ES2745989T3

ES2745989T3 - Métodos de extracción y separación de lípidos microbianos

Info

Publication number: ES2745989T3
Application number: ES10765129T
Authority: ES
Inventors: Jon Wittenberg; Felipe Arana
Original assignee: Corbion Biotech Inc
Current assignee: Corbion Biotech Inc
Priority date: 2009-04-14
Filing date: 2010-04-14
Publication date: 2020-03-04
Anticipated expiration: 2030-04-14
Also published as: SG175722A1; WO2010120939A3; BRPI1014451A2; IL215719B; IL215719A0; EP2419520A4; EP2419520B1; CN106367198A; CO6460757A2; ZA201107514B; CA2758924A1; CN102575271A; WO2010120939A2; AU2010236412B2; EP2419520A2; BRPI1014451B1; CA2758924C; SG10201401472YA; AU2010236412A1

Abstract

Un método para extraer lípidos de biomasa microbiana que comprende a. secar la biomasa microbiana para producir biomasa microbiana seca que tiene un contenido de humedad del 3% al 15%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, del 0,1% al 5%, del 0,1% al 3%, o de 0,5% a 3,5% en peso y constituyendo al menos 20% de aceite en peso; b. acondicionar la biomasa microbiana seca para producir materia prima acondicionada calentando la biomasa microbiana seca a una temperatura en el rango de 70°C a 150°C, teniendo los piensos acondicionados un contenido de humedad de 0,5% a 2,5% en peso de la biomasa microbiana; y c. someter los piensos acondicionados a una presión suficiente para separar al menos el 5% del aceite en la biomasa de otros componentes, dejando biomasa gastada de contenido reducido de aceite en relación con los piensos acondicionados.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos de extracción y separación de lípidos microbianos

REFERENCIA A UNA LISTA DE SECUENCIAS

[0001] Esta aplicación incluye una lista de secuencias como se muestra en las páginas 1-21, adjuntas al presente.

CAMPO DE INVENCIÓN

[0002] Esta invención se refiere generalmente a la producción y extracción de aceite a partir de microorganismos. En particular, la invención proporciona métodos para extraer, recuperar, aislar y obtener aceite de un microorganismo y composiciones que comprenden el aceite. En consecuencia, la invención se refiere a los campos de biología, microbiología, tecnología de fermentación y tecnología de producción de aceite y combustible.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0003] El combustible fósil es un término general para los depósitos geológicos inflamables de los materiales orgánicos formados a partir de plantas y animales en descomposición que han sido convertidos a aceite crudo, carbón, gas natural, o aceites pesados por la exposición a calor y presión en la corteza de la tierra durante cientos de millones de años.

[0004] Los combustibles fósiles son un recurso finito, no renovable. Con la modernización global en los siglos 20° y 2 l, la demanda de energía de los combustibles fósiles, especialmente la gasolina derivada del aceite, está creciendo y ha sido la causa de grandes conflictos regionales y mundiales. La mayor demanda de energía también ha aumentado el costo de los combustibles de hidrocarburos. Además de la energía, muchas industrias, incluidas las industrias de fabricación de plásticos y productos químicos, dependen de la disponibilidad de hidrocarburos como materia prima para la fabricación. Las alternativas a las fuentes de suministro actuales ayudarían a mitigar la presión al alza sobre estos costos de piensos.

[0005] Los lípidos para su uso en biocombustibles se pueden producir en microorganismos, tales como algas, hongos, y bacterias. Por lo general, la fabricación de un lípido en un microorganismo implica el desarrollo de microorganismos, como algas, hongos o bacterias, que son capaces de producir un lípido deseado en un fermentador o biorreactor, aislar la biomasa microbiana, secarla y extraer los lípidos intracelulares, que son una forma de aceite Sin embargo, estos procesos generalmente se consideran ineficientes y costosos, particularmente cuando se considera la escala en la que deben realizarse para producir suministros significativos de combustible. Un problema importante con estos procesos es la extracción de lípidos o aceites de un microorganismo.

[0006] El documento WO2006/046943 A2 describe métodos para preparar lípidos que contienen ácidos grasos poliinsaturados a partir de un material que contiene lípidos que incluyen tratamiento enzimático de componentes del material y/o interrupción de la presión del material. Los materiales que contienen lípidos incluyen biomasa, como microorganismos.

[0007] Existe una necesidad de un proceso para la extracción de aceite a partir de microorganismos que mitiga los problemas de baja eficiencia y alto costo de los métodos actuales para la extracción de lípidos a partir de microorganismos. La presente invención proporciona dicho proceso.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0008] La presente invención es como se describe en las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona un método para la extracción de lípidos de biomasa microbiana que comprende

a. secar la biomasa microbiana para producir biomasa microbiana seca que tiene un contenido de humedad del 3% al 15%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, del 0.1% al 5%, del 0,1% al 3%, o de 0,5% a 3,5% en peso y constituyendo al menos 20% de aceite en peso;

b. acondicionar la biomasa microbiana seca para producir materia prima acondicionada calentando la biomasa microbiana seca a una temperatura en el rango de 70°C a 150°C, los piensos acondicionados tiene un contenido de humedad de 0,5% a 2,5% en peso de la biomasa microbiana; y

c. someter los piensos acondicionados a una presión suficiente para separar al menos el 5% del aceite en la biomasa de otros componentes, dejando la biomasa gastada de contenido reducido de aceite en relación con los piensos acondicionados.

[0009] La presente invención proporciona un método para la extracción de lípidos/aceite a partir de biomasa microbiana. En una realización, la presente invención proporciona un método para extraer aceite de biomasa microbiana, comprendiendo dicho método las etapas de someter biomasa microbiana seca que tiene un contenido de humedad de menos del 6% en peso y que constituye al menos 20% de aceite en peso y acondicionado por calor. a una temperatura en el rango de 70°C a 150°C (160°F a 300°F) para presionar lo suficiente como para extraer más del 5% del aceite en peso de la biomasa para que el aceite extraído y la biomasa gastada del aceite reducido se produce contenido En diversas realizaciones, más del 75% del aceite en peso en la biomasa microbiana seca se extrae de la biomasa en la etapa de prensado.

[0010] Por lo tanto, este método comprende secado y después el acondicionamiento de la biomasa microbiana para producir piensos acondicionados que luego se someten a presión. El acondicionamiento cambia las propiedades físicas y/o fisicoquímicas de la biomasa, pero no provoca la liberación de más del 5% del aceite en la biomasa. La etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa microbiana seca a una temperatura en el rango de 70°C a 150°C (160°F a 300°F), alterando así su contenido de humedad. En diversas realizaciones, se agrega un "agente de carga" o "ayuda de prensa" a la biomasa microbiana o a los piensos acondicionados antes de la aplicación de presión durante la etapa de prensado. Durante la etapa de prensado, los piensos acondicionados se someten a una presión suficiente para separar al menos el 5% del aceite en la biomasa o piensos acondicionados de otros componentes. Estos otros componentes están contenidos en la "biomasa gastada", que puede incluir aceite residual pero, en cualquier caso, ha reducido el contenido de aceite en relación con los piensos acondicionados. En una realización, la presión es ejercida por una prensa de expulsión.

[0011] En diversas realizaciones de este y otros aspectos de la invención, la biomasa se prepara por fermentación de un microorganismo seleccionado del grupo que consiste de microalgas, bacterias oleaginosas, levadura oleaginosa, y hongos. En diversas realizaciones, la microalga es una especie de un género seleccionado de Chlorella, Parachlorella o Prototheca, o es una de las otras especies en la Tabla 1, a continuación. En diversas realizaciones, la bacteria oleaginosa es una especie del género Rhodococcus. En diversas realizaciones, la levadura oleaginosa es Rhodotorula glutinis u otra especie listada en la Tabla 2, a continuación. En diversas realizaciones, los hongos son una especie incluida en la Tabla 3, a continuación.

[0012] En diversas realizaciones de este y otros aspectos de la invención, la biomasa se prepara por fermentación de un microbio que contiene 18: ácido 1 graso. En diversas realizaciones, el microbio tiene un perfil de ácido graso de menos del 2% de C14: 0; aproximadamente 13-16% C16: 0; aproximadamente 1-4% de C18: 0; aproximadamente 64-71% de C18: 1; aproximadamente 10-15% de C18: 2; aproximadamente 0,5-2% p/p C18: 3; y menos del 1% de longitud de cadena de carbono de 20 o más. En diversas realizaciones, el microbio tiene un perfil de ácido graso de aproximadamente 1-2% de C14: 0; aproximadamente 20% de C16: 0; aproximadamente 4% de C18: 0; aproximadamente 64% de C18: 1; y aproximadamente 7-8% de C18: 2. En algunas realizaciones, el microbio tiene un perfil de ácido graso de aproximadamente C14: 0 (1,65); C16: 0 (28,0); C18: 0 (2,90); C18: 1 (53,80); C18: 2 (10,95); y C18: 3 alfa (0,80). En otras realizaciones, el microbio tiene un perfil de ácido graso de C14: 0 (2,33); C15: 0 (9,08); C16: 0 (24,56); C16: 1 (11,07); C17: 0 (10,50); C18: 0 (2,49); C18: 1 (17,41); C18: 2 (0,05). En otras realizaciones más, el microbio tiene un perfil de ácido graso de C12 (menos del 1%); C14: 0 (2,18-3,36); C15: 0 (0,12-0,25); C16: 0 (29,94-33,26); C16: 1 (0,49-0,76); C17: 0; C18: 0 (6,88-8,17); C18: 1 (42,68-48,12); C18: 2 (7,88-9,28) C18: 3 alfa (0,84-1,33); y mayor que C: 20 (1,1-1,45). En diversas realizaciones, el microbio tiene menos del 0,5% de DHA. En estas y otras realizaciones, el microbio es, en algunos casos, una microalga.

[0013] En diversas realizaciones de este y otros aspectos de la invención, la biomasa microbiana (seco o hidratado) o materia prima acondicionada que contiene al menos 25% aceite (lípidos) en peso. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca o materia prima acondicionada contiene al menos 25% de aceite en peso de células secas. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca o los piensos acondicionados contiene al menos 40%, al menos 50% o al menos 75% de aceite en peso de células secas. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca o materia prima acondicionada contiene al menos 15% de carbohidratos en peso de células secas.

[0014] En diversas realizaciones de este y otros aspectos de la invención, la etapa de acondicionamiento implica la aplicación de calor y/o presión a la biomasa. En diversas realizaciones, la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa a una temperatura en el intervalo de 70°C a 150°C (160°F a 300°F). En diversas realizaciones, el calentamiento se realiza usando un agitador vertical apilado. En diversas realizaciones, la etapa de acondicionamiento comprende tratar la biomasa seca con un expansor o extrusor para dar forma y/u homogeneizar la biomasa. En diversas realizaciones, la biomasa seca tiene un contenido de humedad de menos del 5% en peso. En diversas realizaciones, la biomasa seca tiene un contenido de humedad en el intervalo de 0,1% y 5% en peso. En diversas realizaciones, la biomasa seca tiene un contenido de humedad de menos del 4% en peso. En diversas realizaciones, la biomasa seca tiene un contenido de humedad en el intervalo de 0,5% y 3,5% en peso. En diversas realizaciones, la biomasa seca tiene un contenido de humedad en el intervalo de 0,1% y 3% en peso.

[0015] En diversas realizaciones de este y otros aspectos de la invención, se añade un agente de carga a la biomasa microbiana, que puede ser seco o hidratado (es decir, la biomasa que no se ha secado o que contiene significativa, es decir, más de 6% en peso, humedad, incluida la biomasa en caldo de fermentación que no ha sido sometido a ningún proceso para eliminar o separar agua) biomasa microbiana o piensos acondicionados antes del paso de prensado. En diversas realizaciones, el agente de carga tiene un tamaño de partícula promedio de menos de 1,5 mm. En diversas realizaciones, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en celulosa, rastrojo de maíz, romero seco, cáscaras de soja, biomasa gastada (biomasa de contenido lipídico reducido en relación con la biomasa a partir de la cual se preparó), bagazo de caña de azúcar y hierba de cambio. En diversas realizaciones, el agente de carga es biomasa gastada que contiene entre 50% y 80% de polisacárido en peso y/o menos de 10% de aceite en peso. En diversas realizaciones, el polisacárido en la biomasa gastada utilizada como agente de carga contiene 20 30 por ciento en moles de galactosa, 55-65 por ciento en moles de glucosa y/o 5-15 por ciento en moles de manosa.

[0016] La invención proporciona varios métodos relacionados con la extracción de aceite a partir de biomasa microbiana que emplean los agentes de carga descritos anteriormente. En un método, la biomasa microbiana hidratada adecuada para la extracción de aceite se prepara agregando un agente de carga a la biomasa y secando la mezcla obtenida de ese modo a un contenido de humedad inferior al 6% en peso, formando así una mezcla seca de agente de carga/biomasa. En otro método, el aceite se extrae de la biomasa microbiana mediante el secado conjunto de biomasa microbiana hidratada que contiene al menos un 20% de aceite en peso y un agente de carga para formar una mezcla seca de agente de carga/biomasa; reducir el contenido de humedad en la mezcla a menos del 4% en peso; y presionar la mezcla de contenido reducido de humedad para extraer el aceite del mismo, formando así biomasa gastada de contenido reducido de lípidos. En otro método, se obtienen mayores rendimientos de aceite a partir de biomasa microbiana que contiene al menos un 20% de lípidos en peso al secar la biomasa microbiana con un agente de carga, porque la mezcla secada, al presionar, liberará más aceite del que se puede obtener de la biomasa en las mismas condiciones en ausencia de un agente de carga. En diversas realizaciones de estos y otros métodos de la invención, la biomasa microbiana hidratada está contenida en un caldo de fermentación que no ha sido sometido a procesos para separar o eliminar el agua de la biomasa antes de agregar el agente de carga a la biomasa. Típicamente, la mezcla de agente de carga y biomasa se acondiciona calentando a una temperatura en el intervalo de 70°C a 150°C (160°F a 300°F) inmediatamente antes del paso de prensado.

[0017] En diversas realizaciones de los diferentes aspectos de la invención, la biomasa microbiana seca, hidratada biomasa microbiana mezclado con un agente de carga, o piensos acondicionados, que comprende opcionalmente un agente de carga, se somete a presión en una etapa de prensado para extraer el aceite, produciendo aceite separado de la biomasa gastada. El paso de prensado implica someter una presión suficiente para extraer el aceite de los piensos acondicionados. La lisis celular ocurrirá durante este paso, si la biomasa o piensos no ha sido sometida a condiciones que lisen algunas o todas las células antes del paso de prensado. En diversas realizaciones de los diferentes aspectos de la invención, la etapa de prensado implicará someter los piensos acondicionados a al menos 689 bar (10.000 psi) de presión. En diversas realizaciones, el paso de prensado implica la aplicación de presión durante un primer período de tiempo, una reducción de la presión durante un segundo período de tiempo, y luego la aplicación de una presión mayor que durante el primer período de tiempo durante un tercer período de tiempo. Este proceso puede repetirse una o más veces ("presión oscilante"). En diversas realizaciones, se aplican más de 5 ciclos de presión oscilante. En diversas realizaciones, uno o más de los ciclos posteriores pueden ejercer una presión promedio que es más alta que la presión promedio ejercida en uno o más ciclos anteriores. Por ejemplo y sin limitación, la presión promedio en el último ciclo puede ser al menos 2 veces mayor que la presión promedio en el primer ciclo o en cualquier ciclo anterior. En diversas realizaciones, el contenido de humedad de los piensos acondicionados se controla durante la etapa de prensado.

[0018] En diversas realizaciones, la etapa de prensado se lleva a cabo con una prensa de expulsor. En diversas realizaciones, la etapa de prensado se realiza en un modo de flujo continuo. En diversas realizaciones, la velocidad de lubricación es de al menos 500 g/min. a no más de 1000 g/min. En diversas realizaciones de flujo continuo, la prensa de expulsión es un dispositivo que comprende un eje helicoidal que gira continuamente dentro de una jaula que tiene un alimentador en un extremo y un estrangulador en el extremo opuesto, que tiene aberturas dentro de la jaula. Los piensos acondicionados ingresa a la jaula a través del alimentador, y la rotación del eje helicoidal avanza la materia prima a lo largo de la jaula y aplica presión a los piensos dispuestos entre la jaula y el estrangulador, la presión libera aceite a través de las aberturas de la jaula y extruye la biomasa gastada del extremo del estrangulador de la jaula. En diversas realizaciones, la jaula tiene una longitud interna que está entre al menos diez veces y al menos veinte veces su diámetro interno. En diversas realizaciones, la jaula comprende una pluralidad de barras alargadas con al menos algunas de las barras alargadas separadas por uno o más espaciadores, las barras descansando sobre un marco, en donde el uno o más espaciadores entre las barras forman las aberturas, y el aceite es liberado a través de las aberturas a un recipiente colector acoplado fluidamente con la jaula. En diversas realizaciones, los separadores entre las barras alargadas son de diferentes espesores, permitiendo así la variación del espacio entre cada barra alargada. En diversas realizaciones, los separadores o los espacios entre las barras tienen un espesor de 0,13 a 0,76 mm (0,005 a 0,030 pulgadas).

[0019] En diversas realizaciones, la presión aumenta en un factor de entre 10 y 20 desde el alimentador de extremo al extremo del cebador de la jaula. En diversas realizaciones, la presión a lo largo de la jaula no aumenta en más del 100% de la presión en el extremo del alimentador de la jaula por pie lineal de la jaula entre el alimentador y los extremos del estrangulador de la jaula. En diversas realizaciones, la potencia consumida por el dispositivo no aumenta en más del 10% cuando está completamente cargada con materia prima acondicionada en relación con el funcionamiento vacío. En diversas realizaciones, el tiempo de residencia de la materia prima en el barril del dispositivo no es superior a 5-10 min. En diversas realizaciones, se controla y/o controla la temperatura del dispositivo de expulsión o la presión ejercida por el dispositivo de expulsión o ambas.

[0020] En diversas realizaciones, la presión se controla ajustando la velocidad de rotación de un eje de tornillo sinfín. En diversas realizaciones, incluidas aquellas en las que no se controla la presión, se puede usar una prensa de expulsor (tomillo) que comprende un eje helicoidal y un barril. En diversas realizaciones, el barril tiene una longitud y un canal que tiene un diámetro dimensionado para recibir el eje helicoidal, y en el que la longitud del barril es al menos 10 a 15 veces mayor que el diámetro del canal. En diversas realizaciones, el barril de la prensa tiene una entrada y una salida, y el diámetro del eje helicoidal aumenta desde la entrada hasta la salida, y el prensado comprende aumentar la presión desde la entrada hasta la salida del barril; En diversas realizaciones, la presión en la salida es de 12 a 16, o incluso hasta 20 veces mayor que la presión en la entrada. En diversas realizaciones, la prensa de expulsión comprende un eje helicoidal y un barril que tiene un primer canal y un segundo canal, ambos canales concéntricos y dimensionados para recibir el eje helicoidal, en donde el primer canal tiene un primer diámetro y el segundo canal tiene un segundo diámetro diferente al primer diámetro. En diversas realizaciones, los piensos acondicionados permanecen residentes en el barril de la prensa de expulsión durante 5 a 10 minutos.

[0021] En diversas realizaciones, la prensa expulsora comprende un eje de tornillo sinfín dispuesto en el barril forrado con una pluralidad de barras alargadas separadas por uno o más espaciadores entre los mismos, los espaciadores creando una brecha entre las barras alargadas. En tal prensa, la presión se puede controlar ajustando el espacio cambiando el tamaño o el número de espaciadores entre las barras alargadas, y/o si la prensa tiene un espacio entre una superficie externa del eje helicoidal y una superficie interna del alargado barras, la presión se puede controlar reemplazando al menos algunas de las barras alargadas con barras de diferentes tamaños para cambiar el espacio. En diversas realizaciones, la prensa comprende una abertura de salida y un estrangulador ajustable acoplado a la misma, y la presión se controla ajustando el estrangulador para aumentar o disminuir la presión. En diversas realizaciones, la prensa comprende un eje helicoidal dispuesto en un barril, y la presión se controla ajustando un espacio entre una superficie externa del eje helicoidal y una superficie interna del cilindro.

[0022] Después del paso de prensado, los resultados del método en la extracción del aceite y la producción de biomasa agotada. En diversas realizaciones, el aceite liberado contiene partículas sólidas de biomasa o materia prima acondicionada, y el método comprende además separar el aceite liberado de las partículas sólidas. Opcionalmente, las partículas sólidas separadas se pueden someter a presión para extraer cualquier aceite restante de las mismas. En diversas realizaciones, el aceite extraído contiene no más de 8 ppm de cloruro, no más de 2 ppm de fósforo, no más de 26 ppm de potasio, no más de 12 ppm de sodio y/o no más de 5 ppm de azufre. El aceite producido por el proceso es útil en una variedad de aplicaciones, que incluyen, entre otras, la producción de combustibles como biodiesel y diesel renovable y la producción de alimentos.

[0023] En diversas realizaciones, el contenido de aceite en la biomasa agotada de contenido reducido de aceite es al menos 45 por ciento menos que el contenido de aceite de la biomasa microbiana antes del paso de prensado. En diversas realizaciones, la biomasa gastada de contenido reducido de aceite que queda después del paso de prensado se granula o se extruye como una torta. La biomasa gastada, que puede someterse a procesos adicionales, incluido el acondicionamiento y el prensado adicionales o los métodos de extracción basados en solventes u otros para extraer el aceite residual, es igualmente útil en una variedad de aplicaciones, que incluyen pero no se limitan al uso como alimento, particularmente para animales, y como agente de carga. En diversas realizaciones, el aceite restante se extrae de la biomasa gastada de contenido reducido de aceite; En diversas realizaciones, la extracción se realiza sometiendo la biomasa gastada a presión o extrayendo el aceite con un disolvente orgánico.

