受试者中的表达)的表达的约1/2x、约1/4x、约1/5x、约1/10x、约1/20x、约1/25x、约1/50x、约1/75x或约1/100x或更少。
RNAi分子包含与靶基因的全部或片段基本上互补或完全互补的序列。RNAi分子可以补充内含子与外显子之间的边界处的序列，以防止特定基因的新生成的核RNA转录物成熟成mRNA以进行转录。与特定基因互补的RNAi分子可以与靶基因的mRNA杂交并防止其翻译。反义分子可以是DNA、RNA或其衍生物或杂合体。此类衍生物分子的实例包含但不限于肽核酸(PNA)和基于硫代磷酸酯的分子，如脱氧核糖核胍(DNG)或核糖核胍(RNG)。
RNAi分子可以作为体外合成的即用型RNA或作为转染到细胞中的有义和反义RNA序列(或编码有义和反义RNA序列的DNA)提供，其将在转录时产生RNAi分子。RNA分子与例如靶mRNA的杂交导致杂交复合物通过RNA酶H降解和/或抑制翻译复合物的形成。两者都导致无法产生原始基因的产物。
与所关注的转录物杂交的RNAi分子的长度可以为大约10个核苷酸、约15个或30个核苷酸、或约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个或更多个核苷酸。在实施例中，RNAi分子与所关注的转录物杂交以形成至少约17个碱基对的完全或接近完全双链区；在实施例中，双链区包含至少约10个连续碱基对。反义序列与靶向转录物的同一性程度可以为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95。
RNAi分子还可以包含突出端，即通常不成对的突出核苷酸，其不直接参与通常由本文定义的一对有义链和反义链的核心序列形成的双螺旋结构。RNAi分子可以在有义链和反义链中的每一者上独立地含有约1-5个碱基的3'和/或5'突出端。在一些情况下，有义链和反义链两者均含有3'和5'突出端。在一些情况下，一条链碱基的3'突出核苷酸中的一个或多个与另一条链的一个或多个5'突出核苷酸配对。在其它情况下，一条链碱基的3'突出核苷酸中的所述一个或多个不与另一条链的所述一个或多个5'突出核苷酸配对。RNAi分子的有义链和反义链可以含有或可以不含相同数量的核苷酸碱基。反义链和有义链可以形成双链体，其中5'端仅具有平端，3'端仅具有平端，5'端和3'端两者均是平端，或者5'端和3'端均不是平端。在另一种情况下，突出端中的核苷酸的一个或多个含有硫代磷酸酯(thiophosphate)、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、脱氧核苷酸反向(3'至3'连接的)核苷酸或者是经修饰的核糖核苷酸或脱氧核苷酸。
小干扰RNA(siRNA)分子包含与靶mRNA的约15个至约25个连续核苷酸相同的核苷酸序列。在一些情况下，siRNA序列以二核苷酸AA开始，包含约30-70％(约30-60％、约40-60％或约45％-55％)的GC含量，并且例如如通过标准BLAST搜索所确定的，与要引入到其中的基因组中的除靶标外的任何核苷酸序列不具有高同一性百分比。
siRNA和shRNA类似于内源性微小RNA(miRNA)基因的加工途径中的中间体(Bartel,《细胞(Cell)》116:281-297,2004)。在一些情况下，siRNA可以充当miRNA，并且反之亦然(Zeng等人,《分子细胞(Mol.Cell)》9:1327-1333,2002；Doench等人,《基因与发育(Genes Dev.)》17:438-442,2003)。外源性siRNA下调与siRNA具有种子互补性的mRNA(Birmingham等人,《自然方法(Nat.Methods)》3:199-204,2006)。3'UTR内的多个靶位点提供更强的下调(Doench等人,《基因疗法(Genes Dev.)》17:438-442,2003)。
已知的有效siRNA序列和同源结合位点也在相关文献中得到充分表示。RNAi分子容易通过本领域已知的技术设计和产生。另外，一些计算工具增加了找到有效和特异性序列基序的机会(Pei等人,《自然方法》3(9):670-676,2006；Reynolds等人,《自然生物技术》22(3):326-330,2004；Khvorova等人,《自然结构与生物学(Nat.Struct.Biol.)》10(9):708-712,2003；Schwarz等人,《细胞》115(2):199-208,2003；Ui-Tei等人,《核酸研究(NucleicAcids Res.)》32(3):936-948,2004；Heale等人,《核酸研究》33(3):e30,2005；Chalk等人,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》319(1):264-274,2004；以及Amarzguioui等人,《生物化学与生物物理研究通讯》316(4):1050-1058,2004)。
RNAi分子调节由基因编码的RNA的表达。由于多个基因可以彼此共享一定程度的序列同源性，因此在一些情况下，RNAi分子可以被设计成靶向具有足够序列同源性的一类基因。在一些情况下，RNAi分子可以含有与在不同基因靶标之间共享的序列互补的序列，或者对于特定基因靶标是唯一的序列。在一些情况下，RNAi分子可以被设计成靶向RNA序列的在若干基因之间具有同源性的保守区，由此靶向基因家族中的若干基因(例如，不同基因同种型、剪接变体、突变基因等)。在一些情况下，RNAi分子可以被设计成靶向单个基因的特定RNA序列所特有的序列。
抑制性RNA分子可以被修饰，例如以含有经修饰的核苷酸，例如2'-氟、2'-邻甲基、2'-脱氧、未锁定核酸、2'-羟基、硫代磷酸酯、2'-硫代尿苷、4'-硫代尿苷、2'-脱氧尿苷。不受理论束缚，据信此类修饰可以增加核酸酶抗性和/或血清稳定性，或者降低免疫原性。
在一些情况下，RNAi分子或其前体通过生理不稳定的键或接头与递送聚合物连接。选择生理不稳定接头，使得当在某些生理条件下存在时，其经历化学转化(例如，切割)(例如，在细胞质的还原环境中切割的二硫键)。通过切割生理不稳定键从聚合物释放分子有助于分子与适当的细胞组分相互作用以进行活动。
RNAi分子-聚合物缀合物可以通过将分子与聚合物共价连接来形成。聚合物被聚合或被修饰以使得其含有反应性基团A。RNAi分子也被聚合或被修饰以使得其含有反应性基团B。选择反应性基团A和B，使得其可以使用本领域已知的方法通过可逆共价键连接。
RNAi分子与聚合物的缀合可以在存在过量聚合物的情况下进行。因为RNAi分子和聚合物在缀合期间可能具有相反电荷，所以过量聚合物的存在可以减少或消除缀合物的聚集。可替代地，可以使用过量的载剂聚合物，如聚阳离子。在施用缀合物之前，可以从经缀合的聚合物中去除过量的聚合物。可替代地，过量聚合物可以与缀合物共施用。
基于非编码RNA，如核酶、RNA酶P、siRNA和miRNA的抑制剂的制备和使用也是本领域已知的，例如，如Sioud,RNA治疗剂：功能、设计和递送(Therapeutics:Function,Design,and Delivery)(《分子生物学方法(Methods in MolecularBiology)》)胡玛纳出版社(2010)所描述的。
基因编辑
细菌源性脂质组合物可以包含基因编辑系统的组分。例如，药剂可以在基因中引入改变(例如，插入、缺失(例如，敲除)、易位、倒位、单点突变或其它突变)。示例性基因编辑系统包含锌指核酸酶(ZFN)、基于转录活化因子样效应物的核酸酶(TALEN)和簇状调节间隔短回文重复序列(CRISPR)系统。基于ZFN、TALEN和CRISPR的方法描述于例如Gaj等人,生物技术趋势(Trends Biotechnol)31(7):397-405,2013中。
关于基因编辑系统的组分和过程的其它描述可见于国际专利申请公开案第WO2021/041301号中，所述公开案通过引用整体并入本文中。
异源治疗剂
细菌源性脂质组合物可以包含治疗剂(例如，影响动物(例如，哺乳动物，例如，人类)、动物病原体或其病原体载体，并且可以装载到细菌源性脂质组合物中的药剂)，如治疗性肽、治疗性核酸(例如，治疗性RNA)、治疗性小分子或病原体控制剂(例如，抗真菌剂、抗菌剂、杀病毒剂、抗病毒剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂或昆虫驱除剂)。装载有此类药剂的细菌源性脂质组合物可以与药学上可接受的载剂调配，以用于递送到动物、动物病原体或其病原体载体。
抗菌剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含抗菌剂。例如，包含抗生素的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间施用于动物：在动物体内或动物身上达到抗生素浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或治疗或预防动物中的细菌感染。对于本文所描述的方法中的任何方法，抗菌剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的抗菌剂。
如本文所使用的，术语“抗菌剂”是指杀伤或抑制细菌，如植物病原细菌的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的材料，并包含杀菌剂(例如，消毒剂化合物、防腐化合物或抗生素)或抑菌剂(例如，化合物或抗生素)。杀菌抗生素杀伤细菌，而抑菌抗生素仅减慢其生长或繁殖。
示例性杀菌剂包含上文在“异源农业剂”部分中已经讨论过的与抗菌剂有关的杀菌剂。
作为防腐剂(即，可以用于人或动物身体、皮肤、粘膜、伤口等的杀菌剂)，在适当的条件下(主要是对人/动物的浓度、pH、温度和毒性)可以使用上述消毒剂中的几种。其中，重要的是：适当稀释的氯制剂(即Daquin溶液、0.5％次氯酸钠或次氯酸钾溶液，pH调节至pH为7-8，或0.5％-1％苯磺基氯胺钠(氯胺B)溶液)；一些碘制剂，如各种盖伦(软膏、溶液、创口贴)中的碘代聚维酮，过去也有卢戈氏溶液、过氧化物作为过水脲溶液和pH缓冲的0.1％-0.25％过氧乙酸溶液；含或不含防腐剂添加剂的醇，主要用于皮肤防腐；弱有机酸，如山梨酸、苯甲酸、乳酸和水杨酸；一些酚类化合物，如六氯苯、三氯生和二溴；以及阳离子活性化合物，如0.05％-0.5％的苯扎氯铵、0.5-4％的氯己定、0.1-2％的奥替尼啶溶液。
细菌源性脂质组合物可以包含抗生素。可以使用本领域中已知的任何抗生素。通常基于抗生素的作用机制、化学结构或活性谱范围对抗生素进行分类。
本文所描述的抗生素可以靶向任何细菌功能或生长过程，并且可以是抑菌的(例如，减慢或防止细菌生长)或杀菌的(例如，杀伤细菌)。在一些情况下，抗生素是杀菌抗生素。在一些情况下，杀菌抗生素是靶向细菌细胞壁的抗生素(例如，青霉素和头孢菌素)；靶向细胞膜的抗生素(例如，多粘菌素)；或抑制必需细菌酶的抗生素(例如，利福霉素、闰年霉素、喹诺酮和磺酰胺)。在一些情况下，杀菌抗生素是氨基糖苷(例如，春日霉素)。在一些情况下，抗生素是抑菌抗生素。在一些情况下，抑菌抗生素靶向蛋白质合成(例如，大环内酯类、林可酰胺类和四环素类)。本文可以使用的另外的种类的抗生素包含环状脂肽(如达托霉素)、甘氨酰环素(如替加环素)、噁唑烷酮(如利奈唑胺)或闰年霉素(如非达霉素)。抗生素的实例包含利福平、环丙沙星、多西环素、氨苄西林和多粘菌素B。本文所描述的抗生素可以具有任何水平的靶特异性(例如，窄谱或广谱)。在一些情况下，抗生素是窄谱抗生素，并且因此靶向特定类型的细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。可替代地，抗生素可以是靶向广泛范围的细菌的广谱抗生素。
适于治疗动物的抗菌剂的实例包含盘尼西林(阿莫西林(Amoxicillin)、氨比西林(Ampicillin)、巴氨西林(Bacampicillin)、羧苄青霉素(Carbenicillin)、氯洒西林(Cloxacillin)、双氯西林(Dicloxacillin)、氟氯西林(Flucloxacillin)、美洛西林(Mezlocillin)、萘夫西林(Nafcillin)、苯唑西林(Oxacillin)、盘尼西林G(PenicillinG)、普鲁卡因青霉素(Crysticillin)300A.S.、青霉素G钾(Pentids)、苄星青霉素(Permapen)、苄青霉素(Pfizerpen)、苄青霉素AS、威西林(Wycillin)、盘尼西林V、哌拉西林(Piperacillin)、匹氨西林(Pivampicillin)、匹美西林(Pivmecillinam)、替卡西林(Ticarcillin))、头孢菌素(Cephalosporins)(头孢乙腈(Cefacetrile)(头孢塞曲(cephacetrile)))、头孢羟氨苄(Cefadroxil/cefadroxyl)、头孢氨苄(Cefalexin/cephalexin)、头孢来星(Cefaloglycin/cephaloglycin)、头孢洛宁(Cefalonium/cephalonium)、头孢噻啶(Cefaloridine/cephaloradine)、头孢噻吩(Cefalotin/cephalothin)、头孢匹林(Cefapirin/cephapirin)、头孢曲秦(Cefatrizine)、头孢氮氟(Cefazaflur)、头孢西酮(Cefazedone)、头孢唑啉(Cefazolin/cephazolin)、头孢拉定(Cefradine/cephradine)、头孢沙定(Cefroxadine)、头孢替唑(Ceftezole)、头孢克洛(Cefaclor)、头孢羟唑(Cefamandole)、头孢美唑(Cefmetazole)、头孢尼西(Cefonicid)、头孢替坦(Cefotetan)、头孢西丁(Cefoxitin)、头孢罗齐(Cefprozil/cefproxil)、头孢呋辛(Cefuroxime)、头孢唑喃(Cefuzonam)、头孢卡品(Cefcapene)、头孢达肟(Cefdaloxime)、头孢地尼(Cefdinir)、头孢托仑(Cefditoren)、头孢他美(Cefetamet)、头孢克肟(Cefixime)、头孢甲肟(Cefmenoxime)、头孢地秦(Cefodizime)、头孢噻肟(Cefotaxime)、头孢咪唑(Cefpimizole)、头孢泊肟(Cefpodoxime)、头孢特仑(Cefteram)、头孢布烯(Ceftibuten)、头孢噻呋(Ceftiofur)、头孢噻林(Ceftiolene)、头孢唑肟(Ceftizoxime)、头孢曲松(Ceftriaxone)、头孢哌酮(Cefoperazone)、头孢他啶(Ceftazidime)、头孢克定(Cefclidine)、头孢吡肟(Cefepime)、头孢瑞南(Cefluprenam)、头孢噻利(Cefoselis)、头孢唑兰(Cefozopran)、头孢匹罗(Cefpirome)、头孢喹肟(Cefquinome)、头孢托罗(Ceftobiprole)、头孢洛林(Ceftaroline)、头孢氯嗪(Cefaclomezine)、头孢洛仑(Cefaloram)、头孢帕罗(Cefaparole)、头孢卡奈(Cefcanel)、头孢屈洛(Cefedrolor)、头孢吡酮(Cefempidone)、头孢三唑(Cefetrizole)、头孢维曲(Cefivitril)、头孢马替林(Cefmatilen)、头孢氯铵(Cefmepidium)、头孢维星(Cefovecin)、头孢噁唑(Cefoxazole)、头孢罗替(Cefrotil)、头孢舒米(Cefsumide)、头孢呋汀(Cefuracetime)、头孢噻氧(Ceftioxide)、组合、头孢他啶(Ceftazidime)/阿维巴坦(Avibactam)、头孢洛扎(Ceftolozane)/他唑巴坦(Tazobactam)、单内酰环类(氨曲南(Aztreonam))、碳青霉烯类(亚胺培南(Imipenem))、亚胺培南/西司他丁(cilastatin)、多利培南(Doripenem)、厄他培南(Ertapenem)、美罗培南(Meropenem)、美罗培南/法硼巴坦(vaborbactam)、大环内酯类(阿奇霉素(Azithromycin)、红霉素(Erythromycin)、克拉霉素(Clarithromycin)、地红霉素(Dirithromycin)、罗红霉素(Roxithromycin)、泰利霉素(Telithromycin))、林可酰胺类(克林霉素(Clindamycin)、林可霉素(Lincomycin))、链阳菌素类(普那霉素(Pristinamycin)、奎奴普丁(Quinupristin)/达福普利丁(dalfopristin))、氨基糖苷类(阿米卡星(Amikacin)、庆大霉素(Gentamicin)、卡那霉素(Kanamycin)、新霉素(Neomycin)、奈替米星(Netilmicin)、巴龙霉素(Paromomycin)、链霉素(Streptomycin)、托普霉素(Tobramycin))、喹诺酮(Quinolone)(氟甲喹(Flumequine)、萘啶酸(Nalidixicacid)、奥索利酸(Oxolinic acid)、吡咯米酸(Piromidic acid)、吡哌酸(Pipemidicacid)、罗索沙星(Rosoxacin)、第二代、环丙沙星(Ciprofloxacin)、依诺沙星(Enoxacin)、洛美沙星(Lomefloxacin)、那地沙星(Nadifloxacin)、诺氟沙星(Norfloxacin)、氧氟沙星(Ofloxacin)、培氟沙星(Pefloxacin)、芦氟沙星(Rufloxacin)、巴洛沙星(Balofloxacin)、加替沙星(Gatifloxacin)、格雷沙星(Grepafloxacin)、左氧氟沙星(Levofloxacin)、莫西沙星(Moxifloxacin)、帕珠沙星(Pazufloxacin)、司帕沙星(Sparfloxacin)、替马沙星(Temafloxacin)、托氟沙星(Tosufloxacin)、贝西沙星(Besifloxacin)、德拉沙星(Delafloxacin)、克林沙星(Clinafloxacin)、吉米沙星(Gemifloxacin)、普卢利沙星(Prulifloxacin)、西他沙星(Sitafloxacin)、曲伐沙星(Trovafloxacin))、磺酰胺类(磺胺甲二唑(Sulfamethizole)、磺胺甲噁唑(Sulfamethoxazole)、磺胺异噁唑(Sulfisoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲噁唑(Trimethoprim-Sulfamethoxazole))、四环素(地美环素(Demeclocycline)、强力霉素(Doxycycline)、米诺环素(Minocycline)、氧四环素(Oxytetracycline)、四环素、替加环素(Tigecycline)、其它(脂肽、氟喹诺酮(Fluoroquinolone)、脂糖肽类、头孢菌素(Cephalosporin)、大环类(Macrocyclics)、氯霉素(Chloramphenicol)、甲硝哒唑(Metronidazole)、替硝唑(Tinidazole)、呋喃妥英(Nitrofurantoin)、糖肽类、万古霉素(Vancomycin)、替考拉宁(Teicoplanin)、脂糖肽类、泰拉万欣(Telavancin)、噁唑烷酮类(Oxazolidinones)、利奈唑胺(Linezolid)、环丝氨酸2、利福霉素(Rifamycins)、利福平(Rifampin)、利福布汀(Rifabutin)、利福喷汀(Rifapentine)、利福拉齐(Rifalazil)、多肽、杆菌肽(Bacitracin)、多粘菌素B、结核放线菌素(Tuberactinomycins)、紫霉素(Viomycin)、卷曲霉素(Capreomycin))。
本领域技术人员将理解，组合物中的每种抗生素的合适浓度取决于如功效、抗生素的稳定性、不同抗生素的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
抗真菌剂
本文所描述的细菌源性脂质组合物可以进一步包含抗真菌剂。例如，包含抗真菌剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间施用于动物：在动物体内或动物身上达到抗真菌剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或治疗或预防动物中的真菌感染。对于本文所描述的方法中的任何方法，本文所描述的抗真菌剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的抗真菌剂。
如本文所使用的，术语“杀真菌剂”或“抗真菌剂”是指杀伤或抑制真菌，如对动物致病的真菌的生长、增殖、分裂、繁殖或传播的物质。许多不同类型的抗真菌剂已商业生产。抗真菌剂的非限制性实例包含：烯丙胺(阿莫罗芬(Amorolfin)、布替萘芬(Butenafine)、萘替芬(Naftifine)、特比萘芬(Terbinafine))、咪唑类(联苯苄唑(Bifonazole)、布康唑(Butoconazole)、克霉唑(Clotrimazole)、益康唑(Econazole)、芬替康唑(Fenticonazole)、酮康唑(Ketoconazole)、异康唑(Isoconazole)、卢立康唑(Luliconazole)、咪康唑(Miconazole)、奥莫康唑(Omoconazole)、奥昔康唑(Oxiconazole)、塞他康唑(Sertaconazole)、硫康唑(Sulconazole)、噻康唑(Tioconazole)、特康唑(Terconazole)；三唑类(阿巴康唑(Albaconazole)、艾氟康唑(Efinaconazole)、氟康唑(Fluconazole)、艾沙康唑(Isavuconazole)、依曲康唑(Itraconazole)、泊沙康唑(Posaconazole)、雷夫康唑(Ravuconazole)、特康唑、伏立康唑(Voriconazole))、噻唑类(阿巴芬净(Abafungin))、多烯类(两性霉素B、制真菌素(Nystatin)、那他霉素(Natamycin)、曲古霉素(Trichomycin))、棘白菌素类(Echinocandins)(阿尼芬净(Anidulafungin)、卡泊芬净(Caspofungin)、米卡芬净(Micafungin))、其它(托萘酯(Tolnaftate)、氟胞嘧啶(Flucytosine)、布替萘芬(Butenafine)、灰黄霉素(Griseofulvin)、环匹罗司(Ciclopirox)、硫化硒(Seleniumsulfide)、他伐硼罗(Tavaborole))。本领域技术人员将理解，组合物中的每种抗真菌剂的合适浓度取决于如功效、抗真菌剂的稳定性、不同抗真菌剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
杀虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含杀虫剂。例如，杀虫剂可以降低动物病原体的昆虫载体的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含杀虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与昆虫接触：(a)在昆虫内部或昆虫上达到杀虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低昆虫的适应性。在一些情况下，杀虫剂可以降低寄生昆虫的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含杀虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与寄生昆虫或受其感染的动物接触：(a)在寄生昆虫内部或寄生昆虫上达到杀虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低寄生昆虫的适应性。对于本文所描述的方法中的任何方法，本文所描述的杀虫剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的杀虫剂。
如本文所使用的，术语杀虫剂(“insecticide”或“insecticidal agent”)是指杀伤或抑制昆虫，如动物病原体的昆虫载体或寄生昆虫的生长、增殖、繁殖或传播的物质。杀虫剂的非限制性实例在WO 2021/041301的表4中找到，所述文献通过引用整体并入本文。合适的杀虫剂的另外的非限制性实例包含上文在“异源农业剂”部分中已经讨论过的杀虫剂。本领域技术人员将理解，组合物中的每种杀虫剂的合适浓度取决于如功效、杀虫剂的稳定性、不同杀虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
杀线虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含作为治疗剂的杀线虫剂。用作治疗剂的杀线虫剂的非限制性实例包含上文在“异源农业剂”部分中已经讨论过的与杀线虫剂有关的那些。
抗寄生虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含抗寄生虫剂。例如，抗寄生虫剂可以降低寄生原生动物的适应性(例如，减少生长或杀伤)。包含如本文所描述的抗寄生虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与原生动物接触：(a)在原生动物或受其感染的动物内部或其上达到抗寄生虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；以及(b)降低原生动物的适应性。这可用于治疗或预防动物中的寄生虫。例如，包含如本文所描述的抗寄生虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间施用于动物：在动物体内或动物身上达到抗寄生虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或治疗或预防动物中的寄生虫(例如，寄生线虫、寄生昆虫或原生动物)感染。对于本文所描述的方法中的任何方法，本文所描述的抗寄生虫剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与其细菌源性脂质组合物相缔合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的抗寄生虫剂。
如本文所使用的，术语抗寄生虫剂(“antiparasitic”或“antiparasitic agent”)是指杀伤或抑制寄生虫，如寄生原生动物、寄生线虫或寄生昆虫的生长、增殖、繁殖或传播的物质。抗寄生虫剂的实例包含驱肠虫剂(Antihelmintics)(苄酚宁(Bephenium)、乙胺嗪(Diethylcarbamazine)、伊佛霉素(Ivermectin)、氯硝柳胺(Niclosamide)、哌嗪(Piperazine)、吡喹酮(Praziquantel)、噻嘧啶(Pyrantel)、吡维铵(Pyrvinium)、苯并咪唑、阿苯达唑(Albendazole)、氟苯达唑(Flubendazole)、甲苯咪唑(Mebendazole)、噻苯咪唑(Thiabendazole)、左旋咪唑(Levamisole)、硝唑尼特(Nitazoxanide)、Monopantel、艾默德斯(Emodepside)、螺吲哚(Spiroindoles))、抗疥螨剂(Scabicides)(苯甲酸苄酯、苯甲酸苄酯/双硫仑(disulfiram)、林丹(Lindane)、马拉松(Malathion)、苄氯菊酯(Permethrin))、灭虱药(Pediculicides)(辟喹醚(Piperonyl butoxide/除虫菊素(pyrethrins)、多杀菌素(Spinosad)、莫昔克丁(Moxidectin))、抗疥螨剂(克罗米通(Crotamiton))、抗绦虫剂(Anticestodes)(氯硝柳胺、吡喹酮、阿苯达唑)、抗阿米巴药(Antiamoebics)(利福平、两性霉素B)；或者抗原虫剂(Antiprotozoals)(美拉胂醇(Melarsoprol)、依洛尼塞(Eflornithine)、甲硝哒唑(Metronidazole)、替硝唑、米替福新(Miltefosine)、青蒿素(Artemisinin))。在某些情况下，抗寄生虫剂可以用于治疗或预防牲畜动物感染，例如，左旋咪唑、芬苯达唑(Fenbendazole)、奥芬达唑(Oxfendazole)、阿苯达唑(Albendazole)、莫昔克丁、依立诺克丁(Eprinomectin)、多拉菌素(Doramectin)、伊佛霉素或克洛索隆(Clorsulon)。本领域技术人员将理解，组合物中的每种抗寄生虫剂的合适浓度取决于如功效、抗寄生虫剂的稳定性、不同抗寄生虫剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
抗病毒剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含抗病毒剂。包含抗病毒剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间施用于动物：在动物体内或动物身上达到抗病毒剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或到治疗或预防动物中的病毒感染。对于本文所描述的方法中的任何方法，本文所描述的抗病毒剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的抗病毒剂。
如本文所使用的，术语“抗病毒剂(antiviral)”或“杀病毒剂(virucide)”是指杀伤或抑制病毒，如感染动物的病毒病原体的生长、增殖、繁殖、发育或传播的物质。多种药剂可以用作抗病毒剂，包含化学品或生物药剂(例如，核酸，例如，dsRNA)。本文中有用的抗病毒剂的实例包含阿巴卡韦(Abacavir)、阿昔洛韦(Acyclovir/Aciclovir)、阿德福韦(Adefovir)、金刚烷胺(Amantadine)、安普那韦(Amprenavir/Agenerase)、安普利根(Ampligen)、阿比多尔(Arbidol)、阿扎那韦(Atazanavir)、阿特普拉(Atripla)、巴尔韦(Balavir)、西多福韦(Cidofovir)、可比韦(Combivir)、度鲁特韦(Dolutegravir)、地瑞那韦(Darunavir)、地拉韦啶(Delavirdine)、地达诺新(Didanosine)、二十二醇(Docosanol)、依度尿苷(Edoxudine)、依非韦伦(Efavirenz)、恩曲他滨(Emtricitabine)、恩夫韦地(Enfuvirtide)、恩替卡韦(Entecavir)、埃克列韦(Ecoliever)、泛昔洛韦(Famciclovir)、福米韦生(Fomivirsen)、福桑普那韦(Fosamprenavir)、膦甲酸钠(Foscarnet)、膦乙酸钠(Fosfonet)、融合抑制剂(Fusion inhibitor)、更昔洛韦(Ganciclovir)、依巴他滨(Ibacitabine)、异丙肌苷(Imunovir)、碘苷(Idoxuridine)、咪喹莫特(Imiquimod)、茚地那韦(Indinavir)、肌苷(Inosine)、整合酶抑制剂(Integrase inhibitor)、III型干扰素(Interferon type III)、II型干扰素(Interferon type II)、I型干扰素(Interferontype I)、干扰素(Interferon)、拉米夫定(Lamivudine)、洛匹那韦(Lopinavir)、洛韦利德(Loviride)、马拉韦罗(Maraviroc)、吗啉脒胍(Moroxydine)、美替沙腙(Methisazone)、奈非那韦(Nelfinavir)、奈韦拉平(Nevirapine)、多吉美(Nexavir)、硝唑尼特(Nitazoxanide)、核苷类似物(Nucleoside analogues)、利托那韦(Norvir)、奥瑟他韦(Oseltamivir)(特敏福(Tamiflu))、聚乙二醇干扰素α-2a(Peginterferon alfa-2a)、喷昔洛韦(Penciclovir)、帕拉米韦(Peramivir)、普拉康纳利(Pleconaril)、足叶草毒素(Podophyllotoxin)、雷特格韦(Raltegravir)、利巴韦林(Ribavirin)、金刚烷乙胺(Rimantadine)、利托那韦(Ritonavir)、嘧啶(Pyramidine)、沙奎那韦(Saquinavir)、索非布韦(Sofosbuvir)、司他夫定(Stavudine)、协同增强剂(抗逆转录病毒)、特拉匹韦(Telaprevir)、替诺福韦(Tenofovir)、替诺福韦二吡呋酯(Tenofovir disoproxil)、替普那韦(Tipranavir)、三氟尿苷(Trifluridine)、拉米夫定(Trizivir)、曲金刚胺(Tromantadine)、特鲁瓦达(Truvada)、伐昔洛韦(Valaciclovir)、缬更昔洛韦(Valganciclovir)、维立韦罗(Vicriviroc)、维达拉滨(Vidarabine)、塔利韦林(Viramidine)、扎西他滨(Zalcitabine)、扎那米韦(Zanamivir)(瑞乐沙(Relenza))或齐多夫定(Zidovudine)。本领域技术人员将理解，组合物中的每种抗病毒剂的合适浓度取决于如功效、抗病毒剂的稳定性、不同抗病毒剂的数量、调配物和组合物的施用方法等因素。
驱虫剂
细菌源性脂质组合物可以进一步包含驱虫剂。例如，驱虫剂可以驱除动物病原体的载体，如昆虫。对于本文所描述的方法中的任何方法，本文所描述的驱虫剂可以调配在细菌源性脂质组合物中，并且在某些情况下，可以与细菌源性脂质组合物相缔合。在一些情况下，细菌源性脂质组合物包含两种或更多种(例如，2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或多于10种)不同的驱虫剂。
例如，包含如本文所描述的驱虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与昆虫载体或载体的栖息地接触：(a)达到驱虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或(b)相对于对照，降低动物附近的昆虫水平。可替代地，包含如本文所描述的驱虫剂的细菌源性脂质组合物可以足以进行以下的量和时间与动物接触：(a)达到驱虫剂浓度的目标水平(例如，预定或阈值水平)；和/或(b)相对于未经处理的动物，降低动物附近或动物上的昆虫水平。
众所周知的昆虫驱除剂的一些实例包含：苯偶酰；苯甲酸苄酯；2,3,4,5-双(丁基-2-烯)四氢糠醛(MGK驱虫剂11)；丁氧基聚丙二醇；N-丁基乙酰苯胺；正丁基-6,6-二甲基-5,6-二氢-1,4-吡喃酮-2-甲酸酯(避虫酮)；己二酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯；琥珀酸二正丁酯(驱虫特)；N,N-二乙基-间甲苯酰胺(DEET)；驱蚊灵；双环[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸(内,内)-二甲酯；邻苯二甲酸二甲酯；2-乙基-2-丁基-1,3-丙二醇；2-乙基-1,3-己二醇(Rutgers 612)；异辛可部酸二正丙酯(MGK驱虫剂326)；2-苯基环己醇；对甲烷-3,8-二醇和N,N-二乙基琥珀酸正丙酯。其它驱虫剂包含香茅油、邻苯二甲酸二甲酯、草酸正丁基甲苯甲醛和2-乙基己二醇-1,3(参见Kirk-Othmer《化学技术百科全书》,第2版,第11卷：724-728；和《简明化学词典》,第8版,第756页)。
在一些情况下，驱虫剂是昆虫驱逐剂，包含合成或非合成昆虫驱逐剂。合成昆虫驱除剂的实例包含邻氨基苯甲酸甲酯和其它基于邻氨基苯甲酸酯的昆虫驱除剂、苯甲醛、DEET(N,N-二乙基-间甲苯酰胺)、碳酸二甲酯、邻苯二甲酸二甲酯、艾卡瑞丁(即派卡瑞丁、Bayrepel和KBR 3023)、避虫酮(例如，如在“6-2-2”混合物中使用的(60％邻苯二甲酸二甲酯、20％避虫酮、20％乙基己二醇)、IR3535(3-[N-丁基-N-乙酰基]-氨基丙酸、乙酯)、甲氧苄氟菊酯、苄氯菊酯、SS220或三环癸烯基烯丙基醚。天然昆虫驱除剂的实例包含紫珠(紫珠)叶、桦树树皮、沼泽桃金娘(香杨梅)、猫薄荷油(例如，猫薄荷酮)、香茅油、柠檬桉树的精油(柠檬桉；例如，对薄荷烷-3,8-二醇(PMD))、印楝油、柠檬草、来自互叶千层叶的茶树油、烟草或其提取物。
细菌源性脂质组合物的用途
细菌源性脂质组合物可用于各种农业或治疗性应用。下文进一步描述使用细菌源性脂质组合物的方法的实例。
递送到植物
本文提供了例如通过使植物或其部分(例如，植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞、原生质体或组织(例如，分生组织))与细菌源性脂质组合物接触而将细菌源性脂质组合物递送到植物的方法。在一些情况下，植物可以用不包含异源功能剂的细菌源性脂质组合物处理。在其它情况下，细菌源性脂质组合物包含异源功能剂，例如杀虫剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、除草剂)、害虫控制剂(例如，驱虫剂)、施肥剂或植物改良剂。
在一些实施例中，本文提供了一种增加植物的适应性的方法，所述方法包含向植物递送细菌源性脂质组合物，例如，通过使植物或其部分(例如，植物的叶、种子、花粉、根、果实、芽、花、细胞、原生质体或组织(例如，分生组织))与本文所描述的细菌源性脂质组合物接触(例如，以有效量和持续时间)，以相对于未经处理的植物(例如，尚未递送细菌衍生脂质组合物的植物)增加植物的适应性。
由于细菌源性脂质组合物的递送而导致的植物适应性的增加可以以多种方式表现出来，例如，由此导致植物的更好产生，例如，提高产率，提高植物的活力(例如，提高对非生物或生物应力的耐受性或提高对害虫的抗性)或提高从植物采集的产物的质量。相对于在相同条件下产生的但不施加本发明的组合物或与施用常规农业剂的植物的相同产品的产率相比，植物的经提高的产率涉及植物的产物产率(例如，如通过植物生物质、谷物、种子或水果产率、蛋白质含量、碳水化合物或油含量或叶面积所测量的)增加可测量的量。
由于细菌源性脂质组合物的递送而导致的植物适应性的增加还可以通过其它方法来测量，相对于在相同条件下产生的但不施加本发明的组合物或施用常规农业剂的植物的相同因素相比，例如活力等级、林分(每单位面积的植物数量)、植物高度、茎周长、茎长度、叶数、叶大小、植物冠层、视觉外观(如更绿的叶色)、根系等级、出苗、蛋白质含量、增加的分蘖、更大的叶、更多的叶、更少的死基生叶、更强的分蘖、更少的所需肥料、更少的所需种子、更高产的分蘖、更早的开花、更早的谷物或种子成熟、更少的植物节(倒伏)、增加的芽生长、更早的发芽或这些因素的任何组合增加可测量或明显的量。
在除草剂包含在细菌源性脂质组合物中的情况下，本文提供了一种降低杂草适应性或杀伤杂草的方法。在此类情况下，与未经处理的杂草(例如，尚未施用细菌源性脂质组合物的杂草)相比，所述方法可以有效地将杂草的适应性降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。例如，与未经处理的杂草相比，所述方法可以有效地杀伤杂草，由此将杂草的群体减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。在一些情况下，所述方法基本上消除了杂草。
根据本发明方法可以递送细菌源性脂质组合物(即“经处理的”)的植物包含整个植物和其部分，包含但不限于芽营养器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构，例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花药和胚珠)、种子(包括胚胎、胚乳、子叶和种皮)和果实(成熟的卵巢)、植物组织(例如，分生组织、维管组织、根组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞等)和其子代。植物部分可以进一步指植物的部分，如芽、根、茎、种子、托叶、叶、花瓣、花、胚珠、苞片、分枝、叶柄、节间、树皮、柔毛、分蘖、根茎、复叶、叶片、花粉、雄蕊等。
可以根据细菌源性脂质组合物处理的植物和杂草的类型的实例可以在WO 2021/041301中找到，所述文献通过引用整体并入本文。
递送到植物害虫
本文提供了将细菌源性脂质组合物递送到植物害虫的方法，例如，通过使植物害虫与细菌源性脂质组合物接触。在一些情况下，植物害虫可以用不包含异源功能剂的细菌源性脂质组合物处理。在其它情况下，细菌源性脂质组合物包含异源功能剂，例如杀虫剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀病毒剂、除草剂)或害虫控制剂(例如，驱虫剂)。例如，所述方法可用于降低害虫的适应性，例如预防或治疗由于递送细菌源性脂质组合物而导致的害虫侵扰。
在一些实施例中，本文提供了一种降低害虫的适应性的方法，所述方法包含向害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物(例如，以有效量和有效持续时间)，以相对于未经处理的害虫(例如，尚未递送细菌源性脂质组合物的害虫)降低害虫的适应性。
在一些实施例中，本文提供了一种减少(例如，治疗)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中所述方法包含向植物害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。在一些实施例中，本文提供了一种减少(例如，治疗)具有真菌感染的植物中的真菌感染的方法，其中所述方法包含向植物害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，并且其中细菌源性脂质组合物包含抗真菌剂。
在一些实施例中，本文提供了一种减少(例如，治疗)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法，其中所述方法包含向植物害虫害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，本文提供了一种减少(例如，治疗)具有细菌感染的植物中的细菌感染的方法，其中所述方法包含向植物害虫害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，并且其中细菌源性脂质组合物包含抗菌剂。
在一些实施例中，本文提供了一种降低昆虫植物害虫的适应性的方法，其中所述方法包含向昆虫植物害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，本文提供了一种降低昆虫植物害虫的适应性的方法，其中所述方法包含向昆虫植物害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，并且其中所述细菌源性脂质组合物包含杀虫剂。
在一些实施例中，本文提供了一种降低线虫植物害虫的适应性的方法，其中所述方法包含向线虫植物害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，本文提供了一种降低线虫植物害虫的适应性的方法，其中所述方法包含向线虫植物害虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，并且其中细菌源性脂质组合物包含杀线虫剂。
在一些实施例中，本文提供了一种降低杂草的适应性的方法，其中所述方法包含向杂草递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，本文提供了一种降低杂草的适应性的方法，其中所述方法包含向杂草递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，并且其中细菌源性脂质组合物包含除草剂(例如，草铵膦)。
合适的抗菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、除草剂包含上文已经描述的那些。
由于递送细菌源性脂质组合物，害虫的适应性降低可以多种方式表现出来。在一些情况下，由于递送细菌源性脂质组合物，害虫的适应性降低可以表现为害虫的生理学的恶化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的害虫相比，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，所述参数包含但不限于繁殖率、生育能力、寿命、活力、移动性、繁殖力、害虫发育、体重、代谢率或活性或存活率。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的害虫相比，害虫适应性降低可以表现为害虫中的一种或多种营养素(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽)的产生减少。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的害虫相比，害虫适应性降低可以表现为害虫对杀虫剂或化感物质药剂的敏感性增加，和/或害虫对杀虫剂的抗性降低。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的害虫相比，本文所提供的方法或组合物可以有效地降低害虫对寄生虫或病原体(例如，真菌、细菌或病毒病原体或寄生虫)的抗性。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的害虫相比，本文所提供的方法或组合物可以有效地降低害虫携带或传播植物病原体(例如，植物病毒(例如，TYLCV)或植物细菌(例如，农杆菌))的能力。
递送到植物共生体
本文提供了向植物共生体递送本文所公开的细菌源性脂质组合物的方法。包含用于通过使共生体与细菌源性脂质组合物接触将细菌源性脂质组合物递送到共生体(例如，细菌内共生体、真菌内共生体或昆虫)的方法。所述方法可用于增加植物共生体的适应性，例如有益于植物的适应性的共生体。在一些情况下，植物共生体可以用不包含异源功能剂的细菌源性脂质组合物处理。在其它情况下，细菌源性脂质组合物包含异源功能剂，例如施肥剂。
如此，所述方法可以用于增加植物共生体的适应性。一方面，本文提供了一种增加共生体的适应性的方法，所述方法包含向共生体递送本文所描述的细菌源性脂质组合物(例如，以有效量和有效持续时间)，以相对于未经处理的共生体(例如，尚未递送细菌源性脂质组合物的共生体)增加共生体的适应性。
在一些实施例中，本文提供了一种增加真菌(例如，植物的真菌内共生体)的适应性的方法，其中所述方法包含向内共生体递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，本文提供了一种增加细菌(例如，植物的细菌内共生体)的适应性的方法，其中所述方法包含向细菌递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些实施例中，本文提供了一种增加昆虫(例如，植物的昆虫共生体)的适应性的方法，其中所述方法包含向昆虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。
在一些情况下，由于施用细菌源性脂质组合物，共生体适应性增加可以表现为共生体的生理学改善(例如，改善的健康或提高的存活率)。在一些情况下，与尚未递送细菌源性脂质组合物的共生体相比，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，所述参数包含但不限于繁殖率、寿命、移动性、繁殖力、体重、代谢率或活性或存活率。例如，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，本文所提供的方法或组合物可以有效地改善共生体的总体健康或提高共生体的总体存活率。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性增加可以表现为由共生体执行的期望活动(例如，授粉、对害虫的捕食、种子传播或废物或有机材料的分解)的频率或功效的增加。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性增加可以表现为共生体中的一种或多种营养素(例如，维生素、碳水化合物、氨基酸或多肽)的产生增加。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性增加可以表现为共生体对杀虫剂的敏感性降低和/或共生体对杀虫剂的抗性增加。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性增加可以表现为共生体对化感物质药剂的敏感性降低和/或共生体对化感物质药剂的抗性增加。在一些情况下，化感物质药剂是咖啡因、大豆半胱氨酸蛋白酶抑制剂N、单萜、二萜酸或酚类化合物。在一些情况下，本文所提供的方法或组合物可以通过增加共生体将化感物质药剂代谢或降解成可用基质的能力来降低共生体对化感物质药剂的敏感性。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，本文所提供的方法或组合物可以有效地增加共生体对寄生虫或病原体(例如，真菌、细菌或病毒病原体；或寄生性螨虫(蜜蜂中的狄氏瓦螨(Varroa destructormite))的抗性。
在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的共生体生物体相比，共生体适应性增加可以表现为其它适应性优点，如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)的改善、在某些栖息地存活的能力的改善或维持某一饮食的能力的改善(例如，与玉米相比，代谢大豆的能力的改善)。
可以使用本领域的任何标准方法来评估共生体适应性。在一些情况下，可以通过评估单个共生体来评估共生体适应性。可替代地，可以通过评估共生体群体来评估共生体适应性。例如，共生体适应性增加可以表现为与其它昆虫的成功竞争的增加，由此导致共生体群体的大小增加。
递送到动物病原体
本文提供了通过使病原体与细菌源性脂质组合物接触将本文所描述的细菌源性脂质组合物递送至动物(例如，人类)病原体的方法。如本文所使用的，术语“病原体”是指通过例如以下在动物中引起疾病或疾病症状的生物体，如微生物体或无脊椎动物：(i)直接感染动物，(ii)通过产生在动物中引起疾病或疾病症状的药剂(例如，产生致病毒素的细菌等)，和/或(iii)在动物中引发免疫(例如，炎症应答)(例如，叮咬昆虫，例如，臭虫)。如本文所使用的，病原体包含但不限于细菌、原生动物、寄生虫、真菌、线虫、昆虫、类病毒和病毒或其任何组合，其中每种病原体能够通过自身或与另一种病原体协同引发动物，如人类的疾病或症状。
在一些情况下，动物(例如，人类)病原体可以用不包含异源功能剂的细菌源性脂质组合物处理。在其它情况下，细菌源性脂质组合物包含异源功能剂，例如异源治疗剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或驱虫剂)。所述方法可用于降低动物病原体的适应性，例如，以预防或治疗病原体感染或控制由于递送细菌源性脂质组合物而引起的病原体的扩散。
根据本文所描述的方法可靶向的病原体的实例包含细菌(例如，链球菌(Streptococcusspp.)、肺炎球菌(Pneumococcus spp.)、假单胞菌(Pseudomonas spp.)、志贺氏菌(Shigella spp)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、弯曲杆菌(Campylobacter spp.)或大肠杆菌(Escherichia spp))、真菌(酵母菌(Saccharomyces spp.)或念珠菌(Candidaspp))、寄生昆虫(例如，臭虫(Cimex spp))、寄生线虫(例如，寄生线虫(Heligmosomoidesspp)或寄生原生动物(例如，滴虫(Trichomoniasis spp))。
例如，本文提供了一种降低病原体的适应性的方法，所述方法包含向病原体递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中相对于未经处理的病原体，所述方法降低病原体的适应性。在一些实施例中，所述方法包含将组合物递送到病原体生长、生活、繁殖、进食或侵扰的至少一个栖息地。在本文所描述的方法的一些情况下，组合物作为病原体可吸入组合物递送以供病原体摄取。在本文所描述的方法的一些情况下，组合物作为液体、固体、气溶胶、糊剂、凝胶或气体递送(例如，递送到病原体)。
本文还提供了一种降低寄生昆虫的适应性的方法，其中所述方法包含向寄生昆虫递送细菌源性脂质组合物。在一些情况下，所述方法包含向寄生昆虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包含杀虫剂。例如，寄生昆虫可以是臭虫。本文提供了寄生昆虫的其它非限制性实例。在一些情况下，相对于未经处理的寄生昆虫，所述方法降低寄生昆虫的适应性。
另外，本文还提供了一种降低寄生线虫的适应性的方法，其中所述方法包含向寄生线虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。在一些情况下，所述方法包含向寄生线虫递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包含杀线虫剂。例如，寄生线虫是肠道寄生线虫(Heligmosomoidespolygyrus)。本文提供了寄生线虫的其它非限制性实例。在一些情况下，相对于未经处理的寄生线虫，所述方法降低寄生线虫的适应性。
本文进一步提供了一种降低寄生原生动物的适应性的方法，其中所述方法包含向寄生原生动物递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。在一些情况下，所述方法包含向寄生原生动物递送本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括抗寄生虫剂。例如，寄生原生动物可以是阴道毛滴虫(T.vaginalis)。本文提供了寄生原生动物的其它非限制性实例。在一些情况下，相对于未经处理的寄生原生动物，所述方法降低寄生原生动物的适应性。
由于递送细菌源性脂质组合物，病原体的适应性降低可以多种方式表现出来。在一些情况下，由于递送细菌源性脂质组合物，病原体的适应性降低可以表现为病原体的生理学的恶化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的病原体相比，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，所述参数包含但不限于繁殖率、生育能力、寿命、活力、移动性、繁殖力、病原体发育、体重、代谢率或活性或存活率。例如，本文所提供的方法或组合物可以有效地降低病原体的总体健康或降低病原体的总体存活率。在一些情况下，病原体的降低的存活率比参考水平(例如，在未接受细菌源性脂质组合物的病原体中发现的水平)高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些情况下，与尚未施用细菌源性脂质组合物的病原体相比，所述方法和组合物有效地降低病原体繁殖(例如，繁殖率、生育力)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未接受细菌源性脂质组合物的病原体中发现的水平)，所述方法和组合物将其它生理参数，如移动性、体重、寿命、繁殖力或代谢率有效地降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。
在一些情况下，与尚未递送细菌源性脂质组合物的病原体相比，害虫适应性降低可以表现为病原体对抗病原体剂的敏感性增加和/或病原体对抗病原体剂的抗性降低。
在一些情况下，与尚未递送细菌源性脂质组合物的病原体相比，病原体适应性降低可以表现为其它适应性缺点，如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)的降低、在某些栖息地存活的能力的降低或维持某一饮食的能力的降低。
可以使用本领域的任何标准方法来评估病原体适应性。在一些情况下，可以通过评估单个病原体来评估害虫适应性。可替代地，可以通过评估病原体群体来评估害虫适应性。例如，病原体适应性降低可以表现为与其它病原体的成功竞争的降低，由此导致病原体群体的大小减小。
本文所描述的细菌源性脂质组合物和相关方法可用于降低动物病原体的适应性，并且由此治疗或预防动物中的感染。
递送到病原体载体
本文提供了通过使病原体载体与细菌源性脂质组合物接触将本文所描述的细菌源性脂质组合物递送到病原体载体，如本文所公开的病原体载体的方法。如本文所使用的，术语“载体”是指可以将动物病原体从储器携带或传输到动物的昆虫。示例性载体包含昆虫，如具有刺吸式口器的昆虫，如在半翅目(Hemiptera)和一些膜翅目(Hymenoptera)和双翅目(Diptera)中发现的，如蚊子、蜂、黄蜂、蚊、虱子、菜蝇、跳蚤和蚁，以及蛛形纲(Arachnidae)的成员，如蜱虫和螨虫。
在一些情况下，动物(例如，人类)病原体的载体可以用不包含异源功能剂的细菌源性脂质组合物处理。在其它情况下，细菌源性脂质组合物包含异源功能剂，例如异源治疗剂(例如，抗菌剂、抗真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或驱虫剂)。所述方法可用于降低病原体载体的适应性，例如，以控制由于递送细菌源性脂质组合物而引起的病原体的扩散。根据本发明方法可以靶向的病原体载体的实例包含昆虫，如本文所描述的昆虫。
例如，本文提供了一种降低动物病原体载体的适应性的方法，所述方法包含向载体递送有效量的本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中相对于未经处理的载体，所述方法降低载体的适应性。在一些情况下，所述方法包含将组合物递送到载体生长、生活、繁殖、进食或侵扰的至少一个栖息地。在一些情况下，组合物作为可食用组合物递送以供载体摄取。在一些情况下，载体是昆虫。在一些情况下，昆虫是蚊子、蜱虫、螨虫或虱子。在一些情况下，组合物作为液体、固体、气溶胶、糊剂、凝胶或气体递送(例如，递送到病原体载体)。
例如，本文提供了一种降低动物病原体的昆虫载体的适应性的方法，其中所述方法包含向载体递送本文所描述的细菌源性脂质组合物。在一些情况下，所述方法包含向载体递送细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包含杀虫剂。例如，昆虫载体可以是蚊子、蜱虫、螨虫或虱子。本文提供了病原体载体的其它非限制性实例。在一些情况下，相对于未经处理的载体，所述方法降低载体的适应性。
在一些情况下，由于施用组合物，载体适应性降低可以表现为载体的生理学的恶化或下降(例如，健康或存活降低)。在一些情况下，与尚未递送组合物的载体生物体相比，生物体的适应性可以通过一个或多个参数来测量，所述参数包含但不限于繁殖率、寿命、移动性、繁殖力、体重、代谢率或活性或存活率。例如，本文所提供的方法或组合物可以有效地降低载体的总体健康或降低载体的总体存活率。在一些情况下，载体的降低的存活率比参考水平(例如，在未接受组合物的载体中发现的水平)高约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。在一些情况下，与尚未递送组合物的载体生物体相比，所述方法和组合物有效地降低载体繁殖(例如，繁殖率)。在一些情况下，相对于参考水平(例如，在未递送组合物的载体中发现的水平)，所述方法和组合物将其它生理参数，如移动性、体重、寿命、繁殖力或代谢率有效地降低约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％。
在一些情况下，与尚未递送组合物的载体生物体相比，载体适应性的降低可以表现为载体对杀虫剂的敏感性的增加和/或载体对杀虫剂的抗性降低。在一些情况下，与尚未递送组合物的载体相比，本文所提供的方法或组合物可以通过降低载体将杀虫剂代谢或降解到可用基质中的能力来增加载体对杀虫剂的敏感性。
在一些情况下，与尚未递送组合物的载体生物体相比，载体适应性降低可以表现为其它适应性缺点，如对某些环境因素的耐受性(例如，高温或低温耐受性)的降低、在某些栖息地存活的能力的降低或维持某一饮食的能力的降低。在一些情况下，本文所提供的方法或组合物可以本文所描述的任何多种方式有效地降低载体适应性。进一步地，组合物可以降低任何数量的载体种类、顺序、家族、属或物种(例如，1个载体物种、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、200个、250个、500个或更多个载体物种)中的载体适应性。在一些情况下，组合物作用于单个载体种类、顺序、家族、属或物种。
可以使用本领域的任何标准方法来评估载体适应性。在一些情况下，可以通过评估单个载体来评估载体适应性。可替代地，可以通过评估载体群体来评估载体适应性。例如，载体适应性降低可以表现为与其它载体的成功竞争的降低，由此导致载体群体的大小减小。