[0024] En vista de lo anterior, la presente invención está dirigida a un método para extraer lípidos a partir de biomasa microbiana. En una realización, el método comprende someter a presión a la biomasa microbiana que constituye al menos un 20% en peso de lípidos y que tiene un contenido de humedad de menos del 6% en peso, por lo que las células de la biomasa se lisan, liberando más del 5% de los lípidos y dejando biomasa gastada de contenido reducido de lípidos, en donde los lípidos extraídos y la biomasa gastada se separan entre sí.

[0025] En algunos casos, la biomasa microbiana se somete a una presión más baja durante un primer periodo de tiempo seguido por una presión más alta para un segundo período de tiempo. En algunos casos, la biomasa microbiana se somete a más de 5 ciclos de presión oscilante, y la presión promedio ejercida sobre la biomasa durante el transcurso del último ciclo es al menos 2 veces mayor que la presión promedio ejercida sobre la biomasa durante el curso. del primer ciclo. En algunos casos, la biomasa microbiana está sujeta a presión mediante un método que comprende flujo continuo a través de un dispositivo que aplica la presión. En una realización, el dispositivo es una prensa de expulsión. En algunos casos, la biomasa microbiana se somete a al menos 689 bares (10.000 PSI) de presión.

[0026] En algunas realizaciones, la biomasa microbiana está sujeto a presión por un método que comprende de flujo continuo a través de un dispositivo de aplicación de la presión, en el que el dispositivo es un eje de tornillo sinfín que gira continuamente dentro de una jaula que tiene un alimentador en un extremo y una bobina de choque en una extremo opuesto al mismo, y que tiene aberturas dentro de la jaula, en donde la biomasa ingresa a la jaula a través del alimentador, y la rotación del eje de gusano avanza la biomasa a lo largo de la jaula y aplica presión a la biomasa dispuesta entre la jaula y el estrangulador, la presión de lisis células de la biomasa y la liberación de aceite a través de las aberturas de la jaula de tal manera que la biomasa gastada de contenido reducido de aceite se extruye desde el extremo del estrangulador de la jaula. En algunos casos, la jaula comprende una pluralidad de barras alargadas con al menos algunas de las barras alargadas separadas por uno o más espaciadores, y las barras descansando sobre un marco, en donde el uno o más espaciadores entre las barras forman las aberturas y los lípidos se liberan a través de las aberturas a un recipiente colector acoplado de manera fluida con la jaula. En algunos casos, los espaciadores entre las barras alargadas son de diferentes espesores, permitiendo así la variación del espacio entre cada barra alargada. En algunas realizaciones, los separadores o los espacios entre las barras tienen un espesor de 0,13 a 0,76 mm (0,005 a 0,030 pulgadas). En algunos casos, la presión aumenta en un factor de entre 10 y 20 desde el extremo del alimentador hasta el extremo del estrangulador de la jaula. En algunos casos, el tiempo de residencia de la biomasa en el barril del dispositivo es de entre 5 y 10 minutos. En algunas realizaciones, la jaula tiene una longitud interna que está entre al menos diez veces y al menos 20 veces su diámetro interno. En algunos casos, la energía consumida por un dispositivo no aumenta en más del 10% cuando está completamente cargada con biomasa microbiana en relación con el funcionamiento en vacío. En algunos casos, la presión a lo largo de la jaula no aumenta en más del 100% de la presión en el extremo del alimentador de la jaula por pie lineal de la jaula entre el alimentador y los extremos del estrangulador de la jaula.

[0027] En algunas realizaciones, el método comprende además peletizar la biomasa agotada de reducido contenido de aceite o la extrusión de la biomasa agotada de reducido contenido de aceite como un pastel. En algunas realizaciones, el método comprende además extraer lípidos de la biomasa gastada de contenido reducido de aceite. En algunos casos, el contenido de lípidos en la biomasa gastada de contenido reducido de aceite es al menos un 45 por ciento menor que el contenido de lípidos de la biomasa microbiana antes de someterla a presión. En algunas realizaciones, el método comprende además extraer lípidos de la biomasa gastada de contenido reducido de aceite con un disolvente orgánico.

[0028] En algunos casos, el método comprende ajustar el contenido de humedad de la biomasa microbiana a entre 1,0% y 2,0% en peso antes de someter la biomasa microbiana a la presión. En algunas realizaciones, el ajuste se logra acondicionando la biomasa con calor. En algunos casos, el acondicionamiento con calor se realiza utilizando una acondicionadora vertical apilada.

[0029] En algunas realizaciones, el método comprende además el acondicionamiento de la biomasa para cambiar sus propiedades físicas o fisioquímicas sin liberar más del 5% de los lípidos para facilitar la liberación de los lípidos en una etapa posterior en el que la biomasa se somete a presión. En algunos casos, la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa a 66-149°C (150-300°F). En algunos casos, la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa a 93-132°C (200-270°F). En algunos casos, la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa a 99-127°C (210-260°F). En algunas realizaciones, la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa durante un período de tiempo entre 20 y 60 minutos. En algunas realizaciones, la etapa de acondicionamiento comprende someter la biomasa a una primera presión que no libera más del 5% de los lípidos en la biomasa.

[0030] En algunas realizaciones, el método comprende además el tratamiento de la biomasa con un expansor o extrusora sin liberar más del 5% de los lípidos en la biomasa antes del paso de someter la biomasa a la presión suficiente para liberar más de 5% de los lípidos.

[0031] En algunas realizaciones, el método comprende además la adición de un agente de carga a la biomasa microbiana para facilitar la liberación de los lípidos cuando la biomasa microbiana se somete a presión. En algunos casos, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en hierba de cambio, cáscaras de soja, romero seco, rastrojo de maíz, celulosa, biomasa gastada de contenido lipídico reducido y bagazo de caña de azúcar. En algunos casos, el agente de carga se gasta biomasa microbiana de contenido lipídico reducido que comprende entre 40% y 90% de polisacárido y menos de 10% de aceite. En algunos casos, el agente de carga es biomasa microbiana de contenido lipídico reducido que comprende entre 60% y 80% de polisacárido y menos de 10% de aceite. En algunos casos, el agente de carga se gasta biomasa microbiana de la misma cepa que la biomasa microbiana. En algunas realizaciones, el polisacárido es de 20-30 por ciento en moles de galactosa; 55-65% en moles por ciento de glucosa; y 5-15 por ciento en moles de manosa. En algunos casos, la biomasa gastada de contenido reducido de lípidos proviene de microalgas del género Chlorella, Parachlorella o Prototheca. En algunas realizaciones, el agente de carga tiene un tamaño de partícula promedio de menos de 1,5 mm. En algunos casos, el agente de carga tiene un tamaño de partícula promedio de entre 150-350 micras. En algunos casos, el agente de carga se agrega a la biomasa microbiana antes de una etapa de deshidratación de la biomasa microbiana a un contenido de humedad de menos del 6%.

[0032] En algunas realizaciones de la presente invención, la biomasa microbiana es de microalgas. En algunos casos, las microalgas se seleccionan de las especies enumeradas en la Tabla 1. En algunos casos, las microalgas son del género Chlorella, Parachlorella o Prototheca. En algunas realizaciones, la microalga tiene una secuencia genómica de ARNr 23S con al menos 75%, 85% o 95% de identidad de nucleótidos con uno o más de las SEQ ID NO: 1-23 o 26-34.

[0033] En algunas realizaciones de la presente invención, la biomasa microbiana es una bacteria. En algunos casos, la bacteria es del género Rhodococcus.

[0034] En algunas realizaciones de la presente invención, la biomasa microbiana es una levadura oleaginosa. En algunos casos, la levadura oleaginosa se selecciona de las especies enumeradas en la Tabla 2. En algunos casos, la levadura oleaginosa es Rhodotorula glutinis. En algunas realizaciones, la levadura oleaginosa tiene una secuencia genómica de ARNr 18S y 26S fúngica con al menos 75%, 85% o 95% de identidad de nucleótidos con una o más de las SEQ ID NO: 37-76. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana es una levadura oleaginosa del género Torulaspora o Yarrowia.

[0035] En algunas realizaciones de la presente invención, la biomasa microbiana es hongos oleaginosos no de levadura. En algunos casos, los hongos oleaginosos no levadura se seleccionan entre las especies enumeradas en la Tabla 3.

[0036] En algunas realizaciones, la biomasa microbiana contiene al menos 45% de lípidos en peso celular seco. En algunos casos, la biomasa microbiana tiene al menos 15% de carbohidratos en peso seco. En algunos casos, la biomasa microbiana se deriva de microalgas que tienen un perfil de ácidos grasos de: menos del 2% de C14: 0; aproximadamente 13-16% C16: 0; aproximadamente 1-4% de C18: 0; aproximadamente 64-71% de C18: 1; aproximadamente 10-15% de C18: 2; aproximadamente 0,5-2% de C18: 3; y menos del 1% de longitud de cadena de carbono de 20 o más. En algunos casos, las microalgas tienen un perfil lipídico de ácidos grasos que comprende al menos 15% de ácidos grasos C: 16, al menos 50% de ácidos grasos C18: 1, al menos 7% de ácidos grasos C18: 2 y menos del 3% de C10:0-C14: 0 ácidos grasos. En algunos casos, las microalgas tienen un perfil de ácidos grasos de: aproximadamente 1-2% C14: 0; aproximadamente 16-26% C16: 0; aproximadamente 2-6% de C18: 0; aproximadamente 58-68% de C18: 1; y aproximadamente 7-11% de C18: 2. En algunas realizaciones, la microalga tiene un perfil lipídico que comprende al menos 4% de C8-C14 y contiene un gen exógeno que codifica una tioesterasa con preferencia por una o más longitudes de cadena de ácido graso de 8, 10, 12 y 14 átomos de carbono. En algunos casos, las microalgas tienen un perfil lipídico que comprende entre 10 y 40% de C8-C14. En algunos casos, la biomasa microbiana tiene un perfil lipídico que comprende al menos 10% 16: 1. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana contiene al menos 30% de lípidos en peso. En algunos casos, la biomasa microbiana contiene al menos 40% de lípidos en peso. En algunos casos, la biomasa microbiana contiene al menos 50% de lípidos en peso. En algunos casos, la biomasa microbiana contiene entre 60-70% de lípidos en peso.

[0037] En algunas realizaciones, el lípido extraído tiene menos de 0,01 miligramo de clorofila por kilogramo de lípidos. En algunos casos, el lípido extraído tiene entre 0,2 y 0,3 microgramos de carotenoides por mililitro de lípido.

[0038] En algunas realizaciones, la biomasa microbiana contiene un gen exógeno que codifica una invertasa de sacarosa.

[0039] En algunas realizaciones, la biomasa microbiana ha sido sometido a una etapa de secado neumático antes de la aplicación de presión.

[0040] En algunas realizaciones, los lípidos extraídos comprenden uno o más de los siguientes: cloruro de no más de 8 ppm, no más de 2 ppm de fósforo, no más de 26 ppm de potasio, no más de 12 ppm de sodio y no más de 5 ppm de azufre.

[0041] En otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método de preparación de biomasa microbiana hidratado para la extracción de aceite. En una realización, el método comprende agregar un agente de carga a la biomasa y secar el agente de carga y la biomasa juntos hasta un contenido de humedad de menos del 6%, formando así una mezcla seca de agente de carga-biomasa. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana hidratada está contenida en un caldo de fermentación que no ha sido sometido a procesos de separación o eliminación de agua. En algunos casos, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en hierba de cambio, cáscaras de soja, romero seco, rastrojo de maíz, celulosa, biomasa gastada de contenido lipídico reducido y bagazo de caña de azúcar. En algunos casos, el agente de carga es biomasa gastada de contenido lipídico reducido que comprende entre 40% y 90% de polisacárido y menos de 10% de aceite.

[0042] En aún otro aspecto, la presente invención está dirigida a un método para extraer lípidos a partir de biomasa microbiana. En una realización, el método comprende (a) secar conjuntamente biomasa microbiana hidratada que constituye al menos un 20% en peso de lípidos y un agente de carga, formando así una mezcla seca de agente de carga-biomasa, (b) acondicionar la mezcla seca de agente de carga-biomasa para que el contenido de humedad sea del 0,5% al 2,5% en peso, y (c) someter a presión la mezcla de agente de carga seca y biomasa acondicionada, por lo que las células de la biomasa se lisan, liberando más del 5% de los lípidos y quedando gastados biomasa de contenido lipídico reducido. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana hidratada está contenida en un caldo de fermentación que no ha sido sometido a procesos de separación o eliminación de agua. En algunos casos, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en hierba de cambio, cáscaras de soja, romero seco, rastrojo de maíz, celulosa, biomasa gastada de contenido lipídico reducido y bagazo de caña de azúcar. En algunos casos, el agente de carga es biomasa gastada de contenido lipídico reducido que comprende entre 40% y 90% de polisacárido y menos de 10% de aceite.

[0043] En otro aspecto más, la presente invención está dirigida a un método para aumentar el rendimiento en la extracción de lípidos a partir de biomasa microbiana que constituye al menos 20% de lípidos en peso. En una realización, el método comprende secar conjuntamente la biomasa microbiana con un agente de carga, por lo que la cantidad de aceite extraído de la biomasa microbiana y el agente de carga secada cuando se somete a presión es mayor que sin la adición del agente de carga. En algunos casos, la biomasa microbiana se deriva de un cultivo que se cultivó a través de un proceso seleccionado del grupo que consiste en un proceso heterotrófico, un proceso fotoautotrófico y un proceso mixotrófico.

[0044] Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se describen en los dibujos adjuntos, una breve descripción de los cuales sigue inmediatamente, y en la descripción detallada de la invención a continuación, y se ejemplifican en los ejemplos siguientes. Cualquiera o todas las características discutidas anteriormente y a lo largo de la aplicación se pueden combinar en diversas realizaciones de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0045]

La figura 1a muestra la biomasa de microalgas después de que la humedad de la superficie se haya eliminado mediante secado en tambor.

La Figura 1b muestra la biomasa de microalgas después de ser acondicionada usando una "pre-prensa" de baja presión para formar pinzas.

La Figura 2a muestra la torta prensada gastada de biomasa microbiana que es de baja calidad para la extracción posterior con solvente.

La Figura 2b muestra la torta prensada gastada de biomasa microbiana que es de buena calidad para la posterior extracción con solvente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0046] La presente invención proporciona métodos para la extracción de lípidos a partir de microorganismos. Esta descripción detallada de la invención se divide en secciones para la conveniencia del lector, comenzando con la sección I, que proporciona definiciones de varios términos utilizados para describir la invención. La Sección II describe los métodos de la invención para extraer aceite de microorganismos, para preparar biomasa microbiana para la extracción de aceite y para procesar adicionalmente la biomasa gastada. La Sección III describe los microorganismos útiles para generar biomasa microbiana que contiene aceite y los métodos para cultivarlos para producir aceite. La sección V proporciona ejemplos ilustrativos de cómo practicar los métodos de la invención.

I. DEFINICIONES

[0047] A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan un experto en la materia a la que esta invención pertenece con definiciones generales de muchos de los términos utilizados en esta divulgación: Singleton et al, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2a ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Ed. Walker, 1988); Glossary of Genetics, 5a Ed, R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en este documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen, a menos que se especifique lo contrario.

[0048] "Porcentaje de Area" se refiere al área de los picos observados usando métodos de detección de FAME GC/FID en donde cada ácido graso en la muestra se convierte en un éster metílico de ácido graso (FAME) antes de la detección. Por ejemplo, se observa un pico separado para un ácido graso de 14 átomos de carbono sin insaturación (C14: 0) en comparación con cualquier otro ácido graso como C14: 1. El área del pico para cada clase de FAME es directamente proporcional a su composición porcentual en la mezcla y se calcula en función de la suma de todos los picos presentes en la muestra (es decir, [área bajo el pico específico/área total de todos los picos medidos] X 100). Cuando se hace referencia a los perfiles lipídicos de aceites y células de la invención, "al menos 4% C8-C14" significa que al menos 4% de los ácidos grasos totales en la célula o en la composición de glicerolípidos extraídos tienen una longitud de cadena que incluye 8, 10, 12 o 14 átomos de carbono.

[0049] "Axénico" se refiere a un cultivo de un organismo que está libre de contaminación por otros organismos vivos.

[0050] "Biomasa" se refiere a material producido por el crecimiento y/o propagación de células. La biomasa puede contener células y/o contenidos intracelulares, así como material extracelular. El material extracelular incluye, pero no se limita a, compuestos secretados por una célula.

[0051] "Biorreactor" se refiere a un recinto o recinto parcial en el que las células, p. ej., se cultivan microorganismos, opcionalmente en suspensión.

[0052] El "agente de carga" y el "auxiliar de prensa" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a material que es adecuado para añadir a la materia prima (tal como biomasa seca y/o acondicionada) para aumentar el contenido de fibra de la materia prima. Los agentes de carga incluyen, pero no se limitan a, hierba de cambio, cáscaras de soja, biomasa gastada y bagazo de caña de azúcar. Los agentes de carga facilitan la liberación de lípidos (aceite) de la biomasa, tal vez al aumentar la uniformidad con la que se puede aplicar presión a las células componentes de la biomasa. En algunos casos, una ayuda de prensa también puede actuar como ayuda de filtro, aclarando o reduciendo la cantidad de pies que se extrae con el aceite. Un ejemplo de una ayuda de prensa que también actúa como ayuda de filtro es la celulosa.

[0053] "Material celulósico" significa los productos de la digestión de la celulosa, incluyendo la glucosa, xilosa, disacáridos, oligosacáridos, lignina y otras moléculas.

[0054] La "materia prima acondicionada" es biomasa microbiana seca que contiene aceite que ha sido alterada físicamente de alguna manera después de secarse, típicamente sin liberar más del 5% del aceite total de la biomasa y calentada a una temperatura en el rango de 70°C.°C a 150°C (160°F a 300°F). Como se usa en este contexto, la sustancia a la que se refieren "liberar" y "expulsar" es el aceite. Los ejemplos de acondicionamiento incluyen poner la biomasa microbiana seca que contiene aceite a través de un acondicionador apilado vertical, un expansor, un extrusor o un expulsor; y/o someter la biomasa microbiana seca que contiene aceite a la descamación, agrietamiento, fresado, trituración, calentamiento, vaporización, acondicionamiento térmico, baja presión, alta presión y otros métodos para cambiar la naturaleza física del microbiano seco que contiene aceite. biomasa para maximizar la extracción de aceite utilizando métodos de extracción no químicos o sin solventes. Los cambios que ocurren al someter la biomasa microbiana seca que contiene aceite al acondicionamiento incluyen cambios a escala de micras, como paredes celulares rotas, así como cambios a escala macro, como la conversión de escamas secas en gránulos sin liberar aceite a baja presión.

[0055] "Comida delipidada" y "biomasa microbiana delipidada" se refieren a la biomasa microbiana después de extraer el aceite (incluido el lípido), ya sea mediante el uso de una prensa de expulsión o extracción con disolvente o ambos.

[0056] "Secado hacia atrás" se refiere al proceso de agregar torta prensada (también denominada en el presente documento biomasa gastada) nuevamente en el extremo de alimentación de la prensa donde se mezcla con biomasa no prensada. Esencialmente, la torta prensada está actuando como un agente de carga o ayuda de prensa para el material no comprimido. El aceite residual en la torta prensada puede recuperarse más junto con el aceite de la biomasa sin comprimir utilizando este proceso.

[0057] El "peso de la célula seca" se refiere al peso de la biomasa microbiana una vez que se ha eliminado todo o sustancialmente todo el agua (humedad) de la misma.

[0058] La "biomasa microbiana seca" se refiere a la biomasa microbiana de la que se ha eliminado la humedad libre o la humedad de la superficie, generalmente de modo que la biomasa microbiana contenga menos del 10%, y a menudo menos del 6%, de humedad en peso. En una realización, la biomasa microbiana seca se deriva de microalgas. En una realización, la biomasa microbiana seca se deriva de microalgas que contienen al menos 20% de lípidos por peso de células secas después del secado.

[0059] El "expansor" se refiere a un extrusor de bajo cizallamiento que calienta, homogeneiza y/o forma semillas oleaginosas y otros materiales que contienen aceite en pastillas o gránulos porosos con una alta densidad aparente. En una realización de un proceso mediado por expansor, se inyecta vapor en escamas/tortas de semillas oleaginosas o material que contiene aceite a presión, y esta mezcla se extruye a través de placas a la atmósfera. Las pinzas se expanden cuando se liberan a la atmósfera, de ahí el nombre expansor. Históricamente, el expansor se ha utilizado para preparar recolectores derivados de semillas de plantas/semillas oleaginosas para la extracción con solventes debido a la mayor densidad aparente de los recolectores después del tratamiento con el expansor, lo que permite una mayor superficie y una mayor eficiencia en la extracción con solventes.

[0060] "Prensa de expulsión" significa una prensa de tornillo o expulsor continuo que se utiliza para la extracción mecánica de semillas oleaginosas, como por ejemplo, soja y colza/canola. La materia prima que contiene aceite (como las semillas oleaginosas) se alimenta a la máquina en un extremo y el material está sujeto a la fricción y a la alta presión del accionamiento del tornillo que mueve el material a lo largo de un eje. El aceite se libera y se filtra a través de pequeñas aberturas a lo largo del eje y los sólidos (con contenido de aceite reducido) se expulsan al final del eje como una torta prensada. Los ejemplos de prensas de expulsores/tornillos incluyen los que comercializa Anderson International Corp. (Cleveland, OH), Alloco (Santa Fe, Argentina), De Smet Rosedowns (Humberside, Reino Unido), The Dupps Co. (Germantown, Ohio), Grupo Tecnal (Sao Paulo, Brasil), Insta Pro (Des Moines, lowa), Harburg Freudenberger (anteriormente Krupp Extraktionstechnik) (Hamburgo, Alemania), French Oil Mill Machinery Company (Piqua, OH), Maschinenfabrik Reinartz (Neuss, Alemania), Shann Consultoría (Nueva Gales del Sur, Australia) y SKET (Magdeburgo, Alemania).

[0061] "Fibra" significa los carbohidratos complejos de plantas y otras fuentes que contienen fibra tales como microorganismos que no pueden ser digeridos por humanos. Los carbohidratos complejos que se encuentran en la fibra pueden incluir celulosa, hemicelulosa y lignina, dextrinas, pectinas, beta-glucanos y oligosacáridos.

[0062] "Fuente de carbono fija" se refiere a las moléculas que contienen carbono, típicamente moléculas orgánicas, que están presentes a temperatura y presión ambiente en forma sólida o líquida durante una fermentación.

[0063] "Biomasa microbiana hidratada" significa biomasa microbiana que contiene al menos 10% de contenido de humedad que está en un líquido. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana hidratada está contenida en un caldo de fermentación que no ha sido sometido a procesos de separación o eliminación de agua.

[0064] "hidrocarburo" se refiere a: (a) una molécula que contiene solamente átomos de hidrógeno y de carbono, en el que los átomos de carbono están unidos covalentemente para formar un esqueleto lineal, ramificado, cíclico o parcialmente cíclico al que los átomos de hidrógeno están unidos; o (b) una molécula que contiene principalmente átomos de hidrógeno y carbono que pueden convertirse para contener solo átomos de hidrógeno y carbono mediante una a cuatro reacciones químicas. Ejemplos no limitativos de este último incluyen hidrocarburos que contienen un átomo de oxígeno entre un átomo de carbono y un átomo de hidrógeno para formar una molécula de alcohol, así como aldehídos que contienen un átomo de oxígeno. Los métodos para la reducción de alcoholes a hidrocarburos que contienen solo átomos de carbono e hidrógeno son bien conocidos. Otro ejemplo de un hidrocarburo es un éster, en el que un grupo orgánico reemplaza un átomo de hidrógeno (o más de uno) en un ácido de oxígeno. La estructura molecular de los compuestos de hidrocarburos varía desde la más simple, en forma de metano (CH4), que es un componente del gas natural, hasta la muy grande y compleja, como los asfaltenos que se encuentran en el aceite crudo, el aceite y los betunes. Los hidrocarburos pueden estar en forma gaseosa, líquida o sólida, o cualquier combinación de estas formas, y pueden tener uno o más enlaces dobles o triples entre átomos de carbono adyacentes en la cadena principal. Por consiguiente, el término incluye alcanos, alquenos, lípidos y parafina lineales, ramificados, cíclicos o parcialmente cíclicos. Los ejemplos incluyen propano, butano, pentano, hexano, octano, escualeno y carotenoides.

[0065] La "relación hidrógeno:carbono" se refiere a la relación de átomos de hidrógeno a átomos de carbono en una molécula en una base de átomo a átomo. La relación también puede usarse para referirse al número de átomos de carbono e hidrógeno en una molécula de hidrocarburo. Por ejemplo, el hidrocarburo con la relación más alta es metano, CH⁴(4:1).

[0066] La "fracción hidrófoba" se refiere a una porción, o fracción, de un material que es más soluble en una fase hidrófoba en comparación con una fase acuosa. Una fracción hidrófoba es sustancialmente insoluble en agua y generalmente no polar.

[0067] La frase "aumento de producción de lípidos" se refiere a un aumento en la productividad de un cultivo microbiano, por ejemplo, el aumento de peso seco de células por litro de cultivo, aumentando el porcentaje de lípidos en las células y/o el porcentaje de células que constituyen lípidos, y/o aumentan la cantidad total de lípidos por volumen de cultivo por unidad de tiempo.

[0068] La frase "la limitación de la concentración de un nutriente" se refiere a una concentración de nutriente en un cultivo que limita la propagación de un organismo cultivado. Una "concentración no limitante de un nutriente" es una concentración que soporta la propagación máxima durante un período de cultivo dado. Por lo tanto, el número de células producidas durante un período de cultivo dado es menor en presencia de una concentración limitante de un nutriente que cuando el nutriente no es limitante. Se dice que un nutriente está "en exceso" en un cultivo, cuando el nutriente está presente en una concentración mayor que la que soporta la propagación máxima.

[0069] "Lípido" se refiere a una molécula lipofílica de un organismo biológico. Las funciones biológicas de un lípido incluyen, pero no se limitan a, almacenar energía, servir como un componente estructural de una membrana celular y actuar como una molécula de señalización. Las moléculas de lípidos son solubles en solventes no polares (como éter y cloroformo) y son relativamente o completamente insolubles en agua. Las moléculas de lípidos tienen estas propiedades, ya que consisten principalmente en cadenas de hidrocarburos relativamente largas que son de naturaleza hidrófoba. Los ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos (saturados e insaturados); glicéridos o glicerolípidos (tales como monoglicéridos, diglicéridos, triglicéridos y grasas neutras, y fosfoglicéridos o glicerofosfolípidos); no glicéridos (esfingolípidos, lípidos de esteroles, incluyendo colesterol y hormonas esteroides, lípidos prenol, incluidos terpenoides, ceras y policétidos); y derivados de lípidos complejos (lípidos ligados al azúcar, o glicolípidos, y lípidos ligados a proteínas). Otros ejemplos de lípidos incluyen ácidos grasos libres; ésteres de ácidos grasos; esteroles; pigmentos (p. ej, carotenoides y oxicarotenoides), fitoesteroles, ergotionina, ácido lipoico, antioxidantes que incluyen betacaroteno y tocoferol. También se incluyen en la clase de lípidos los ácidos grasos poliinsaturados como el ácido araquidónico, el ácido estearidónico, el colesterol, el desmesterol, la astaxantina, la cantaxantina y los ácidos grasos altamente saturados n-6 y n-3, como el ácido eicosapentaenoico (EPA), el ácido docosapentaenoico, y ácido docosahexaenoico (DHA). El aceite microbiano, como se usa en el presente documento, se refiere a lípidos.

[0070] La frase "lípido: composición con disolvente orgánico" se refiere a una mezcla de lípidos y disolvente orgánico.

[0071] "Lisado" se refiere a haber roto la membrana celular o plasmática y opcionalmente la pared celular de un organismo biológico o celular, y liberando al menos algo de contenido intracelular en el entorno extracelular. "Lisis" se refiere a la rotura de la membrana celular o plasmática y, opcionalmente, de la pared celular de un organismo biológico suficiente para liberar al menos algo de contenido intracelular en el entorno extracelular, a menudo por medios mecánicos, virales, osmóticos o mecanismos de variación de temperatura que comprometen su integridad. "Lisar" se refiere a la ruptura de la membrana celular o plasmática y, opcionalmente, la pared celular de un organismo biológico o célula suficiente para liberar al menos algo de contenido intracelular en el entorno extracelular.

[0072] "Microalgas" se refiere a un organismo microbiano que contiene un cloroplasto, y opcionalmente que es capaz de realizar la fotosíntesis. Las microalgas incluyen fotoautótrofos obligados, que no pueden metabolizar una fuente fija de carbono como energía, así como heterótrofos, que pueden vivir únicamente de una fuente fija de carbono. Las microalgas pueden referirse a organismos unicelulares que se separan de las células hermanas poco después de la división celular, como Chlamydomonas, y a microbios como, por ejemplo, Volvox, que es un microbio fotosintético multicelular simple de dos tipos de células distintas. "Microalgas" también puede referirse a células como Chlorella y Dunaliella. Las "microalgas" también incluyen otros organismos fotosintéticos microbianos que exhiben adhesión de célula a célula, como Agmenellum, Anabaena y Pyrobotrys. Las "microalgas" también incluyen microorganismos heterotróficos obligados que han perdido la capacidad de realizar la fotosíntesis, como ciertas especies de dinoflagelados y especies del género Prototheca.

[0073] La "biomasa microbiana" se refiere a la biomasa derivada de un microbio.

[0074] "Microorganismo" y "microbio" se usan indistintamente aquí y se refieren a organismos unicelulares microscópicos.

[0075] "Aceite" se refiere a una sustancia que contiene carbono hidrófobo, lipófilo, no polar, que incluye pero no se limita a aceite crudo derivado ológicamente, fracciones destiladas de aceite crudo derivado geológicamente, hidrocarburos, aceite vegetal, aceite de algas y lípidos microbianos.

[0076] La "levadura oleaginosa" se refiere a una levadura que puede acumular más del 20% de su peso de células secas como lípidos. La levadura oleaginosa incluye organismos como Yarrowia lipolytica y otras especies del subdominio Dikarya de hongos como Rhodosporidium toruloides (Eukaryota; Fungi/Metazoa group; Fungi; Dikarya; Basidiomycota; Pucciniomycotina; Microbotryomycetes; Sporidiobolaium; Rhodosporidium); Rhodosporidolium; Rhodosporboidium; Rhodosporidol; Rhodotorula glutinis (Eukaryota; grupo Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Basidiomycota; Pucciniomycotina; Microbotryomycetes; Sporidiobolales; Sporidiobolales mitospóricos; Rhodotorula); Lipomyces tetrasporus (Eukaryota; grupo Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Ascomycota; Saccharomyceta; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Lipomycetaceae; Lipomyces); Cryptococcus curvatus (eucariota; grupo Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Tremellomycetes; Tremellales; Tremellales mitospóricos; Cryptococcus); Trichosporon domesticum (Eukaryota; grupo Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Basidiomycota; Agaricomycotina; Tremellomycetes; Tremellales; Tremellales mitospóricos; Trichosporon); Yarrowia lipolytica (Eucariota; grupo Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Ascomicota; Saccharomyceta; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Dipodascaceae; Yarrowia); Sporobolomyces alborubescens (Eukaryota; grupo de Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Basidiomycota; Pucciniomycotina; Microbotryomycetes; Sporidiobolales; Mitosporic Sporidiobolales; Sporobolomyces); Geotrichum vulgare (Eucariontes; grupo de Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Ascomycota; Saccharomyceta; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Dipodascaceae; Dipodascaceae mitospórico; Geotrichum): y Torulaspora delbrueckii (Eucariontes; grupo Hongos/Metazoos; Hongos; Dikarya; Ascomycota; Saccharomyceta; Saccharomycotina; Saccharomycetes; Saccharomycetales; Saccharomycetaceae; Torulaspora). dentro de Dikarya, la invención incluye el uso de organismos de todos los subdominios de Dikarya (Ascomycota y Basidiomycota) y subclasificaciones taxonómicas dentro de Ascomycota y Basidiomycota.

[0077] El "disolvente orgánico" se refiere a un material que contiene carbono que disuelve un soluto sólido, líquido o gaseoso, dando como resultado una solución.

[0078] El "fotobiorreactor" se refiere a un recipiente, al menos parte del cual es al menos parcialmente transparente o parcialmente abierto, permitiendo así que pase la luz, en el que, por ejemplo, se cultivan una o más células de microalgas. Los fotobiorreactores pueden estar cerrados, como en el caso de una bolsa de polietileno o matraz Erlenmeyer, o pueden estar abiertos al medio ambiente, como en el caso de un estanque al aire libre.

[0079] El "polisacárido" (también llamado "glicano") se refiere a los carbohidratos formados por monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. La celulosa es un ejemplo de un polisacárido que forma ciertas paredes celulares de las plantas. La celulosa puede ser despolimerizada por enzimas para producir monosacáridos como xilosa y glucosa, así como disacáridos y oligosacáridos más grandes. Otros ejemplos de polisacáridos incluyen fibra, fibra dietética soluble e insoluble, hemicelulosa y el carbohidrato de las paredes celulares microbianas, como el contenido en la biomasa gastada.

[0080] La "enzima que degrada el polisacárido" se refiere a cualquier enzima capaz de catalizar la hidrólisis, o la despolimerización, de cualquier polisacárido. Por ejemplo, la celulosa cataliza la hidrólisis de la celulosa.

[0081] "Puerto", en el contexto de un biorreactor, se refiere a una abertura en el biorreactor que permite la entrada o salida de materiales tales como gases, líquidos y células. Los puertos generalmente están conectados a tubos que salen del fotobiorreactor.

[0082] El "prensado" se refiere a la aplicación de presión suficiente para forzar el aceite intracelular de la biomasa microbiana, que también puede denominarse en este documento como un "paso de prensado". El prensado puede ser suficiente para lisar todas o sustancialmente todas las células en la biomasa microbiana.

[0083] "Biomasa gastada", "biomasa microbiana gastada" y "torta prensada" se refieren a biomasa microbiana que se ha convertido en materia prima acondicionada y luego se ha sometido a alta presión para que el material resultante tenga menos contenido de lípidos en aw/w base que la materia prima condicionada de la que se deriva. Se puede lograr una alta presión mediante el uso de presión de compresión, como la proporcionada por máquinas como una prensa de expulsión, un expulsor de aceite de tornillo, y una prensa mecánica, así como por presión hidráulica directa y otros procesos para que el aceite se extraiga del material de alimentación acondicionado. En una realización, la biomasa microbiana gastada se prepara haciendo pasar biomasa microbiana que contiene aceite a través de una prensa de semillas oleaginosas. En una realización, la biomasa microbiana gastada es biomasa de microalgas que tiene menos del 30% de aceite por peso de células secas

[0084] "Adecuado para la alimentación animal" significa que una sustancia o material puede ser consumido sin efecto perjudicial por un animal, típicamente un mamífero no humano de interés agrícola o veterinario, incluyendo, pero no limitado a caballos, ganado vacuno, cerdos, pollos, perros y gatos; En realizaciones preferidas, un material adecuado para alimentación animal proporciona nutrición al animal.

II. MÉTODOS PARA EXTRACTAR ACEITE DE MICROORGANISMOS

[0085] En un aspecto, la presente invención proporciona métodos para extraer, recuperar, aislar, o la obtención de otra forma de aceite (lípidos) a partir de microorganismos. Los métodos de la presente invención son aplicables a la extracción de una variedad de lípidos de una variedad de microorganismos. En los métodos de la presente invención, el microorganismo productor de lípidos (p. ej., una microalga) se cultiva primero en condiciones que permitan que la producción de lípidos genere biomasa microbiana que contiene aceite. La biomasa que contiene aceite se mezcla, dependiendo del método empleado, opcionalmente con un agente de carga, y se seca y acondiciona para preparar una materia prima seca y acondicionada que luego se prensa para extraer el aceite. Para conveniencia del lector, esta discusión se divide en subsecciones.

[0086] La subsección A describe la biomasa microbiana adecuada para la extracción de aceite de acuerdo con los métodos de la invención. La subsección B describe los métodos para eliminar el agua de la biomasa, incluidos el desagüe y el secado. La subsección C describe métodos para acondicionar la biomasa. La subsección D describe los agentes de carga (ayudas de prensa) y su uso con biomasa microbiana seca, biomasa microbiana hidratada y materia prima acondicionada. La subsección E describe varios métodos para someter los piensos acondicionados a presión para extraer aceite (el paso de prensado). La subsección F describe el aceite producido por la etapa de prensado y los métodos para su uso y posterior purificación. La subsección G describe la biomasa gastada de contenido reducido de aceite producida por la etapa de prensado y los métodos para su uso.

Biomasa adecuada

[0087] Mientras que la biomasa a partir de una amplia variedad de microbios, incluyendo microalgas, bacterias oleaginosas, levadura oleaginosa y hongos (véase la Sección III, a continuación), se pueden emplear en los métodos de la invención, la biomasa microbiana adecuados para uso en los métodos descritos en el presente documento típicamente comprende al menos 20% de aceite por peso de células secas. En algunas realizaciones, la biomasa comprende aceite en un intervalo de al menos 25% a al menos 60% o más de aceite por peso de células secas. En algunas realizaciones, la biomasa contiene de 15 a 90% de aceite, de 25 a 85% de aceite, de 40 a 80% de aceite o de 50 a 75% de aceite en peso de células secas. En diversas realizaciones de la invención, la biomasa microbiana (seca o hidratada) o materia prima acondicionada contiene al menos 25% en peso de aceite. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca o materia prima acondicionada contiene al menos 25% de lípidos en peso o en peso de células secas. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca o los piensos acondicionados contienen al menos 40%, al menos 50% o al menos 75% de lípidos en peso o en peso de células secas. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca o materia prima acondicionada contiene al menos 15% de carbohidratos en peso o en peso de células secas.

[0088] El aceite de la biomasa descrito aquí, o extraído de la biomasa para uso en los métodos y composiciones de la presente invención puede comprender glicerolípidos con una o más distintas cadenas laterales de éster de ácido graso. Los glicerolípidos están compuestos por una molécula de glicerol esterificada a una, dos o tres moléculas de ácido graso, que pueden tener diferentes longitudes y tener diferentes grados de saturación. La longitud y las características de saturación de las moléculas de ácido graso (y, por lo tanto, el aceite) pueden manipularse para modificar las propiedades o proporciones de las moléculas de ácido graso en el aceite de la presente invención mediante condiciones de cultivo o mediante ingeniería de la ruta de los lípidos, como se describe en este documento (véanse también las solicitudes de patente PCT números US09/066141 y US09/066142). Por lo tanto, se pueden preparar mezclas específicas de aceite de algas dentro de una sola especie de microalgas (u otro microbio), o mezclando juntas la biomasa o el aceite de algas de dos o más especies de microalgas (u otro microbio).

[0089] La composición de aceite, es decir, las propiedades y las proporciones de los constituyentes de ácidos grasos de los glicerolípidos, también pueden ser manipulados mediante la combinación de la biomasa o aceite de al menos dos géneros distintos o especies de microbios, es decir, las microalgas. En algunas realizaciones, al menos dos de los distintos géneros o especies de microbios, es decir, microalgas, tienen diferentes perfiles de glicerolípidos. Las distintas especies (o géneros) de microbios se pueden cultivar juntas o por separado como se describe en este documento (para microalgas, típicamente en condiciones heterotróficas), para generar los aceites respectivos. Diferentes especies de microbios pueden contener diferentes porcentajes de distintos componentes de ácidos grasos en los glicerolípidos de la célula.

[0090] En diversas realizaciones, el aceite microbiano que consta primordialmente de aceite monoinsaturado. En algunos casos, el aceite es al menos 50% de aceite monoinsaturado en peso o volumen. En diversas realizaciones, el aceite es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, o al menos 80% o más de aceite monoinsaturado en peso o en volumen. En algunas realizaciones, el aceite comprende al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40% o al menos 50% o más de ácido oleico esterificado o ácido alfa-linolénico esterificado en peso o en volumen. En diversas realizaciones, el aceite comprende menos del 10%, menos del 5%, o menos del 1% en peso o en volumen, o está sustancialmente libre de ácido docosahexanoico esterificado (DHA).

[0091] En diversas realizaciones de este y otros aspectos de la invención, la biomasa se prepara por fermentación de un microbio que contiene 18: 1 ácido graso. En diversas realizaciones, el microbio tiene un perfil de ácido graso de menos del 1% de C14: 0; aproximadamente 10-11% de C16: 0; aproximadamente 3-4% de C18: 0; aproximadamente 70-71% de C18: 1; aproximadamente 14-15% de C18: 2; aproximadamente 1-2% de C18: 3; y menos del 1% de C20: 0. En diversas realizaciones, el microbio tiene un perfil de ácido graso de aproximadamente 1-2% de C14: 0; aproximadamente 20% de C16: 0; aproximadamente 4% de C18: 0; aproximadamente 64% de C18: 1; y aproximadamente 7-8% de C18: 2. En diversas realizaciones, el microbio tiene como máximo 0,5% de DHA. En estas y otras realizaciones, el microbio es, en algunos casos, una microalga.

[0092] Por lo tanto, una amplia variedad de biomasa microbiana es adecuada para uso en los métodos de la invención. De acuerdo con estos métodos, la biomasa que contiene aceite es típicamente deshidratada, secada, acondicionada y luego presionada para extraer el aceite.

B. Deshidratación y secado de la biomasa microbiana

[0093] Las diversas realizaciones de los métodos de la invención implican una o más etapas de eliminación de agua (u otros líquidos) de la biomasa microbiana. Estos pasos para eliminar el agua pueden incluir los distintos pasos a los que se hace referencia en este documento como deshidratación y secado.

[0094] La deshidratación, como se usa en el presente documento, se refiere a la separación del microbio que contiene aceite del caldo de fermentación (líquidos) en el que se cultivó. La deshidratación, si se realiza, debe realizarse mediante un método que no genere, o solo ocasione, una pérdida mínima en el contenido de aceite de la biomasa. En consecuencia, generalmente se tiene cuidado para evitar la lisis celular durante cualquier etapa de deshidratación. La deshidratación es una separación sólido-líquido e implica la eliminación de líquidos del material sólido. Los procesos comunes para el desagüe incluyen la centrifugación, filtración y/o el uso de presión mecánica.