通过降低携带动物病原体的载体的适应性，本文所提供的组合物可有效地减少载体传播疾病的传播。可以使用本文所描述的任何调配物和递送方法以有效进行以下的量和持续时间将组合物递送到昆虫：减少疾病的传播，例如减少载体之间的竖直或水平传播和/或减少对动物的传播。例如，与尚未递送组合物的载体生物体相比，本文所描述的组合物可以将载体传播病原体的竖直或水平传播减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。作为另一实例，与尚未递送组合物的载体生物体相比，本文所描述的组合物可以将昆虫载体的载体竞争减少约2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更多。
递送到动物
本文提供了例如通过使动物细胞、组织、受试者或其部分与细菌源性脂质组合物接触将本文所描述的细菌源性脂质组合物递送到动物细胞、组织或受试者(例如，哺乳动物，例如，人类)的方法。在一些情况下，可以用不包含异源功能剂的细菌源性脂质组合物处理动物。在其它情况下，细菌源性脂质组合物包含异源功能剂，例如异源治疗剂(例如，治疗性蛋白质或肽核酸、或小分子、抗菌剂、抗真菌剂、杀虫剂、杀线虫剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂或驱虫剂)。
一方面，本文提供了一种增加动物(例如，人类)的适应性的方法，所述方法包含向动物递送本文所描述的细菌源性脂质组合物(例如，以有效量和持续时间)，以相对于未经处理的动物(例如，尚未递送细菌源性脂质组合物的动物)增加动物的适应性。
由于递送细菌源性脂质组合物，动物的适应性的增加可以通过评估动物适应性(例如，哺乳动物的适应性，例如，人类的适应性(例如，健康))的任何方法来确定。
本文提供了一种修饰或增加动物(例如，人类)的适应性的方法，所述方法包含向动物递送有效量的本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中所述方法修饰动物，并且由此相对于未经处理的动物，在动物中引入或增加有益性状(例如，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。具体地，相对于未经处理的动物，所述方法可以将动物，例如，哺乳动物，例如，人类的适应性增加(例如，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在另外的方面，本文提供了一种增加动物(例如，人类)的适应性的方法，所述方法包含使动物的细胞与有效量的本文所描述的细菌源性脂质组合物接触，其中相对于未经处理的动物，所述方法将动物，例如，哺乳动物的适应性增加(例如，约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或大于100％)。
在某些情况下，动物是哺乳动物，例如，人类。在某些情况下，动物是家畜动物或兽医动物。在某些情况下，动物是小鼠。
施加方法
本文所描述的植物可以允许将本文所描述的细菌源性脂质组合物递送或施用到所述植物的任何合适的方式暴露于所述组合物。细菌源性脂质组合物可以单独地递送或者与其它活性物质(例如，施肥剂)或非活性物质组合递送，并且可以通过以下施加：例如喷雾、注射(例如，微注射)、通过植物、倾倒、浸渍、呈经浓缩的液体、凝胶、溶液、悬浮液、喷雾、粉末、团粒、压块、块等的形式，被调配成递送有效浓度的细菌源性脂质组合物。用于施加本文所描述的组合物的量和位置通常由植物的栖息地、植物可以被细菌源性脂质组合物靶向的生命周期阶段、进行施加的部位以及细菌源性脂质组合物的物理和功能特性确定。
在一些情况下，通过例如背包式喷雾、空中喷雾、作物喷雾/除尘等将组合物直接喷雾到植物，例如作物上。在将细菌源性脂质组合物递送到植物的情况下，接受细菌源性脂质组合物的植物可以处于植物生长的任何阶段。例如，调配的细菌源性脂质组合物可以在植物生长的早期阶段作为种子包衣或根处理施加，或者在作物循环的后期阶段作为总植物处理施加。在一些情况下，细菌源性脂质组合物可以作为局部药剂施加到植物。
进一步地，细菌源性脂质组合物可以作为全身剂施加(例如，在植物生长的土壤中，或在用于给植物浇水的水中)，所述全身剂被吸收并分布在植物组织中。在一些情况下，植物或食物生物体可以被基因转化以表达细菌源性脂质组合物。
延迟或连续释放还可以通过用可溶解或可生物侵蚀的涂层，如明胶来涂覆细菌源性脂质组合物或具有细菌源性脂质组合物的组合物，所述涂层在使用环境中溶解或侵蚀，然后使细菌源性脂质组合物可用，或者通过将药剂分散在可溶解或可侵蚀的基质中。此类连续释放和/或分配装置可以有利地用于始终维持本文所描述的细菌源性脂质组合物中的一种或多种的有效浓度。
在一些情况下，将细菌源性脂质组合物递送到植物的一部分，例如叶、种子、花粉、根、果实、芽或花或其组织、细胞或原生质体。在一些情况下，将细菌源性脂质组合物递送到植物的细胞。在一些情况下，将细菌源性脂质组合物递送到植物的原生质体。在一些情况下，将细菌源性脂质组合物递送到植物的组织。例如，可以将组合物递送到植物的分生组织(例如，顶端分生组织、侧生分生组织或居间分生组织)。在一些情况下，将组合物递送到植物的永久性组织(例如，简单组织(例如，薄壁组织、厚角组织或厚壁组织)或复杂的永久性组织(例如，木质部或韧皮部))。在一些情况下，将组合物递送到植物胚胎。
在一些情况下，可以推荐细菌源性脂质组合物作为每公顷(g/ha或kg/ha)的细菌源性脂质组合物的量或每公顷(kg a.i./ha或g a.i./ha)的活性成分(例如，具有或不具有异源功能剂的细菌源性脂质组合物)或酸当量的量进行现场施加。在一些情况下，可能需要将较少量的本发明组合物中的异源功能剂施加于土壤、植物培养基、种子植物组织或植物以实现与在缺乏细菌源性脂质组合物的组合物中施加异源功能剂的结果相同的结果。例如，异源功能剂的量施加的水平可以是在非细菌源性脂质组合物中施加的相同异源功能剂的量施加的水平，例如，在没有细菌源性脂质组合物的情况下直接施加的相同异源功能剂的量施加的水平约1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/15、1/20、1/30、1/50或1/100(或介于约1/100与约1/2之间的任何范围，例如约1/10至1/2、约1/15至1/5、约1/20至1/10、约1/50至1/10)的水平施加。细菌源性脂质组合物可以每公顷各种量施加，例如以约0.0001、0.001、0.005、0.01、0.1、1、2、10、100、1,000、2,000、5,000(或介于约0.0001与5,000之间的任何范围)kg/ha施加。例如，约0.0001至约0.01、约0.01至约10、约10至约1,000、约1,000至约5,000kg/ha。
治疗方法
本文所描述的细菌源性脂质组合物还可在多种治疗方法中使用。例如，所述方法和组合物可以用于预防或治疗动物(例如，人类)中的病原体感染。如本文所使用的，术语“治疗”是指出于预防性和/或治疗性目的向动物施用药物组合物。“预防感染”是指对尚未患病但易患或以其它方式有风险患上特定疾病的动物的预防性治疗。“治疗感染”是指向已经患有疾病的动物施用治疗以改善或稳定动物的病状。本发明方法涉及将本文所描述的细菌源性脂质组合物递送到动物，如人类。
例如，本文提供了一种治疗患有真菌感染的动物的方法，其中所述方法包含向动物施用有效量的细菌源性脂质组合物。在一些情况下，所述方法包含向动物施用有效量的本文所描述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包含抗真菌剂。在一些情况下，抗真菌剂是抑制引起真菌感染的真菌中的基因表达的核酸。
另一方面，本文提供了一种治疗患有细菌感染的动物的方法，其中所述方法包含向动物施用有效量的细菌源性脂质组合物。在一些情况下，所述方法包含向动物施用有效量的本文所描述的细菌源性脂质组合物，并且其中所述细菌源性脂质组合物包含抗菌剂。在一些情况下，所述方法减少或基本上消除细菌感染。在一些情况下，动物是人类、兽医动物或家畜动物。
本发明方法可用于治疗动物中的(例如，如由动物病原体引起的)感染，其是指向已经患有疾病的动物施用治疗以改善或稳定动物的病状。这可以涉及相对于起始量减少动物中、动物上或动物周围的病原体的定植(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)和/或允许个体受益(例如，以足以解决症状的量减少定植)。在此类情况下，经处理的感染可以表现为症状的减少(例如，减少约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。在一些情况下，经处理的感染可有效地增加个体的存活可能性(例如，存活可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)或增加群体的总体存活率(例如，存活可能性增加约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。例如，组合物和方法可以有效地“基本上消除”感染，这是指以足以持续地解决动物中的症状(例如，持续至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个月)的量减少感染。
本发明方法可用于预防感染(例如，如由动物病原体引起的)，其是指以足以维持初始病原体群体的量(例如，大约是在健康个体中发现的量)预防一种或多种病原体在动物体内、动物身上或动物周围的定植增加(例如，相对于未经处理的动物，大约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或超过100％)，预防感染的发作和/或防止与感染相关的症状或病状。例如，在免疫功能低下的个体(例如，患有癌症、患有HIV/AIDS或服用免疫抑制剂的个体)中，或在经历长期抗生素疗法的个体中，个体可以在准备进行侵入性医疗程序(例如，准备进行外科手术，如接受移植、干细胞疗法、移植物、假体、接受长期或频繁的静脉内插管或在重症监护室接受治疗)时接受预防性治疗以预防真菌感染。
细菌源性脂质组合物可以被调配用于施用或通过任何合适的方法施用，包含例如，静脉内施用、肌肉内施用、皮下施用、皮内施用、经皮施用、动脉内施用、腹膜内施用、病变内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鞘内施用、鼻内施用、阴道内施用、直肠内施用、局部施用、肿瘤内施用、腹膜施用、结膜下施用、囊内施用、粘膜内施用、心包内施用、脐内施用、眼内施用、眶内施用、口服施用、局部施用、经皮施用或玻璃体内(例如，通过玻璃体内注射)施用、通过滴眼液施用、通过吸入施用、通过注射施用、通过植入施用、通过输注施用、通过连续输注施用、通过直接局部灌注浴靶细胞施用、通过导管施用、通过灌洗施用、以乳霜施用或以脂质组合物施用。在本文所描述的方法中使用的组合物还可以全身或局部施用。施用方法可以根据各种因素(例如，所施用的化合物或组合物以及所治疗的病状、疾病或病症的严重程度)而变化。在一些情况下，细菌源性脂质组合物是静脉内、肌肉内、皮下、局部、口服、经皮、腹膜内、眶内、植入、吸入、鞘内、脑室内或鼻内施用的。给药可以通过任何合适的途径，例如，通过注射，如静脉内或皮下注射，部分取决于施用是短暂性的还是慢性的。本文考虑了各种给药方案，包含但不限于在各种时间点上的单次或多次给药、团注施用和脉冲输注。
对于本文所描述的感染的预防或治疗(当单独使用或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)，将取决于要治疗的疾病的类型、疾病的严重程度和病程、是否施用以用于预防性或治疗性目的、先前的治疗、患者的临床病史和对细菌源性脂质组合物的应答。细菌源性脂质组合物可以例如一次或通过一系列治疗施用于患者。对于数天或更长时间内的重复施用，取决于病状，治疗一般将通常持续直到出现期望的疾病症状抑制或者不再可检测到感染。此类剂量可以间歇地施用，例如每周或每两周施用(例如，使得患者接受例如约两个至约二十个剂量的细菌源性脂质组合物。可以施用初始较高装载剂量，随后施用一或多个较低剂量。然而，其它剂量方案可以是有用的。通过常规技术和测定容易地监测此疗法的进展。
在一些情况下，施用于个体(例如，人类)的细菌源性脂质组合物的量可以在个体体重的约0.01mg/kg至约5g/kg(例如，约0.01mg/kg-0.1mg/kg、约0.1mg/kg-1mg/kg、约1mg/kg-10mg/kg、约10mg/kg-100mg/kg、约100mg/kg-1g/kg或约1g/kg-5g/kg)的范围内。在一些情况下，施用于个体(例如，人类)的细菌源性脂质组合物的量为个体体重的至少0.01mg/kg(例如，至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少1mg/kg、至少10mg/kg、至少100mg/kg、至少1g/kg或至少5g/kg)。剂量可以作为单剂量或作为多剂量(例如，2个、3个、4个、5个、6个、7个或多于7个剂量)施用。在一些情况下，施用于动物的细菌源性脂质组合物可以单独或与另外的治疗剂组合施用。如与单次治疗相比，可以减少组合治疗中施用的抗体的剂量。这种疗法的进展容易通过常规技术来监测。
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含具有本文所描述的细菌源性脂质组合物的容器。试剂盒可以进一步包含用于根据本发明的方法将细菌源性脂质组合物施加或递送到植物的指导材料。本领域技术人员将理解，在本发明的方法中施加细菌源性脂质组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明包含但不限于书面说明材料(如标签、小册子、活页)、口头指导材料(如盒式磁带或CD)或视频说明(如录像带或DVD)。
用于病毒感染的核酸疫苗
当细菌源性脂质组合物包含对抗各种病毒感染的抗原多肽时，所述组合物可以用作核酸疫苗组合物。
在一些实施例中，细菌源性脂质组合物/核酸疫苗调配物(即，BacLC/核酸疫苗)包括编码一种或多种抗原多肽的一种或多种多核苷酸(例如，mRNA)，以对抗各种病毒感染。所述一种或多种多核苷酸(例如，mRNA)编码源自引起传染病、病症或病状，例如，由RNA病毒引起的病毒感染的感染源的一种或多种抗原多肽。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码如下文所描述的各种类型和病毒株的一种或多种野生型或工程化抗原(或针对抗原的抗体)。
病毒感染。
BacLC/核酸疫苗可以适于对抗与病毒感染相关的传染病、病症或病状，包含但不限于急性发热性咽炎、咽结膜热、流行性角结膜炎、婴儿肠胃炎、柯萨奇感染(coxsackieinfections)、传染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤(burkitt lymphoma)、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发性HSV-1感染(例如，儿童的龈口炎、成人的扁桃体炎和咽炎、角结膜炎)、潜伏性HSV-1传染(例如，唇疱疹和冷疱疹)、原发性HSV-2感染、潜伏性HSV-2感染、无菌性脑膜炎、传染性单核细胞增多症、巨细胞包涵体病、卡波西肉瘤(kaposisarcoma)、多中心卡斯特莱曼病(multicentric castleman disease)、原发性渗出性淋巴瘤、AIDS、流感、瑞氏综合征(reye syndrome)、麻疹、感染后脑脊髓炎、腮腺炎、增生性上皮病变(例如，常见的扁平疣、跖疣和肛门生殖器疣、喉乳头状瘤、疣状表皮发育不良)、宫颈癌、鳞状细胞癌、哮吼、肺炎、细支气管炎、普通感冒、脊髓灰质炎、狂犬病、细支气管炎、肺炎、流感样综合征、严重的细支气管炎伴肺炎、德国麻疹、先天性风疹、水痘和带状疱疹。
示例性病毒感染源包含但不限于选自由以下组成的组的病毒株：腺病毒；1型单纯疱疹；2型单纯疱疹；脑炎病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-barrvirus)；人巨细胞病毒；8型人疱疹病毒；人乳头瘤病毒；BK病毒；JC病毒；天花；脊髓灰质炎病毒、乙型肝炎病毒；人博卡病毒(Humanbocavirus)；细小病毒B19；人星状病毒；诺沃克病毒(Norwalk virus)；柯萨奇病毒(coxsackievirus)；甲型肝炎病毒；脊髓灰质炎病毒；鼻病毒；严重急性呼吸综合征病毒；丙型肝炎病毒；黄热病病毒；登革热病毒(dengue virus)；西尼罗河病毒(West Nile virus)；风疹病毒；戊型肝炎病毒；人类免疫缺陷病毒(HIV)；甲型或乙型流感病毒；瓜纳里托病毒(Guanarito virus)；胡宁病毒(Juninvirus)；拉萨病毒(Lassa virus)；马秋波病毒(Machupo virus)；萨比亚病毒(Sabiávirus)；克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)；埃博拉病毒(Ebolavirus)；马尔堡病毒(Marburg virus)；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；呼吸道合胞病毒；人偏肺病毒；亨德拉病毒(Hendravirus)；尼帕病毒(Nipah virus)；狂犬病病毒；丁型肝炎；轮状病毒；环状病毒；科蜱病毒属(Coltivirus)；汉坦病毒(Hantavirus)；中东呼吸道冠状病毒(Middle East Respiratory Coronavirus)；基孔肯雅病毒(Chikungunya virus)或版纳病毒(Bannavirus)。
感染原可以是从由下表的病毒组成的组中选择的病毒株。
其它合适的病毒感染和病毒感染原描述于美国专利申请公开案第US2019/0015501号和美国专利第11,007,260号中，所述文献中的两个文献均通过引用整体并入。
蚊传播病毒
登革热。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码登革热病毒(黄病毒(flavi virus))的病毒株。在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)编码E蛋白结构域III(DENV1-4串联mRNA)、E蛋白结构域I/II铰链区(DENV1-4单独mRNA)、prM蛋白(DENV1-4串联或单个mRNA)和C蛋白(DENV1-4串联或单一mRNA)。
基孔肯雅病毒。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码基孔肯雅病毒的病毒株。在一些实施例中，抗原多肽编码选自由以下组成的组的基孔肯雅包膜和/或衣壳抗原多肽：C、E1、E2、E3、6K和C-E3-E2-6K-E1。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码选自以下菌株和分离物的基孔肯雅多肽：TA53、SA76、UG82、37997、IND-06、Ross、S27、M-713424、E1-A226V、E1-T98、IND-63-WB1、Gibbs 63-263、TH35、1-634029、AF15561、IND-73-MH5、653496、C0392-95、P0731460、MY0211MR/06/BP、SV0444-95、K0146-95、TSI-GSD-218-VR1、TSI-GSD-218、M127、M125、6441-88、MY003IMR/06/BP、MY0021MR/06/BP、TR206/H804187、MY/06/37348、MY/06/37350、NC/2011-568、1455-75、RSU1、0706aTw、InDRE51CHIK、PR-S4、AMA2798/H804298、Hu/85/NR/001、PhH15483、0706aTw、0802aTw、MY019IMR/06/BP、PR-S6、PER160/H803609、99659、JKT23574、0811aTw、CHIK/SBY6/10、2001908323-BDG E1、2001907981-BDGE1、2004904899-BDG E1、2004904879-BDG E1、2003902452-BDG E1、DH 130003、0804aTw、2002918310-BDG E1、JC2012、chik-sy、3807、3462、Yap 13-2148、PR-S5、0802aTw、MY019IMR/06/Bp、0706aTw、PhH15483、Hu/85/NR/001、CHIKV-13-112A、InDRE 4CHIK、0806aTw、0712aTw、3412-78、Yap 13-2039、LEIV-CHIKV/Moscow/1、DH130003和20039。
寨卡病毒。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码寨卡病毒(黄病毒(flavi virus))的病毒株。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码选自来自选自由MR 766、SPH2015和ACD75819组成的组的ZIKV血清型的ZIKV多肽。
委内瑞拉马脑炎(Venezuelan equine encephalitis，VEE)病毒。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码VEE病毒的病毒株。
BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码蚊传播病毒的另外的病毒类型和病毒株或其片段，如美国专利第11,007,260号中所描述的那些，所述美国专利通过引用整体并入本文。
流感
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码流感病毒的病毒株。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码甲型流感或乙型流感或其组合的病毒株。在一些实施例中，甲型流感或乙型流感或其组合病毒株与鸟、猪、马、狗、人类或非人类灵长类动物相关。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码编码血凝素蛋白或其片段。在一些实施例中，血凝素蛋白是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、H17、H18或其片段。在一些实施例中，血凝素蛋白不包括头部结构域(HA1)。在一些实施例中，血凝素蛋白包括头部结构域(HA1)的一部分。在一些实施例中，血凝素蛋白不包括细胞质结构域。在一些实施例中，血凝素蛋白包括细胞质结构域的一部分。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码编码截短的血凝素蛋白。在一些实施例中，截短的血凝素蛋白包括跨膜结构域的一部分。在一些实施例中，病毒是选自由以下组成的组：H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H10N8。
BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码流感病毒的另外的病毒类型和病毒株或其片段，如美国专利申请公开第2019/0015501号中所描述的那些，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
冠状病毒
β冠状病毒。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包括β冠状病毒(BetaCoV)或其片段或亚基的刺突蛋白(S)的肽/蛋白质。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)包括编码包括β冠状病毒(BetaCoV)或其片段或亚基的刺突蛋白(S)的肽/蛋白质的开放阅读框。
BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码蚊传播病毒的不同β冠状病毒类型和β冠状病毒的病毒株或其片段，如美国专利第10,933,127号中所描述的那些，所述美国专利通过引用整体并入本文。
中东呼吸综合征冠状病毒。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包括以下的肽/蛋白质：MERS冠状病毒的刺突蛋白(S)、刺突S1片段(S1)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)和/或核衣壳蛋白(N)，或这些蛋白质中的任一种的片段或变体。
BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)可以编码MERS冠状病毒的不同病毒株或其片段，如美国专利申请公开第US2019/0351048号中所描述的那些，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
SARS-CoV-2
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码SARS-CoV-2的一种或多种野生型或工程化抗原(或针对抗原的抗体)。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)的开放阅读框编码SARS-CoV-2的一种或多种野生型或工程化抗原(或针对抗原的抗体)。在一些实施例中，开放阅读框是密码子优化的。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包括以下的肽/蛋白质：SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S)、膜(M)蛋白、包膜(E)蛋白和/或核衣壳(NC)蛋白、或其片段或变体。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包括SARS-CoV-2病毒或其片段或变体的刺突蛋白(S)的肽/蛋白质。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)编码包括以下的肽/蛋白质：SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白(S)的至少一个或两个结构域，和少于全长刺突蛋白。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)包括编码具有双脯氨酸稳定突变的SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的开放阅读框(ORF)。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码选自由以下组成的组的SARS-CoV-2病毒的病毒株或变体：
α(谱系B.1.1.7、Q.1-Q.8)，
β(谱系B.1.351、B.1.351.2、B.1.351.3)，
δ
γ(谱系P.1、P.1.1、P.1.2)
ε(谱系B.1.427、B.1.429)
η(谱系B.1.525)
ι(谱系B.1.526)
κ(谱系B.1.617.1)
B.1.617.3
λ(谱系C.37)
μ(谱系B.1.621、B.1.621.1)
ζ(谱系P.2)。
ο
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白和/或RBD或其片段。在一些实施例中，S抗原和/或其RBD抗原片段在RBD内包括选自由以下组成的组的一个或多个突变：K417N或K417T、N439N、N440K、G446V、L452R、Y453F、S477G或S477N、E484Q或E484K、F490S、N501S或N501Y、D614G、Q677P或Q677H、P681H或P681R。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白和/或RBD或其片段。在一些实施例中，S抗原包含使刺突蛋白三聚体稳定的突变，包括例如K986P和V987P突变(S-2P变体)和其它脯氨酸取代，特别是F817P、A892P、A899P和A942P，且可以组合在一起以获得多个脯氨酸变体，特别是六脯氨酸变体(HexaPro)。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白和/或RBD或其片段。在一些实施例中，S抗原包括选自由以下组成的组的一个或多个突变：取代L18F、T20N、P26S、D80A、D138Y、R190S、D215G、A570D、D614G、H655Y、P681H、A701V、T716I、S982A、T1027I、D1118H和V1176F；以及缺失δ69-70、δ144、δ242-244和δ246-252。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗中的多核苷酸(例如，mRNA)(或其开放阅读框)编码SARS-CoV-2刺突(S)蛋白和/或RBD或其片段。在一些实施例中，S抗原或其RBD抗原片段包括以下突变：N501Y；E484K和N501Y；K417T或K417N、E484K和N501Y；K417N、N439N、Y453F、S477N、E484K、F490S和N501Y；K417N、N439N、L452R、S477N、E484K、F490S和N501Y。
另外的突变可见于WO 2021/154763A1中，其通过引用整体并入本文中。
核酸序列
在一些实施例中，由多核苷酸编码的抗原多肽是冠状病毒或其片段或亚基。在一些实施例中，所述抗原多肽是MERS病毒(MERS-CoV)、SARS病毒(SARS-CoV)或其片段或亚基的刺突蛋白(S)。
在一些实施例中，所述抗原多肽是SARS病毒或其片段或亚基。所述抗原多肽可以是SARS-CoV-2刺突蛋白或SARS-CoV-2刺突糖蛋白。
在一些实施例中，所述多核苷酸可以是mRNA、siRNA或siRNA前驱体、微小RNA(miRNA)或miRNA前驱体、质粒、Dicer底物小干扰RNA(dsiRNA)、短发夹RNA(shRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、肽核酸(PNA)、吗啉代、锁核酸(LNA)、piwi相互作用RNA(piRNA)、核酶、脱氧核酶(DNAzyme)、适体、环状RNA(circRNA)、向导RNA(gRNA)或编码这些RNA中的任一者的DNA分子。在一个实施例中，所述多核苷酸是mRNA。