[0095] La centrifugación es un proceso que implica el uso de fuerza centrífuga para la separación de mezclas. Los componentes más densos de la mezcla migran lejos del eje de la centrífuga, mientras que los componentes menos densos de la mezcla migran hacia el eje. Al aumentar la fuerza gravitacional efectiva (es decir, al aumentar la velocidad de centrifugación), el material más denso, generalmente sólido, se separa del material menos denso, generalmente líquido, según la densidad.

[0096] La biomasa microbiana útil en los métodos de la presente invención puede ser deshidratada del caldo de fermentación mediante el uso de centrifugación, para formar una pasta concentrada. Después de la centrifugación, todavía hay una cantidad sustancial de humedad superficial o libre en la biomasa microbiana (p. ej., más del 70%) y, por lo tanto, la centrifugación no se considera, para los fines de la presente invención, una etapa de secado. Opcionalmente, después de la centrifugación, la biomasa se puede lavar con una solución de lavado (p. ej., agua desionizada) para eliminar el caldo de fermentación restante y los desechos.

[0097] En algunas realizaciones, la deshidratación implica el uso de filtración. Un ejemplo de filtración que es adecuado para la presente invención es la filtración de flujo tangencial (TFF), también conocida como filtración de flujo cruzado. La filtración de flujo tangencial es una técnica de separación que utiliza sistemas de membrana y fuerza de flujo para purificar sólidos de líquidos. Para un método de filtración preferido, ver Geresh, Carb. Polym. 50; 183-189 (2002), que analiza el uso de un filtro de fibra hueca de 0,45 uM de tecnologías MaxCell A/G. Ver también, por ejemplo, dispositivos Millipore Pellicon®, utilizados con 100kD, 300kD, 1000 kD (número de catálogo P2C01MC01), 0,1 uM (número de catálogo P2VVPPV01), 0,22uM (número de catálogo P2GVPPV01) y membranas de 0,45uM (número de catálogo P2HVMPV01). El retenido no debe pasar a través del filtro a un nivel significativo. El retenido tampoco debe adherirse significativamente al material del filtro. TFF también se puede realizar utilizando sistemas de filtración de fibra hueca.

[0098] Los ejemplos no limitantes de filtración de flujo tangencial incluyen los que implican el uso de un filtro con un tamaño de poro de al menos aproximadamente 0,1 micrómetros, al menos aproximadamente 0,12 micrómetros, al menos aproximadamente 0,14 micrómetros, al menos aproximadamente 0,16 micrómetros, al menos aproximadamente 0,18 micrómetros, al menos aproximadamente 0,2 micrómetros, al menos aproximadamente 0,22 micrómetros, al menos aproximadamente 0,45 micrómetros o al menos aproximadamente 0,65 micrómetros. Los tamaños de poro preferidos de TFF permiten que fluyan los solutos y los desechos en el caldo de fermentación, pero no las células microbianas.

[0099] En otras realizaciones, la deshidratación implica el uso de presión mecánica aplicada directamente a la biomasa para separar el caldo de fermentación líquido de la biomasa microbiana. La cantidad de presión mecánica aplicada no debería causar la ruptura de un porcentaje significativo de las células microbianas, si eso resultara en la pérdida de aceite, sino que simplemente debería ser suficiente para deshidratar la biomasa al nivel deseado para el procesamiento posterior.

[0100] Un ejemplo no limitativo del uso de presión mecánica para deshidratar biomasa microbiana emplea la prensa de filtro de correa. Una prensa de filtro de correa es un dispositivo de deshidratación que aplica presión mecánica a una suspensión (p. ej., biomasa microbiana que proviene directamente del fermentador o biorreactor) que pasa entre las dos correas tensas a través de una serpentina de rodillos de diámetro decreciente. La prensa de filtro de correa se puede dividir en tres zonas: zona de gravedad, donde el agua/líquido de drenaje libre se drena por gravedad a través de una correa porosa; una zona de cuña, donde los sólidos se preparan para la aplicación de presión; y una zona de presión, donde se aplica presión ajustable a los sólidos drenados por gravedad.

[0101] Una o más de las técnicas de deshidratación anteriores se pueden usar solas o en combinación para deshidratar la biomasa microbiana para usar en la presente invención. La presente invención resulta en parte del descubrimiento de que el contenido de humedad de la biomasa microbiana (materia prima acondicionada) afecta dramáticamente el rendimiento del aceite obtenido en la etapa de prensado, y que el nivel óptimo de humedad, por debajo del 6% y preferiblemente por debajo del 2%, es bastante diferente de los niveles óptimos de humedad para extraer aceite de muchas semillas oleaginosas. Si bien el nivel de humedad óptimo puede variar según el tipo de semillas oleaginosas, y también pueden variar según el tipo de biomasa microbiana, el nivel óptimo de humedad para prensar biomasa microbiana es menor que el de las semillas oleaginosas. Por ejemplo, el contenido óptimo de humedad para prensar sésamo y linaza es de aproximadamente 4% (Willems et al, J. Food Engineering 89: 1, pp,8-16, 2008). El contenido óptimo de humedad para prensar semillas de crambe es entre 9,2 y 3,6% (Singh et al, JAOCS 79: 2, pp,165-170, 2006). El contenido óptimo de humedad para prensar las semillas de canola es de aproximadamente 5% (Vadke et al, JAOCS 65: 7, pp,1169-1176, 1988). El contenido óptimo de humedad para prensar el coco es de aproximadamente el 11% (Mpagalile et al, Int. J. Food Sciences and Nutrition, 56: 2, pp,125 - 132, 2005). Otros contenidos óptimos de humedad son 7% para colza, 6% para camelina, 8,5% para girasol, 11% para cártamo y 12% para soja (Alam, MS Noviembre 2007. Basics of Fats and Oils Chemistry: Factors Affecting Crude Oil Quality. Presentado al Vegetable Oils Extraction Short Course, Texas A&M Food Protein R&D Center, College Station, Téjas).

[0102] Por el contrario, el contenido de humedad óptimo para el prensado de la biomasa microbiana es de menos de 6% en peso, y más preferiblemente menos de 3%. Por ejemplo, el contenido óptimo de humedad puede ser 0,5-2% en peso. En diversas realizaciones, particularmente aquellas relacionadas con la extracción de aceite de biomasa microalgal, el contenido de humedad óptimo está en el rango de 0,5% a 2% del peso total de la biomasa microbiana. En una realización, el contenido de humedad está en el rango de 0,7% a 1,2% del peso total de la biomasa microbiana. En una realización, el contenido de humedad está en el intervalo de 1,0% a 2,0% del peso total de la biomasa microbiana. El nivel óptimo de humedad puede depender de varios factores, que incluyen, entre otros, el porcentaje de lípidos (aceite) medido por el peso de las células secas (DCW) o la cantidad de fibra y hemicelulosa en la biomasa. En algunas realizaciones de los métodos de la invención, tales como, por ejemplo, aquellos en los que se emplea un agente de carga (véase la subsección D), la deshidratación sola proporciona un contenido de humedad adecuado de la biomasa microbiana que luego se acondiciona antes del paso de prensado. En otros métodos y realizaciones de la invención, la biomasa deshidratada se somete a una etapa de secado y luego se acondiciona antes del paso de prensado (en la que se extrae el aceite de la biomasa).

[0103] El secado, como se menciona en el presente documento, se refiere a la eliminación de parte o la totalidad de la humedad libre o la humedad superficial de la biomasa microbiana. Al igual que la deshidratación, el proceso de secado no debe provocar una pérdida significativa de aceite de la biomasa microbiana. Por lo tanto, la etapa de secado normalmente no debería causar la lisis de un número significativo de células microbianas, porque en la mayoría de los casos, los lípidos se encuentran en compartimentos intracelulares de la biomasa microbiana. Varios métodos de secado de biomasa microbiana conocidos en la técnica para otros fines son adecuados para su uso en los métodos de la presente invención. La biomasa microbiana después de que se haya eliminado la humedad libre o la humedad superficial se conoce como biomasa microbiana seca.

[0104] En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca tiene un contenido de humedad en el intervalo de 0,1% a 5% en peso. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca tiene un contenido de humedad de menos del 4% en peso. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana seca tiene un contenido de humedad en el rango de 0,5% a 3,5% en peso. En diversas formas de realización, la biomasa microbiana seca tiene un contenido de humedad en el intervalo de 0,1% a 3% en peso. Ejemplos no limitativos de métodos de secado adecuados para su uso en la preparación de biomasa microbiana seca de acuerdo con los métodos de la invención incluyen liofilización y el uso de secadores tales como un secador de tambor, secador por pulverización y un secador de bandeja, cada uno de los cuales se describe a continuación.

[0105] La liofilización, también conocida como liofilización o criodicación, es un proceso de deshidratación que se usa típicamente para preservar un material perecedero. El proceso de liofilización implica la congelación del material y luego reducir la presión circundante y agregar suficiente calor para permitir que el agua congelada en el material se sublime desde la fase sólida hasta el gas. En el caso de la biomasa microbiana liofilizante, como la biomasa derivada de microalgas, la pared celular de las microalgas actúa como un crioprotector que evita la degradación de los lípidos intracelulares durante el proceso de liofilización.

[0106] Secadores de tambor son uno de los métodos más económicos para el secado de grandes cantidades de biomasa microbiana. Los secadores de tambor, o secadores de rodillos, consisten en dos grandes cilindros de acero que giran uno hacia el otro y se calientan desde el interior con vapor. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana se aplica al exterior de los cilindros grandes en láminas delgadas. A través del calor del vapor, la biomasa microbiana se seca, típicamente en menos de una revolución de los cilindros grandes, y la biomasa microbiana seca resultante se raspa de los cilindros con una cuchilla de acero. La biomasa microbiana seca resultante tiene una consistencia escamosa. En diversas realizaciones, la biomasa microbiana se deshidrata primero y luego se seca usando un secador de tambor. Se puede encontrar una descripción más detallada de un secador de tambor en la Patente de Estados Unidos N° 5,729,910, que describe un tambor de secado rotativo.

[0107] El secado por pulverización es un método comúnmente usado para secar una alimentación líquida usando un gas caliente. Un secador por pulverización toma una corriente de líquido (p. ej., que contiene la biomasa microbiana) y separa el soluto como un sólido y el líquido en un vapor. La corriente de entrada de líquido se rocía a través de una boquilla en una corriente de vapor caliente y se vaporiza. Se forman sólidos a medida que la humedad abandona rápidamente las gotas. La boquilla del secador por atomización es ajustable, y generalmente se ajusta para que las gotas sean lo más pequeñas posible para maximizar la transferencia de calor y la velocidad de vaporización del agua. Los sólidos secos resultantes pueden tener una consistencia fina y pulverulenta, dependiendo del tamaño de la boquilla utilizada. En otras realizaciones, los secadores por pulverización pueden usar un proceso de liofilización en lugar de calentamiento por vapor para secar el material.

[0108] Los secadores de bandejas se usan típicamente para trabajos de laboratorio y operaciones de secado a pequeña escala piloto. Los secadores de bandejas funcionan en función del calentamiento por convección y la evaporación. El caldo de fermentación que contiene la biomasa microbiana se puede secar eficazmente a partir de una amplia gama de concentraciones celulares utilizando calor y una ventilación de aire para eliminar el agua evaporada.

[0109] Los secadores instantáneos se usan típicamente para secar sólidos que se han deshidratado o que inherentemente tienen poc contenido de humedad. También conocidos como "secadores neumáticos", estos secadores típicamente dispersan el material húmedo en una corriente de aire calentado (o gas) que lo transporta a través de un conducto de secado. El calor de la corriente de aire (o corriente de gas) seca el material a medida que se transporta a través del conducto de secado. El producto seco se separa luego utilizando ciclones y/o filtros de bolsa. Se pueden usar temperaturas de secado elevadas con muchos productos, porque la evaporación de la humedad superficial enfría instantáneamente el gas/aire de secado sin aumentar apreciablemente la temperatura del producto. Se pueden encontrar descripciones más detalladas de los secadores instantáneos y los secadores neumáticos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4,214,375, que describe un secador de flash, y en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 3,789,513 y 4,101,264, que describen los secadores neumáticos.

[0110] Independientemente del método seleccionado para una etapa de secado, el objetivo del paso de secado es reducir el contenido de humedad en la biomasa microbiana. La biomasa microbiana seca (materia prima acondicionada) adecuada para el prensado tiene un contenido de humedad de 0,5-2,5% en peso. La humedad puede volver a agregarse a la biomasa, si es necesario, después del secado para ajustar el contenido de humedad al nivel óptimo. Si la biomasa microbiana seca se mezclará con un agente de carga seco (vea la subsección D) o se acondicionará de manera que reduzca aún más el contenido de humedad (vea la subsección C), entonces puede ser aceptable un contenido de humedad más alto (superior al 6% en peso), como agentes de carga y/o acondicionamiento pueden, en algunas realizaciones, reducir el contenido de humedad al nivel óptimo deseado.

[0111] La biomasa microbiana deshidratada y/o seca se acondiciona antes del paso de prensado, como se describe en la siguiente subsección.

C. Acondicionam iento de la biomasa microbiana

[0112] El acondicionamiento de la biomasa microbiana ayuda a alcanzar los niveles deseados de extracción de aceite. El acondicionamiento se refiere a calentar la biomasa a una temperatura en el rango de 70°C a 150°C (160°F a 300°F) y cambiar la naturaleza física o fisicoquímica de la biomasa microbiana para mejorar los rendimientos de aceite en la extracción de aceite posterior (presionando) paso. El acondicionamiento de la biomasa microbiana da como resultado la producción de "materia prima acondicionada". Además de calentar o "cocinar" la biomasa, los ejemplos no limitantes de acondicionamiento de la biomasa incluyen ajustar el contenido de humedad dentro de la biomasa microbiana seca, someter la biomasa microbiana seca a una "pre-prensa" de baja presión, sometiendo la biomasa microbiana seca a ciclos de calentamiento y enfriamiento, sometiendo la biomasa microbiana seca a un expansor, y/o ajustando el tamaño de partícula de la biomasa microbiana seca.

[0113] El paso de acondicionamiento puede incluir técnicas (p. ej., calentamiento o aplicación o presión) que se superponen en parte con técnicas usadas en los pasos de secado o prensado. Sin embargo, los objetivos principales de estos pasos son diferentes: el objetivo principal del paso de secado es la eliminación de parte o la totalidad de la humedad libre o de la superficie de la biomasa microbiana. El objetivo principal del paso de acondicionamiento es calentar la biomasa, lo que opcionalmente puede provocar la eliminación del agua intracelular, es decir, ajustar el contenido de humedad intracelular de la biomasa microbiana y/o alterar la naturaleza física o fisicoquímica de la biomasa microbiana. sin liberación sustancial de lípidos para facilitar la liberación de aceite durante el paso de prensado. El objetivo principal del paso de prensado es liberar aceite de la biomasa microbiana o materia prima acondicionada, es decir, la extracción del aceite.

[0114] En diversas realizaciones, el acondicionamiento implica alterar, o ajustar, el contenido de humedad de la biomasa microbiana mediante la aplicación de calor, es decir, acondicionamiento térmico. El acondicionamiento térmico, como se usa en este documento, se refiere al tratamiento térmico (ya sea directo o indirecto) de la biomasa microbiana. El contenido de humedad de la biomasa microbiana se puede ajustar mediante el uso de calor (directo o indirecto), que se realiza después de un paso de secado. Aunque la biomasa se puede secar por cualquiera de los métodos descritos anteriormente, el contenido de humedad de la biomasa microbiana después del secado puede variar, por ejemplo, de 3% a 15% de humedad en peso, o 5-10% de humedad en peso. Tal rango de humedad puede no ser óptimo para la recuperación máxima de aceite en el paso de prensado. Por lo tanto, puede haber un beneficio en el acondicionamiento térmico de la biomasa microbiana deshidratada y/o seca para ajustar el nivel de humedad a un nivel (inferior al 6%) óptimo para la máxima recuperación de aceite.

[0115] Acondicionadores de calor usados en el procesamiento de aceite de semillas son adecuados para uso en el acondicionamiento de la biomasa microbiana de acuerdo con los métodos de la presente invención, tales como acondicionadores apilados verticales. Estos consisten en una serie de tres a siete o más recipientes de acero cilíndricos superpuestos cerrados. Cada recipiente está revestido de forma independiente para calentar con vapor en ambos lados y en el fondo, y está equipado con un agitador tipo barrido montado cerca del fondo y operado por un eje común que se extiende a través de toda la serie de recipientes. La temperatura del acondicionador de calor también es ajustable a través de la regulación del calentamiento por vapor. Hay una compuerta operada automáticamente en el fondo de cada bandeja, excepto la última, para descargar el contenido a la bandeja de abajo. La bandeja superior está provista de chorros de pulverización para la adición de humedad si se desea. Si bien la humedad se rocía sobre las semillas en muchos procesos de extracción de aceite agrícola durante el acondicionamiento, este proceso común no es deseable para acondicionar la biomasa microbiana. Las cocinas también suelen tener un tubo de escape y un ventilador para eliminar la humedad. Por lo tanto, es posible controlar la humedad de la biomasa microbiana, no solo con respecto al contenido de humedad final sino también en cada etapa de la operación. A este respecto, un paso de acondicionamiento para calentar la biomasa microbiana durante un período prolongado de tiempo (10-60 minutos, por ejemplo) proporciona el efecto de no solo reducir la humedad y aumentar la temperatura de la biomasa, sino también alterar la naturaleza biofísica de la biomasa microbiana más allá de cualquier efecto de calentamiento que pueda ocurrir en una etapa de prensado posterior, es decir, simplemente por la fricción del material a medida que se fuerza, por ejemplo, una prensa.

[0116] Además, una cocina horizontal con camisa de vapor es otro tipo de acondicionador de calor que es adecuado para su uso de acuerdo con los métodos de la presente invención. En este diseño, la biomasa se mezcla, calienta y transporta en un plano horizontal en camas más profundas en comparación con las cocinas verticales apiladas convencionales. En la cocina horizontal, la acción de una mezcla de barrena especialmente diseñada transporta la biomasa, mientras que la biomasa se calienta simultáneamente con vapor indirecto de la camisa de vapor. El agua, el vapor y el aire se expulsan de la cocina a través de un conducto superior, que puede tener o no un extractor de aire dependiendo de la capacidad de la cocina. Para cocinar biomasa a un alto caudal, se pueden apilar varias cocinas horizontales. En esta configuración, la biomasa se alimenta a la cocina de nivel superior y se calienta y transporta a través del sinfín y luego se arroja por gravedad a una cocina de nivel inferior donde se repite el proceso. Se pueden apilar varios niveles de cocinas horizontales dependiendo del caudal necesario y el tiempo/temperatura de acondicionamiento requeridos. La humedad y la temperatura se pueden controlar y ajustar independientemente para cada nivel de cocina horizontal.

[0117] Para el acondicionamiento térmico de la biomasa microbiana, especialmente la biomasa microalgal, el tiempo y la temperatura óptimos que pasa la biomasa en un acondicionador apilado vertical pueden variar dependiendo del nivel de humedad de la biomasa después del secado. El acondicionamiento por calor (a veces denominado "cocción") no debe provocar la quema o el quemado de cantidades significativas de biomasa microbiana durante la cocción. Dependiendo del contenido de humedad de la biomasa microbiana antes del acondicionamiento térmico, es decir, para niveles muy bajos de humedad, puede ser beneficioso o incluso necesario humedecer la biomasa antes del acondicionamiento térmico para evitar quemaduras. Dependiendo del tipo de biomasa microbiana que se va a alimentar a través de una prensa de expulsión, variará la temperatura óptima para el acondicionamiento térmico. Para algunos tipos de microalgas, la temperatura óptima para el acondicionamiento térmico está entre 93-132°C (200-270°F). En algunas realizaciones, la biomasa de microalgas se acondiciona por calor a 99-110°C (210-230°F). En otras realizaciones, la biomasa de microalgas se acondiciona por calor a 104-132°C (220-270°F). En otras realizaciones más, la biomasa de microalgas se acondiciona por calor a 116-127°C (240-260°F). Estos intervalos de temperatura son, como el contenido de humedad, significativamente diferentes de lo que se usa típicamente en un proceso de acondicionamiento de semillas oleaginosas, ya que los procesos de semillas oleaginosas generalmente usan temperaturas de acondicionamiento más bajas.

[0118] El calentamiento de la biomasa microbiana que contiene aceite antes del prensado puede ayudar en la liberación de aceite y/o acceder a los compartimentos cargados de aceite de las células. La biomasa microbiana que contiene aceite contiene el aceite en compartimentos hechos de componentes celulares como proteínas y fosfolípidos. Los ciclos repetitivos de calentamiento y enfriamiento pueden desnaturalizar las proteínas y alterar la estructura química de los componentes celulares de estos compartimentos de aceite y, por lo tanto, proporcionar un mejor acceso al aceite durante el proceso de extracción posterior. Por lo tanto, en diversas realizaciones de la invención, la biomasa microbiana se acondiciona para preparar materia prima acondicionada que se usa en la etapa de prensado, y la etapa de acondicionamiento implica calentamiento y, opcionalmente, uno o más ciclos de calentamiento y enfriamiento.

[0119] Los piensos acondicionados tienen un contenido de humedad de 0,5% a 2,5% en peso.

[0120] Además de calentar la biomasa, el acondicionamiento puede, en algunas realizaciones, implicar la aplicación de presión a la biomasa microbiana. Para distinguir este tipo de acondicionamiento de la presión aplicada durante la extracción de aceite (el paso de prensado), este tipo de acondicionamiento se denomina "preimpresión". La preimpresión se realiza a baja presión, una presión inferior a la utilizada para la extracción de aceite en el paso de prensado. Las prensas de expulsor (tornillo) de alta presión ordinarias pueden funcionar a baja presión para este paso de acondicionamiento previo a la prensa. Pre-prensar la biomasa a baja presión puede ayudar a romper las células para permitir un mejor flujo de aceite durante el prensado posterior a alta presión; sin embargo, el preprensado no causa que una cantidad significativa (p. ej., más del 5%) del aceite se separe de la biomasa microbiana. Además, la fricción y el calor generados durante la preimpresión también pueden ayudar a abrir los compartimientos de aceite en las células. Pre-prensar la biomasa a baja presión también cambia la textura y el tamaño de partícula de la biomasa, porque la biomasa se extruirá de la prensa en forma de gránulos. En algunas realizaciones, se usa una extrusora (véase la discusión a continuación) para lograr los mismos resultados o resultados similares que una etapa de acondicionamiento previo a la presión de baja presión. En algunas realizaciones, los gránulos de biomasa acondicionada se procesan adicionalmente para lograr un tamaño de partícula óptimo para el posterior prensado a presión total.

[0121] Por lo tanto, otro parámetro relevante para la extracción óptima de aceite de la biomasa microbiana es el tamaño de partícula. Típicamente, el tamaño de partícula óptimo para una torta de presión de aceite de prensa (prensa de tornillo) es de aproximadamente 0,159 cm (1/16° de pulgada) de espesor. Los factores que pueden afectar el rango del tamaño de partícula incluyen, entre otros, el método utilizado para secar la biomasa microbiana y/o la adición de un agente de carga o ayuda de prensa a la biomasa. Si la biomasa se seca en una bandeja, por ejemplo, se extiende en húmedo sobre una bandeja y luego se seca en un horno, la biomasa microbiana seca resultante puede necesitar dividirse en piezas uniformes del tamaño de partícula óptimo para que sea óptima para presionar en una prensa de expulsión. Lo mismo es cierto si se agrega un agente de carga a la biomasa microbiana antes del proceso de secado. Por lo tanto, el acondicionamiento puede implicar un paso que da como resultado la alteración del tamaño de partícula o el tamaño promedio de partícula de la biomasa microbiana. Se pueden emplear máquinas tales como molinos de martillos o escamas de acuerdo con los métodos de la invención para ajustar el grosor y el tamaño de partícula de la biomasa microbiana que contiene aceite.

[0122] De manera similar, la extracción de aceite mejorada puede resultar de la alteración de otras propiedades físicas de la biomasa microbiana seca. En particular, la porosidad y/o la densidad de la biomasa microbiana pueden afectar los rendimientos de extracción de aceite. En diversas realizaciones de los métodos de la invención, se realiza el acondicionamiento de la biomasa para alterar su porosidad y/o densidad. Comúnmente utilizado antes de la extracción con hexano u otro solvente de aceite de semillas oleaginosas, expansores y extrusoras aumentan la porosidad y la densidad aparente de la materia prima. De acuerdo con los métodos de la presente invención, expansores y extrusoras pueden emplearse para acondicionar la biomasa microbiana antes de la extracción de aceite y pueden o no causar que una cantidad significativa de aceite se separe de la biomasa microbiana. Tanto los expansores como los extrusores son máquinas de bajo cizallamiento que calientan, homogenizan y dan forma al material que contiene aceite en pinzas o gránulos. Los expansores y extrusoras funcionan de manera similar; ambos tienen una configuración de tornillo sin fin/collar dentro de un eje de modo que, a medida que mueve el material dentro del eje, la presión mecánica y el cizallamiento rompen las células. La mayor diferencia entre expansores y extrusoras es que el expansor usa agua y/o vapor para hinchar el material al final del eje. La repentina alta presión (y el cambio de presión) hace que la humedad en el material se vaporice, "hinchando" o expandiendo el material utilizando la humedad interna. Las extrusoras cambian la forma del material, formando pinzas o gránulos. Las extrusoras también lisan las células y vaporizan el agua de la biomasa (reducción de la humedad) mientras aumentan la temperatura de la biomasa (calientan la biomasa) a través de la fricción mecánica que la extrusora ejerce sobre la biomasa. Por lo tanto, las extrusoras y expansores pueden usarse de acuerdo con los métodos de la invención para acondicionar la biomasa microbiana seca. El extrusor/expansor puede romper las células, liberando los lípidos intracelulares, y también puede cambiar la porosidad y la densidad aparente del material. Estos cambios en las propiedades físicas de la materia prima pueden ser ventajosos en la extracción posterior de aceite.

[0123] Los métodos de acondicionamiento descritos anteriormente se pueden usar solos o en combinación de acuerdo con los métodos de la invención para lograr la materia prima de biomasa microbiana óptima acondicionada para la extracción de aceite posterior. Por lo tanto, el paso de acondicionamiento implica la aplicación de calor y, opcionalmente, presión a la biomasa. En diversas realizaciones, la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa a una temperatura en el intervalo de 70°C a 150°C (160°F a 300°F). En diversas realizaciones, el calentamiento se realiza usando un agitador vertical apilado. En diversas realizaciones, la etapa de acondicionamiento comprende además tratar la biomasa seca con un expansor o extrusor para dar forma y/u homogeneizar la biomasa.

D. Agentes de carga (ayudas de prensa)

[0124] En diversas realizaciones de la invención, se agrega un agente de carga o coadyuvante de prensa a la biomasa microbiana, que puede ser biomasa microbiana seca o hidratada (es decir, biomasa que no se ha secado o que contiene cantidades significativas, es decir, más del 6% en peso, humedad, incluida la biomasa en caldo de fermentación que no ha sido sometido a ningún proceso para eliminar o separar agua) o materia prima acondicionada, antes del paso de prensado. En diversas realizaciones, el agente de carga tiene un tamaño de partícula promedio de menos de 1,5 mm. En algunas realizaciones, el agente de carga o ayuda de prensa tiene un tamaño de partícula de entre 50 micras y 1,5 mm. En otras realizaciones, el auxiliar de prensa tiene un tamaño de partícula de entre 150 micras y 350 micras. En algunas realizaciones, el agente de carga es una ayuda de filtro. En diversas realizaciones, el agente de carga se selecciona del grupo que consiste en celulosa, rastrojo de maíz, romero seco, cáscaras de soja, biomasa gastada (biomasa de contenido lipídico reducido en relación con la biomasa a partir de la cual se preparó), incluida la biomasa microbiana gastada, azúcar bagazo de caña y pasto de hierba. En diversas realizaciones, el agente de carga es biomasa microbiana gastada (véase la subsección G a continuación) que contiene entre 40% y 90% en peso de polisacárido, como celulosa, hemicelulosa, fibra soluble e insoluble, y combinaciones de estos diferentes polisacáridos y/o menos del 10% de aceite en peso. En diversas realizaciones, el polisacárido en la biomasa microbiana gastada usada como agente de carga contiene 20-30 por ciento en moles de galactosa, 55-65 por ciento en moles de glucosa y/o 5-15 por ciento en moles de manosa.

[0125] Por lo tanto, la adición de un agente de presión o agente de carga puede ser ventajosa en algunas realizaciones de la invención. Cuando hay un alto contenido de aceite y poca fibra en la biomasa, alimentar la biomasa a través de una prensa puede dar como resultado una emulsión. Esto da como resultado bajos rendimientos de aceite, porque el aceite está atrapado dentro de los sólidos. Una forma de acuerdo con los métodos de la invención para mejorar el rendimiento en tales casos es agregar polisacárido a la biomasa en forma de un agente de carga, también conocido como "ayuda de prensa" o "ayuda de presión". Los agentes de carga son típicamente aditivos con alto contenido de fibra que funcionan ajustando el contenido total de fibra de la biomasa microbiana a un rango óptimo. La biomasa microbiana, como las microalgas y similares, típicamente tiene muy poco contenido de fibra cruda. Típicamente, la biomasa microbiana, incluida la biomasa de microalgas, tiene un contenido de fibra cruda de menos del 2%. La adición de aditivos con alto contenido de fibra (en forma de ayuda de prensa) puede ayudar a ajustar el contenido total de fibra de la biomasa microbiana a un rango óptimo para la extracción de aceite utilizando una prensa de expulsión. El contenido óptimo de fibra para una semilla oleaginosa típica puede variar del 10-20%. De acuerdo con los métodos de la presente invención, puede ser útil ajustar el contenido de fibra de la biomasa microbiana para una extracción óptima del aceite. El rango de contenido de fibra en la biomasa puede ser igual o similar al contenido de fibra óptimo para una semilla oleaginosa típica, aunque el contenido de fibra óptimo para cada biomasa microbiana puede ser menor o mayor que el contenido de fibra óptimo de un aceite típico semilla. Las ayudas de prensado adecuadas incluyen, pero no se limitan a, hierba de cambio, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, bagazo de caña de azúcar, cáscaras de soja, romero seco, celulosa, estofado de maíz, torta delipidada (ya sea prensada o extraída con solvente) de soja, colza, semilla de algodón, girasol, semillas de jatropha, pulpa de papel, papel usado y similares. En algunas realizaciones, la biomasa microbiana gastada de contenido lipídico reducido de una prensa previa se usa como agente de carga. En algunas aplicaciones, especialmente cuando el aceite se va a utilizar en una aplicación de alimentos o se va a consumir, la ayuda de prensado utilizada para mezclar con la biomasa microbiana (seca o hidratada) o materia prima acondicionada se seleccionará para cumplir con los requisitos reglamentarios (para uso como alimento). Por lo tanto, los agentes de carga, cuando se incorporan a una biomasa, cambian las propiedades fisicoquímicas de la biomasa para facilitar una aplicación más uniforme de presión a las células en la biomasa.

[0126] En algunos casos, el agente de carga se puede agregar a la biomasa microbiana después de que se haya secado, pero aún no acondicionado. En tales casos, puede ser ventajoso mezclar la biomasa microbiana seca con la cantidad deseada de ayuda de prensa y luego acondicionar la biomasa microbiana y la ayuda de prensa juntas antes de alimentar a una prensa de tomillo. En otros casos, la ayuda de prensa se puede agregar a una biomasa microbiana hidratada antes de que la biomasa microbiana haya sido sometida a procesos de separación o deshidratación, secado o acondicionamiento. En tales casos, el auxiliar de prensa se puede agregar directamente al caldo de fermentación que contiene la biomasa microbiana antes de cualquier deshidratación u otro paso.

[0127] La invención proporciona varios métodos relacionados con la extracción de aceite a partir de biomasa microbiana que emplean los agentes de carga descritos anteriormente. En un método, la biomasa microbiana hidratada adecuada para la extracción de aceite se prepara agregando un agente de carga a la biomasa y secando la mezcla obtenida de ese modo a un contenido de humedad inferior al 6% en peso, formando así una mezcla seca de agente de carga/biomasa. En otro método, el aceite se extrae de la biomasa microbiana mediante el secado conjunto de la biomasa microbiana hidratada que contiene al menos 20% en peso de aceite (incluido al menos 40% de aceite) y un agente de carga para formar una mezcla seca de agente de carga/biomasa; reducir el contenido de humedad en la mezcla a menos del 4% en peso, es decir, mediante secado y/o acondicionamiento; y presionar la mezcla de contenido reducido de humedad para extraer el aceite del mismo, formando así biomasa gastada de contenido reducido de lípidos. En otro método, se obtienen mayores rendimientos de aceite a partir de biomasa microbiana que contiene al menos 20% de lípidos en peso al secar la biomasa microbiana con un agente de carga, porque la mezcla secada, al presionar, liberará más aceite del que puede ser obtenido de la biomasa en las mismas condiciones en ausencia de un agente de carga. En diversas realizaciones de estos y otros métodos de la invención, la biomasa microbiana hidratada está contenida en un caldo de fermentación que no ha sido sometido a procesos para separar o eliminar agua de la biomasa.

[0128] En una realización, el agente de carga es biomasa microbiana gastada, opcionalmente que se ha procesado o fresado (para homogeneidad y facilidad de mezcla), que se combina con biomasa microbiana que no se ha extraído. En tales casos, el contenido total de polisacárido de la biomasa microbiana mezclada (biomasa gastada como ayuda de prensa y biomasa microbiana no extraída) antes de ser alimentada a una prensa de expulsión contiene entre 10% y 40% del peso total de la biomasa mezclada.

E. Presionando la biomasa microbiana

[0129] Por lo tanto, de acuerdo con los métodos de la invención, los piensos acondicionados, que comprenden opcionalmente un agente de carga, se somete a presión en una etapa de prensado para extraer aceite, produciendo aceite separado de la biomasa gastada. El paso de prensado implica someter una presión suficiente para extraer el aceite de los piensos acondicionados. Por lo tanto, en algunas realizaciones, los piensos acondicionados que se presionan en la etapa de prensado comprende aceite predominantemente o completamente encapsulado en células de la biomasa. En otras realizaciones, la biomasa comprende células predominantemente lisadas y, por lo tanto, el aceite no está encapsulado principalmente en células.

[0130] En diversas realizaciones de los diferentes aspectos de la invención, la etapa de prensado implicará someter los piensos acondicionados a al menos 689 bar (10.000 psi) de presión. En diversas realizaciones, la etapa de prensado implica la aplicación de presión durante un primer período de tiempo y luego la aplicación de una presión más alta durante un segundo período de tiempo. Este proceso puede repetirse una o más veces ("presión oscilante"). En diversas realizaciones, se aplican más de 5 ciclos de presión oscilante. En diversas realizaciones, uno o más de los ciclos posteriores pueden ejercer una presión promedio que es más alta que la presión promedio ejercida en uno o más ciclos anteriores. Por ejemplo y sin limitación, la presión promedio en el último ciclo puede ser al menos 2 veces mayor que la presión promedio en el primer ciclo o en cualquier ciclo anterior. En diversas realizaciones, el contenido de humedad del material de alimentación acondicionado se controla durante la etapa de prensado. En diversas realizaciones, la humedad se controla en un intervalo de 0,1% a 3% en peso.

[0131] En diversas realizaciones, la etapa de prensado se realiza con una prensa de expulsión. En diversas realizaciones, la etapa de prensado se realiza en un modo de flujo continuo. En diversas realizaciones, la velocidad de lubricación es de al menos 500 g/min. a no más de 1000 g/min. En diversas realizaciones de flujo continuo, la prensa de expulsión es un dispositivo que comprende un eje helicoidal que gira continuamente dentro de una jaula que tiene un alimentador en un extremo y un estrangulador en el extremo opuesto, que tiene aberturas dentro de la jaula. Los piensos acondicionados ingresan a la jaula a través del alimentador, y la rotación del eje helicoidal avanza la materia prima a lo largo de la jaula y aplica presión a la materia prima dispuesta entre la jaula y el estrangulador, la presión libera aceite a través de las aberturas de la jaula y extruye la biomasa gastada del extremo del estrangulador de la jaula. En diversas realizaciones, la jaula tiene una longitud interna que está entre al menos diez veces y al menos 20 veces su diámetro interno. En diversas realizaciones, la jaula comprende una pluralidad de barras alargadas con al menos algunas de las barras alargadas separadas por uno o más espaciadores, descansando las barras sobre un marco, en donde el uno o más espaciadores entre las barras forman las aberturas, y el aceite es liberado a través de las aberturas a un recipiente colector acoplado fluidamente con la jaula. En diversas realizaciones, los separadores entre las barras alargadas son de diferentes espesores, permitiendo así la variación del espacio entre cada barra alargada. En diversas realizaciones, los separadores o los espacios entre las barras tienen un espesor de 0,13 a 0,76 mm (0,005 a 0,030 pulgadas).

[0132] La jaula en alguna prensa de expulsión puede calentarse usando vapor o enfriarse usando agua dependiendo de la temperatura óptima necesaria para un rendimiento máximo. La temperatura óptima debe ser suficiente calor para ayudar al prensado, pero no demasiado calor como para quemar la biomasa mientras se alimenta a través de la prensa. La temperatura óptima para la jaula de la prensa de expulsión puede variar según la biomasa microbiana que se va a presionar. En algunas realizaciones, para prensar biomasa microbiana o microalgal, la jaula se precalienta y se mantiene a una temperatura entre 93-132°C (200-270°F). En otras realizaciones, la temperatura óptima de la jaula para biomasa microbiana o de algunas especies de microalgas está entre 99-110°C (210-230°F). En otras realizaciones más, la temperatura óptima de la jaula para la biomasa microbiana o algunas especies de microalgas está entre 116-127°C (240-260°F). Estos intervalos de temperatura difieren significativamente de muchos procesos de prensado de semillas oleaginosas, y de hecho algunos procesos de prensado de semillas oleaginosas se denominan "prensado en frío" debido a la falta de calentamiento de las semillas o el prensado durante el proceso.

[0133] En diversas realizaciones, la presión aumenta en un factor de entre 10 y 20 desde el extremo del alimentador hasta el extremo del estrangulador de la jaula. En diversas realizaciones, la presión a lo largo de la jaula no aumenta en más del 100% de la presión en el extremo del alimentador de la jaula por pie lineal de la jaula entre el alimentador y los extremos del estrangulador de la jaula. En diversas realizaciones, la potencia consumida por el dispositivo no aumenta en más del 10% cuando está completamente cargada con biomasa o materia prima acondicionada en relación con el funcionamiento vacío. En diversas realizaciones, el tiempo de residencia de la materia prima en el barril del dispositivo no es superior a 5-10 min. En diversas realizaciones, se controla y/o monitorea la temperatura del dispositivo o la presión ejercida por el dispositivo o ambas.

[0134] En diversas realizaciones, la presión se controla ajustando la velocidad de rotación de un eje helicoidal. En diversas realizaciones, incluidas aquellas en las que no se controla la presión, se puede usar una prensa de expulsor (tornillo) que comprende un eje helicoidal y un barril. En diversas realizaciones, el barril tiene una longitud y un canal que tiene un diámetro dimensionado para recibir el eje helicoidal, y en el que la longitud del barril es al menos 10 a 15 veces mayor que el diámetro del canal. En diversas realizaciones, el barril de la prensa tiene una entrada y una salida, y el diámetro del eje helicoidal aumenta desde la entrada hasta la salida, y el prensado comprende aumentar la presión desde la entrada hasta la salida del barril; en diversas realizaciones, la presión en la salida es de 12 a 16 o incluso hasta 20 veces mayor que la presión en la entrada. En diversas realizaciones, la prensa del expulsor (tornillo) comprende un eje helicoidal y un barril que tiene un primer canal y un segundo canal, ambos canales concéntricos y dimensionados para recibir el eje helicoidal, en donde el primer canal tiene un primer diámetro y el segundo canal tiene un segundo diámetro diferente al primer diámetro. En diversas realizaciones, los piensos acondicionados permanecen residentes en el barril de la prensa de tornillo durante 5 a 10 minutos.

[0135] En diversas realizaciones, la prensa del expulsor (tornillo) comprende un eje helicoidal dispuesto en un barril forrado con una pluralidad de barras alargadas separadas por uno o más separadores entre ellas, creando una separación entre las barras alargadas. En tal prensa, la presión se puede controlar ajustando el espacio cambiando el tamaño o el número de espaciadores entre las barras alargadas, y/o si la prensa tiene un espacio entre una superficie externa del eje helicoidal y una superficie interna de barras alargadas, la presión se puede controlar reemplazando al menos algunas de las barras alargadas con barras de diferentes tamaños para cambiar el espacio. En diversas realizaciones, la prensa comprende una abertura de salida y un estrangulador ajustable acoplado a la misma, y la presión se controla ajustando el estrangulador para aumentar o disminuir la presión. En diversas realizaciones, la prensa del expulsor (tornillo) comprende un eje helicoidal dispuesto en un barril, y la presión se controla ajustando un espacio entre una superficie externa del eje helicoidal y una superficie interna del cilindro.

[0136] Prensas expulsoras (prensas de tornillo) se utilizan rutinariamente para la extracción mecánica del aceite de habas de soja y semillas oleaginosas. Generalmente, las secciones principales de una prensa de expulsión incluyen una entrada, un tornillo alimentador giratorio, una jaula o barril, un eje helicoidal y un cárter de aceite. La prensa de expulsión es una prensa de jaula continua, en la que la presión se desarrolla mediante un eje helicoidal que gira continuamente. Una presión extremadamente alta, aproximadamente 689-1379 bar (10,000-20.000 libras por pulgada cuadrada), se acumula en la jaula o barril a través de la acción del gusano que trabaja contra un estrangulador ajustable, que restringe la descarga de la torta prensada (gastada biomasa) desde el final del barril. En diversas realizaciones, las prensas de tornillo de los siguientes fabricantes son adecuadas para su uso: Anderson International Corp. (Cleveland, OH), Alloco (Santa Fe, Argentina), De Smet Rosedowns (Humberside, Reino Unido), The Dupps Co. (Germantown, Ohio)), Grupo Tecnal (Sao Paulo, Brasil), Insta Pro (Des Moines, Iowa), French Oil Mill (Piqua, OH), Harburg Freudenberger (anteriormente Krupp Extraktionstechnik) (Hamburgo, Alemania), Maschinenfabrik Reinarte (Neuss, Alemania), Shann Consulting (Nueva Gales del Sur, Australia) y SKET (Magdeburgo, Alemania).