在一些实施例中，所述多核苷酸编码冠状病毒抗原变体(例如变异三聚体刺突蛋白，诸如稳定化融合前刺突蛋白)。抗原变体或其它多肽变体係指其氨基酸序列不同于野生型、天然或参考序列的分子。与天然或参考序列相比，抗原/多肽变体可在氨基酸序列内某些位置处具有取代、缺失和/或插入。通常，变体与野生型、天然或参考序列具有至少50％一致性。在一些实施例中，变体与野生型、天然或参考序列共享至少80％或至少90％一致性。
由本公开的核酸编码的变异抗原/多肽可以含有赋予许多期望特性中的任一个，例如增强其免疫原性、增强其表达和/或改善其在受试者中的稳定性或PK/PD特性的氨基酸变化。变异抗原/多肽可以使用常规诱变技术制备，并酌情分析以确定其是否具有所需特性。确定表达水平和免疫原性的分析是本领域众所周知的，并且这类示范性分析在实例部分中进行阐述。类似地，蛋白质变体的PK/PD特性可以使用本领域公认的技术来测量，例如，通过确定抗原随时间推移在接种受试者中的表达和/或通过观察诱导的免疫应答的持久性。由变异核酸编码的蛋白质的稳定性可以通过分析尿素变性时的热稳定性或稳定性来测量，或者可以使用计算机预测来测量。这类实验和计算机模拟确定的方法是本领域中已知的。
术语“一致性”是指通过比较序列所确定的两种或更多种多肽(例如抗原)或多核苷酸(核酸)的序列之间的关系。一致性还指代两个或多个序列之间的序列相关性程度，由两个或更多个氨基酸残基或核酸残基的串之间的匹配数目确定。一致性测量两个或更多个序列中较小序列之间一致匹配的百分比，其中间隙比对(如果有的话)通过特定数学模型或计算机程序(例如“算法”)解决。相关抗原或核酸的一致性可以通过已知方法容易地计算出来。应用于多肽或多核苷酸序列的“一致性百分比(％)”定义为在比对候选氨基酸或核酸序列与第二序列并在需要时引入间隙以实现最大一致性百分比之后，候选氨基酸或核酸序列中与第二序列的氨基酸序列或核酸序列中的残基一致的残基(氨基酸残基或核酸残基)的百分比。用于比对的方法和计算机程序是本领域众所周知的。应当理解，一致性取决于一致性百分比的计算，但由于计算中引入的间隙和罚分，其值可能不同。通常，特定多核苷酸或多肽(例如，抗原)的变体与所述特定参考多核苷酸或多肽具有至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％但小于100％的序列一致性，通过本文所描述且本领域技术人员已知的序列比对程序和参数确定。这类用于比对的工具包含BLAST套件的工具(Stephen F.Altschul等人(1997),“Gapped BLAST与PSI-BLAST：新一代蛋白质数据库搜索程序(GappedBLAST andPSI-BLAST:a new generation ofprotein database searchprograms)”,《核酸研究》25:3389-3402)。另一种流行的局部比对技术基于Smith-Waterman算法(Smith,T.F.和Waterman,M.S.(1981)“常见分子子序列的鉴定(Identification ofcommon molecularsubsequences)”《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》147:195-197)。基于动态编程的一般全局比对技术是Nedleman-Wunsch算法(Needleman,S.B.和Wunsch,C.D.(1970)“适用于搜索两种蛋白质的氨基酸序列的类似性的一般方法(A general method applicable to thesearch for similarities in the amino acid sequences oftwo proteins)”《分子生物学杂志》48:443-453)。最近，已经开发了一种快速最佳全局序列比对算法(Fast OptimalGlobal SequenceAlignmentAlgorithm；FOGSAA)，据称其比其它最佳全局比对算法方法(包含Neneleman-Wunsch算法)更快地产生核苷酸和蛋白质序列的全局比对。
因此，编码关于参考序列，特别是本文公开的多肽(例如抗原)序列含有取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰的肽或多肽的多核苷酸包含在本公开的范围内。例如，序列标签或氨基酸，例如一种或多种赖氨酸，可以添加到肽序列中(例如，在N末端或C末端处)。序列标签可以用于肽检测、纯化或定位。赖氨酸可以用于增加肽溶解度或允许生物素化。或者，位于肽或蛋白质的氨基酸序列的羧基和氨基酸末端区的氨基酸残基可以任选地缺失，从而提供截短的序列。某些氨基酸(例如，C末端或N末端残基)可替代地取决于序列的使用而缺失，例如，序列作为可溶或连接至固体支持体的较大序列的一部分的表达。在一些实施例中，信号序列、终止序列、跨膜域、接头、多聚化域(例如，折叠区)等的序列可以被实现相同或类似功能的替代序列取代。在一些实施例中，可以例如通过引入较大的氨基酸来填充蛋白质核心中的空腔以改善稳定性。在其它实施例中，埋入的氢键网络可以被疏水性驻留物置换以改善稳定性。在又其它实施例中，糖基化位点可以被去除并被适当残基置换。这类序列是本领域技术人员容易鉴定的。还应当理解，本文提供的一些序列含有序列标签或末端肽序列(例如，在N末端或C末端处)，其可以例如在用于制备RNA(例如，mRNA)疫苗之前缺失。
如本领域技术人员所认识到的，蛋白质片段、功能性蛋白质域和同源蛋白质也被认为在所关注的冠状病毒抗原的范围内。例如，本文提供了参考蛋白质的任何蛋白质片段(意指多肽序列，其至少一个氨基酸残基短于参考抗原序列但其它方面一致)，条件是所述片段是免疫原性的并且赋予对冠状病毒的保护性免疫应答。除了与参考蛋白质一致但截短的变体之外，在一些实施例中，抗原包含2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个突变，如本文所提供的或参考的任何序列所示。抗原/抗原多肽的长度可以在约4、6或8个氨基酸至全长蛋白质的范围内。
在一些实施例中，抗原多肽是结构蛋白。在一些实施例中，抗原多肽是刺突蛋白、包膜蛋白、核衣壳蛋白或膜蛋白。在一些实施例中，抗原多肽是稳定的融合前刺突蛋白。在一些实施例中，mRNA包括编码变异三聚体刺突蛋白的开放阅读框。例如，三聚体刺突蛋白可以包括稳定的融合前刺突蛋白。在一些实施例中，稳定的融合前刺突蛋白是双脯氨酸(S2P)突变。
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)具有编码冠状病毒抗原(例如，变异三聚体刺突蛋白，如稳定的融合前刺突蛋白)的开放阅读框(ORF)。在一些实施例中，RNA(例如，mRNA)进一步包括5'UTR、3'UTR、poly(A)尾和/或5'帽类似物。
在一些实施例中，mRNA包括5'非翻译区(UTR)和/或3'UTR。
信使RNA(mRNA)是编码(至少一种)蛋白质(氨基酸的天然存在的、非天然存在的或经修饰的聚合物)并且可以翻译以在体外、体内、原位或离体产生经编码蛋白质的任何RNA。技术人员应了解，除非另有说明，否则本申请中阐述的核酸序列可以在代表性DNA序列中叙述“T”，但在序列表示RNA(例如，mRNA)的情况下，“T”将被“U”取代。因此，本文通过特定序列识别号公开和鉴定的任何DNA也公开了与DNA互补的对应RNA(例如，mRNA)序列，其中DNA序列的每个“T”被“U”取代。
在一些实施例中，mRNA来源于(a)DNA分子；或(b)RNA分子。在mRNA中，T任选地被U取代。
开放阅读框(ORF)是从起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG或AUG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA，或UAA、UAG或UGA)结束的DNA或RNA的连续延伸段。ORF通常编码蛋白质。本文公开的序列还可以包括另外的元件，例如5'和3'UTR，但与ORF不同的那些元件不一定存在于本公开的多核苷酸中。
稳定元件
除了其它结构特征，例如5'帽结构或3'-poly(A)尾之外，天然存在的真核mRNA分子还可以含有稳定元件，包含但不限于在其5'末端(5'UTR)和/或其3'末端(3'UTR)处的非翻译区(UTR)。5'UTR和3'UTR通常都从基因组DNA转录，并且是不成熟mRNA的元件。在mRNA加工期间，成熟mRNA的特征性结构特征，诸如5'-帽和3'-poly(A)尾通常添加到转录的(不成熟)mRNA中。
在一些实施例中，多核苷酸具有编码至少一种抗原多肽的开放阅读框并且配制在脂质纳米颗粒内，所述抗原多肽具有至少一个修饰、至少一个5'末端帽。在体外转录反应期间，可以使用以下化学RNA帽类似物同时完成多核苷酸的5'加帽，以根据制造商方案产生5'-鸟苷帽结构：3'-O-Me-m7G(5')ppp(5')G[ARCA帽]；G(5')ppp(5')A；G(5')ppp(5')G；m7G(5')ppp(5')A；m7G(5')ppp(5')G(马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室(NewEngland BioLabs,Ipswich,MA))。可以在转录后使用牛痘病毒加帽酶完成经修饰RNA的5'加帽以产生“Cap 0”结构：m7G(5')ppp(5')G(马萨诸塞州伊普斯维奇新英格兰生物实验室)。Cap 1结构可以使用牛痘病毒加帽酶及2'-0甲基转移酶两者产生，以产生m7G(5')ppp(5')G-2'-O-甲基。Cap 2结构可以用Cap 1结构，紧接着使用2'-O甲基转移酶对5'倒数第三核苷酸进行2'-O-甲基化来产生。Cap 3结构可以用Cap 2结构，紧接着使用2'-O甲基转移酶对5'倒数第四核苷酸进行2'-O-甲基化来产生。酶可以来源于重组源。
3'-poly(A)尾通常是添加到转录的mRNA的3'末端的腺嘌呤核苷酸的延伸段。在一些情况下，它可以包括至多约400个腺嘌呤核苷酸。在一些实施例中，3'-poly(A)尾的长度可以是与个别mRNA的稳定性有关的基本元件。
在一些实施例中，多核苷酸包含稳定元件。稳定元件可以包含例如组蛋白茎环。已鉴定出茎环结合蛋白(SLBP)，一种32kDa蛋白。它与细胞核和细胞质中组蛋白消息的3'末端处的组蛋白茎环相关。其表达水平受细胞周期调节；当组蛋白mRNA水平也升高时，其在S期期间达到峰值。已显示所述蛋白质对于U7snRNP对组蛋白前体mRNA的高效3'末端加工是必需的。在加工后，SLBP仍然与茎环相关，并且然后刺激成熟组蛋白mRNA翻译成细胞质中的组蛋白。SLBP的RNA结合结构域在后生动物及原生动物中是保守的；其与组蛋白茎环的结合取决于环的结构。最小结合位点包含相对于茎环在5'的至少三个核苷酸及在3'的两个核苷酸。
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)包含编码区、至少一个组蛋白茎环以及任选地poly(A)序列或多腺苷酸化信号。poly(A)序列或多腺苷酸化信号通常应增强编码的蛋白质的表达水平。在一些实施例中，编码的蛋白质不是组蛋白、报告蛋白(例如荧光素酶、GFP、EGFP、b-半乳糖苷酶、EGFP)或标记物或选择蛋白(例如α-球蛋白、半乳糖激酶和黄嘌呤：鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(GPT))。
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)包含poly(A)序列或多腺苷酸化信号和至少一个组蛋白茎环的组合，即使两者在自然界中都代表替代机制，也起到协同作用以将蛋白质表达增加到超过用任一个别元件观察到的水平。poly(A)和至少一个组蛋白茎环的组合的协同效应不取决于元件的顺序或poly(A)序列的长度。在一些实施例中，RNA(例如，mRNA)不包含组蛋白下游元件(HDE)。“组蛋白下游元件”(HDE)包含天然存在的茎环3'的大约15至20个核苷酸的富嘌呤多核苷酸延伸段，其表示U7snRNA的结合位点，参与将组蛋白前mRNA加工成成熟组蛋白mRNA。在一些实施例中，核酸不包含内含子。
多核苷酸(例如，mRNA)可以含有或可以不含增强子和/或启动子序列，所述增强子和/或启动子序列可以是经修饰的或未经修饰的，或者其可以经活化或灭活。在一些实施例中，组蛋白茎环通常来源于组蛋白基因，并且包含两个相邻部分或完全反向互补序列的分子内碱基配对，所述两个序列通过由形成结构的环的短序列组成的间隔子分开。未配对环区通常不能与茎环元件中的任一个进行碱基配对。这更常发生在RNA中，许多RNA二级结构的关键组分也是如此，但也可能存在于单链DNA中。茎环结构的稳定性通常取决于配对区的长度、错配或凸起(bulge)数目和碱基组成。在一些实施例中，可以产生摆动碱基配对(非沃森-克里克碱基配对)。在一些实施例中，至少一个组蛋白茎环序列包括15至45个核苷酸的长度。
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)去除了一个或多个富AU序列。有时称为AURES的这些序列是在3'UTR中发现的不稳定序列。可以从RNA疫苗中去除AURES。或者，AURES可以保留在RNA疫苗中。
信号肽
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)具有编码融合至冠状病毒抗原的信号肽的ORF。信号肽包括蛋白质N末端15至60个氨基酸通常是在分泌途径上跨膜易位所必需的，因此普遍控制真核生物和原核生物中大多数蛋白质进入分泌途径。在真核生物中，新生前体蛋白(前蛋白)的信号肽将核糖体引导至粗内质网(ER)膜，并引发生长的肽链转运穿过该膜进行加工。内质网加工产生成熟蛋白质，其中信号肽通常通过宿主细胞的ER驻留信号肽酶从前体蛋白质中裂解，或其保持未裂解并充当膜锚定物。信号肽还可以促进蛋白质靶向细胞膜。信号肽的长度可以是15至60个氨基酸。例如，信号肽的长度可以是15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸。在一些实施例中，信号肽的长度是20至60、25至60、30至60、35至60、40至60、45至60、50至60、55至60、15至55、20至55、25至55、30至55、35至55、40至55、45至55、50至55、15至50、20至50、25至50、30至50、35至50、40至50、45至50、15至45、20至45、25至45、30至45、35至45、40至45、15至40、20至40、25至40、30至40、35至40、15至35、20至35、25至35、30至35、15至30、20至30、25至30、15至25、20至25或15至20个氨基酸。
来自异源基因的信号肽(其调节自然界中除冠状病毒抗原之外的基因的表达)是本领域已知的，并且然后可以测试所需性质，然后并入本公开的核酸中。在一些实施例中，信号肽可以包括通过引用整体并入的WO 2021/154763中所描述的信号肽。
融合蛋白
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)编码抗原融合蛋白。因此，一种或多种编码的抗原可以包含连接在一起的两种或更多种蛋白质(例如，蛋白质和/或蛋白质片段)。或者，与蛋白质抗原融合的蛋白质不会促进对自身的强烈免疫反应，而是促进对冠状病毒抗原的强烈免疫反应。在一些实施例中，抗原融合蛋白保留来自每种原始蛋白的功能特性。
支架部分
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)编码融合蛋白，所述融合蛋白包括冠状病毒抗原与支架部分连接。在一些实施例中，这些支架部分对由本公开的核酸编码的抗原赋予所需特性。例如，支架蛋白可以例如通过改变抗原的结构、改变抗原的摄取和加工、和/或引起抗原与结合搭配物结合来改善抗原的免疫原性。
在一些实施例中，支架部分是可以自组装成蛋白质纳米颗粒的蛋白质，所述蛋白质纳米颗粒是高度对称的、稳定的并且结构组织良好，直径为10至150nm，这是与免疫系统的各种细胞最佳相互作用的非常合适的尺寸范围。在一些实施例中，病毒蛋白或病毒样颗粒可用于形成稳定的纳米颗粒结构。这些病毒蛋白的实例是本领域已知的。例如，在一些实施例中，支架部分是B型肝炎表面抗原(HBsAg)。HBsAg形成平均直径为-22nm并且缺乏核酸且因此是非感染性的球形颗粒(Lopez-Sagaseta,J.等人,《计算与结构生物技术杂志(Computational and Structural Biotechnology Journal)》14(2016)58-68)。在一些实施例中，支架部分是B型肝炎核心抗原(HBcAg)自组装成24至31nm直径的颗粒，其类似于从感染了HBV的人肝获得的病毒核心。HBcAg自组装成两类不同尺寸的纳米粒子，直径为300A和360A，对应于180或240个原聚体。在一些实施例中，冠状病毒抗原与HBsAG或HBcAG融合以促进显示冠状病毒抗原的纳米颗粒的自组装。
在一些实施例中，可以使用细菌蛋白质平台。这些自组装蛋白的非限制性实例包含铁蛋白、二氧四氢蝶啶(lumazine)和包封蛋白(encapsulin)。
铁蛋白是一种主要功能是细胞内铁存储的蛋白质。铁蛋白由24个亚基组成，每个亚基由四α螺旋束组成，自组装成八面体对称的四级结构(Cho K.J.等人,《分子生物学杂志》2009；390:83-98)。铁蛋白的几种高分辨率结构已被确定，证实幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)铁蛋白由24个相同的原聚体组成，而在动物体内，铁蛋白轻链和重链可以单独组装或以不同比例组合成24个亚基的颗粒(Granier T.等人,《无机生物化学杂志(J Biol Inorg Chem.)》2003；8:105-111；Fawson D.M.等人,《自然(Nature.)》1991；349:541-544)。铁蛋白自组装成具有稳健的热稳定性和化学稳定性的纳米颗粒。因此，铁蛋白纳米颗粒非常适合携带和暴露抗原。
富马嗪合酶(fumazine synthase；FS)也非常适合作为用于抗原展示的纳米颗粒平台。FS负责核黄素生物合成中的倒数第二个催化步骤，是一种存在于广泛多种生物体中的酶，所述生物体包含古细菌、细菌、真菌、植物和真细菌(eubacteria)(Weber S.E.黄素和黄素蛋白.方法和方案，系列：分子生物学方法(Flavins and Flavoproteins.Methods andProtocols,Series:Methods in MolecularBiology)2014)。FS单体的长度为150个氨基酸，并且由β片以及侧接其侧面的串联α螺旋组成。已经报道了FS的许多不同的季铵结构，说明其形态多样性：从同源五聚体到形成150A直径的衣壳的12个五聚体的对称组装体。甚至已经描述超过100个亚基的FS笼(Zhang X.等人,《分子生物学杂志》2006；362:753-770)。
包封蛋白是一种从嗜热海栖热袍菌(Thermotogamaritima)中分离的新型蛋白质笼纳米颗粒，也可以用作在自组装纳米颗粒的表面上呈递抗原的平台。包封蛋白由相同31kDa单体的60个拷贝组装而成，具有薄的二十面体T＝1对称笼结构，其中内径和外径分别为20nm和24nm(SutterM.等人,《自然结构与分子生物学》2008,15:939-947)。尽管尚未明确理解海栖热袍菌中包封蛋白的确切功能，但其晶体结构最近已被解析，并且其功能被推定为封装蛋白质(诸如DyP(染料脱色过氧化物酶)和Flp(铁蛋白样蛋白质))的细胞室，参与氧化应激反应(Rahmanpour R.等人,《欧洲生物化学联合会期刊(FEBS J.)》2013,280:2097-2104)。
在一些实施例中，多核苷酸编码融合至折叠结构域的冠状病毒抗原(例如，SARS-CoV-2S蛋白)。折叠结构域可以例如从噬菌体T4纤维蛋白获得(参见例如Tao Y等人,《结构(Structure.)》1997年6月15日；5(6):789-98)。
接头和可裂解肽
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)编码多于一种多肽，在本文中称为融合蛋白。在一些实施例中，mRNA进一步编码位于融合蛋白的至少一个或每个结构域之间的接头。接头可以是例如可裂解接头或蛋白酶敏感接头。在一些实施例中，接头选自由以下组成的组：F2A接头、P2A接头、T2A接头、E2A接头及其组合。此自裂解肽接头家族，称为2A肽，已在本领域中有所描述(参见例如Kim，J.H.等人,(2011)《公共科学图书馆·综合(PLoS ONE)》6:el8556)。在一些实施例中，接头是F2A接头。在一些实施例中，融合蛋白含有三个具有插入接头的结构域，具有以下结构：结构域-接头-结构域-接头-结构域。
本领域已知的可裂解接头可以结合本公开使用。示例性的此接头包含F2A接头、T2A接头、P2A接头、E2A接头(参见例如WO2017/127750，其通过引用整体并入本文)。技术人员将理解，其它本领域公认的接头可以适用于本公开的构建体(例如，由本公开的核酸编码)。本领域技术人员同样将理解，其它多顺反子构建体(在同一分子内单独编码多于一种抗原/多肽的mRNA)可能适合于如本文所提供进行使用。
序列优化
在一些实施例中，编码本公开的抗原的ORF是密码子优化的。密码子优化方法是本领域已知的。例如，本文提供的任何一个或多个序列的ORF可以是密码子优化的。在一些实施例中，密码子优化可用于匹配靶生物体和宿主生物体中的密码子频率以确保正确折叠；偏置GC含量以增加mRNA稳定性或减少二级结构；使减少可能损害基因构建或表达的串联重复密码子或碱基运行最小化；定制转录和翻译控制区；插入或去除蛋白质运输序列；去除/添加经编码蛋白中的翻译后修饰位点(例如糖基化位点)；添加、去除或改组蛋白质结构域；插入或缺失限制位点；修饰核糖体结合位点和mRNA降解位点；调整翻译速率以允许蛋白质的各个结构域正确折叠；或者减少或消除多核苷酸内的问题二级结构。密码子优化工具、算法和服务是本领域已知的-非限制性实例包含来自GeneArt(Life Technologies)、DNA2.0(Menlo Park CA)和/或专有方法的服务。在一些实施例中，使用优化算法优化开放阅读帧(ORF)序列。
在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列ORF(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于95％的序列同一性。在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于90％的序列同一性。在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于85％的序列同一性。在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于80％的序列同一性。在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有小于75％的序列同一性。
在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有65％与85％之间(例如，约67％与约85％之间或约67％与约80％之间)的序列同一性。在一些实施例中，密码子优化序列与天然存在的或野生型序列(例如，编码冠状病毒抗原的天然存在的或野生型mRNA序列)共有65％至75％或约80％之间的序列同一性。
在一些实施例中，密码子优化序列编码的抗原与由非密码子优化序列编码的冠状病毒抗原具有相同的免疫原性或更高的免疫原性(例如，高至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％，或至少200％)。当转染到哺乳动物宿主细胞中时，经修饰的mRNA具有12-18小时或大于18小时，例如24、36、48、60、72或大于72小时的稳定性，并且能够由哺乳动物宿主细胞表达。
在一些实施例中，密码子优化的RNA可以是其中G/C水平增强的RNA。核酸分子(例如，mRNA)的G/C含量可影响RNA的稳定性。具有增加量的鸟嘌呤(G)和/或胞嘧啶(C)残基的RNA在功能上可能比含有大量腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)核苷酸的RNA更稳定。作为实例，WO02/098443公开一种药物组合物，其含有通过翻译区中的序列修饰稳定的mRNA。由于遗传密码子的简并性，这些修饰通过用现有密码子代替那些促进更大RNA稳定性而不改变所得氨基酸的密码子来起作用。该方法限于RNA的编码区。
未经化学修饰的核苷酸
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)未被化学修饰并且包括由腺苷、鸟苷、胞嘧啶和尿苷组成的标准核糖核苷酸。在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)的核苷酸和核苷包括标准核苷残基，诸如转录的RNA中存在的核苷残基(例如，A、G、C或U)。在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)的核苷酸和核苷包括标准脱氧核糖核苷，诸如DNA中存在的脱氧核糖核苷(例如，dA、dG、dC或dT)。
化学修饰
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)包括具有编码冠状病毒抗原的开放阅读框的RNA，其中所述核酸包括可以是标准的(未修饰的)或本领域已知的经过修饰的核苷酸和/或核苷。在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)的核苷酸和核苷包括经修饰的核苷酸或核苷。这些经修饰的核苷酸和核苷可以是天然存在的经修饰的核苷酸和核苷，或非天然存在的经修饰的核苷酸和核苷。这些修饰可以包含如本领域中公认的在核苷酸和/或核苷的糖、主链或核碱基部分处的修饰。
多核苷酸(例如，mRNA)的核酸可以包括标准核苷酸和核苷、天然存在的核苷酸和核苷、非天然存在的核苷酸和核苷或其任何组合。
在一些实施例中，多核苷酸的核酸(例如，DNA核酸和RNA核酸，诸如mRNA核酸)包括各种(多于一种)不同类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。在一些实施例中，核酸的特定区含有一种、两种或更多种(任选地不同)类型的标准和/或经修饰的核苷酸和核苷。
在一些实施例中，相对于包括标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸，引入细胞或生物体的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)分别在细胞或生物体中表现出降解减少。
在一些实施例中，相对于包括标准核苷酸和核苷的未修饰的核酸，引入细胞或生物体中的经修饰的RNA核酸(例如，经修饰的mRNA核酸)可以分别在细胞或生物体中表现出免疫原性降低(例如，先天应答减少)。
在一些实施例中，核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)包括在核酸的合成或合成后期间引入以实现所需功能或特性的非天然的经修饰核苷酸。修饰可以存在于核苷酸间键联、嘌呤或嘧啶碱基或糖上。修饰可以通过化学合成或用聚合酶在链末端或链中的任何其它位置引入。核酸的任何区域都可以被化学修饰。
本公开提供核酸(例如，RNA核酸，诸如mRNA核酸)的经修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱(例如嘌呤或嘧啶)或其衍生物(在本文中也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指核苷，包含磷酸酯基。经修饰的核苷酸可以通过任何有用的方法合成，例如化学、酶促或重组，以包含一种或多种经修饰的或非天然核苷。核酸可以包括一个或多个连接的核苷区域。这些区域可以具有可变的主链键联。键联可以是标准磷酸二酯键联，在这种情况下，核酸将包括核苷酸区域。
经修饰的核苷酸碱基配对不仅涵盖标准的腺苷-胸腺嘧啶、腺苷-尿嘧啶或鸟苷-胞嘧啶碱基对，而且还涵盖在核苷酸和/或包括非标准或经修饰碱基的经修饰核苷酸之间形成的碱基对，其中例如在具有至少一种化学修饰的那些核酸中，氢键供体和氢键受体的排列允许在非标准碱基和标准碱基之间或两个互补的非标准碱基结构之间形成氢键结合。这种非标准碱基配对的一个实例是经修饰的核苷酸肌苷与腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶之间的碱基配对。碱基/糖或接头的任何组合可以并入本公开的核酸中。
在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)在核酸的一个或多个或所有尿苷位置处包括尿苷。在一些实施例中，针对特定修饰，mRNA被统一修饰(例如，被完全修饰、在整个序列中修饰)。例如，核酸可以用1-甲基-假尿苷统一修饰，这意味着mRNA序列中的所有尿苷残基均被1-甲基-假尿苷置换。类似地，可以通过用经修饰的残基(例如上述经修饰的残基)置换而针对序列中存在的任何类型的核苷残基对核酸进行统一修饰。
多核苷酸(例如，mRNA)的核酸可以沿着分子的整个长度被部分或完全修饰。例如，一种或多种或全部或给定类型的核苷酸(例如，嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C中的任何一种或多种或全部)可以在本公开的核酸中或者在其预定序列区中(例如，在包含或不包含poly(A)尾的mRNA中)被统一修饰。在一些实施例中，本公开的核酸中(或其序列区中)的所有核苷酸X是经修饰的核苷酸，其中X可以是核苷酸A、G、U、C中的任一者，或组合A+G、A+U、A+C、G+U、G+C、U+C、A+G+U、A+G+C、G+G+C或A+G+C中的任一者。
核酸所可含有约1％至约100％(相对于总核苷酸含量，或者相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间百分比(例如，1％至20％、1％至25％、1％至50％、1％至60％、1％至70％、1％至80％、1％至90％、1％至95％、10％至20％、10％至25％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、10％至100％、20％至25％、20％至50％、20％至60％、20％至70％、20％至80％、20％至90％、20％至95％、20％至100％、50％至60％、50％至70％、50％至80％、50％至90％、50％至95％、50％至100％、70％至80％、70％至90％、70％至95％、70％至100％、80％至90％、80％至95％、80％至100％、90％至95％、90％至100％、以及95％至100％)的经修饰核苷酸。应理解，任何剩余百分比均是由未修饰的A、G、U或C的存在导致。