[0137] La biomasa microbiana o materia prima acondicionada se suministra a la prensa expulsora a través de una admisión. Un tornillo alimentador giratorio hace avanzar el material suministrado desde la entrada al barril, donde luego se comprime mediante la rotación del eje helicoidal. El aceite extraído del material se recoge en una bandeja de aceite y luego se bombea a un tanque de almacenamiento. La biomasa gastada restante se extrae de la prensa como una torta y se puede recolectar para un procesamiento adicional (consulte la subsección G a continuación). La torta puede ser peletizada.

[0138] El eje de tornillo sinfín está asociado con una configuración de collar y se divide en secciones. La configuración de gusano y collar dentro de cada sección es personalizable. El eje helicoidal es responsable de transportar la biomasa (materia prima) a través de la prensa. Puede caracterizarse por tener un cierto diámetro y un paso de rosca. Cambiar el diámetro y el paso del eje puede aumentar o disminuir la presión y el esfuerzo cortante aplicado a la materia prima a medida que pasa a través de la prensa. El propósito del collar es aumentar la presión sobre la materia prima dentro de la prensa y también aplicar un esfuerzo cortante a la biomasa.

[0139] La carga de la prensa en términos de corriente eléctrica requerida para hacer funcionar la prensa cargada con biomasa microbiana (piensos acondicionados) generalmente no es más de aproximadamente el 10% de la corriente eléctrica requerida para hacer funcionar la prensa vacía, y esto sugiere que la potencia requerida para presionar biomasa microbiana (la materia descrita en el presente documento es más baja que otros requisitos de energía típicos de la industria de semillas oleaginosas donde la carga total de la prensa es mayor al 10% de la corriente eléctrica requerida para hacer funcionar la prensa vacía de una materia prima de semillas oleaginosas.

[0140] El eje helicoidal preferiblemente es cónico de modo que su diámetro exterior aumenta a lo largo de la longitud longitudinal lejos de la entrada del barril. Esto disminuye la brecha entre el eje helicoidal y el interior del barril, creando así una mayor presión y tensión de corte a medida que la biomasa viaja a través del barril. Además, el interior del barril está formado por barras de acero planas separadas por separadores (también conocidos como cuñas), que se colocan en los bordes alrededor de la periferia del barril y se mantienen en su lugar mediante una jaula pesada tipo cuna. El ajuste de la cuña entre las barras controla el espacio entre las barras que ayuda a drenar el aceite extraído y también ayuda a regular la presión del barril. Las cuñas son a menudo de 0,00762 cm (0,003”) de espesor a 0,0762 cm (0,030") de espesor y preferiblemente de 0,0127 cm (0,005”) a 0,0508 cm (0,020") de espesor, aunque también se pueden emplear otros espesores. Además, las barras pueden ajustarse, creando secciones dentro del barril.

[0141] A medida que el material de alimentación se presiona o se mueve hacia abajo por el barril, se genera calor significativo por fricción. En algunos casos, la cantidad de calor se controla mediante un sistema de enfriamiento con camisa de agua que rodea el barril. Debido a la extrema presión, el aceite que se presiona desde una prensa de tornillo o una prensa de expulsión contiene una proporción de "pies" o material sólido de la biomasa que fluye con el aceite entre las barras. Los pies se pueden filtrar, drenar y volver a introducir en la prensa junto con la materia prima sin comprimir. Los sensores de temperatura se pueden disponer en varios lugares alrededor del barril para monitorear y ayudar en el control de temperatura. Además, los sensores de presión también se pueden conectar al barril en varios lugares para ayudar a monitorear y controlar la presión.

[0142] Varias características de funcionamiento de la prensa de expulsor (tornillo) pueden expresarse o analizarse como una relación de compresión. La relación de compresión es la relación del volumen de material desplazado por revolución del eje helicoidal al comienzo del barril dividido por el volumen de material desplazado por revolución del eje helicoidal al final del cilindro. Por ejemplo, debido al aumento de las relaciones de compresión, la presión puede ser de 10 a 18 veces mayor al final del barril en comparación con el comienzo del barril. La longitud interna del barril puede ser al menos diez veces o incluso trece veces el diámetro interno del barril. La relación de compresión típica para una prensa de tornillo o expulsor varía de 1 a 18, dependiendo del material de alimentación.

[0143] El tiempo de residencia del material de alimentación en una prensa de expulsor (tornillo) puede afectar la cantidad de recuperación de aceite. El mayor tiempo de residencia en la prensa le da a la materia prima una mayor exposición al esfuerzo cortante y la presión generada por la prensa, lo que puede producir una mayor recuperación de aceite. El tiempo de residencia de la materia prima depende de la velocidad a la que se ejecuta la prensa y la longitud frente al diámetro de la prensa de tornillo (o L/D). Cuanto mayor sea la relación entre la longitud del eje y el diámetro del eje, mayor será el tiempo de residencia de la materia prima (cuando la velocidad de rotación se mantiene constante). En algunas realizaciones, el tiempo de residencia de la biomasa de algas que se presiona con una prensa de expulsión no es más de 5 a 10 minutos. Este tiempo de residencia para la biomasa de algas es aproximadamente el doble del tiempo promedio de residencia para otras semillas oleaginosas como la soja, la colza o la semilla de algodón.

[0144] Los sólidos prensados resultantes o torta (biomasa agotada del contenido de aceite reducido con relación al material de alimentación suministrado a la prensa de tornillo) es expulsada de la prensa expulsora a través del cono de descarga en el extremo del cilindro/eje. El estrangulador utiliza un sistema hidráulico para controlar la abertura de salida en la prensa del expulsor. Una operación de prensa de aceite totalmente optimizada puede extraer la mayor parte del aceite disponible en el material que contiene aceite. Por ejemplo, las condiciones optimizadas para la extracción de aceite de la soja usando una prensa de expulsión dejan aproximadamente 4-6% de aceite residual; pueden obtenerse rendimientos similares a partir de biomasa microbiana (materia prima acondicionada) de acuerdo con los métodos de la invención. Una variedad de factores puede afectar el contenido de aceite residual en la torta prensada. Estos factores incluyen, entre otros, la capacidad de la prensa para romper las células y los compartimentos celulares que contienen aceite y la composición del propio material que contiene aceite, que puede tener una afinidad por el aceite expulsado. En algunos casos, el material que contiene aceite puede tener una alta afinidad por el aceite expulsado y puede absorber el aceite expulsado nuevamente dentro del material, atrapándolo así. En ese caso, el aceite que queda en la biomasa gastada puede ser reprimido o sometido a extracción con solvente, como se describe aquí, para recuperar el aceite.

[0145] No es necesario usar agentes biológicos para extraer aceite usando una prensa de expulsión, es decir: agentes tales como enzimas que se producen independientemente de la biomasa microbiana. La presión ejercida sobre la biomasa acondicionada es el mecanismo principal por el cual se libera el aceite de las vesículas de aceite en la biomasa microbiana.

F. Aceite microbiano producido

[0146] Después del paso de prensado, el método de la invención da como resultado la extracción de aceite y, en consecuencia, la producción de aceite extraído y biomasa gastada de contenido reducido de aceite en relación con los piensos acondicionados suministrados a la etapa de prensado. En diversas realizaciones, el aceite liberado contiene partículas sólidas de biomasa (materia prima acondicionada), y el método comprende además separar el aceite liberado de las partículas sólidas.

[0147] Los contaminantes pueden estar presentes en el aceite después del prensado (o extracción con solvente, vea la subsección G a continuación, o ambos). En algunas realizaciones, puede ser ventajoso eliminar estos contaminantes antes del uso posterior del aceite (ya sea para aplicaciones alimentarias o en reacciones químicas posteriores, como en la producción de combustibles). Las finas, o pequeñas partículas de la biomasa, pueden estar presentes en el aceite extraído. Por lo general, las finas se eliminan pasando el aceite a través de un filtro o algún otro proceso que separa físicamente las partículas del aceite. Opcionalmente, las partículas sólidas separadas se pueden someter a presión o extracción con disolvente para extraer cualquier aceite restante de las mismas.

[0148] El desgomado es otro proceso adecuado para su uso en los métodos de la invención que elimina contaminantes tales como fosfolípidos del aceite. En algunas realizaciones de la invención, el desgomado del aceite extraído se combina con el refinado, el blanqueo y la desodorización (o RBD). El proceso RBD elimina o reduce el olor, color y/o sabor del aceite extraído. El proceso de refinación generalmente consta de dos pasos, desgomado y un paso de neutralización que elimina los ácidos grasos libres (FFA) en el aceite a través de la eliminación cáustica con hidróxido de sodio. El paso de blanqueo implica mezclar el aceite con varias arcillas de blanqueo para absorber el color, los metales traza y los compuestos de azufre. El paso de desodorización es un proceso de destilación que ocurre a baja presión y alta temperatura. El aceite se coloca bajo una aspiradora y se calienta con vapor para eliminar cualquier sabor u olor sobrante y FFA. La desodorización también se puede lograr mediante el tratamiento con carbón activado.

[0149] Otros métodos de eliminación de contaminantes, tales como metales pesados, implican el refinado de alcanos, el pretratamiento con ácido y el uso de arcillas o zeolitas activadas también pueden emplearse en diversas realizaciones de la invención. El aceite se mezcla a temperaturas moderadas con pequeñas cantidades de ciertos hidróxidos alcalinos o de amoníaco y sales alcalinas o de amoníaco en presencia de un catalizador de transferencia de fase. La tecnología PROP, desarrollada por Phillips Petroleum Company, combina la desmetalización química y la hidrogenación para eliminar los contaminantes del aceite. El proceso consiste en mezclar el aceite con una solución acuosa de fosfato de diamonio a una temperatura elevada para reducir el contenido de metal del aceite. Este proceso conduce a reacciones químicas que forman fosfatos metálicos, que luego se pueden eliminar del aceite por filtración. A continuación, el aceite se mezcla con hidrógeno y se filtra desde un lecho de arcilla y se pasa sobre un catalizador de Ni/Mo en un reactor de hidrogenación. Este paso de adsorción elimina los restos de compuestos contaminantes, como azufre, oxígeno, cloro y nitrógeno.

[0150] En diversas realizaciones, el aceite extraído producido por los métodos de la invención contiene no más de 8 ppm de cloruro, no más de 2 ppm de fósforo, no más de 26 ppm de potasio, no más de 12 ppm de sodio, y/o no más de 5 ppm de azufre. El aceite producido por el proceso es útil en una variedad de aplicaciones, que incluyen, entre otras, la producción de combustibles como biodiesel y diesel renovable (ver, por ejemplo, Publicación PCT N° 2008/15ll49 y Solicitudes PCT Nos US09/066141 y US09/066142) y la producción de alimentos (véase, por ejemplo, la solicitud PCT N° US09/060692).

G. Biomasa gastada producida

[0151] Los métodos de extracción de aceite de la presente invención dan como resultado la producción de biomasa microbiana de un contenido reducido de aceite (biomasa agotada también se conoce como torta de prensado o biomasa prensada) con relación a los piensos acondicionados sometidos a presión en la etapa de prensado. En diversas realizaciones de la presente invención, el contenido de aceite en la biomasa gastada de contenido reducido de aceite es al menos un 45 por ciento menor que el contenido de aceite de la biomasa microbiana antes del paso de prensado. En diversas realizaciones, la biomasa gastada de contenido reducido de aceite que queda después del paso de prensado se granula o se extruye como una torta. La torta gastada, que puede someterse a procesos adicionales, que incluyen métodos adicionales de acondicionamiento y prensado o extracción basada en solventes para extraer aceite residual de acuerdo con la invención, es igualmente útil en una variedad de aplicaciones, que incluyen pero no se limitan a su uso como alimento, especialmente para animales, y como ayuda de prensa. En diversas realizaciones de la invención, el aceite restante se extrae de la biomasa gastada de contenido reducido de aceite; en diversas realizaciones, la extracción se realiza sometiendo la biomasa gastada a presión o extrayendo el aceite con un disolvente orgánico.

[0152] En algunos casos, la torta de prensado contiene un intervalo de menos de 50% de aceite de aceite de menos de 1% en peso, incluyendo, por ejemplo, menos de 40% de aceite en peso, aceite de menos de 20% en peso, menos del 10%, menos del 5% de aceite en peso y menos del 2% de aceite en peso. En todos los casos, el contenido de aceite en la torta prensada es menor que el contenido de aceite en el material sin comprimir.

[0153] En algunas realizaciones, la biomasa gastada o la torta prensada se recogen y se reciclan de nuevo en la prensa con materia prima acondicionada fresca o biomasa seca como un agente de carga de presión. En este caso, puede ser necesario acondicionar la biomasa gastada antes o después de que se mezcle con materia prima o biomasa sin comprimir para que sea adecuada como ayuda para presionar. En otras realizaciones, la biomasa gastada o la torta prensada, que puede contener aceite residual y otros componentes, es decir, fibra dietética, es adecuada para su uso como alimento humano o animal o aditivo alimentario. En tales aplicaciones, la biomasa gastada producida por los métodos de la invención puede denominarse "comida" o "comida delipidada".

[0154] Por lo tanto, la biomasa gastada producida por los métodos de la invención es útil como alimento para animales de granja, por ejemplo, rumiantes, aves de corral, cerdos y acuicultura. Esta comida delipidada, como se describió anteriormente, es biomasa microbiana de contenido reducido de lípidos/aceites, y puede producirse a través de un proceso mecánico (p. ej, prensado) o mediante un proceso de extracción con solvente (ver más abajo), o ambos. Típicamente, la comida delipidada tiene menos del 15% de aceite en peso. En una realización preferida, la comida delipidada generada a partir del prensado del expulsor (tornillo) de biomasa microbiana seguido de extracción con disolvente, tiene un contenido de aceite de menos del 10% en peso. Como se describió anteriormente, la comida delipidada es adecuada para su uso como agente de carga (ayuda de prensa). Además, la comida delipidada, aunque con contenido reducido de aceite, todavía contiene proteínas de alta calidad, carbohidratos, fibra, minerales y otros nutrientes apropiados para la alimentación animal. Debido a que las células se lisan predominantemente, la comida delipidada se digiere fácilmente. La comida delipidada se puede combinar opcionalmente con otros ingredientes, como el grano, en un alimento para animales. Debido a que la comida delipidada tiene una consistencia en polvo, puede prensarse en gránulos usando una extrusora o expansores, que están disponibles comercialmente.

[0155] Como se señaló anteriormente, la biomasa gastada, dependiendo de la eficiencia del paso de prensado, puede contener cantidades significativas de aceite. Si bien, en diversas realizaciones, este aceite puede extraerse presionando de acuerdo con los métodos de la invención (p. ej., como cuando la biomasa gastada se usa como agente de carga), la biomasa gastada también puede someterse a extracción con disolvente para recuperar más aceite de la biomasa microbiana.

[0156] Un ejemplo de extracción con disolvente adecuado para su uso en tales realizaciones de la invención es la extracción con disolvente de hexano. En esta realización, después de extraer el aceite mediante prensado, la biomasa gastada restante se mezcla con hexano para extraer el contenido de aceite restante. El aceite libre en la biomasa microbiana gastada forma una mezcla con el disolvente (p. ej, hexano) y se separa de los sólidos (harina de biomasa delipidada). La miscela aceite-solvente se filtra y el solvente se evapora y recicla para su uso en futuras extracciones con solvente. La harina de biomasa delipidada puede desolventizarse y hacerse adecuada para su uso en piensos o aditivos para piensos de acuerdo con los métodos de la invención.

[0157] La extracción con disolvente puede recuperar el aceite libre que está atrapado o reabsorbido en la biomasa microbiana gastada; sin embargo, la extracción con solventes no puede recuperar el aceite que todavía está atrapado en células microbianas ininterrumpidas/no lisadas. La biomasa microbiana que ha sido acondicionada (y lisada) en una extrusora o expansora pero no sometida a la alta presión de una prensa de tornillo también puede extraerse con solvente para recuperar el aceite liberado de la biomasa durante la etapa de acondicionamiento. Debido a que la eficiencia de la extracción con solvente depende de la accesibilidad del solvente al aceite libre, es importante aumentar la porosidad y/o el área superficial del material para la extracción con solvente. Idealmente, para la extracción con solvente, la biomasa microbiana gastada o la torta prensada debe contener un alto porcentaje de células microbianas lisas o rotas, ser de textura porosa y aumentar el área de superficie para la extracción con solvente, no debe estar muy comprimida o quemada, y no debe ser pulverulenta y seca. En una realización preferida, la biomasa microbiana gastada contiene al menos 85% de células microbianas lisadas o rotas.

[0158] Varios tipos de extractores de disolventes se usan en la técnica y son adecuados para usar con la biomasa gastada como se describe anteriormente. En una realización, se usa un extractor continuo de disolvente de percolación para extraer aceite libre residual de la biomasa microbiana gastada. Otro método de extracción de aceite adecuado para su uso de acuerdo con los métodos de la invención es el método de extracción de fluido supercrítico/dióxido de carbono en el que el dióxido de carbono se licua bajo presión y se calienta hasta el punto de tener las propiedades de un líquido y un gas. Este líquido licuado actúa entonces como el disolvente en la extracción del aceite de la biomasa microbiana gastada.

[0159] Los métodos de extracción sin disolventes conocidos en la técnica para lípidos también se pueden usar para recuperar aceite de biomasa gastada de acuerdo con los métodos de la invención. Por ejemplo, los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6,750,048 pueden usarse para recuperar aceite de la biomasa gastada producida por los métodos de la invención. Otro método de extracción sin solvente adecuado consiste en tratar la biomasa gastada con un ácido para crear una suspensión líquida. Opcionalmente, la suspensión se puede sonicar para asegurar la lisis completa de las células de microalgas en la biomasa gastada. El lisado producido por tratamiento ácido se crea preferiblemente a temperaturas superiores a la temperatura ambiente. Dicho lisado, por centrifugación o sedimentación por gravedad, se puede separar en capas, una de las cuales es una capa acuosa: lípida. Otras capas pueden incluir una bolita sólida, una capa acuosa y una capa lipídica. Los lípidos se pueden extraer de la capa de emulsión congelando, descongelando o enfriando la emulsión. En tales métodos, no es necesario agregar ningún disolvente orgánico, aunque en algunas realizaciones puede ser ventajoso hacerlo.

[0160] La siguiente sección describe microorganismos útiles para producir biomasa microbiana que contiene aceite adecuada para usar en los métodos de la invención.

III. MICROORGANISMOS ÚTILES PARA PRODUCIR ACEITE Y MÉTODOS PARA CULTIVARLOS

[0161] La presente invención surgió, en parte, del descubrimiento de que ciertos microorganismos se pueden usar para producir aceite, y las composiciones de hidrocarburos derivadas de los mismos, económicamente y en grandes cantidades para su uso en el combustible para el transporte y la industria petroquímica, así como muchas otras aplicaciones. Los microorganismos adecuados incluyen microalgas, bacterias oleaginosas, levadura oleaginosa y hongos. La transesterficación ácida de lípidos produce ésteres de ácidos grasos de cadena larga útiles como biodiesel. Se pueden aplicar otros procesos enzimáticos a los lípidos derivados de estos organismos como se describe aquí para producir ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos. La presente invención también proporciona métodos para cultivar microorganismos tales como microalgas para lograr una mayor productividad de lípidos y un mayor rendimiento de lípidos.

[0162] Los microorganismos útiles en la invención producen aceite (lípidos o hidrocarburos) adecuado para la producción de biodiesel o como materia prima para aplicaciones industriales. Los hidrocarburos adecuados para la producción de biodiesel incluyen triacilglicéridos (TAG) que contienen moléculas de ácidos grasos de cadena larga. Los hidrocarburos adecuados para aplicaciones industriales, como la fabricación, incluyen ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos. En algunas realizaciones, los ácidos grasos adecuados, o los correspondientes alcoholes primarios, aldehídos o alcanos, generados por los métodos descritos en este documento, contienen de al menos 8 a al menos 35 átomos de carbono. Los ácidos grasos de cadena larga para biodiesel generalmente contienen al menos 14 átomos de carbono o más.

[0163] Los ácidos grasos preferidos, o los correspondientes primarios alcoholes, aldehídos, y alcanos, para aplicaciones industriales contienen al menos 8 o más átomos de carbono. En ciertas realizaciones de la invención, los ácidos grasos anteriores, así como las otras moléculas de hidrocarburos correspondientes, están saturadas (sin dobles ni triples enlaces carbono-carbono); mono-no-saturadas (doble enlace carbono-carbono simple); o poliinsaturadas (dos o más dobles enlaces carbono-carbono); y son lineales (no cíclicos); y/o tienen poca o ninguna ramificación en sus estructuras.

[0164] Los triacilgliceroles que contienen longitudes de cadena de carbono en el intervalo de C8 a C22 se pueden producir usando los métodos de la invención y se prefieren para una variedad de aplicaciones. Para los tensioactivos, los TAG preferidos son típicamente C10-C14. Para biodiesel o diesel renovable, los TAGS preferidos son típicamente C16-C18. Para el combustible para aviones, los TAGS preferidos son típicamente C8-C10. Para la nutrición, los TAG preferidos son los ácidos grasos poliinsaturados C22 (como el DHA) y los carotenoides (como la astaxantina).

[0165] Cualquier especie de organismo que produce lípidos o hidrocarburos adecuados puede usarse en los métodos de la invención, aunque se prefieren los microorganismos que producen naturalmente altos niveles de lípidos o hidrocarburos adecuados. Metzger et al, Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486-496 y A Look Back at the US Department of Energy's Water's Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, revisan la producción de hidrocarburos por microorganismos. John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann y Paul Roessler (1998).