mRNA可含有最少1％和最多100％的经修饰核苷酸或任何中间百分比，诸如至少5％的经修饰核苷酸、至少10％的经修饰核苷酸、至少25％的经修饰核苷酸、至少50％的经修饰核苷酸、至少80％的经修饰核苷酸或至少90％的经修饰核苷酸。例如，核酸可以含有经修饰的嘧啶，诸如经修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施例中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被经修饰的尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)置换。经修饰的尿嘧啶可以由具有单个独特结构的化合物置换，或者可以由具有不同结构(例如，2、3、4个或更多个独特结构)的多种化合物置换。在一些实施例中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被经修饰的胞嘧啶(例如，5-取代的胞嘧啶)置换。经修饰的胞嘧啶可以由具有单个独特结构的化合物置换，或者可以由具有不同结构(例如，2、3、4个或更多个独特结构)的多种化合物置换。
非翻译区(UTR)
多核苷酸(例如，mRNA)可以包括用作或充当非翻译区的一个或多个区域或部分。在mRNA被设计成编码至少一种所关注的抗原的情况下，核酸可以包括这些非翻译区(UTR)中的一个或多个。核酸的野生型非翻译区被转录但不被翻译。在mRNA中，5'UTR从转录起始位点开始并继续到起始密码子，但不包含起始密码子；而3'UTR紧接在终止密码子之后开始并继续直到转录终止信号。越来越多的证据表明UTR在核酸分子和翻译的稳定性方面发挥着调节作用。UTR的调节特征可以并入本公开的多核苷酸中，以尤其增强分子的稳定性。还可以并入特定特征，以确保转录物的受控下调，以防它们被误导到不需要的器官部位。多种5'UTR和3'UTR序列是本领域中已知的且可获得的。
5'UTR是起始密码子(由核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)直接上游(5')的mRNA区域。5'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。天然5'UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们具有如Kozak序列的特征，众所周知，这些特征参与核糖体起始许多基因翻译的过程。Kozak序列具有共有序列CCR(A/G)CCAUGG，其中R是在起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后是另一个‘G’。还已知5'UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
在一些实施例中，5'UTR是异源UTR，即在自然界中发现的与不同ORF相关的UTR。在另一实施例中，5'UTR是合成UTR，即自然界中不存在。合成UTR包含已突变以改善其特性(例如增加基因表达)的UTR以及完全合成的UTR。示例性5'UTR包含非洲爪蟾(Xenopus)或人来源的a-球蛋白或b-球蛋白(8278063；9012219)、人细胞色素b-245a多肽、和羟基类固醇(17b)脱氢酶以及烟草蚀刻病毒(Tobacco etchvirus)(U.S.8278063、9012219，其通过引用整体并入本文中)。还可以使用CMV立即早期1(IE1)基因(US2014/0206753、WO2013/185069，其通过引用整体并入本文中)、序列GGGAUCCUACC(WO2014/144196)。在另一实施例中，TOP基因的5'UTR是缺乏5'TOP基序(寡嘧啶段)的TOP基因的5'UTR(例如WO/2015/101414、WO2015/101415、WO/2015/062738、WO2015/024667、WO2015/024667；可以使用来源于核糖体蛋白大32(L32)基因的5'UTR元件(WO/2015/101414、WO2015/101415、WO/2015/062738)、来源于羟基类固醇(17-b)脱氢酶4基因(HSD17B4)的5'UTR的5'UTR元件(WO2015/024667)，或来源于ATP5A1的5'UTR的5'UTR元件(WO2015/024667)。在一些实施例中，使用内部核糖体进入位点(IRES)代替5'UTR。
3'UTR是在终止密码子(mRNA转录物中传导翻译终止信号的密码子)直接下游(3')的mRNA区域。3'UTR不编码蛋白质(是非编码的)。已知天然或野生型3'UTR中嵌入有腺苷和尿苷的链段。这些富含AU的特征在具有高周转率的基因中尤其普遍。基于其序列特征和功能特性，富含AU元件(ARE)可分成三个类别(Chen等人,1995)：I类ARE在富含U的区域内含有AUUUA基序的若干分散拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有此类ARE的分子包含GM-CSF和TNF-α。III类ARES的定义不太明确。这些富含U的区域不含AUUUA基序。c-Jun和成肌蛋白(Myogenin)是这个类别的两个充分研究的实例。
已知大多数与ARE结合的蛋白质都会破坏信使的稳定性，而ELAV家族的成员，尤其是HuR，已被证明增加mRNA的稳定性。HuR结合所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化到核酸分子的3'UTR中将导致HuR结合，并且因此使体内信息稳定。
3'UTR富含AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节多核苷酸(例如，mRNA)的稳定性。当工程化特定核酸时，可以引入ARE的一个或多个拷贝以使本公开的核酸不太稳定，并且由此减少翻译并减少所得蛋白质的产生。同样，ARE可以被识别并且去除或突变以增加细胞内稳定性，从而增加所得蛋白质的翻译和产生。可以使用本公开的核酸在相关细胞系中进行转染实验，并且可以在转染后的不同时间点分析蛋白质产生。例如，细胞可以用不同的ARE工程化分子转染，并且通过使用相关蛋白质的ELISA试剂盒，分析转染后6小时、12小时、24小时、48小时和7天产生的蛋白质。
3'UTR可以是异源的或合成的。关于3'UTR，球蛋白UTR，包含非洲爪蟾b-球蛋白UTR和人b-球蛋白UTR是本领域中已知的(8278063、9012219、US2011/0086907)。通过头对尾克隆两个连续的人b-球蛋白3'UTR，在一些细胞类型中具有增强的稳定性的经修饰的b-球蛋白构建体已经被开发出来，并且是本领域中众所周知的(US2012/0195936、WO2014/071963)。另外，a2-球蛋白、a1-球蛋白、UTR和其突变体也是本领域中已知的(WO2015/101415、WO2015/024667)。非专利文献中的mRNA构建体中描述的其它3'UTR包含CYBA(Ferizi等人,2015)和白蛋白(Thess等人,2015)。其它示例性3'UTR包含牛或人生长激素(野生型或经修饰)(WO2013/185069、US2014/0206753、WO2014152774)、兔b球蛋白和B型肝炎病毒(HBV)的3'UTR，a-球蛋白3'UTR和病毒VEEV 3'UTR序列也是本领域中已知的。在一些实施例中，使用序列UUUGAAUU(WO2014/144196)。在一些实施例中，使用人和小鼠核糖体蛋白的3'UTR。其它实例包含rps93'UTR(WO2015/101414)、FIG4(WO2015/101415)和人白蛋白7(WO2015/101415)。
本领域普通技术人员将理解，异源或合成的5'UTR可以与任何期望的3'UTR序列一起使用。例如，异源5'UTR可以与具有异源3'UTR的合成3'UTR一起使用。
非UTR序列也可以用作核酸内的区域或子区域。例如，内含子或内含子序列的部分可以并入本公开的核酸的区域中。内含子序列的并入可以增加蛋白质产量以及核酸水平。
特征的组合可以包括在侧接区域中，并且可以包含在其它特征内。例如，ORF可以侧接有5'UTR和/或3'UTR，所述5'UTR可以含有强的Kozak翻译起始信号，所述3'UTR可以包含用于模板化添加poly-A尾的oligo(dT)序列。5'UTR可包括来自相同和/或不同基因的第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，例如美国专利申请公开案第2010/0293625号和PCT/US2014/069155中描述的5'UTR，所述文献通过引用整体并入本文中。应理解，来自任何基因的任何UTR可以并入核酸的区域中。此外，可以利用任何已知基因的多个野生型UTR。提供不是野生型区域的变体的人工UTR也在本公开的范围内。这些UTR或其部分可以以与从中选择它们的转录物中相同的取向放置，或者可以改变取向或位置。因此，5'或3'UTR可以倒置、缩短、延长，由一个或多个其它5'UTR或3'UTR制成。如本文所使用的，术语“改变”在与UTR序列有关时，意味着UTR相对于参考序列已经以某种方式改变。例如，3'UTR或5'UTR可以通过上文所教导的取向或位置的变化而相对于野生型或天然UTR改变，或者可以通过包括另外的核苷酸、核苷酸的缺失、核苷酸的交换或转位来改变。产生“改变的”UTR(无论是3'还是5')的任何这些变化都包括变体UTR。
在一些实施例中，可以使用双、三或四UTR，例如5'UTR或3'UTR。如本文所使用的，“双”UTR是其中同一UTR的两个拷贝串联或大体上串联编码的UTR。例如，双β-球蛋白3'UTR可以根据美国专利公开案2010/0129877中所描述使用，所述公开案的内容通过引用整体并入本文。
具有模式化的UTR也在本公开的范围内。如本文所使用的，“模式化的UTR”是反映重复或交替模式的那些UTR，例如重复一次、两次或多于3次的ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体。在这些模式中，每个字母A、B或C表示核苷酸层面的不同UTR。
在一些实施例中，侧接区选自蛋白质共享共同功能、结构、特征或性质的转录物家族。例如，所关注的多肽可以属于在特定细胞、组织中或在发育期间的某个时间表达的蛋白质家族。来自这些基因中的任一个的UTR可以换成相同或不同蛋白质家族的任何其它UTR以产生新的多核苷酸。如本文所使用的，“蛋白质家族”在最广泛的意义上使用，是指共享至少一种功能、结构、特征、定位、起源或表达模式的一组两种或更多种所关注的多肽。
非翻译区还可以包含翻译增强子元件(TEE)。作为非限制性实例，TEE可以包含美国申请第2009/0226470号(通过引用整体并入本文中)中描述的TEE以及本领域中已知的TEE。编码本文所描述的多核苷酸的RNA cDNA的体外转录可以使用体外转录(IVT)系统进行转录。RNA的体外转录是本领域中已知的，并且描述于国际公开案WO 2014/152027中，所述公开案通过引用整体并入本文中。在一些实施例中，本公开的RNA根据WO 2018/053209和WO2019/036682中描述的任何一种或多种方法来制备，所述文献各自通过引用并入本文中。
在一些实施例中，在体外转录反应中使用非扩增的线性化DNA模板产生RNA转录物，从而产生RNA转录物。在一些实施例中，模板DNA是分离的DNA。在一些实施例中，模板DNA是cDNA。在一些实施例中，cDNA通过RNA多核苷酸(例如但不限于冠状病毒mRNA)的逆转录形成。在一些实施例中，用质粒DNA模板转染细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，例如DH-1细胞。在一些实施例中，培养转染的细胞以复制质粒DNA，然后将其分离和纯化。在一些实施例中，DNA模板包含RNA聚合酶启动子，例如位于所关注基因5'并且可操作地连接至所关注基因的T7启动子。
在一些实施例中，体外转录模板编码5'非翻译区(UTR)，含有开放阅读框，并且编码3'UTR和poly(A)尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板所编码的mRNA。
“5'非翻译区”(UTR)是指位于起始密码子(即，由核糖体翻译的mRNA转录物的第一个密码子)直接上游(即，5')的mRNA区域，其不编码多肽。当生成RNA转录物时，5'UTR可以包括启动子序列。这些启动子序列是本领域中已知的。应当理解，这些启动子序列将不存在于本公开的疫苗中。
“3'非翻译区”(UTR)是指位于终止密码子(即，mRNA转录物中传导翻译终止信号的密码子)直接下游(即，3')的mRNA区域，其不编码多肽。
“开放阅读框”是从起始密码子(例如，甲硫氨酸(ATG))开始并以终止密码子(例如，TAA、TAG或TGA)结束并且编码多肽的连续DNA区段。
“poly(A)尾”是位于3'UTR下游例如直接下游(即，3')的含有多个连续单磷酸腺苷的mRNA区域。poly(A)尾可以含有10至300个单磷酸腺苷。例如，poly(A)尾可以含有10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个单磷酸腺苷。在一些实施例中，poly(A)尾含有50至250个单磷酸腺苷。在相关的生物环境中(例如，在细胞中、在体内)，poly(A)尾用于保护mRNA例如在细胞质中免受酶促降解，并且有助于转录终止和/或从细胞核中输出mRNA并翻译。
在一些实施例中，核酸包含200至3,000个核苷酸。例如，核酸可以包含200至500、200至1000、200至1500、200至3000、500至1000、500至1500、500至2000、500至3000、1000至1500、1000至2000、1000至3000、1500至3000或2000至3000个核苷酸)。
体外转录系统通常包括转录缓冲液、三磷酸核苷酸(NTP)、RNA酶抑制剂和聚合酶。
NTP可以在内部制造，可以从供应商选择，或者可以根据本文所描述合成。NTP可以选自但不限于本文所描述的NTP，包含天然和非天然(经修饰的)NTP。
本公开的方法中可以使用任何数量的RNA聚合酶或变体。聚合酶可以选自但不限于噬菌体RNA聚合酶，例如T7RNA聚合酶、T3RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶和/或突变体聚合酶，例如但不限于能够并入经修饰的核酸和/或经修饰的核苷酸(包含化学修饰的核酸和/或核苷酸)的聚合酶。一些实施例排除了DNA酶的使用。
在一些实施例中，RNA转录物经由酶促加帽被加帽。在一些实施例中，多核苷酸(例如，mRNA)包括5'端帽，例如7mG(5')ppp(5')NlmpNp。
化学合成
固相化学合成。多核苷酸(例如，mRNA)可以全部或部分使用固相技术来制造。核酸的固相化学合成是一种自动化方法，其中分子固定在固体载体上并且在反应物溶液中逐步合成。固相合成可用于位点特异性引入核酸序列中的化学修饰。
液相化学合成。通过依序添加单体构建块来合成多核苷酸(例如，mRNA)可以在液相中进行。
合成方法的组合。上文所讨论的合成方法各自具有其自身的优势和限制。已尝试组合这些方法以克服限制。方法的这些组合在本公开的范围内。固相或液相化学合成与酶促连接的组合使用提供了一种产生长链核酸的高效方法，这是单独通过化学合成无法获得的。
核酸区域或子区域的连接
也可以使用通过连接酶组装核酸。DNA或RNA连接酶通过形成磷酸二酯键来促进多核苷酸链的5'和3'端的分子间连接。核酸例如嵌合多核苷酸和/或环状核酸可以通过一个或多个区域或子区域的连接来制备。DNA片段可以通过连接酶催化的反应连接，以产生具有不同功能的重组DNA。两种寡脱氧核苷酸(一种具有5'磷酰基且另一种具有游离3'羟基)充当DNA连接酶的底物。
纯化
本文所描述的核酸的纯化可以包含但不限于核酸净化、质量保证和质量控制。可以通过本领域中已知的方法进行净化，所述方法例如但不限于珠粒(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA)、poly-T珠粒、LNATM oligo-T捕获探针(Inc,Vedbaek,Denmark)或基于HPLC的纯化方法，例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC)。术语“纯化”在与核酸相关使用时，例如“纯化的核酸”，是指与至少一种杂质分离的核酸。“杂质”是使得另一种物质变得不合适、不纯净或较差的任何物质。因此，纯化的核酸(例如，DNA和RNA)以与其在自然界中发现的形式或环境不同的形式或环境存在，或者以与在使其经受处理或纯化方法之前其存在的形式或环境不同的形式或环境存在。
质量保证和/或质量控制检查可以使用例如但不限于凝胶电泳、UV吸光度或分析性HPLC的方法进行。
在一些实施例中，核酸可以通过包含但不限于逆转录酶-PCR的方法进行测序。
量化
在一些实施例中，多核苷酸(例如mRNA)可以在外来体中或当来源于一种或多种体液时定量。体液包含外周血、血清、血浆、腹水、尿液、脑脊髓液(CSF)、痰、唾液、骨髓、滑液、房水、羊水、耵聍、母乳、支气管肺泡灌洗液、精液、前列腺液、考珀液(cowper's fluid)或射精前液、汗液、粪便、头发、眼泪、囊肿液、胸膜和腹膜液、心包液、淋巴、食糜、乳糜、胆汁、间质液、月经、脓液、皮脂、呕吐物、阴道分泌物、粘膜分泌物、粪便水、胰液、窦腔灌洗液、支气管肺吸出物、囊胚腔液和脐带血。或者，外来体可以从选自由以下组成的组的器官获取：肺、心脏、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝和胎盘。
可以使用构建体特异性探针、细胞术、qRT-PCR、实时PCR、PCR、流式细胞术、电泳、质谱法或其组合进行分析，同时可以使用免疫组织化学方法例如酶联免疫吸附测定(ELISA)方法来分离外来体。外来体也可以通过尺寸排阻色谱法、密度梯度离心、差速离心、纳米膜超滤、免疫吸收捕获、亲和纯化、微流体分离或其组合来分离。
这些方法使研究者能够实时监测剩余或递送的核酸水平。这是可能的，因为在一些实施例中，本公开的核酸由于结构或化学修饰而不同于内源形式。
在一些实施例中，核酸可以使用例如但不限于紫外可见光谱法(UV/Vis)的方法定量。UV/Vis光谱仪的非限制性实例是光谱仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔公司(ThermoFisher,Waltham,MA))。可以分析定量的核酸，以便确定核酸是否具有适当尺寸，检查核酸是否未发生降解。核酸的降解可以通过以下方法来检查，例如但不限于琼脂糖凝胶电泳、基于HPLC的纯化方法(例如但不限于强阴离子交换HPLC、弱阴离子交换HPLC、反相HPLC(RP-HPLC)和疏水相互作用HPLC(HIC-HPLC))、液相色谱-质谱法(LCMS)、毛细管电泳(CE)和毛细管凝胶电泳(CGE)。
多价疫苗
如本文所提供的，BacLC/核酸疫苗可以包含编码相同或不同物种的两种或更多种抗原的RNA或多个RNA。在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗包含编码两种或更多种冠状病毒抗原的RNA或多个RNA。在一些实施例中，RNA可以编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12种或更多种冠状病毒抗原。
在一些实施例中，编码抗原的两种或更多种不同RNA(例如，mRNA)可以配制在同一脂质纳米颗粒中。在其它实施例中，可以将编码抗原的两种或更多种不同RNA配制在分开的脂质纳米颗粒中(每种RNA配制在单个脂质纳米颗粒中)。然后，可以将脂质纳米颗粒组合并作为单一疫苗组合物(例如，包括编码多种抗原的多种RNA)施用，或者可以单独施用。
组合疫苗
如本文所提供的，BacLC/核酸疫苗可以包含编码相同或不同病毒株的两种或更多种抗原的RNA或多个RNA。本文还提供了组合疫苗，所述组合疫苗包含编码一种或多种冠状病毒和不同生物体的一种或多种抗原的RNA。因此，本公开的疫苗可以是组合疫苗，其靶向相同病毒株/物种的一种或多种抗原，或不同病毒株/物种的一种或多种抗原，例如诱导对如下生物体的免疫性的抗原：冠状病毒感染风险较高的同一地理区域中存在的生物体，或个体在暴露于冠状病毒时可能接触到的生物体。
疫苗施用
在一些实施例中，可以向受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类受试者)施用BacLC/核酸疫苗，并且RNA多核苷酸在体内翻译以产生抗原多肽(抗原)。组合物(例如，包括RNA)的“有效量”至少部分地基于靶组织、靶细胞类型、施用手段、RNA的物理特征(例如，长度、核苷酸组成和/或经修饰核苷的程度)、疫苗的其它组分和其它决定因素，诸如受试者的年龄、体重、身高、性别和一般健康状况。通常，有效量的BacLC/核酸疫苗提供诱导型或增强型免疫应答，作为受试者的细胞中的抗原产生的函数。在一些实施例中，与含有编码相同抗原或肽抗原的对应未经修饰的多核苷酸的组合物相比，有效量的含有具有至少一个化学修饰的RNA多核苷酸的组合物更高效。抗原产生的增加可以通过细胞转染的增加(用RNA疫苗转染的细胞的百分比)、多核苷酸的蛋白质翻译和/或表达的增加、核酸降解的减少(例如，通过增加的经修饰多核苷酸的蛋白质翻译持续时间证明)或宿主细胞的抗原特异性免疫应答的改变来证明。
术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，使得所述组合物尤其适合于体内或离体的诊断或治疗用途。施用于受试者或对受试者施用后，“药学上可接受的载剂”不会引起不期望的生理效应。药物组合物中的载剂在其与活性成分相容并且能够使其稳定的意义上必须也是“可接受的”。一种或多种增溶剂可用作药物载剂以用于递送活性剂。药学上可接受的载剂的实例包含但不限于生物相容的媒剂、佐剂、添加剂和稀释剂，以实现可用作剂型的组合物。其它载剂的实例包含胶体氧化硅、硬脂酸镁、纤维素和月桂基硫酸钠。另外的合适的药物载剂和稀释剂以及其使用的药物必需品描述于《雷明顿的药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》中。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗可用于治疗或预防冠状病毒感染。BacLC/核酸疫苗可以作为主动免疫方案的一部分预防性或治疗性地施用于健康个体，或者在潜伏期的感染早期或症状发作后的主动感染期间施用。在一些实施例中，提供给细胞、组织或受试者的RNA的量可以是对免疫预防有效的量。
BacLC/核酸疫苗可以与其它预防性或治疗性化合物一起施用。作为非限制性实例，预防性或治疗性化合物可以是佐剂或加强剂。如本文所使用的，当提及预防性组合物例如疫苗时，术语“加强剂”是指预防性(疫苗)组合物的额外施用。可以在较早施用预防性组合物之后给予加强剂(或加强疫苗)。预防性组合物的初次施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、15分钟、20分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、36小时、2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、18个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年、45年、50年、55年、60年、65年、70年、75年、80年、85年、90年、95年或超过99年。在示例性实施例中，预防性组合物的初次施用与加强剂之间的施用时间可以是但不限于1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、6个月或1年。
在一些实施例中，BacLC/核酸疫苗可以肌肉内、鼻内或皮内施用，类似于本领域中已知的灭活疫苗的施用。
BacLC/核酸疫苗可以用于各种环境中，这取决于感染的流行程度或未满足的医疗需求的程度或水平。作为非限制性实例，RNA疫苗可用于治疗和/或预防各种感染性疾病。RNA疫苗具有优异的特性，因为它们比市售疫苗产生更大的抗体滴度、更好的中和免疫力、产生更持久的免疫应答和/或更早产生应答。
试剂盒
本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含具有本文所描述的细菌源性脂质组合物的容器。试剂盒可以进一步包含用于根据本发明的方法将细菌源性脂质组合物施加或递送到植物的指导材料。本领域技术人员将理解，在本发明的方法中施加细菌源性脂质组合物的说明书可以是任何形式的说明书。此类说明包含但不限于书面说明材料(如标签、小册子、活页)、口头指导材料(如盒式磁带或CD)或视频说明(如录像带或DVD)。
其它实施例：
实施例1.一种细菌源性脂质组合物，其包括：
(a)细菌组分，所述细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质；以及
(b)可电离脂质。
实施例2.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌组分包括分离的细菌胞外囊泡。
实施例3.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌组分是通过在存在所述可电离脂质的情况下重构包括所述细菌组分的膜来修饰的。
实施例4.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌组分是通过用所述可电离脂质重构包括所述细菌组分的经纯化的细菌脂质的膜来修饰的。
实施例5.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质具有一种或多种选自由以下组成的组的特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P比率。
实施例6.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物进一步包括固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
实施例7.根据实施例6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG或PEG-PE。
实施例8.根据实施例7所述的细菌源性脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG，并且所述PEG-DMG是PEG2000-DMG或PEG2000-PE。
实施例9.根据实施例6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括：
约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质；
约20mol％至约60mol％的所述细菌组分；
约7mol％至约45mol％的所述固醇；以及
约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
实施例10.根据实施例9所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括：
约35mol％的所述可电离脂质；
约50mol％的细菌脂质；
约12.5mol％的所述固醇；以及
约2.5mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
实施例11.根据实施例6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35:50:12.5:2.5的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质。
实施例12.根据实施例6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35:20:42.5:2.5的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质。
实施例13.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315。
实施例14.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质是其中每个R独立地是C8-C14烷基。
实施例15.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌来源选自埃希氏杆菌属、不动杆菌属、农杆菌属、项圈藻属、产水菌属、固氮弧菌属、固氮菌属、博代氏杆菌属、慢生根瘤菌属、布鲁氏菌属、布赫纳氏菌属、伯克氏菌属、韧皮部杆菌属、色杆菌属、鳄球藻属、脱氯单胞菌属、脱亚硫酸菌属、脱硫小杆菌属、欧文氏菌属、弗朗西斯氏菌属、梭杆菌属、粘杆菌属、葡糖杆菌属、螺杆菌属、军团菌属、磁螺菌属、中慢生根瘤菌属、甲基球菌属、奈瑟氏菌属、亚硝化单胞菌属、念珠藻属、发光杆菌属、光杆状菌属、单胞菌属、原绿球藻属、假单胞菌属、嗜冷杆菌属、罗尔斯通菌属、红长命菌属、沙门氏菌属、希瓦氏菌属、志贺氏菌属、中华根瘤菌属、聚球藻属、集胞藻属、热粘球菌属、热袍菌属、栖热菌属、硫杆菌属、束毛藻属、弧菌属、魏格沃斯菌属、沃廉菌属、黄单胞菌属、木杆菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、梭菌属、异常球菌属、微小杆菌属、地芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳杆菌属、穆尔氏菌属、大洋芽胞杆菌属、共生菌属和热厌氧杆菌属。
实施例16.根据实施例15所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌来源是大肠杆菌或鼠伤寒沙门氏菌。
实施例17.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是选自由以下组成的组的亲脂性部分：脂质复合物、脂质体、脂质纳米颗粒、基于聚合物的载剂、外泌体、层状体、胶束和乳液。
实施例18.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是选自由以下组成的组的脂质体：阳离子脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、单层脂质体、多层脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体和多囊泡脂质体。
实施例19.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是脂质纳米颗粒。
实施例20.根据实施例19所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小小于约200nm。