[0166] Las consideraciones que afectan la selección de un microorganismo para su uso en la invención incluyen, además de la producción de hidrocarburos adecuados para biodiésel o para aplicaciones industriales: (1) alto contenido de lípidos como porcentaje del peso celular; (2) facilidad de crecimiento; y (3) facilidad de procesamiento. En realizaciones particulares, el microorganismo produce células que son al menos: aproximadamente 40%, a 60% o más (incluyendo más de 70%) de lípidos cuando se cosecha para extracción de aceite. Para ciertas aplicaciones, los organismos que crecen heterotróficamente (en azúcar en ausencia de luz) o pueden ser diseñados para hacerlo, son útiles en los métodos de la invención. Véanse las solicitudes de patente de EE.UU. Nos 60/837,839, 61/118,994, 11/893,364 y 12/194,389, así como las publicaciones de solicitud de patente de EE.UU. 20090004715, 20090047721, 20090011480, 20090035842, 20090061493 y 20090148918; Solicitudes PCT Nos 2009/066141 y 2009/066142; y Publicación PCT N°2008/151149. Para aplicaciones en las que un organismo se modificará genéticamente, la facilidad de transformación y la disponibilidad de marcadores y promotores seleccionables, constitutivos y/o inducibles, que son funcionales en el microorganismo afectarán la selección del organismo a modificar.

[0167] Microalgas naturales son microorganismos preferidos para uso en los métodos de la invención. Por lo tanto, en diversas realizaciones preferidas de la presente invención, el microorganismo que produce un lípido, el microorganismo del que se extrae, recupera u obtiene el aceite, es una microalga. Los ejemplos de géneros y especies de microalgas que pueden usarse en los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los siguientes géneros y especies de microalgas.

Tabla 1. Microalgas.

[0168] En varias realizaciones preferidas de la presente invención, el microorganismo que produce un lípido o un microorganismo del que se puede extraer, recuperar u obtener aceite es un organismo de una especie del género Chlorella. En diversas realizaciones preferidas, las microalgas son Chlorella protothecoides, Chlorella ellipsoidea, Chlorella minutissima, Chlorella zofinienesi, Chlorella luteoviridis, Chlorella kessleri, Chlorella sorokiniana, Chlorella fusca var. vacuolata Chlorella sp, Chlorella cf. Minutissima o Chlorella emersonii. Chlorella es un género de algas verdes unicelulares, perteneciente al filo Chlorophyta. Es de forma esférica, aproximadamente 2 a 10 pm de diámetro, y es sin flagelos. Algunas especies de Chlorella son naturalmente heterotróficas. La Chlorella, particularmente los Chlorella protothecoides, es un microorganismo preferido para usar en la invención debido a su alta composición de lípidos y su capacidad para crecer heterotróficamente.

[0169] La Chlorella, preferiblemente, Chlorella protothecoides, Chlorella minutissima o Chlorella emersonii, pueden modificarse genéticamente para expresar uno o más genes heterólogos ("transgenes"). Se pueden encontrar ejemplos de expresión de transgenes en, p. ej., Chlorella, en la literatura (ver por ejemplo Current Microbiology Vol. 35 (1997), pp. 356-362; Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2000 Jul; 16 (4):443-6; Current Microbiology Vol. 38 (1999), pp. 335 341; Appl Microbiol Biotechnol (2006) 72: 197-205; Marine Biotechnology 4, 63-73, 2002; Current Genetics 39: 5, 365 370 (2001); Plant Cell Reports 18: 9, 778-780, (1999); Biologia Plantarium 42 (2): 209-216, (1999); Plant Pathol. J 21 (1): 13-20, (2005)), y dichas referencias enseñan diversos métodos y materiales para introducir y expresar genes de interés en tales organismos, como las solicitudes de patente mencionadas anteriormente. También se pueden diseñar otras microalgas productoras de lípidos, incluidas las Microalgas procarióticas (ver Kalscheuer et al, Applied Microbiology and Biotechnology, Volumen 52, Número 4/Octubre, 1999), que son adecuadas para su uso en los métodos de la invención.

[0170] Las especies de Chlorella adecuadas para su uso en la invención también pueden identificarse mediante un método que implica la amplificación de ciertas regiones diana del genoma. Por ejemplo, la identificación de una especie o cepa específica de Chlorella se puede lograr mediante la amplificación y secuenciación de ADN nuclear y/o cloroplasto usando cebadores y metodología usando cualquier región del genoma, como, por ejemplo, los métodos descritos en Wu et al. Bot. Bull. Acad. Sin. 42: 115-121 (2001). Identificación de aislamientos Chlorella spp. utilizando secuencias de ADN ribosomal. Los expertos en la técnica pueden utilizar métodos bien establecidos de análisis filogenético, como la amplificación y secuenciación del espaciador transcrito interno ribosómico (ADNr ITS1 e ITS2), ARNr 18S y otras regiones genómicas conservadas para identificar especies no solo de Chlorella, sino otros organismos productores de aceite y lípidos capaces de usar los métodos descritos aquí. Para ejemplos de métodos de identificación y clasificación de algas, ver Genetics, 170 (4): 1601-10 (2005) y RNA, 11 (4): 361-4 (2005).

[0171] La comparación de ADN genómico también se puede usar para identificar especies adecuadas de microalgas para usar en los métodos de la presente invención. Las regiones de ADN conservado, que incluyen pero no se limitan a ADN que codifica ARNr 23S, pueden amplificarse a partir de especies de microalgas y compararse con secuencias de consenso para detectar especies de microalgas que están taxonómicamente relacionadas con una microalga preferida para usar en los métodos de la presente invención. También se pueden usar comparaciones de ADN genómico similares para identificar especies adecuadas de levadura oleaginosa para usar en los métodos de la presente invención. Las regiones de ADN genómico conservado, tales como, entre otras, secuencias genómicas conservadas entre tres regiones principales de hongos 18S y cinco regiones principales de genes de ARNr 26S fúngicos pueden amplificarse a partir de especies de levaduras oleaginosas que pueden, por ejemplo, estar relacionadas taxonómicamente con especies de levadura oleaginosas preferidas usadas en la presente invención y comparadas con las regiones correspondientes de esas especies preferidas. El ejemplo 13 describe la secuenciación genómica de las regiones 3' conservadas de las regiones fúngicas 18S y 5' del ARNr 26S fúngico para 48 cepas de levaduras oleaginosas y las secuencias genómicas se enumeran como SEQ ID NO: 37-76.

[0172] En algunas realizaciones, la levadura oleaginosa preferida para usar en los métodos de la presente invención tiene secuencias de ADN genómico que codifican la secuencia genómica de ARNr 18S y 26S fúngica con al menos 75%, 85% o 95% de identidad de nucleótidos para uno o más de SEQ ID NOs: 37-76.

[0173] En algunas realizaciones, las microalgas preferidas para usar en los métodos de la presente invención tienen secuencias de ADN genómico que codifican 23S ARNr que son al menos 99%, o al menos 95%, o al menos 90%, o al menos 85% idénticas a secuencias de 23S ARNr de una especie de Chlorella.

[0174] Prototheca es un género de microalgas unicelulares que se cree que es un mutante no fotosintético de Chlorella. Mientras que Chlorella puede obtener su energía a través de la fotosíntesis, las especies del género Prototheca son heterótrofos obligados. Las prototecas son de forma esférica, de unos 2 a 15 micrómetros de diámetro y carecen de flagelos. En diversas realizaciones preferidas, las microalgas utilizadas en los métodos de la invención se seleccionan de las siguientes especies de Prototheca: Prototheca stagnora, Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis, Prototheca wickerhamii y Prototheca zopfii.

[0175] En algunas realizaciones, las microalgas preferidas para usar en los métodos de la presente invención tienen secuencias de ADN genómico que codifican 23S ARNr que tienen al menos 99%, o al menos 95%, o al menos 90%, o al menos 85% idénticas a una secuencia 23S ARNr de una especie de Prototheca.

[0176] Además de Prototheca y Chlorella, se pueden usar otras microalgas de acuerdo con los métodos de la presente invención. En diversas realizaciones preferidas, las microalgas se seleccionan de un género o especie de cualquiera de los siguientes géneros y especies: Parachlorella kessleri, Parachlorella beijerinckii, Neochloris oleabundans, Bracteacoccus grandis, Bracteacoccus cinnabarinas, Bracteococcus aerius, Bracteococcus sp. o Scenedesmus rebescens. Otros ejemplos no limitantes de microalgas (incluida Chlorella) se enumeran en la Tabla 1, arriba.

[0177] Además de las microalgas, la levadura oleaginosa puede acumular más del 20% de su peso de células secas como lípidos y, por lo tanto, son útiles en los métodos de la invención. En una realización preferida de la presente invención, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo del que se puede extraer, recuperar u obtener aceite, es una levadura oleaginosa. Los ejemplos de levadura oleaginosa que pueden usarse en los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la levadura oleaginosa enumerada en la Tabla 2. Métodos ilustrativos para el cultivo de levadura oleaginosa (Yarrow ialipolyticay Rhodotorulagraminis) para lograr alto contenido de aceite se proporciona en los ejemplos a continuación.

Tabla 2. Levadura oleaginosa.

Rhodotorula glutinis var. glutinis, Rhodotorula gracilis, Rhodotorula graminis Rhodotorula minuta, Rhodotorula mucilaginosa, Rhodotorula mucilaginosa var. mucilaginosa, Rhodotorula terpenoidalis, Rhodotorula toruloides, Sporobolomyces alborubescens, Starmerella bombicola, Torulaspora delbruekii, Torulaspora pretoriensis, Trichosporon behrend, Trichosporon brassicae, Trichosporon domesticum, Trichosporon laibachii, Trichosporon loubieri, Trichosporon loubieri var. loubieri, Trichosporon montevideense, Trichosporon pullulans, Trichosporon sp., Wickerhamomyces Canadensis, Yarrowia lipolytica, y Zygoascus meyerae.

[0178] En una realización preferida de la presente invención, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo del que se puede extraer, recuperar u obtener un lípido, es un hongo. Los ejemplos de hongos que pueden usarse en los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, los hongos enumerados en la Tabla 3.

Tabla 3. Hongos oleaginosos.

[0179] Por lo tanto, en una realización de la presente invención, el microorganismo utilizado para la producción de biomasa microbiana para su uso en los métodos de la invención es un hongo. Los ejemplos de hongos adecuados (p. ej, Mortierella alpine, Mucor circinelloides y Aspergillus ochraceus) incluyen aquellos que han demostrado ser susceptibles de manipulación genética, como se describe en la literatura (ver, por ejemplo, Microbiology, Jul; 153 (Pt,7): 2013-25 (2007); Mol Genet Genomics, junio; 271 (5): 595-602 (2004); Curr Genet, marzo; 21 (3): 215-23 (1992); Current Microbiology, 30 (2): 83-86 (1995); Sakuradani, NISR Research Grant, "Studies of Metabolic Engineering of Useful Lipid-producing Microorganisms" (2004), y PCT/JP2004/012021).

[0180] En otras realizaciones de la presente invención, un microorganismo que produce un lípido o un microorganismo del que se puede extraer, recuperar u obtener aceite es una bacteria oleaginosa. Las bacterias oleaginosas son bacterias que pueden acumular más del 20% de su peso de células secas como lípidos. Las especies de bacterias oleaginosas para usar en los métodos de la presente invención incluyen especies del género Rhodococcus, tales como Rhodococcus opacus y Rhodococcus sp. Los métodos de cultivo de bacterias oleaginosas, como Rhodococcus opacus, son conocidos en la técnica (véase Waltermann, et al, (2000) Microbiology, 146: 1143-1149). En los ejemplos a continuación se proporcionan métodos ilustrativos para cultivar Rhodococcus opacus para lograr un alto contenido de aceite.

[0181] Para producir biomasa microbiana que contiene aceite adecuada para usar en los métodos de la invención, se cultivan microorganismos para la producción de aceite (p. ej., hidrocarburos, lípidos, ácidos grasos, aldehídos, alcoholes y alcanos). Este tipo de cultivo generalmente se realiza primero a pequeña escala e, inicialmente, al menos, en condiciones en las que puede crecer el microorganismo inicial. Por ejemplo, si el microorganismo de partida es un fotoautótrofo, el cultivo inicial se realiza en presencia de luz. Las condiciones de cultivo pueden cambiarse si el microorganismo evoluciona o se manipula para que crezca independientemente de la luz. El cultivo para fines de producción de hidrocarburos se realiza preferentemente a gran escala. Preferiblemente, una fuente de carbono fija está presente en exceso. El cultivo también puede exponerse a la luz parte o todo el tiempo, si se desea o es beneficioso.

[0182] Las microalgas se pueden cultivar en medios líquidos. El cultivo puede estar contenido dentro de un biorreactor. Opcionalmente, el biorreactor no permite la entrada de luz. Alternativamente, las microalgas pueden cultivarse en fotobiorreactores que contienen una fuente fija de carbono y permiten que la luz penetre en las células. Para las células de microalgas que pueden utilizar la luz como fuente de energía, la exposición de las células a la luz, incluso en presencia de una fuente de carbono fijado que transporten y utilicen las células (es decir, el crecimiento mixotrófico), sin embargo, acelera el crecimiento en comparación con el cultivo de esas células en la oscuridad. Los parámetros de la condición de cultivo pueden manipularse para optimizar la producción total de aceite, la combinación de especies de hidrocarburos producidos y/o la producción de una especie de hidrocarburos particular. En algunos casos, es preferible cultivar células en la oscuridad, como, por ejemplo, cuando se usan fermentadores extremadamente grandes (40.000 litros y más) que no permiten que la luz golpee una proporción significativa (o ninguna) del cultivo.

[0183] El medio de cultivo de microalgas típicamente contiene componentes tales como una fuente de nitrógeno fija, oligoelementos, opcionalmente un tampón para el mantenimiento del pH y fosfato. Los componentes además de una fuente de carbono fija, como el acetato o la glucosa, pueden incluir sales como el cloruro de sodio, particularmente para las microalgas de agua de mar. Ejemplos de oligoelementos incluyen zinc, boro, cobalto, cobre, manganeso y molibdeno, por ejemplo, en las formas respectivas de ZnCh, H3BO3, C oC ha^ O , CuC h ^ ^ O , M n C h ^ ^ O y (NH⁴)⁶MoyO²⁴-4H²O. También se pueden manipular otros parámetros de cultivo, como el pH de los medios de cultivo, la identidad y concentración de oligoelementos y otros constituyentes de los medios.

[0184] Para organismos capaces de crecer en una fuente de carbono fija, la fuente de carbono fija puede ser, por ejemplo, glucosa, fructosa, sacarosa, galactosa, xilosa, mañosa, ramnosa, N-acetilglucosamina, glicerol, floridosida, ácido glucurónico y/o acetato. La una o más fuentes de carbono fijas proporcionadas exógenamente se pueden suministrar al medio de cultivo a una concentración de al menos aproximadamente 50 pm a al menos 500 mM, y en diversas cantidades en ese intervalo (es decir, 100 pm, 500 pm, 5 mM, 50 mM).

[0185] Ciertas microalgas se pueden cultivar en presencia de luz. Se puede manipular la cantidad de fotones que impactan en un cultivo de tales células de microalgas, así como otros parámetros, como el espectro de longitud de onda y la relación de oscuridad: horas de luz por día. Las microalgas también se pueden cultivar con luz natural, así como combinaciones simultáneas y/o alternas de luz natural y luz artificial. Por ejemplo, las microalgas del género Chlorella pueden cultivarse bajo luz natural durante el día y bajo luz artificial durante la noche.

[0186] Se puede manipular el contenido de gas de un fotobiorreactor para cultivar microorganismos como las microalgas. Parte del volumen de un fotobiorreactor puede contener gas en lugar de líquido. Las entradas de gas pueden usarse para bombear gases al fotobiorreactor. Se puede bombear cualquier gas a un fotobiorreactor, incluyendo aire, mezclas de aire/CO2, gases nobles como el argón y otros. La tasa de entrada de gas en un fotobiorreactor también se puede manipular. El aumento del flujo de gas en un fotobiorreactor aumenta la turbidez de un cultivo de microalgas. La colocación de puertos que transportan gases en un fotobiorreactor también puede afectar la turbidez de un cultivo a una velocidad de flujo de gas dada. Las mezclas de aire/CO2 se pueden modular para generar cantidades óptimas de CO2 para el crecimiento máximo de un organismo particular. Las microalgas crecen significativamente más rápido a la luz bajo, por ejemplo, 3% de CO²/97% de aire que en 100% de aire. 3% de CO²/97% de aire tiene aproximadamente 100 veces más CO2 que en el aire. Por ejemplo, mezclas de aire:CO2 en un intervalo de aproximadamente 99,75% de aire: 0,25% de CO2 a 95,00% de aire: 5,0% de CO2 se puede infundir en un biorreactor o fotobiorreactor.

[0187] Los cultivos de microalgas también pueden someterse a mezcla usando dispositivos tales como palas giratorias e impulsores, balanceo de un cultivo, barras de agitación, infusión de gas a presión y otros instrumentos; tales métodos se pueden usar para asegurar que todas las células en un fotobiorreactor estén expuestas a la luz pero, por supuesto, encuentren aplicación con cultivos de células que no usan la luz como fuente de energía.

[0188] Algunas especies de microalgas pueden crecer utilizando una fuente de carbono fija, como glucosa o acetato, en ausencia de luz. Tal crecimiento se conoce como crecimiento heterotrófico. Para Chlorella protothecoides, por ejemplo, el crecimiento heterotrófico produce una alta producción de biomasa y una acumulación de alto contenido de lípidos. Por lo tanto, una alternativa al crecimiento fotosintético y la propagación de microorganismos, como se describió anteriormente, es el uso del crecimiento heterotrófico y la propagación de microorganismos, en condiciones en las que una fuente de carbono fija proporciona energía para el crecimiento y la acumulación de lípidos. En algunas realizaciones, la fuente de energía de carbono fija comprende material celulósico, que incluye material celulósico despolimerizado, un azúcar de 5 carbonos o un azúcar de 6 carbonos.

[0189] Se han informado métodos para el crecimiento y la propagación de Chlorella protothecoides a altos niveles de aceite como porcentaje del peso seco (véase, por ejemplo, Miao y Wu, J. Biotechnology, 2004, 11: 85-93 y Miao y Wu, Biosource Technology (2006) 97: 841-846, métodos de informe para obtener 55% de peso de células secas de aceite).

[0190] La Publicación PCT WO2008/151149 describe las condiciones de crecimiento preferidas para Chlorella. Se pueden cultivar múltiples especies de Chlorella y múltiples cepas dentro de una especie en presencia de glicerol. La solicitud de patente mencionada anteriormente describe parámetros de cultivo que incorporan el uso de glicerol para la fermentación de múltiples géneros de microalgas. Varias especies y cepas de Chlorella proliferan muy bien no solo en glicerol de grado reactivo purificado, sino también en subproducto de glicerol acidulado y no acidulado de la transesterificación de biodiesel. En algunos casos, las microalgas, como las cepas de Chlorella, experimentan una división celular más rápida en presencia de glicerol que en presencia de glucosa. En estos casos, los procesos de crecimiento de dos etapas en los que las células se alimentan primero con glicerol para aumentar la densidad celular y luego se alimentan con glucosa para acumular lípidos pueden mejorar la eficiencia con la que se producen los lípidos.

[0191] Otras materias primas para el cultivo de microalgas en condiciones de crecimiento heterotrófico para los fines de la presente invención incluyen mezclas de glicerol y glucosa, mezclas de glucosa y xilosa, mezclas de fructosa y glucosa, sacarosa, glucosa, fructosa, xilosa, arabinosa, manosa, galactosa, acetato y melaza. Otras materias primas adecuadas incluyen la mazorca de maíz, la pulpa de remolacha azucarera y la hierba de cambio en combinación con enzimas de despolimerización.

[0192] Para la producción de lípidos y aceites, las células, incluidas las células recombinantes, se fermentan típicamente en grandes cantidades. El cultivo puede ser en grandes volúmenes líquidos, como en cultivos en suspensión como ejemplo. Otros ejemplos incluyen comenzar con un pequeño cultivo de células que se expande en una gran biomasa en combinación con el crecimiento y la propagación celular, así como la producción de lípidos (aceite). Se pueden usar biorreactores o fermentadores de acero para acomodar grandes volúmenes de cultivo. Para estas fermentaciones, el uso de condiciones de crecimiento fotosintético puede ser imposible o al menos poco práctico e ineficiente, por lo que pueden preferirse las condiciones de crecimiento heterotróficas.

[0193] Las fuentes de nutrientes apropiadas para el cultivo en un fermentador para condiciones de crecimiento heterotrófico incluyen materias primas tales como una o más de las siguientes: una fuente de carbono fija como glucosa, almidón de maíz, material celulósico despolimerizado, sacarosa, caña de azúcar, remolacha azucarera, lactosa, suero de leche, melaza o similares; una fuente de nitrógeno, como proteínas, harina de soja, licor de maíz, amoníaco (puro o en forma de sal), nitrato o sal de nitrato; y una fuente de fósforo, como las sales de fosfato. Además, un fermentador para condiciones de crecimiento heterotrófico permite el control de condiciones de cultivo tales como temperatura, pH, tensión de oxígeno y niveles de dióxido de carbono. Opcionalmente, los componentes gaseosos, como el oxígeno o el nitrógeno, pueden burbujearse a través de un cultivo líquido. Otras fuentes de almidón (glucosa) incluyen trigo, papa, arroz y sorgo. Otras fuentes de carbono incluyen corrientes de proceso como glicerol de grado técnico, licor negro y ácidos orgánicos como acetato y melaza. Las fuentes de carbono también se pueden proporcionar como una mezcla, como una mezcla de sacarosa y pulpa de remolacha azucarera despolimerizada.