实施例21.根据实施例20所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小小于约150nm。
实施例22.根据实施例20所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小小于约100nm。
实施例23.根据实施例20所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小为约85nm至约90nm。
实施例24.根据实施例19所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均多分散性指数(PDI)在约0.1至约0.4的范围内。
实施例25.根据实施例24所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均PDI在约0.2至约0.3的范围内。
实施例26.根据前述实施例中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物进一步包括一种或多种异源功能剂。
实施例27.根据实施例26所述的细菌源性脂质组合物，其中所述异源功能剂由所述细菌源性脂质组合物包封、包埋在所述细菌源性脂质组合物的表面上或与所述表面缀合。
实施例28.根据实施例26所述的细菌源性脂质组合物，其中所述异源功能剂包括多核苷酸。
实施例29.根据实施例28所述的细菌源性脂质组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
实施例30.根据实施例26所述的细菌源性脂质组合物，其中细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约50:1至约10:1。
实施例31.根据实施例30所述的细菌源性脂质组合物，其中细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约44:1至约24:1。
实施例32.根据实施例30所述的细菌源性脂质组合物，其中细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约40:1至约28:1。
实施例33.根据实施例30所述的细菌源性脂质组合物，其中细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约38:1至约30:1。
实施例34.根据实施例30所述的细菌源性脂质组合物，其中细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约37:1至约33:1。
实施例35.根据前述实施例中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其进一步包括pH为约7.0至约8.5的HEPES或TRIS缓冲液。
实施例36.根据实施例35所述的细菌源性脂质组合物，其中所述HEPES或TRIS缓冲液的浓度为约7mg/mL至约15mg/mL。
实施例37.根据实施例35或36所述的细菌源性脂质组合物，其中所述缓冲液进一步包括约2.0mg/mL至约4.0mg/mL的NaCl。
实施例38.根据前述实施例中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其进一步包括一种或多种冷冻保护剂。
实施例39.根据实施例38所述的细菌源性脂质组合物，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自由蔗糖、甘油和其组合组成的组。
实施例40.根据实施例29所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括浓度为约70mg/mL至约110mg/mL的蔗糖和浓度为约50mg/mL至约70mg/mL的甘油的组合。
实施例41.根据前述实施例中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是经冻干的组合物。
实施例42.根据实施例41所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括一种或多种冻干保护剂。
实施例43.根据实施例41所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括泊洛沙姆、山梨酸钾、蔗糖或其任何组合。
实施例44.根据实施例43所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.01％w/w至约1.0％w/w的泊洛沙姆。
实施例45.根据实施例43或44所述的细菌源性脂质组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
实施例46.根据实施例41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.01％w/w至约1.0％w/w的多核苷酸。
实施例47.根据实施例41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约1.0％w/w至约5.0％w/w的脂质。
实施例48.根据实施例41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.5％w/w至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。
实施例49.根据实施例41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.75％w/w至约2.75％w/w的NaCl。
实施例50.根据实施例41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约85％w/w至约95％w/w的糖。
实施例51.根据实施例50所述的细菌源性脂质组合物，其中所述糖是蔗糖。
实施例52.根据实施例41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中经冻干的细菌源性脂质纳米颗粒包括约1.0％w/w至约5.0％w/w的山梨酸钾。
实施例53.一种用于制备细菌源性脂质组合物的方法，所述方法包括：
在存在(b)可电离脂质的情况下重构(a)包括从细菌来源提取的一种或多种脂质的细菌组分，以产生所述细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质具有以下所列特性中的两种或更多种特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P比率；以及
将一种或多种异源功能剂装载到所述细菌源性脂质组合物中。
实施例54.根据实施例53所述的方法，其中所述重构步骤包括：
在存在所述可电离脂质(b)的情况下重构包括所述细菌组分(a)的经纯化的细菌脂质的膜，以产生所述细菌源性脂质组合物。
实施例55.根据实施例53所述的方法，其中所述异源功能剂包括多核苷酸。
实施例56.根据实施例55所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA。
实施例57.根据实施例1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质具有一种或多种选自由以下组成的组的特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少3的N:P比率。
实施例58.一种用于制备细菌源性脂质组合物的方法，所述方法包括：
在存在(b)可电离脂质的情况下重构(a)包括从细菌来源提取的一种或多种脂质的细菌组分，以产生所述细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质具有以下所列特性中的两种或更多种特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少3的N:P比率；以及
将一种或多种异源功能剂装载到所述细菌源性脂质组合物中。
实例
现在总体上描述本发明，通过参考以下实例将更容易理解本发明，包含所述实例仅用于说明本发明的某些方面和实施例，且不意图限制本发明。
实例1：细菌源性脂质组合物的制备与修饰
此实例描述了包括从细菌来源提取的脂质的细菌组分的制备，以及对细菌组分进行修饰以形成细菌源性脂质组合物。
包括从细菌来源提取的脂质的细菌组分
可以利用美国专利申请公开第2020/0254028号中公开的方法来提取和分离包括分离的细菌胞外囊泡(EV)的细菌组分，所述美国专利申请公开通过引用整体并入本文。
可以利用国际申请公开第WO 20010/120939号、美国专利第7,847,113号和美国专利第8,592,188号中公开的方法来从细菌来源中提取和分离脂质，所述文献通过引用整体并入本文。
来自细菌来源的脂质提取物也可以从商业来源获得。例如，来自大肠杆菌的极性脂质提取物可以从Avanti极性脂质公司(Avanti Polar Lipids,Inc.)(阿拉巴马州阿拉巴斯特(Alabaster,AL))获得。
细菌脂质的纯化和另外的处理
使用超滤结合尺寸排阻色谱法进行细菌组分的纯化。使用100kDA分子量截止值(MWCO)Amicon旋转过滤器(默克密理博公司(MerckMillipore))浓缩包括分离的细菌胞外囊泡(EV)或来自上文实例的提取的细菌脂质级分的粗细菌组分。随后，将经浓缩的粗细菌组分溶液装载到PURE-EV尺寸排阻色谱柱(汉萨生物医学生命科学有限公司(HansaBioMedLife Sciences Ltd))上，并根据制造商的说明分离。在洗脱之后合并经纯化的含细菌组分的级分。任选地，可以使用100kDa MWCOAmicon旋转过滤器或通过切向流过滤(TFF)进一步浓缩细菌组分。
使用碘克沙醇梯度进行细菌组分的纯化。通过使用碘克沙醇梯度来纯化包括来自上文实例的分离的细菌胞外囊泡(EV)或提取的细菌脂质级分的粗细菌组分，如Rutter和Innes,《植物生理学(PlantPhysiol.)》173(1):728-741(2017)所描述的，所述文献通过引用整体并入本文。为了制备不连续的碘克沙醇梯度(OptiPrep；西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))，通过在囊泡分离缓冲液(VIB；20mM MES、2mM CaCl2和0.1M NaCl，pH 6)中稀释60％的OptiPrep储备水溶液来制备40％(v/v)、20％(v/v)、10％(v/v)和5％(v/v)的溶液。梯度通过分层3ml 40％溶液、3mL 20％溶液、3mL 10％溶液和2mL 5％溶液来形成。将包括分离的细菌胞外囊泡(EV)或来自上文实例的提取的细菌脂质级分的粗细菌组分在4℃下以40,000g离心60分钟。将沉淀物重悬于0.5ml的VIB中，并在梯度的顶部上分层。在4℃下以100,000g离心17小时。丢弃梯度顶部处的前4.5ml，并且随后收集3体积的含有细菌组分的0.7ml，用VIB加至3.5mL，并在4℃下以100,000g离心60分钟。将沉淀物用3.5ml VIB洗涤，并使用相同的离心条件排斥。
使用蔗糖梯度进行细菌组分的纯化。将包括分离的细菌胞外囊泡(EV)或来自上文实例的提取的细菌脂质级分的粗细菌组分以150,000g离心90分钟，并且将含细菌组分的沉淀物重悬于1ml PBS中，如Mu等人,《分子营养与食物研究(Molecular Nutrition&FoodResearch)》58(7):1561-1573(2014)中所描述的，所述文献通过引用整体并入本文。将重悬的沉淀物转移到蔗糖阶梯梯度(8％/15％/30％/45％/60％)，并以150,000g离心120分钟，以产生经纯化的细菌组分。从30％/45％界面采集经纯化的细菌组分。
从细菌组分中去除聚集体。为了从包括来自上文实例的分离的细菌胞外囊泡(EV)或提取的细菌脂质级分的粗细菌组分，或从来自上述实例的经纯化的细菌组分中去除蛋白质聚集体，可以包含另外的纯化步骤。
将所产生的含细菌组分的溶液通过一系列pH来沉淀溶液中的蛋白质聚集体。通过添加氢氧化钠或盐酸(使用经校准的pH探针测量pH)将pH调节至3、5、7、9或11。一旦溶液处于指定pH下，就过滤以去除微粒。可替代地，分离的含细菌组分的溶液可以通过添加带电聚合物，如Polymin-P或Praestol 2640进行絮凝。简单来说，将2-5g/LPolymin-P或Praestol2640添加到溶液中并且用叶轮混合。然后过滤溶液以去除微粒。可替代地，通过增加盐浓度来溶解聚集体。将NaCl添加到含细菌组分的溶液中，直到其为1mol/L。然后过滤溶液以纯化细菌组分。可替代地，通过提高温度来溶解聚集体。将分离的含细菌组分的混合物在混合的情况下加热，直到其达到50℃的均匀温度，持续5分钟。然后过滤混合物以分离细菌组分。可替代地，根据标准程序，可以通过排阻色谱柱从含细菌组分的溶液中分离可溶性污染物，其中细菌脂质在第一级分中洗脱，而蛋白质和核糖核蛋白以及一些脂蛋白随后洗脱。蛋白质聚集体去除的效率通过BCA/Bradford蛋白质定量测量和比较去除蛋白质聚集体前后的蛋白质浓度来确定。
细菌脂质(来自大肠杆菌)储备溶液的制备。来自大肠杆菌的极性脂质提取物从Avanti极性脂质公司(阿拉巴马州阿拉巴斯特)获得。将脂质从由Avanti极性脂质公司提供的am-poules(通常为100mg/4ml氯甲烷)定量转移到100ml圆底烧瓶中，并通过旋转蒸发去除MeCl2。将脂质膜在真空下干燥至少30分钟，然后通过搅拌30分钟在所选缓冲液中再水合。使用液态N2和37℃水浴对脂质分散体进行10次冻融循环，然后在-20℃下在氩气下以等分试样的形式储存。所有步骤都在氩气下进行，以限制脂质暴露于空气中。
对细菌组分进行修饰以形成细菌源性脂质组合物
为了形成细菌源性脂质组合物，将细菌组分用可电离脂质和胆固醇以及PEG-脂质修饰。
使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,1959,《生物化学与生理学杂志》37:911-917)从细菌组分的经浓缩的溶液中提取细菌脂质，并且如上文所描述地进行分离。通过将溶剂在细菌组分的经浓缩的溶液中用惰性气体流(例如，氮气)蒸发来制备含有细菌脂质的脂质膜。
将可电离脂质添加到氯仿:甲醇(9:1)中的提取的细菌脂质储备溶液中，这相当于总脂质的25％或40％(w/w)，并通过剧烈混合重悬脂质。通过NanoFCM评估细菌源性脂质组合物的大小和颗粒数量。用可电离脂质(例如，C12-200和MC3)进行细菌组分的修饰以使得细菌源性脂质组合物的表面电荷能够发生pH依赖性变化：随着pH降低，细菌源性脂质组合物的表面电荷将增加。
细菌源性脂质组合物的表征
根据制造商的说明，通过使用Malvern NanoSight的纳米颗粒跟踪分析(NTA)或使用iZon qNano的可调谐电阻脉冲传感(TRPS)来确定细菌源性脂质组合物的颗粒浓度。使用荧光亲脂性染料，如DiOC6(ICN生物医学公司(ICN Biomedicals))来测定脂质浓度，如Rutter和Innes,《植物生理学》173(1):728-741,2017所描述的。简而言之，将细菌源性脂质组合物悬浮于用MES缓冲液(20mM MES，pH 6)和2mM 2,29-二吡啶基二硫化物稀释的100ml10mM DiOC6(ICN生物医学公司)中，并在37℃下温育10分钟，用3mL MES缓冲液洗涤，排斥(40,000g，60分钟，在4℃下)，并重悬于新鲜的MES缓冲液中。在485nm激发和535nm发射下测量DiOC6荧光强度。
根据Wu等人,《分析师(Analyst)》140(2):386-406(2015)的方案，还通过JEOL1010透射电子显微镜上的电子和冷冻电子显微镜对细菌源性脂质组合物进行了表征，所述文献通过引用整体并入本文。根据制造商的说明，可以使用Malvern Zetasizer或iZonqNano测量细菌源性脂质组合物的大小和ζ电位。使用氯仿提取分离脂质，并用LC-MS/MS表征。
细菌源性脂质组合物的稳定性的表征
细菌源性脂质组合物经受各种储存和生理条件。将细菌源性脂质组合物悬浮于水、5％蔗糖或PBS中，并在-20℃、4℃、20℃和37℃下放置1天、7天、30天和180天。还将细菌源性脂质组合物悬浮于水中，并且使用旋转蒸发器系统干燥，并且在4℃、20℃和37℃下放置1天、7天和30天和180天。将细菌源性脂质组合物还悬浮于水或5％蔗糖溶液中，在液氮中快速冷冻并冻干。在1天、7天、30天和180天之后，然后将经干燥和经冻干的细菌源性脂质组合物重悬于水中。在高于0℃的温度下的条件下的前三个实验也暴露于人工阳光模拟器，以便确定模拟室外UV条件下的含量稳定性。在添加或不添加1单位胰蛋白酶或其它模拟胃液的情况下，细菌源性脂质组合物还在pH为1、3、5、7和9的缓冲溶液中经受37℃、40℃、45℃、50℃和55℃的温度，持续1小时、6小时和24小时。
在这些处理中的每一个之后，使细菌源性脂质组合物回到20℃，中和至pH 7.4，并且使用上述表征方法中的一些或全部进行表征。
使用微流体进行细菌源性脂质组合物的调配
在此实例中，IGNITETM微流体仪器(精密纳米系统有限公司(PrecisionNanoSystems))用作模型微流体系统。此方法允许通过混合水相和可混溶溶剂或含有从细菌来源提取的经溶解的脂质的可混溶溶剂的组合，通过自组装形成细菌源性脂质组合物。
可以使用来自商业来源的细菌脂质提取物。可替代地，使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,《生物化学与生理学杂志》37:911-917(1959))从细菌组分的经浓缩的溶液中提取来自细菌来源的脂质，并且如上文所描述地进行分离。将细菌脂质提取物在氯仿:甲醇(9:1)、DMF:甲醇(4:1)或乙醇中的储备溶液与可电离脂质(例如，C12-200)和其它外源性脂质(例如，固醇和PEG脂质)混合，这相当于总脂质的25％或40％(w/w)，通过剧烈混合重悬，并通过用惰性气体(例如，氮气)流蒸发溶剂干燥以制备脂质膜。
可以使用各种有机溶剂来溶解经干燥的脂质膜：乙腈、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、1-丁醇、二甲基亚砜、乙腈:乙醇(1:1)、乙腈:甲醇(3:1)、丙酮:甲醇(3:1)、甲基叔丁基醚:丙醇(3:2)、四氢呋喃:甲醇(3:2)、二甲基亚砜:甲醇(3:1)和二甲基甲酰胺:甲醇(4:1)。将275μL有机溶剂添加到1mg经干燥的脂质膜中。将样品在水浴超声波仪中在37℃下超声处理10分钟。
将脂质溶液(溶解于有机溶剂或溶剂组合中的细菌源性脂质组合物脂质；有机相)装载到1mL滑动尖端注射器(贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson))中，并放置在安装在IGNITETM微流体装置(精密纳米系统有限公司)上的设置为37℃的加热块中。将825μL水相(10mM柠檬酸盐缓冲液，针对可电离脂质，pH 3.2，或针对阳离子脂质的H2O或PBS)装载到1mL滑动尖端注射器(贝克顿迪金森公司)中，并安装到微流体装置上。将水相和有机相以12毫升/分钟流速以3:1体积比在微流体装置中混合。在室温下，将所得颗粒在Slide-A-LyzerTM G2盒(20kDa MWCO)中相对于PBS透析4-24小时。可以使用Zetasizer(马尔文帕纳科公司(Malvern Panalytical))测量颗粒的流体动力学直径和多分散性。颗粒的最终浓度和大小可以由NanoFCM使用制造商提供的浓度和大小标准来确定。
实例2：示例性细菌源性脂质组合物的制备和表征。
此实例描述了细菌源性脂质组合物的制备以及细菌源性脂质组合物的表征，如与其它脂质组合物(例如，LNP)相比，所述细菌源性脂质组合物包括用可电离脂质、固醇和PEG脂质重构的细菌脂质(大肠杆菌)。
BacLC组合物。在此实施例中，对于细菌源性脂质组合物，来自大肠杆菌的极性脂质提取物(根据实例1制备的细菌脂质(来自大肠杆菌)储备溶液)用作细菌脂质；C12-200[1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)]用作可电离脂质；胆固醇(14:0)用作固醇；DMPE-PEG2k用作PEG化脂质的模型。制备细菌源性脂质组合物以分别以35:50:12.5:2.5的摩尔比产生可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:大肠杆菌极性脂质:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。
LNP组合物。制备LNP(脂质纳米颗粒)调配物作为对照，以分别以35:16:46.5:2.5的摩尔比产生可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:DOPE:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。DOPE：1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(Avanti极性脂质公司)。将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。
构成上述BacLC组合物和LNP组合物(对照)的各种组分的摩尔比如图2所示。
将上述组合物装载到Slide-A-Lyzer G2透析盒(10k MWCO)中，并在轻轻搅拌的情况下，在室温下在200倍样品体积的1×PBS中透析4小时。更新PBS溶液，并且在轻轻搅拌的情况下，使组合物在4℃下进一步透析至少14小时。然后收集经透析的组合物并且以3000xg通过离心浓缩(Amicon超离心过滤器，100k MWCO)。
使用ZetasizerUltra(马尔文帕纳科公司)对经浓缩的颗粒的大小、多分散性和颗粒浓度进行表征。与常规脂质纳米颗粒组合物(LNP)的颗粒相比，上述BacLC组合物的颗粒的大小和多分散性的结果如图3A所示。
实例3：用各种货物装载细菌源性脂质组合物。
此实例描述了用各种货物(异源功能剂)，如小分子、蛋白质和核酸装载细菌源性脂质组合物的方法。
将小分子装载到细菌源性脂质组合物中。如实例1或实例2中所描述地制备细菌源性脂质组合物。为了将小分子装载到细菌源性脂质组合物中，将细菌源性脂质组合物置于PBS溶液中，其中小分子呈固体形式或溶解。将溶液在22℃下放置1小时。可替代地，根据Wang等人,《自然通讯》4:文章编号：1867(2013)的方案，对溶液进行超声处理以诱导穿孔和扩散到外泌体中，所述文献通过引用整体并入本文。可替代地，根据Wahlgren等人,《核酸研究》40(17):e130(2012)的方案对细菌源性脂质组合物进行电穿孔，所述文献通过引用整体并入本文。可替代地，根据Haney等人,《控释杂志(JContr.Rel.)》(2015)的方案，将细菌源性脂质组合物中的脂质与小分子溶液混合，并通过脂质挤出机，所述文献通过引用整体并入本文。在使用之前，可以使用如实例1中所描述的方法纯化装载的细菌源性脂质组合物以去除未结合的小分子。
将蛋白质或肽装载到细菌源性脂质组合物中。如实例1或实例2中所描述地制备细菌源性脂质组合物。为了将蛋白质或肽装载到细菌源性脂质组合物中，在PBS中，将细菌源性脂质组合物与蛋白质或肽一起置于溶液中。如果蛋白质或肽是不溶性的，则调节pH直到其是可溶的。如果蛋白质或肽仍然不溶，则使用不溶性蛋白质或肽。然后根据来自Wang等人,《自然通讯》4:文章编号：1867(2013)的方案，对溶液进行超声处理以诱导穿孔和扩散到细菌源性脂质组合物中，所述文献通过引用整体并入本文。可替代地，根据Wahlgren等人,《核酸研究》40(17):e130(2012)的方案对细菌源性脂质组合物进行电穿孔，所述文献通过引用整体并入本文。可替代地，根据Haney等人,《控释杂志)》(2015)的方案，将细菌源性脂质组合物中的脂质与蛋白质或肽溶液混合，并通过脂质挤出机，所述文献通过引用整体并入本文。在使用之前，可以使用如实例1中所描述的方法纯化装载的细菌源性脂质组合物以去除未结合的肽和蛋白质。为了测量蛋白质或肽的装载，皮尔斯定量比色肽测定可以用于装载和卸载的细菌源性脂质组合物的小样品。
将核酸装载到细菌源性脂质组合物中。如实例1或实例2中所描述地制备细菌源性脂质组合物。为了将核酸装载到细菌源性脂质组合物中，在PBS中，将细菌源性脂质组合物与核酸一起置于溶液中。然后根据来自Wang等人,《自然通讯》4:文章编号：1867(2013)的方案，对溶液进行超声处理以诱导穿孔和扩散到细菌源性脂质组合物中，所述文献通过引用整体并入本文。可替代地，根据Wahlgren等人,《核酸研究》40(17):e130(2012)的方案对细菌源性脂质组合物进行电穿孔，所述文献通过引用整体并入本文。可替代地，根据Haney等人,《控释杂志)》(2015)的方案，将细菌源性脂质组合物中的脂质与核酸溶液混合，并通过脂质挤出机，所述文献通过引用整体并入本文。在使用之前，可以使用如实例1中所描述的方法纯化装载的细菌源性脂质组合物以去除未结合的核酸。装载在细菌源性脂质组合物中的核酸按照制造商的说明使用来自赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)的Quant-It测定进行定量，或者如果核酸被荧光标记，则使用读板器进行荧光定量。
实例4：用mRNA装载细菌源性脂质组合物并将其递送到人细胞中
此实例说明了用mRNA装载细菌源性脂质组合物并将装载mRNA的细菌源性脂质组合物递送到人细胞中的方法。在此实例中，C12-200用作模型可电离脂质，并且来自大肠杆菌的极性脂质提取物用作模型细菌组分。编码萤火虫荧光素酶(Fluc mRNA)的mRNA用作模型mRNA，并且A549(人肺上皮癌)细胞用作模型人细胞系。使用挤出和微流体调配含有mRNA的细菌源性脂质组合物。
用可电离脂质修饰细菌组分。来自大肠杆菌的极性脂质提取物可以从Avanti极性脂质公司(阿拉巴马州阿拉巴斯特)获得。可替代地，使用Bligh-Dyer方法(Bligh和Dyer,《生物化学与生理学杂志》37:911-917(1959)从细菌组分的经浓缩的溶液中提取来自大肠杆菌的脂质，并且如上文在实例1中所描述地进行分离。细菌源性脂质组合物是通过将可电离脂质(例如，C12-200)添加到大肠杆菌脂质提取物于氯仿:甲醇(9:1)或DMF:甲醇(4:1)中的储备溶液中至总脂质的25％或40％(w/w)，并在干燥之前通过剧烈混合重悬来制备的。
用mRNA装载细菌源性脂质组合物。为了通过挤出制备具有C12-200的脂质组合物，将溶解于无核酸酶水中的mRNA以每1mg细菌脂质35μgmRNA的量添加到干燥的脂质膜中，并在室温下放置1小时以用于水合。使用0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 3.2(天惠华公司(Teknova))将重悬的脂质溶液的pH调节至4.5以促进RNA包埋。然后使脂质溶液经受5次冻融循环。随后，使用0.1M碳酸氢盐缓冲液pH 10使脂质溶液的pH达到pH 9，并且然后使脂质经受5次另外的冻融循环。在具有100kDa MWCO膜的透析装置中，将脂质组合物相对于PBS透析过夜。通过超速离心去除游离RNA。将脂质组合物在4℃下以100,000g离心30分钟，去除上清液，并用1mL PBS或水洗涤沉淀物。如上文所描述地重复离心，并将最终沉淀物重悬于期望室温缓冲液(例如，PBS)中。囊泡的大小和最终浓度通过NanoFCM进行评估。
为了通过微流体用C12-200制备脂质组合物，将1mg含有25％(w/w)C12-200的细菌脂质溶解于275μL DMF:MeOH(4:1)中，并在水浴超声波仪中在37℃下超声处理10分钟。将脂质溶液(有机相)装载到1mL滑动尖端注射器(贝克顿迪金森公司)中，并放置在安装在微流体装置上的设置为37℃的加热块中。将35μg萤火虫荧光素酶(Fluc)mRNA溶解于825μLH2O或PBS pH 7.4中，以调配水相。将水相装载到1mL滑动尖端注射器(贝克顿迪金森公司)中，并安装到微流体装置(IGNITETM，精密纳米系统有限公司)上。将水相和有机相以3:1体积比并以12毫升/分钟流速在微流体装置中混合。在室温下，将所得颗粒在Slide-A-LyzerTM G2盒(20kDa MWCO)中相对于PBS透析4-24小时。囊泡的大小和最终浓度通过NanoFCM进行评估。
RNA装载是通过Quant-iTTM 测定(赛默科技公司(ThermoScientific))测定的。根据制造商的方案，在存在肝素(5mg/mL)和1％TritonTM X-100的情况下进行测定，以使装载mRNA的脂质组合物裂解并使其释放包封的货物。
萤火虫荧光素酶mRNA(Fluc)到哺乳动物细胞(A549)的递送。A549细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(hiFBS，吉博科公司(Gibco))和青霉素/链霉素的杜氏改良伊氏培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM))(4500mg/L葡萄糖)中在37℃和5％CO2下培养。每3-4天传代细胞。对于实验，在实验前一天，将每个孔10,000个细胞接种在100μL培养基中的96孔板中。将含有50、100和200ng FLuc mRNA的上述制备的细菌源性脂质组合物添加到每个孔中并温育24小时。作为阳性对照，根据制造商的方案，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞科技公司)用100ng Fluc mRNA转染细胞。使用100ng的游离Flu c mRNA作为阴性对照。根据制造商的方案，用CellTiter-FluorTM细胞活力测定(普洛麦格公司(Promega))和Bright-GloTM荧光素酶测定系统(普洛麦格公司)分析细胞活力和FLuc表达。使用SYNERGYTM H1读板器(伯腾仪器公司(BioTek Instruments))对荧光和发光进行定量。
实例5：示例性装载mRNA的细菌源性脂质组合物的制备
多核苷酸的制备和表征
多核苷酸和/或其部分或区域的制造可以利用国际专利申请公开案第WO 2014/152027号中教导的方法来实现，所述公开案通过引用整体并入本文中。纯化方法可以包含国际专利申请公开案第WO2014/152030号和第WO2014/152031号中所教导的纯化方法，所述公开案通过引用整体并入本文中。多核苷酸的检测和表征方法可以根据国际专利申请公开案第WO2014/144039号中所教导进行，所述公开案通过引用整体并入本文中。多核苷酸的表征可以使用多核苷酸定位(polynucleotide mapping)、逆转录酶测序、电荷分布分析、RNA杂质检测或前述中的两种或更多种的任何组合来实现。“表征”包括例如确定RNA转录物序列、确定RNA转录物的纯度或确定RNA转录物的电荷异质性。这些方法教导于例如国际专利申请公开案第WO2014/144711号和第WO2014/144767号中，所述公开案通过引用整体并入本文中。
mRNA设计和修饰的其它细节可见于WO 2021/154763和WO 2021/188969中，所述文献通过引用整体并入本文中。
SARS-CoV-2病毒产生
使用SARS-CoV-2病毒株“Slovakia/SK-BMC5/2020”来进行仓鼠感染，所述病毒株最初由欧洲病毒资源库走向全球(EuropeanVirusArchive global，EVAg)(GISAID EPI_ISL_417879，https://www.european-virus-archive.com/virus/sars-cov-2-strain-slovakiask-bmc52020)提供，在Vero E6/TMPRSS2细胞上产生和滴定。所述病毒株属于GH进化枝。
在接种有50×106个Vero E6/TMPRSS2细胞的T175烧瓶中且以40mL最终体积进行病毒产生。通过ViCell设备，通过0.25％台盼蓝(trypanblue)排除测定来评估细胞计数和活力。在48小时的感染时间范围后(使用0.001至0.005MOI的SARS-CoV-2病毒)，在显微镜观察下证实致细胞病变效应。收获培养物上清液，离心(以5000g进行5分钟)且等分(1mL等分试样)。
在Vero E6/TMPRSS2细胞上测定病毒原液TCID50滴度。在测试前约两小时，将细胞以每孔2×104个细胞的密度平板接种在96孔板中的200μL体积的完全生长培养基(DMEM10％FCS)中。将细胞用病毒原液的连续稀释液(一式8份；第1次稀释度为1:100；5倍连续稀释)在37℃下感染1小时。添加新鲜培养基后保持72小时，并且然后根据供应商方案(普洛麦格(Promega),参考编号G5430)进行MTS/PMS测定。使用ELISA读板器读取板并记录数据。基于Spearman-Karber公式，将感染力表示为TCID50/mL/72h。
SARS-CoV-2刺突(S)mRNA序列
研究旨在测试候选冠状病毒疫苗在小鼠中的免疫原性，所述候选冠状病毒疫苗包括表1中编码冠状病毒抗原(例如，刺突(S)蛋白)，如SARS-CoV-2抗原的mRNA。
表1.SARS-CoV-2刺突(S)mRNA序列(具有经修饰的帽)
所递送的货物S蛋白mRNA的编码部分的实例如下：uaauacgacucacuauaagGAGAAUAAACUAGUAUUCUUCUGGUCCCCACAGACUCAGAGAGAACCCGCCACCAUGUUCGUGUUCCUGGUGCUGCUGCCUCUGGUGUCCAGCCAGUGUGUGAACCUGACCACCAGAACACAGCUGCCUCCAGCCUACACCAACAGCUUUACCAGAGGCGUGUACUACCCCGACAAGGUGUUCAGAUCCAGCGUGCUGCACUCUACCCAGGACCUGUUCCUGCCUUUCUUCAGCAACGUGACCUGGUUCCACGCCAUCCACGUGUCCGGCACCAAUGGCACCAAGAGAUUCGACAACCCCGUGCUGCCCUUCAACGACGGGGUGUACUUUGCCAGCACCGAGAAGUCCAACAUCAUCAGAGGCUGGAUCUUCGGCACCACACUGGACAGCAAGACCCAGAGCCUGCUGAUCGUGAACAACGCCACCAACGUGGUCAUCAAAGUGUGCGAGUUCCAGUUCUGCAACGACCCCUUCCUGGGCGUCUACUACCACAAGAACAACAAGAGCUGGAUGGAAAGCGAGUUCCGGGUGUACAGCAGCGCCAACAACUGCACCUUCGAGUACGUGUCCCAGCCUUUCCUGAUGGACCUGGAAGGCAAGCAGGGCAACUUCAAGAACCUGCGCGAGUUCGUGUUUAAGAACAUCGACGGCUACUUCAAGAUCUACAGCAAGCACACCCCUAUCAACCUCGUGCGGGAUCUGCCUCAGGGCUUCUCUGCUCUGGAACCCCUGGUGGAUCUGCCCAUCGGCAUCAACAUCACCCGGUUUCAGACACUGCUGGCCCUGCACAGAAGCUACCUGACACCUGGCGAUAGCAGCAGCGGAUGGACAGCUGGUGCCGCCGCUUACUAUGUGGGCUACCUGCAGCCUAGAACCUUCCUGCUGAAGUACAACGAGAACGGCACCAUCACCGACGCCGUGGAUUGUGCUCUGGAUCCUCUGAGCGAGACAAAGUGCACCCUGAAGUCCUUCACCGUGGAAAAGGGCAUCUACCAGACCAGCAACUUCCGGGUGCAGCCCACCGAAUCCAUCGUGCGGUUCCCCAAUAUCACCAAUCUGUGCCCCUUCGGCGAGGUGUUCAAUGCCACCAGAUUCGCCUCUGUGUACGCCUGGAACCGGAAGCGGAUCAGCAAUUGCGUGGCCGACUACUCCGUGCUGUACAACUCCGCCAGCUUCAGCACCUUCAAGUGCUACGGCGUGUCCCCUACCAAGCUGAACGACCUGUGCUUCACAAACGUGUACGCCGACAGCUUCGUGAUCCGGGGAGAUGAAGUGCGGCAGAUUGCCCCUGGACAGACAGGCAAGAUCGCCGACUACAACUACAAGCUGCCCGACGACUUCACCGGCUGUGUGAUUGCCUGGAACAGCAACAACCUGGACUCCAAAGUCGGCGGCAACUACAAUUACCUGUACCGGCUGUUCCGGAAGUCCAAUCUGAAGCCCUUCGAGCGGGACAUCUCCACCGAGAUCUAUCAGGCCGGCAGCACCCCUUGUAACGGCGUGGAAGGCUUCAACUGCUACUUCCCACUGCAGUCCUACGGCUUUCAGCCCACAAAUGGCGUGGGCUAUCAGCCCUACAGAGUGGUGGUGCUGAGCUUCGAACUGCUGCAUGCCCCUGCCACAGUGUGCGGCCCUAAGAAAAGCACCAAUCUCGUGAAGAACAAAUGCGUGAACUUCAACUUCAACGGCCUGACCGGCACCGGCGUGCUGACAGAGAGCAACAAGAAGUUCCUGCCAUUCCAGCAGUUUGGCCGGGAUAUCGCCGAUACCACAGACGCCGUUAGAGAUCCCCAGACACUGGAAAUCCUGGACAUCACCCCUUGCAGCUUCGGCGGAGUGUCUGUGAUCACCCCUGGCACCAACACCAGCAAUCAGGUGGCAGUGCUGUACCAGGACGUGAACUGUACCGAAGUGCCCGUGGCCAUUCACGCCGAUCAGCUGACACCUACAUGGCGGGUGUACUCCACCGGCAGCAAUGUGUUUCAGACCAGAGCCGGCUGUCUGAUCGGAGCCGAGCACGUGAACAAUAGCUACGAGUGCGACAUCCCCAUCGGCGCUGGAAUCUGCGCCAGCUACCAGACACAGACAAACAGCCCUCGGAGAGCCAGAAGCGUGGCCAGCCAGAGCAUCAUUGCCUACACAAUGUCUCUGGGCGCCGAGAACAGCGUGGCCUACUCCAACAACUCUAUCGCUAUCCCCACCAACUUCACCAUCAGCGUGACCACAGAGAUCCUGCCUGUGUCCAUGACCAAGACCAGCGUGGACUGCACCAUGUACAUCUGCGGCGAUUCCACCGAGUGCUCCAACCUGCUGCUGCAGUACGGCAGCUUCUGCACCCAGCUGAAUAGAGCCCUGACAGGGAUCGCCGUGGAACAGGACAAGAACACCCAAGAGGUGUUCGCCCAAGUGAAGCAGAUCUACAAGACCCCUCCUAUCAAGGACUUCGGCGGCUUCAAUUUCAGCCAGAUUCUGCCCGAUCCUAGCAAGCCCAGCAAGCGGAGCUUCAUCGAGGACCUGCUGUUCAACAAAGUGACACUGGCCGACGCCGGCUUCAUCAAGCAGUAUGGCGAUUGUCUGGGCGACAUUGCCGCCAGGGAUCUGAUUUGCGCCCAGAAGUUUAACGGACUGACAGUGCUGCCUCCUCUGCUGACCGAUGAGAUGAUCGCCCAGUACACAUCUGCCCUGCUGGCCGGCACAAUCACAAGCGGCUGGACAUUUGGAGCAGGCGCCGCUCUGCAGAUCCCCUUUGCUAUGCAGAUGGCCUACCGGUUCAACGGCAUCGGAGUGACCCAGAAUGUGCUGUACGAGAACCAGAAGCUGAUCGCCAACCAGUUCAACAGCGCCAUCGGCAAGAUCCAGGACAGCCUGAGCAGCACAGCAAGCGCCCUGGGAAAGCUGCAGGACGUGGUCAACCAGAAUGCCCAGGCACUGAACACCCUGGUCAAGCAGCUGUCCUCCAACUUCGGCGCCAUCAGCUCUGUGCUGAACGAUAUCCUGAGCAGACUGGACCCUCCUGAGGCCGAGGUGCAGAUCGACAGACUGAUCACAGGCAGACUGCAGAGCCUCCAGACAUACGUGACCCAGCAGCUGAUCAGAGCCGCCGAGAUUAGAGCCUCUGCCAAUCUGGCCGCCACCAAGAUGUCUGAGUGUGUGCUGGGCCAGAGCAAGAGAGUGGACUUUUGCGGCAAGGGCUACCACCUGAUGAGCUUCCCUCAGUCUGCCCCUCACGGCGUGGUGUUUCUGCACGUGACAUAUGUGCCCGCUCAAGAGAAGAAUUUCACCACCGCUCCAGCCAUCUGCCACGACGGCAAAGCCCACUUUCCUAGAGAAGGCGUGUUCGUGUCCAACGGCACCCAUUGGUUCGUGACACAGCGGAACUUCUACGAGCCCCAGAUCAUCACCACCGACAACACCUUCGUGUCUGGCAACUGCGACGUCGUGAUCGGCAUUGUGAACAAUACCGUGUACGACCCUCUGCAGCCCGAGCUGGACAGCUUCAAAGAGGAACUGGACAAGUACUUUAAGAACCACACAAGCCCCGACGUGGACCUGGGCGAUAUCAGCGGAAUCAAUGCCAGCGUCGUGAACAUCCAGAAAGAGAUCGACCGGCUGAACGAGGUGGCCAAGAAUCUGAACGAGAGCCUGAUCGACCUGCAAGAACUGGGGAAGUACGAGCAGUACAUCAAGUGGCCCUGGUACAUCUGGCUGGGCUUUAUCGCCGGACUGAUUGCCAUCGUGAUGGUCACAAUCAUGCUGUGUUGCAUGACCAGCUGCUGUAGCUGCCUGAAGGGCUGUUGUAGCUGUGGCAGCUGCUGCAAGUUCGACGAGGACGAUUCUGAGCCCGUGCUGAAGGGCGUGAAACUGCACUACACAUGAUGACUCGAGCUGGUACUGCAUGCACGCAAUGCUAGCUGCCCCUUUCCCGUCCUGGGUACCCCGAGUCUCCCCCGACCUCGGGUCCCAGGUAUGCUCCCACCUCCACCUGCCCCACUCACCACCUCUGCUAGUUCCAGACACCUCCCAAGCACGCAGCAAUGCAGCUCAAAACGCUUAGCCUAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGUGAUUAACCUUUAGCAAUAAACGAAAGUUUAACUAAGCUAUACUAACCCCAGGGUUGGUCAAUUUCGUGCCAGCCACACCCUGGAGCUAGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCAUAUGACUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAcggcu
用SARS-CoV-2SmRNA装载细菌源性脂质组合物
制备和表征细菌源性脂质组合物，并且用mRNA装载细菌源性脂质组合物的方案和详细实验程序遵循实例1-4中描述的那些。
此实例描述了细菌源性脂质组合物的调配，包括用可电离脂质(C12-200)、固醇(胆固醇)和PEG脂质(DMPE-PEG2k)重构的细菌脂质(大肠杆菌)，以包封mRNA(例如，SARS-CoV-2(S)mRNA核酸序列)。作为比较实例，LNP也用相同的mRNA调配。根据实例2制备用作比较实例的细菌源性脂质组合物(BacLC)和其它脂质组合物(LNP)。SARS-CoV-2刺突(S)mRNA序列(本文所描述)用作装载的mRNA。
在其它实例中，流感血凝素(HA)mRNA序列(如本文所描述)用作装载的mRNA。
BacLC/mRNA调配物。根据实例2调配大肠杆菌BacLC组合物，所述组合物包括分别呈35:50:12.5:2.5摩尔比的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:大肠杆菌极性脂质:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。为了制备此调配物，将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用不含RNA酶的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，以得到最终浓度为50mM的柠檬酸盐缓冲液。调配物的可电离脂质:mRNA比率，即可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率维持处于15:1。
在其它实例中，根据实例2调配大肠杆菌(Avanti公司)BacLC组合物，所述组合物包括分别呈35:50:12.5:2.5或35:20:42.5:2.5摩尔比的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:大肠杆菌极性脂质(从Avanti公司购买):胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。为了制备此调配物，将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用不含RNA酶的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，以得到最终浓度为50mM的柠檬酸盐缓冲液。调配物的可电离脂质:mRNA比率，即可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率维持处于15:1。
在其它实例中，根据实例2调配沙门氏菌BacLC组合物，所述组合物包括分别呈35:50:12.5:2.5摩尔比的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:沙门氏菌鼠伤寒极性脂质:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。为了制备此调配物，将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用不含RNA酶的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，以得到最终浓度为50mM的柠檬酸盐缓冲液。调配物的可电离脂质:mRNA比率，即可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率维持处于15:1。
LNP/mRNA调配物。根据实例2调配比较LNP(脂质纳米颗粒)，所述组合物包括分别呈35:16:46.5:2.5摩尔比的可电离脂质:结构脂质:固醇:PEG-脂质(C12-200:DOPE:胆固醇(14:0):DMPE-PEG2k)。为了制备此调配物，将上述脂质溶解于乙醇中，以上述摩尔比混合，并在乙醇(有机相)中稀释，以获得5.5mM的总脂质浓度。用不含RNA酶的水和100mM柠檬酸盐缓冲液pH 3制备mRNA溶液(水相)，以得到最终浓度为50mM的柠檬酸盐缓冲液。调配物的可电离脂质:mRNA比率，即可电离脂质氮:mRNA磷酸盐(N:P)比率维持处于15:1。
使用ZetasizerUltra(马尔文帕纳科公司)对经浓缩的颗粒的大小、多分散性和颗粒浓度进行表征。与常规脂质纳米颗粒组合物(LNP)的颗粒相比，上述BacLC组合物的颗粒的大小和多分散性的结果如图3A所示，如实例2所示。
通过Quant-iT RiboGreen RNA测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司)来表征mRNA包封效率。如与比较调配物(LNP/mRNA)的颗粒相比，上述BacLC/mRNA调配物的颗粒的mRNA包封效率的结果如图3B和表2所示。
将颗粒稀释至期望的mRNA浓度，以得到于PBS中的最终10％蔗糖溶液。然后将调配物在液氮中快速冷冻。所得具有mRNA的调配物如表2所示。
表2.含有mRNA的调配物
实例6：使用装载mRNA的细菌源性脂质组合物作为SARS-CoV-2疫苗
根据实例5制备此实例中测试的BacLC/mRNA调配物(大肠杆菌BacLC/SARS-CoV-2)和比较调配物(LNP/mRNA)。
BacLC/mRNA调配物的单剂量肌肉内递送的设计和评估如方案1所示。
如方案1中所示，针对每种调配物评估三只小鼠。根据表3中的处理时间表，使用肌肉内(IM)途径在第0天在一只大腿上部向小鼠注射测试样品。
表3.处理时间表
动物数量 测试 处理(IM) 剂量/注射
3 PBS(1x剂量) 在第0天，1x剂量
3 BacLC/mRNA 在第0天，1x剂量 1μgmRNA
3 LNP/mRNA 在第0天，1x剂量 1μgmRNA
血清采集。在第12天和第28天从小鼠尾静脉采集血液样品血液。使血液样品凝结，并且然后离心以获得血清。
血液中ELISPOT T细胞应答评估。使用IFNγ双色ELISPOT测定在第12天评估小鼠针对SARS-CoV-2抗原的T细胞应答。将血细胞向下旋转，使红细胞裂解，并对细胞进行计数。通过吖啶橙排除测定在Luna细胞计数仪上评估细胞活力。通过用50,000个原初小鼠脾细胞补充血细胞来运行ELISPOT测定，所述原初小鼠脾细胞用SARS-CoV-2/S肽刺激过夜。第二天，使用彩色免疫斑点测定评估产生IFNγ的细胞。使用ELISPOT读板器对板进行分析。
ELISPOT T细胞应答评估。使用IFNγ免疫斑点双色ELISPOT测定在第28天评估小鼠针对SARS-CoV-2抗原的T细胞应答。在使红细胞裂解之前和之后，在细胞过滤器上分离脾细胞并在其上过滤。通过吖啶橙排除测定在Luna细胞计数仪上对活脾细胞进行计数并评估其活力。ELISPOT测定是通过SARS-CoV-2/S肽刺激细胞过夜来进行的。第二天，使用IFNγ彩色免疫斑点测定评估产生IFNγ的细胞。使用ELIPOT读板器对板进行分析。
通过多重ELISA评估结合抗体滴度。使用多重ELISA和中和测定对针对SARS-CoV-2的抗体应答(IgG)进行分析，以定量靶向SARS-CoV-2的抗原的小鼠抗体的应答。通过以1/10倍稀释液稀释血浆来测定针对SARS-CoV-2的IgG抗体滴度。简而言之，将ELISA板用S抗体包被过夜。第二天，将板封闭，将样品稀释，并且将所有稀释液添加过夜。在3天之后，完成检测抗体和ELISA开发。通过选择样品不再稀释的最后稀释来选择抗体滴度。
总之，三只小鼠肌肉内施用有单剂量的根据实例5制备的BacLC/SARS-CoV-2(含SmRNA 1μg)。在第12天使用IFNγ彩色ELISPOT测定对血液中的抗原特异性T细胞进行定量。在第12天通过多重ELISA评估抗体应答(IgG)。在第28天在对应ELISPOT测定(IFNγ)中评估抗SARS-CoV-2/S T细胞应答。还对具有那些比较调配物(LNP/mRNA，含有SmRNA 1μg)中的每一种的小鼠样品(n＝3)进行相同的测定，根据实例5制备的。
图4示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)的小鼠相比，在小鼠中单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司(Avanti))/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 1μg)之后，在第12天时在100uL小鼠血液中产生IFNg的抗原特异性T细胞的数量。对照是PBS。结果表明，单剂量肌肉内疫苗接种大肠杆菌BacLC/SARS-CoV-2调配物可在免疫后12天诱导全身性SARS-CoV2刺突特异性T细胞应答。此外，如与在相同剂量下具有相同肌肉内递送的比较调配物(LNP/mRNA，含有SmRNA 1μg)的小鼠相比，大肠杆菌BacLC/SARS-CoV-2调配物能够在免疫后12天诱导更高的全身性SARS-CoV2刺突特异性T细胞应答。
图5示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)的小鼠相比，在小鼠中单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 1μg)之后，在第12天时小鼠的血浆中对SARS-CoV-2的S1抗原具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。结果表明，单剂量肌肉内疫苗接种大肠杆菌(Avanti公司)BacLC/SARS-CoV-2调配物可在小鼠接种之后第12天时诱导高水平的S抗原特异性IgG。与LNP/mRNA相比，大肠杆菌(Avanti公司)BacLC/SARS-CoV-2调配物能够诱导更高或相当水平的S抗原特异性IgG。
图6示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)的小鼠相比，在小鼠中单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 1μg)之后，在第28天时小鼠中每106个脾细胞中产生细胞因子IFNg的SARS-CoV-2S特异性T细胞的数量。对照是PBS。结果表明，单剂量肌肉内疫苗接种大肠杆菌BacLC/SARS-CoV-2调配物可在免疫后28天诱导SARS-CoV2刺突特异性T细胞应答。如与在相同剂量下的比较调配物(LNP/mRNA，含有S mRNA 1μg)相比，大肠杆菌(Avanti公司)BacLC/SARS-CoV-2调配物能够在免疫后28天诱导更高水平的或相当水平的SARS-CoV2刺突特异性T细胞应答。
实例7：装载mRNA的细菌源性脂质组合物作为SARS-CoV-2疫苗的比较
根据实例5制备此实例中测试的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)调配物并且列出于表4中。
BacLC/mRNA调配物的单剂量肌肉内递送的设计和评估如方案2所示。
表4.具有刺突mRNA的细菌脂质
如方案2中所示，针对每种调配物评估三只小鼠。根据表5中的处理时间表，使用肌肉内(IM)途径在第0天在一只大腿上部向小鼠注射测试样品。
表5.处理时间表
血液收集。在第7天和第12天从小鼠尾静脉或通过心脏穿刺收集的终末出血收集血液样品。通过以2000g离心血液10分钟来获得样品。
ELISPOT T细胞应答评估。使用小鼠ELISPOT IFNγ彩色免疫斑点测定在第12天评估针对SARS-CoV-2抗原的T细胞应答。将脾推动穿过细胞过滤器以分离脾细胞，将样品在4℃下以500xg离心5分钟，并且然后对样品进行红细胞裂解。通过吖啶橙排除测定在Luna细胞计数仪上对活脾细胞进行计数并评估其活力。ELISPOT测定是通过SARS-CoV-2/S肽刺激细胞过夜来进行的。第二天，使用IFNγ彩色免疫斑点测定评估产生IFNγ的细胞。使用ELIPOT读板器对板进行分析。
通过多重ELISA评估结合抗体滴度。使用多重ELISA和中和测定对针对SARS-CoV-2的抗体应答(IgG)进行分析，以定量靶向SARS-CoV-2的抗原的小鼠抗体的应答。通过以1/10倍稀释液稀释血浆来测定针对SARS-CoV-2的IgG抗体滴度。简而言之，将ELISA板用RBD抗体包被过夜。第二天，将板封闭，将样品稀释，并且将所有稀释液添加过夜。在3天之后，完成检测抗体和ELISA开发。通过选择样品不再稀释的最后稀释来选择抗体滴度。
总之，三只小鼠肌肉内施用有单剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)或BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)。在第12天通过多重ELISA评估抗体应答(IgG)。在第12天在对应ELISPOT测定(IFNγ)中评估抗SARS-CoV-2/S T细胞应答。
图7示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第12天时小鼠中每106个脾细胞中产生细胞因子IFNg的SARS-CoV-2S特异性T细胞的数量。对照是PBS。结果表明，所有三种BacLC调配物在免疫后12天诱导SARS-CoV-2刺突特异性T细胞应答。
图8示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第12天时小鼠血浆中对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。结果表明，所有三种BacLC调配物在小鼠疫苗接种后第12天时诱导高水平的RBD-抗原特异性IgG。
将相同的调配物(表4)进一步测试至第28天。BacLC/mRNA调配物的单剂量肌肉内递送的设计和评估如方案3所示。
如方案3中所示，针对每种调配物评估三只小鼠。根据表5中的处理时间表，使用肌肉内(IM)途径在第0天在一只大腿上部向小鼠注射测试样品。
血液收集。在第7天、第13天和第28天从小鼠尾静脉或通过心脏穿刺收集的终末出血收集血液样品。通过以2000g离心血液10分钟来获得样品。
通过多重ELISA评估结合抗体滴度。使用多重ELISA和中和测定对针对SARS-CoV-2的抗体应答(IgG)进行分析，以定量靶向SARS-CoV-2的抗原的小鼠抗体的应答。通过以1/10倍稀释液稀释血浆来测定针对SARS-CoV-2的IgG抗体滴度。简而言之，将ELISA板用RBD抗体包被过夜。第二天，将板封闭，将样品稀释，并且将所有稀释液添加过夜。在3天之后，完成检测抗体和ELISA开发。通过选择样品不再稀释的最后稀释来选择抗体滴度。
通过中尺度发现进行的抗体应答评估。对针对SARS-CoV-2的抗体应答(IgA)进行分析，以使用MSD测定用对应于电化学发光(ECL)的量度来定量靶向SARS-CoV-2的RBD特异性和S蛋白特异性抗原的小鼠抗体的应答。
总之，三只小鼠肌肉内施用有单剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)或BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)。在第28天通过多重ELISA或MSD评估血液和支气管肺泡灌洗液中的抗体应答(IgG和IgA)。
图9示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第28天时小鼠血浆中对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。结果表明，所有三种BacLC调配物在小鼠疫苗接种后第28天时诱导高水平的RBD-抗原特异性IgG。
图10A-10B示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第28天时小鼠血浆中分别对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)或S-蛋白具有特异性的抗体(IgA)的水平。对照是PBS。结果表明，BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2在小鼠疫苗接种之后在28天时通过高全身水平的RBD特异性和S蛋白特异性IgA诱导强大的免疫应答。
图10C-10D示出了在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/SARS-CoV-2(大肠杆菌BacLC，含有S mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/SARS-CoV-2(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有S mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2(沙门氏菌BacLC，含有S mRNA 10μg)之后，在第28天时小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中分别对SARS-CoV-2的受体结合结构域(RBD)或S-蛋白具有特异性的抗体(IgA)的水平。对照是PBS。结果表明，BacLC沙门氏菌/SARS-CoV-2在小鼠疫苗接种之后在28天时通过增加的BALF水平的RBD特异性和S蛋白特异性IgA在下呼吸道诱导高的强效粘膜应答。
实例8：装载mRNA的细菌源性脂质组合物作为流感疫苗
根据实例5制备此实例中测试的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感调配物(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有HAmRNA 10μg)和比较调配物(LNP/流感)，并且列出于表6中。所递送货物HA的编码部分如下：UAAUACGACUCACUAUAAGGGGAAAUAAGAGAGAAAAGAAGAGUAAGAAGAAAUAUAAGACCCCGGCGCCGCCACCAUGAAGGUGAAACUCCUAGUGCUGCUGUGCACCUUCACAGCAACCUACGCCGACACCAUCUGCAUUGGUUAUCACGCGAAUAAUAGUACCGACACUGUCGACACAGUUCUGGAGAAGAAUGUAACCGUGACCCACUCCGUCAAUUUAUUGGAGAACGGGGGCGGGGGCAAAUAUGUUUGUAGCGCCAAACUGCGCAUGGUCACUGGAUUGAGGAACAAGCCCUCCAAGCAGUCCCAAGGCCUGUUCGGGGCUAUUGCAGGUUUUACGGAGGGCGGGUGGACAGGGAUGGUGGAUGGUUGGUACGGGUACCACCACCAGAAUGAACAAGGAUCUGGAUACGCCGCCGAUCAGAAGUCUACUCAGAAUGCUAUCAAUGGAAUCACCAAUAAAGUUAAUUCAGUGAUAGAAAAAAUGAACACACAGUACACUGCAAUCGGCUGCGAAUAUAACAAGUCAGAGAGAUGCAUGAAGCAGAUCGAGGAUAAGAUCGAGGAGAUUGAGUCCAAAAUAUGGUGUUACAACGCCGAACUCCUCGUACUGCUCGAAAACGAGAGGACACUUGAUUUUCAUGACAGUAACGUGAAAAACCUGUAUGAAAAAGUGAAAAGCCAGCUAAAGAACAACGCUAAAGAAAUUGGCAAUGGAUGUUUUGAGUUCUACCAUAAAUGCAAUGAUGAGUGUAUGGAGAGCGUCAAGAACGGCACGUAUGACUACCCAAAGUAUAGCGAAGAAUCGAAGCUGAACCGGGAGAAGAUCGACGGUGUCAAGCUUGAGUCUAUGGGCGUGUACCAAAUUGAAGGACGAUGAUAAUAGGCUGGAGCCUCGGUGGCCUAGCUUCUUGCCCCUUGGGCCUCCCCCCAGCCCCUCCUCCCCUUCCUGCACCCGUACCCCCGUGGUCUUUGAAUAAAGUCUGAGUGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGAAGAGC
BacLC/mRNA调配物的单剂量肌肉内递送的设计和评估如方案4所示。
表6.具有HAmRNA的细菌脂质
如方案4中所示，针对每种调配物评估五只小鼠。根据表7中的处理时间表，使用肌肉内(IM)途径在第0天向小鼠注射测试样品，其中一半的调配物进入到每只大腿上部。
表7.处理时间表
血液收集。在6小时、第1天、第7天和第14天从小鼠尾静脉或通过心脏穿刺收集的终末出血收集血液样品。通过以2000g离心血液10分钟来获得样品。
ELISPOT T细胞应答评估。使用小鼠ELISPOT IFNγ彩色免疫斑点测定在第14天评估针对流感抗原的T细胞应答。将脾推动穿过细胞过滤器以分离脾细胞，将样品在4℃下以500xg离心5分钟，并且然后对样品进行红细胞裂解。通过吖啶橙排除测定在Luna细胞计数仪上对活脾细胞进行计数并评估其活力。通过用流感/HA肽刺激细胞过夜来运行ELISPOT测定。第二天，使用IFNγ彩色免疫斑点测定评估产生IFNγ的细胞。使用ELIPOT读板器对板进行分析。
通过多重ELISA评估抗体应答。使用多重ELISA对针对流感的抗体应答(IgG)进行分析，以定量靶向流感的HA特异性抗原的小鼠抗体的应答。
总之，如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，五只小鼠肌肉内施用有单剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有HAmRNA 10μg)。在第14天通过多重ELISA评估血浆中的抗体应答(IgG)。在第14天在对应ELISPOT测定(IFNγ)中评估抗流感/HAT细胞应答。
图11示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有HAmRNA 10μg)之后，在第14天时小鼠中每106个脾细胞产生细胞因子IFNg的流感HA特异性T细胞的数量。对照是PBS。结果表明，单剂量肌肉内疫苗接种BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感调配物可在免疫后14天诱导脾流感HA特异性T细胞应答。此外，如与在相同剂量下具有相同肌肉内递送的比较调配物(LNP/mRNA，含有HAmRNA 10μg)的小鼠相比，BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感调配物能够在免疫后14天在脾中诱导更高的T细胞应答。
图12示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有血凝素(HA)mRNA 10μg)之后，在第14天时小鼠血浆中对流感的HA具有特异性的抗体(IgG)的水平。对照是PBS。结果表明，与比较调配物(LNP/mRNA，含有HAmRNA 10μg)的水平相比，BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/流感在小鼠疫苗接种后在第14天时通过高全身水平的HA特异性IgG以相当的水平诱导强效的免疫应答。
实例9：细菌源性脂质组合物的转染和生物分布
根据实例5制备此实例中测试的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA调配物(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有CRE mRNA 10μg)和比较调配物(LNP/mRNA，含有CRE mRNA 10μg)，并且列出于表8中。
BacLC/mRNA调配物的单剂量肌肉内递送的设计和评估如本文所提供。每组四只TdTomato/Ai9小鼠(缓冲液、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)和LNP)在第0天肌肉内注射10μg/20μL。在第6天，收集脾和淋巴结并制备以用于FACS。
表8.具有CRE mRNA的细菌脂质
荧光激活细胞分选(FACS)。在从小鼠的脾和淋巴结(腹股沟和腘)收集的淋巴细胞、髓系细胞和非免疫细胞中分析tdTomato+细胞的频率。将脾通过过滤器过滤，在4℃下以500xg离心5分钟，然后对细胞进行红细胞裂解。将细胞离心并重悬于Fc块中，在冰上温育10分钟，并且然后添加抗体。将细胞在黑暗中在冰上温育30分钟，用FACS缓冲液洗涤，并在其上运行流式细胞术。将淋巴结合并，使用胶原酶和DNA酶在37℃下消化10分钟，并且然后过滤。在过滤之后，将细胞在4℃下以500xg离心5分钟，然后从Fc封闭步骤遵循上述方案。所使用的抗体包含CD4、F4/80、CD31、EpCam、CD11b、tdtomato、CD45、活/死染色、CD11C、CD19、CD8b和CD3。
总之，如与肌肉内递送比较调配物(LNP，含有CRE mRNA 10μg或缓冲液)的小鼠相比，四只Ai9/tdTomato小鼠肌肉内施用有单剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有CRE mRNA 10μg)。tdTomato+细胞的频率作为转染的量度在给药后六天在脾和淋巴结上通过FACS测量。
图13A-13C示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有CRE mRNA 10μg)之后，在第6天时Ai9小鼠的脾中分别地tdTomato+淋巴细胞、髓系细胞和非免疫细胞的频率。对照是PBS。结果表明，与比较调配物(LNP/mRNA，含有CRE mRNA 10μg)的水平相比，BacLC大肠杆菌(Avanti公司)在脾淋巴细胞、髓系细胞和非免疫细胞中以相当的水平具有高转染。
图14A-14C示出了如与肌肉内递送比较调配物(LNP)的小鼠相比，在单剂量肌肉内递送根据实例5制备的大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有CRE mRNA 10μg)之后，在第6天时Ai9小鼠的淋巴结中分别地tdTomato+淋巴细胞、髓系细胞和非免疫细胞的频率。对照是PBS。结果表明，与比较调配物(LNP/mRNA，含有CRE mRNA 10μg)相比，BacLC大肠杆菌(Avanti公司)在脾淋巴细胞、髓系细胞和非免疫细胞中以相当的水平或更高的水平具有高转染。
除了转染之外，还测试了各种BacLC/mRNA调配物的生物分布。根据实例5制备此实例中测试的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)调配物并且列出于表9中。
此实例中使用的FLuc mRNA(TriLink，CleanCap FLuc mRNA)的编码部分如下：
AUGGAGGACGCCAAGAACAUCAAGAAGGGCCCCGCCCCCUUCUACC
CCCUGGAGGACGGCACCGCCGGCGAGCAGCUGCACAAGGCCAUGAA
GCGGUACGCCCUGGUGCCCGGCACCAUCGCCUUCACCGACGCCCACA
UCGAGGUGGACAUCACCUACGCCGAGUACUUCGAGAUGAGCGUGCG
GCUGGCCGAGGCCAUGAAGCGGUACGGCCUGAACACCAACCACCGG
AUCGUGGUGUGCAGCGAGAACAGCCUGCAGUUCUUCAUGCCCGUGC
UGGGCGCCCUGUUCAUCGGCGUGGCCGUGGCCCCCGCCAACGACAU
CUACAACGAGCGGGAGCUGCUGAACAGCAUGGGCAUCAGCCAGCCC
ACCGUGGUGUUCGUGAGCAAGAAGGGCCUGCAGAAGAUCCUGAACG
UGCAGAAGAAGCUGCCCAUCAUCCAGAAGAUCAUCAUCAUGGACAG
CAAGACCGACUACCAGGGCUUCCAGAGCAUGUACACCUUCGUGACC
AGCCACCUGCCCCCCGGCUUCAACGAGUACGACUUCGUGCCCGAGA
GCUUCGACCGGGACAAGACCAUCGCCCUGAUCAUGAACAGCAGCGG
CAGCACCGGCCUGCCCAAGGGCGUGGCCCUGCCCCACCGGACCGCCU
GCGUGCGGUUCAGCCACGCCCGGGACCCCAUCUUCGGCAACCAGAU
CAUCCCCGACACCGCCAUCCUGAGCGUGGUGCCCUUCCACCACGGCU
UCGGCAUGUUCACCACCCUGGGCUACCUGAUCUGCGGCUUCCGGGU
GGUGCUGAUGUACCGGUUCGAGGAGGAGCUGUUCCUGCGGAGCCUG
CAGGACUACAAGAUCCAGAGCGCCCUGCUGGUGCCCACCCUGUUCA
GCUUCUUCGCCAAGAGCACCCUGAUCGACAAGUACGACCUGAGCAA
CCUGCACGAGAUCGCCAGCGGCGGCGCCCCCCUGAGCAAGGAGGUG
GGCGAGGCCGUGGCCAAGCGGUUCCACCUGCCCGGCAUCCGGCAGG
GCUACGGCCUGACCGAGACCACCAGCGCCAUCCUGAUCACCCCCGAG
GGCGACGACAAGCCCGGCGCCGUGGGCAAGGUGGUGCCCUUCUUCG
AGGCCAAGGUGGUGGACCUGGACACCGGCAAGACCCUGGGCGUGAA
CCAGCGGGGCGAGCUGUGCGUGCGGGGCCCCAUGAUCAUGAGCGGC
UACGUGAACAACCCCGAGGCCACCAACGCCCUGAUCGACAAGGACG
GCUGGCUGCACAGCGGCGACAUCGCCUACUGGGACGAGGACGAGCA
CUUCUUCAUCGUGGACCGGCUGAAGAGCCUGAUCAAGUACAAGGGC
UACCAGGUGGCCCCCGCCGAGCUGGAGAGCAUCCUGCUGCAGCACC
CCAACAUCUUCGACGCCGGCGUGGCCGGCCUGCCCGACGACGACGCC
GGCGAGCUGCCCGCCGCCGUGGUGGUGCUGGAGCACGGCAAGACCA
UGACCGAGAAGGAGAUCGUGGACUACGUGGCCAGCCAGGUGACCAC
CGCCAAGAAGCUGCGGGGCGGCGUGGUGUUCGUGGACGAGGUGCCC
AAGGGCCUGACCGGCAAGCUGGACGCCCGGAAGAUCCGGGAGAUCC
UGAUCAAGGCCAAGAAGGGCGGCAAGAUCGCCGUGUGA
BacLC/mRNA调配物的单剂量静脉内递送的设计和评估如方案5所示。
表9.具有荧光素酶mRNA的细菌脂质组合物
如方案5中所示，针对每种调配物评估两只小鼠。在0小时将测试样品静脉内注射到小鼠中，并且然后在4-6小时后向小鼠注射D-荧光素(200μL，15mg/mL)。在5分钟之后，在自动暴露下对动物的全身进行活体成像。然后对动物实施安乐死，并且在1秒和1分钟的暴露下对器官成像。
图15A-C示出了在小鼠静脉内施用一定剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)之后，在4-6小时小鼠的全身、肝和脾的辐射。图15D示出了在小鼠静脉内施用一定剂量的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPOmRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)之后，在4-6小时脾与肝的辐射比。结果表明，所有三种BacLC均显示出对肝和脾的分布，其中在比较之下，BacLC沙门氏菌具有更高的脾:肝比率。
图16A-C示出了在小鼠静脉内施用一定剂量的根据实例5制备的BacLC大肠杆菌/mRNA(大肠杆菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)、BacLC大肠杆菌(Avanti公司)/mRNA(大肠杆菌(Avaanti公司)BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)和BacLC沙门氏菌/mRNA(沙门氏菌BacLC，含有FLuc:EPO mRNA 10μg)之后，在4-6小时小鼠的肠系膜淋巴结、胃和肠系膜脂肪垫的辐射。结果表明，所有三种BacLC调配物分布到淋巴结、胃和脂肪，其中与BacLC大肠杆菌相比，BacLC大肠杆菌(Avanti公司)和BacLC沙门氏菌在胃中显示出更高的信号。所有这三种在淋巴结中都具有等效的辐射率。
尽管出于清楚理解的目的，已经通过图示和实例的方式详细描述了前述发明，但是这些描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。本文引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用明确地通过引用整体并入。其它实施例处于权利要求书内。

Claims (56)

1.一种细菌源性脂质组合物，其包括：
(a)细菌组分，所述细菌组分包括从细菌来源提取的一种或多种脂质；以及
(b)可电离脂质。
2.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌组分包括分离的细菌胞外囊泡。
3.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌组分是通过在存在所述可电离脂质的情况下重构包括所述细菌组分的膜来修饰的。
4.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌组分是通过用所述可电离脂质重构包括所述细菌组分的经纯化的细菌脂质的膜来修饰的。
5.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质具有一种或多种选自由以下组成的组的特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P比率。
6.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物进一步包括固醇和聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
7.根据权利要求6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG或PEG-PE。
8.根据权利要求7所述的细菌源性脂质组合物，其中所述PEG-脂质缀合物是PEG-DMG，并且所述PEG-DMG是PEG2000-DMG或PEG2000-PE。
9.根据权利要求6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括：
约20mol％至约50mol％的所述可电离脂质；
约20mol％至约60mol％的所述细菌组分；
约7mol％至约45mol％的所述固醇；以及
约0.5mol％至约3mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
10.根据权利要求9所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括：
约35mol％的所述可电离脂质；
约50mol％的细菌脂质；
约12.5mol％的所述固醇；以及
约2.5mol％的所述聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物。
11.根据权利要求6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35:50:12.5:2.5的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质。
12.根据权利要求6所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括摩尔比为约35:20:42.5:2.5的可电离脂质:细菌脂质:固醇:PEG-脂质。
13.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质选自由以下组成的组：1,1'-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮杂二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、MD1(cKK-E12)、OF2、EPC、ZA3-Ep10、TT3、LP01、5A2-SC8、脂质5、SM-102(脂质H)和ALC-315。
14.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质是其中每个R独立地是C8-C14烷基。
15.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌来源选自埃希氏杆菌属(Escherichia)、不动杆菌属(Acinetobacter)、农杆菌属(Agrobacterium)、项圈藻属(Anabaena)、产水菌属(Aquifex)、固氮弧菌属(Azoarcus)、固氮菌属(Azotobacter)、博代氏杆菌属(Bordetella)、慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)、布鲁氏菌属(Brucella)、布赫纳氏菌属(Buchnera)、伯克氏菌属(Burkholderia)、韧皮部杆菌属(Candidatus)、色杆菌属(Chromobacterium)、鳄球藻属(Crocosphaera)、脱氯单胞菌属(Dechloromonas)、脱亚硫酸菌属(Desulfitobacterium)、脱硫小杆菌属(Desulfotalea)、欧文氏菌属(Erwinia)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、梭杆菌属(Fusobacterium)、粘杆菌属(Gloeobacter)、葡糖杆菌属(Gluconobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、军团菌属(Legionella)、磁螺菌属(Magnetospirillum)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)、甲基球菌属(Methylococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、念珠藻属(Nostoc)、发光杆菌属(Photobacterium)、光杆状菌属(Photorhabdus)、单胞菌属(Polaromonas)、原绿球藻属(Prochlorococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、红长命菌属(Rubrivivax)、沙门氏菌属(Salmonella)、希瓦氏菌属(Shewanella)、志贺氏菌属(Shigella)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、聚球藻属(Synechococcus)、集胞藻属(Synechocystis)、热粘球菌属(Thermosynechococcus)、热袍菌属(Thermotoga)、栖热菌属(Thermus)、硫杆菌属(Thiobacillus)、束毛藻属(Trichodesmium)、弧菌属(Vibrio)、魏格沃斯菌属(Wigglesworthia)、沃廉菌属(Wolinella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、木杆菌属(Xylella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、异常球菌属(Deinococcus)、微小杆菌属(Exiguobacterium)、地芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳杆菌属、穆尔氏菌属(Moorella)、大洋芽胞杆菌属(Oceanobacillus)、共生菌属(Symbiobacterium)和热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacterium)。
16.根据权利要求15所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌来源是大肠杆菌(E.coli)或鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。
17.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是选自由以下组成的组的亲脂性部分：脂质复合物、脂质体、脂质纳米颗粒、基于聚合物的载剂、外泌体、层状体、胶束和乳液。
18.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是选自由以下组成的组的脂质体：阳离子脂质体、纳米脂质体、蛋白脂质体、单层脂质体、多层脂质体、含神经酰胺的纳米脂质体和多囊泡脂质体。
19.根据权利要求1所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是脂质纳米颗粒。
20.根据权利要求19所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小小于约200nm。
21.根据权利要求20所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小小于约150nm。
22.根据权利要求20所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小小于约100nm。
23.根据权利要求20所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的大小为约85nm至约90nm。
24.根据权利要求19所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均多分散性指数(PDI)在约0.1至约0.4的范围内。
25.根据权利要求24所述的细菌源性脂质组合物，其中所述脂质纳米颗粒的平均PDI在约0.2至约0.3的范围内。
26.根据前述权利要求中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物进一步包括一种或多种异源功能剂。
27.根据权利要求26所述的细菌源性脂质组合物，其中所述异源功能剂由所述细菌源性脂质组合物包封、包埋在所述细菌源性脂质组合物的表面上或与所述表面缀合。
28.根据权利要求26所述的细菌源性脂质组合物，其中所述异源功能剂包括多核苷酸。
29.根据权利要求28所述的细菌源性脂质组合物，其中所述多核苷酸是mRNA。
30.根据权利要求26所述的细菌源性脂质组合物，其中细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约50:1至约10:1。
31.根据权利要求30所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约44:1至约24:1。
32.根据权利要求30所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约40:1至约28:1。
33.根据权利要求30所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约38:1至约30:1。
34.根据权利要求30所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质纳米颗粒的总脂质:异源功能剂重量比是约37:1至约33:1。
35.根据前述权利要求中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其进一步包括pH为约7.0至约8.5的HEPES或TRIS缓冲液。
36.根据权利要求35所述的细菌源性脂质组合物，其中所述HEPES或TRIS缓冲液的浓度为约7mg/mL至约15mg/mL。
37.根据权利要求35或36所述的细菌源性脂质组合物，其中所述缓冲液进一步包括约2.0mg/mL至约4.0mg/mL的NaCl。
38.根据前述权利要求中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其进一步包括一种或多种冷冻保护剂。
39.根据权利要求38所述的细菌源性脂质组合物，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自由蔗糖、甘油和其组合组成的组。
40.根据权利要求29所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物包括浓度为约70mg/mL至约110mg/mL的蔗糖和浓度为约50mg/mL至约70mg/mL的甘油的组合。
41.根据前述权利要求中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述细菌源性脂质组合物是经冻干的组合物。
42.根据权利要求41所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括一种或多种冻干保护剂。
43.根据权利要求41所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括泊洛沙姆(poloxamer)、山梨酸钾、蔗糖或其任何组合。
44.根据权利要求43所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.01％w/w至约1.0％w/w的泊洛沙姆。
45.根据权利要求43或44所述的细菌源性脂质组合物，其中所述泊洛沙姆是泊洛沙姆188。
46.根据权利要求41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.01％w/w至约1.0％w/w的多核苷酸。
47.根据权利要求41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约1.0％w/w至约5.0％w/w的脂质。
48.根据权利要求41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.5％w/w至约2.5％w/w的TRIS缓冲液。
49.根据权利要求41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约0.75％w/w至约2.75％w/w的NaCl。
50.根据权利要求41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中所述经冻干的细菌源性脂质组合物包括约85％w/w至约95％w/w的糖。
51.根据权利要求50所述的细菌源性脂质组合物，其中所述糖是蔗糖。
52.根据权利要求41至45中任一项所述的细菌源性脂质组合物，其中经冻干的细菌源性脂质纳米颗粒包括约1.0％w/w至约5.0％w/w的山梨酸钾。
53.一种用于制备细菌源性脂质组合物的方法，所述方法包括：
在存在(b)可电离脂质的情况下重构(a)包括从细菌来源提取的一种或多种脂质的细菌组分，以产生所述细菌源性脂质组合物，其中所述可电离脂质具有以下所列特性中的两种或更多种特性：
(i)至少2个可电离胺；
(ii)至少3个脂质尾部，其中所述脂质尾部中的每一个的长度为至少6个碳原子；
(iii)约4.5至约7.5的pKa；
(iv)由至少两个原子的链分开的可电离胺和杂有机基团；以及
(v)至少10的N:P比率；以及
将一种或多种异源功能剂装载到所述细菌源性脂质组合物中。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述重构步骤包括：
在存在所述可电离脂质(b)的情况下重构包括所述细菌组分(a)的经纯化的细菌脂质的膜，以产生所述细菌源性脂质组合物。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述异源功能剂包括多核苷酸。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述多核苷酸是mRNA。
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