[0194] Se puede usar un fermentador para condiciones de crecimiento heterotrófico para permitir que las células experimenten las diversas fases de su ciclo fisiológico. Como ejemplo, se puede introducir un inóculo de células productoras de lípidos en un medio seguido de un período de retraso (fase de retraso) antes de que las células comiencen a propagarse. Después del período de retraso, la tasa de propagación aumenta de manera constante y entra en la fase logarítmica o exponencial. La fase exponencial a su vez es seguida por una disminución de la propagación debido a la disminución de nutrientes como el nitrógeno, el aumento de sustancias tóxicas y los mecanismos de detección de quórum. Después de esta ralentización, la propagación se detiene y las células entran en una fase estacionaria o en un estado de crecimiento estable, dependiendo del entorno particular proporcionado a las células.

[0195] En un método de cultivo heterotrófico útil para los propósitos de la presente invención, los microorganismos se cultivan usando biomasa celulósica despolimerizada como materia prima. A diferencia de otras materias primas que pueden usarse para cultivar microorganismos, como el almidón de maíz o la sacarosa de la caña de azúcar o la remolacha azucarera, la biomasa celulósica (despolimerizada o no) no es adecuada para el consumo humano. La biomasa celulósica (p. ej, rastroj, como el rastrojo de maíz) es económica y está fácilmente disponible; sin embargo, los intentos de utilizar este material como piensos para la levadura han fallado. En particular, se ha encontrado que tales piensos son inhibitorios para el crecimiento de la levadura, y la levadura no puede usar los azúcares de 5 carbonos producidos a partir de materiales celulósicos (p. ej., xilosa de hemicelulosa). Por el contrario, las microalgas pueden proliferar en material celulósico despolimerizado. Por consiguiente, la invención contempla métodos para cultivar una microalga en condiciones de crecimiento heterotrófico en presencia de un material celulósico y/o un azúcar de 5 carbonos. Los materiales celulósicos generalmente incluyen: 40-60% de celulosa; 20-40% de hemicelulosa; y 10-30% de lignina.

[0196] Materiales celulósicos adecuados incluyen residuos de cultivos energéticos herbáceos y leñosos, así como cultivos agrícolas, es decir, las partes de la planta, principalmente tallos y típicamente no hojas retiradas de los campos con la comida principal o producto de fibra. Los ejemplos incluyen desechos agrícolas tales como bagazo de caña de azúcar, cáscaras de arroz, fibra de maíz (incluidos tallos, hojas, cáscaras y mazorcas), paja de trigo, paja de arroz, pulpa de remolacha azucarera, pulpa de cítricos, cáscaras de cítricos; desechos forestales tales como adelgazamiento de madera dura y blanda, y residuos de madera dura y blanda de operaciones de madera; desechos de madera tales como desechos de aserraderos (astillas de madera, aserrín) y desechos de fábricas de pulpa; desechos urbanos, como fracciones de papel de desechos sólidos municipales, desechos urbanos de madera y desechos verdes urbanos, como recortes municipales de césped; y residuos de construcción de madera. Los productos celulósicos adicionales incluyen cultivos celulósicos dedicados, como hierba de switch, madera de álamo híbrida y miscanto, caña de fibra y sorgo de fibra. Los azúcares de cinco carbonos que se producen a partir de dichos materiales incluyen la xilosa.

[0197] Algunos microbios pueden procesar material celulósico y utilizar directamente materiales celulósicos como fuente de carbono. Sin embargo, el material celulósico puede necesitar ser tratado para aumentar el área de superficie accesible o para que la celulosa se descomponga primero como preparación para la utilización microbiana como fuente de carbono. Las formas de preparar o tratar previamente el material celulósico para la digestión enzimática son bien conocidas en la técnica. Los métodos se dividen en dos categorías principales: (1) separar el material celulósico en partículas más pequeñas para aumentar el área de superficie accesible; y (2) tratar químicamente el material celulósico para crear un sustrato utilizable para la digestión enzimática.

[0198] Los métodos para aumentar el área de superficie accesible incluyen explosión de vapor, que implica el uso de vapor a altas temperaturas para separar materiales celulósicos. Debido al requisito de alta temperatura de este proceso, algunos de los azúcares en el material celulósico pueden perderse, reduciendo así la fuente de carbono disponible para la digestión enzimática (ver, por ejemplo, Chahal, DS et al, Proceedings of the 2nd World Congress of Chemical Engineering; (1981) y Kaar et al, Biomass and Bioenergy (1998) 14 (3): 277-87). La explosión de amoníaco permite la explosión de material celulósico a una temperatura más baja, pero es más costoso de realizar y el amoníaco podría interferir con los procesos posteriores de digestión enzimática (ver, por ejemplo, Dale, BE et al, Biotechnology and Bioengineering (1982); 12: 31-43). Otra técnica de explosión implica el uso de una explosión de dióxido de carbono supercrítico para romper el material celulósico en fragmentos más pequeños (véase, por ejemplo, Zheng et al, Biotechnology Letters (1995); 17 (8): 845-850).

[0199] Los métodos para tratar químicamente el material celulósico para crear sustratos utilizables para la digestión enzimática también son conocidos en la técnica. La patente de los Estados Unidos N° 7,413,882 describe el uso de microbios genéticamente modificados que secretan beta-glucosidasa en el caldo de fermentación y el tratamiento del material celulósico con el caldo de fermentación para mejorar la hidrólisis del material celulósico en glucosa. El material celulósico también puede tratarse con ácidos y bases fuertes para ayudar a la posterior digestión enzimática. La patente de los Estados Unidos N° 3,617,431 describe el uso de la digestión alcalina para descomponer los materiales celulósicos.

[0200] Los microorganismos pueden poseer tanto la capacidad de utilizar una materia prima no comestible, como material celulósico o glicerol, como fuente de carbono (o un material celulósico pretratado como fuente de carbono) y la capacidad natural de producir aceites comestibles. Al utilizar estas dos propiedades, material celulósico o glicerol, que normalmente no forma parte de la cadena alimentaria humana (a diferencia de la glucosa y la sacarosa del maíz de la caña de azúcar y la remolacha azucarera, que son composiciones alimenticias adecuadas para el consumo humano) pueden convertirse en aceites comestibles de alta nutrición, que pueden proporcionar nutrientes y calorías como parte de la dieta diaria humana (o animal). De esta manera, la materia prima previamente no comestible puede convertirse en aceites comestibles de alta nutrición y otros productos alimenticios y composiciones alimenticias que contienen estos aceites comestibles de alta nutrición, así como aceites útiles para otros fines.

[0201] Los biorreactores pueden emplearse para métodos de propagación y crecimiento heterotróficos. Como se apreciará, las disposiciones hechas para hacer que la luz esté disponible para las células en los métodos de crecimiento fotosintético son innecesarias cuando se usa una fuente de carbono fija en los métodos de propagación y crecimiento heterotróficos descritos aquí.

[0202] Los ejemplos específicos de condiciones de proceso y métodos de crecimiento y propagación heterotróficos descritos en este documento pueden ser combinados de cualquier manera adecuada para mejorar las eficiencias de crecimiento microbiano y la producción de lípidos. Por ejemplo, los microbios que tienen una mayor capacidad para utilizar cualquiera de los piensos descritos anteriormente para una mayor proliferación y/o producción de lípidos pueden usarse en los métodos de la invención.

[0203] El crecimiento mixotrófico implica el uso de fuentes de carbono tanto ligeras como fijas como fuentes de energía para cultivar células. El crecimiento mixotrófico puede realizarse en un fotobiorreactor. Las microalgas se pueden cultivar y mantener en fotobiorreactores cerrados hechos de diferentes tipos de material transparente o semitransparente. Dicho material puede incluir cerramientos Plexiglass®, cerramientos de vidrio, bolsas hechas de sustancias como el polietileno, tuberías transparentes o semitransparentes y otros materiales. Las microalgas se pueden cultivar y mantener en fotobiorreactores abiertos, como estanques de alcantarilla, estanques de sedimentación y otros recipientes no cerrados. La siguiente discusión sobre los fotobiorreactores útiles para las condiciones de crecimiento mixotrófico es aplicable también a las condiciones de crecimiento fotosintético.

[0204] Los fotobiorreactores pueden tener puertos que permiten la entrada de gases, sólidos, semisólidos y líquidos en la cámara que contiene las microalgas. Los puertos suelen estar unidos a tubos u otros medios de transporte de sustancias. Los puertos de gas, por ejemplo, transportan gases al cultivo. El bombeo de gases a un fotobiorreactor puede servir tanto para alimentar las células con CO2 como para otros gases y para airear el cultivo y, por lo tanto, generar turbidez. La cantidad de turbidez de un cultivo varía a medida que se altera el número y la posición de los puertos de gas. Por ejemplo, los puertos de gas se pueden colocar a lo largo de la parte inferior de una bolsa cilíndrica de polietileno. Las microalgas crecen más rápido cuando se agrega CO2 al aire y se burbujea en un fotobiorreactor. Por ejemplo, se puede infundir una mezcla de 5% de CO²:95% de aire en un fotobiorreactor que contiene células de Botryococcus para tales fines (véase, por ejemplo, J Agric Food Chem. 54 (13): 4593-9 (2006); J Biosci Bioeng. 87 (6): 811-5 (1999) y J Nat Prod. 66 (6): 772-8 (2003)).

[0205] Los fotobiorreactores pueden exponerse a una o más fuentes de luz para proporcionar luz a las microalgas como fuente de energía a través de la luz dirigida a una superficie del fotobiorreactor. Preferiblemente, la fuente de luz proporciona una intensidad que es suficiente para que las células crezcan, pero no tan intensa como para causar daño oxidativo o provocar una respuesta fotoinhibitiva. En algunos casos, una fuente de luz tiene un rango de longitud de onda que imita o imita aproximadamente el rango del sol. En otros casos, se usa un rango de longitud de onda diferente. Los fotobiorreactores se pueden colocar al aire libre o en un invernadero u otra instalación que permita que la luz del sol golpee la superficie. Las intensidades de fotones preferidas para las especies del género Botryococcus están entre 25 y 500 pE itt2 s^_1(véase, por ejemplo, Photosynth Res. 84 (1-3): 21-7 (2005)).

[0206] Como se indicó anteriormente, los fotobiorreactores preferiblemente tienen uno o más puertos que permiten la entrada de medios. No es necesario que solo una sustancia entre o salga de un puerto. Por ejemplo, un puerto puede usarse para hacer fluir medios de cultivo en el fotobiorreactor y luego puede usarse para muestreo, entrada de gas, salida de gas u otros fines. En algunos casos, un fotobiorreactor se llena con medios de cultivo al comienzo de un cultivo, y no se infunden más medios de crecimiento después de inocular el cultivo. En otras palabras, la biomasa de microalgas se cultiva en un medio acuoso durante un período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número; sin embargo, las cantidades de medio de cultivo acuoso no fluyen a través del fotobiorreactor durante todo el período de tiempo. Así, en algunas realizaciones, el medio de cultivo acuoso no fluye a través del fotobiorreactor después de la inoculación.

[0207] En otros casos, los medios de cultivo pueden fluir a través del fotobiorreactor durante todo el período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunas realizaciones, los medios se infunden en el fotobiorreactor después de la inoculación pero antes de que las células alcancen la densidad deseada. En otras palabras, no se mantiene un régimen de flujo turbulento de entrada de gas y entrada de medios para la reproducción de microalgas hasta que se haya logrado un aumento deseado en el número de dichas microalgas.

[0208] Los fotobiorreactores típicamente tienen uno o más puertos que permiten la entrada de gas. El gas puede servir tanto para proporcionar nutrientes como el CO2 como para proporcionar turbulencias en los medios de cultivo. La turbulencia se puede lograr colocando un puerto de entrada de gas por debajo del nivel de los medios de cultivo acuosos para que el gas que ingresa al fotobiorreactor burbujee a la superficie del cultivo. Uno o más puertos de salida de gas permiten que el gas escape, evitando así la acumulación de presión en el fotobiorreactor. Preferiblemente, un puerto de salida de gas conduce a una válvula "unidireccional" que evita que entren microorganismos contaminantes en el fotobiorreactor. En algunos casos, las células se cultivan en un fotobiorreactor durante un período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número, sin embargo, un régimen de flujo turbulento con remolinos turbulentos predominantemente en los medios de cultivo causados por la entrada de gas no se mantiene durante todo el período de tiempo. En otros casos, se puede mantener un régimen de flujo turbulento con remolinos turbulentos predominantemente en todos los medios de cultivo causados por la entrada de gas durante todo el período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En algunos casos, no se mantiene un rango predeterminado de relaciones entre la escala del fotobiorreactor y la escala de remolinos durante el período de tiempo durante el cual las microalgas se reproducen y aumentan en número. En otros casos, dicho rango puede mantenerse.

[0209] Los fotobiorreactores típicamente tienen al menos un puerto que puede usarse para muestrear el cultivo. Preferiblemente, un puerto de muestreo puede usarse repetidamente sin alterar comprometiendo la naturaleza axénica del cultivo. Se puede configurar un puerto de muestreo con una válvula u otro dispositivo que permita detener e iniciar el flujo de muestra. Alternativamente, un puerto de muestreo puede permitir el muestreo continuo. Los fotobiorreactores también suelen tener al menos un puerto que permite la inoculación de un cultivo. Dicho puerto también se puede utilizar para otros fines, como medios o entrada de gas.

[0210] Los microorganismos útiles de acuerdo con los métodos de la presente invención se encuentran en diversas ubicaciones y entornos en todo el mundo. Como consecuencia de su aislamiento de otras especies y su divergencia evolutiva resultante, el medio de crecimiento particular para el crecimiento óptimo y la generación de aceite y/o lípidos de cualquier especie particular de microbio puede necesitar ser determinado experimentalmente. En algunos casos, ciertas cepas de microorganismos pueden ser incapaces de crecer en un medio de crecimiento particular debido a la presencia de algún componente inhibidor o la ausencia de algún requerimiento nutricional esencial requerido por la cepa particular de microorganismo. Hay una variedad de métodos conocidos en la técnica para cultivar una amplia variedad de especies de microalgas para acumular altos niveles de lípidos como porcentaje del peso de las células secas, y también se conocen en la técnica métodos para determinar las condiciones óptimas de crecimiento para cualquier especie de interés.

[0211] Los medios de crecimiento sólidos y líquidos generalmente están disponibles en una amplia variedad de fuentes, y las instrucciones para la preparación de medios particulares que son adecuados para una amplia variedad de cepas de microorganismos se pueden encontrar, por ejemplo, en línea en http://www.utex.org/, un sitio mantenido por la Universidad de Texas en Austin para su colección cultural de algas (UTEX). Por ejemplo, varios medios de agua dulce y agua salada incluyen los que se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4. Medios de algas.

[0212] Un medio adecuado para el cultivo de Chlorella protothecoides comprende Medio de Proteosa. Este medio es adecuado para cultivos axénicos, y se puede preparar un volumen de 1 L del medio (pH < 6,8) mediante la adición de 1 g de peptona de proteosa a 1 litro de Medio Bristol. Medio Bristol comprende 2,94 mM de NaNO3, 0,17 mM de CaCh'2H2O, 0,3 mM de MgSO4-7H2O, 0,43 mM, 1,29 mM de KH2PO4 y 1,43 mM de NaCl en una solución acuosa. Para 1,5% de medio de agar, se pueden agregar 15 g de agar a 1 L de la solución. La solución se cubre y se esteriliza en autoclave, y luego se almacena a una temperatura refrigerada antes de su uso.

[0213] Se pueden identificar fácilmente otros medios adecuados para usar con los métodos de la invención consultando la URL identificada anteriormente, o consultando otras organizaciones que mantienen cultivos de microorganismos, SAG la Culture Collection of Algae en la Universidad de Gotinga (Gotinga, Alemania), CCAP la Culture Collection of Algae y protozoos gestionados por la Asociación Escocesa de Ciencias del Mar (Escocia, Reino Unido) y CCALA, la Culture Collection of Algae Laboratory en el Instituto de Botánica (Trebon, República Checa).

[0214] Los presentes métodos son particularmente adecuados para microalgas que tienen un alto contenido de lípidos (p. ej., al menos 20% de lípidos en peso seco). Las condiciones del proceso pueden ajustarse para aumentar el peso porcentual de las células que son lípidos. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se cultiva un microbio (p. ej., una microalga) en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, como, por ejemplo, nitrógeno y/o fósforo y/o azufre, mientras se proporciona un exceso de energía fija de carbono como la glucosa. La limitación de nitrógeno tiende a aumentar el rendimiento de lípidos microbianos sobre el rendimiento de lípidos microbianos en un cultivo en el que se proporciona nitrógeno en exceso. En realizaciones particulares, el aumento en el rendimiento de lípidos es de al menos aproximadamente 10% a 100% a tanto como 500% o más. El microbio puede cultivarse en presencia de una cantidad limitante de un nutriente durante una parte del período de cultivo total o durante todo el período. En realizaciones particulares, la concentración de nutrientes se cicla entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total.

[0215] Para aumentar los lípidos como un porcentaje del peso de las células secas, se puede emplear acetato en la materia prima para un microbio productor de lípidos (p. ej., una microalga). Acetato alimenta directamente en el punto de metabolismo que inicia la síntesis de ácidos grasos (es decir, acetil-CoA); por lo tanto, proporcionar acetato en el cultivo puede aumentar la producción de ácidos grasos. Generalmente, el microbio se cultiva en presencia de una cantidad suficiente de acetato para aumentar el rendimiento de lípidos microbianos, y/o el rendimiento de ácidos grasos microbianos, específicamente, sobre el rendimiento de lípidos microbianos (p. ej., ácidos grasos) en ausencia de acetato. La alimentación con acetato es un componente útil de los métodos proporcionados aquí para generar biomasa de microalgas que tiene un alto porcentaje de peso de células secas como lípidos.

[0216] En un estado de crecimiento estable, las células acumulan aceite (lípidos) pero no experimentan división celular. En una realización de la invención, el estado de crecimiento se mantiene al continuar proporcionando todos los componentes del medio de crecimiento original a las células con la excepción de una fuente fija de nitrógeno. El cultivo de células de microalgas mediante la alimentación de todos los nutrientes proporcionados originalmente a las células, excepto una fuente fija de nitrógeno, como la alimentación de las células durante un período prolongado de tiempo, puede dar como resultado que un alto porcentaje del peso de las células secas sea lípido. En algunas realizaciones, los nutrientes, tales como metales traza, fosfatos y otros componentes, distintos de una fuente de carbono fija, se pueden proporcionar a una concentración mucho más baja que la proporcionada originalmente en la fermentación inicial para evitar "sobrealimentar" las células con nutrientes que no serán utilizadas por las células, reduciendo así los costos.

[0217] En otras realizaciones, la biomasa con alto contenido de lípidos (aceite) puede generarse alimentando una fuente de carbono fija a las células después de que se haya consumido todo el nitrógeno fijo durante períodos prolongados de tiempo, tal como de al menos 8 a 16 o más días. En algunas realizaciones, se permite que las células acumulen aceite en presencia de una fuente de carbono fija y en ausencia de una fuente de nitrógeno fija durante más de 30 días. Preferiblemente, los microorganismos cultivados usando las condiciones descritas en el presente documento y conocidas en la técnica comprenden lípidos en un intervalo de al menos aproximadamente 20% de lípidos por peso de células secas a aproximadamente 75% de lípidos por peso de células secas.

[0218] Otra herramienta para permitir que las células acumulen un alto porcentaje de peso de células secas como lípidos implica la selección de materia prima. Múltiples especies de Chlorella y múltiples cepas dentro de una especie de Chlorella acumulan un mayor porcentaje de peso de células secas como lípidos cuando se cultivan en presencia de subproducto de biodiésel glicerol que cuando se cultivan en presencia de concentraciones equivalentes de glicerol puro de grado reactivo. De manera similar, Chlorella puede acumular un mayor porcentaje de peso de células secas como lípidos cuando se cultiva en presencia de una mezcla de concentración igual (porcentaje en peso) de glicerol y glucosa que cuando se cultiva en presencia de solo glucosa.

[0219] Otra herramienta para permitir que las células acumulen un alto porcentaje de peso de células secas como lípidos implica la selección de materia prima, así como el momento de la adición de ciertas materias primas. Por ejemplo, Chlorella puede acumular un mayor porcentaje de peso de células secas como lípidos cuando se agrega glicerol a un cultivo durante un primer período de tiempo, seguido de la adición de glucosa y el cultivo continuo durante un segundo período de tiempo, que cuando el mismo cantidades de glicerol y glucosa se agregan juntas al comienzo de la fermentación. Véase la publicación PCT no 2008/151149.

[0220] Por lo tanto, el porcentaje de lípidos (aceite) del peso de las células secas en la producción de lípidos microbianos puede mejorarse, al menos con respecto a ciertas células, mediante el uso de ciertas materias primas y la separación temporal de las fuentes de carbono, así como manteniendo las células en un estado de crecimiento heterotrófico en el que acumulan aceite pero no sufren división celular. Los ejemplos a continuación muestran el crecimiento de varios microbios, incluidas varias cepas de microalgas, para acumular niveles más altos de lípidos como DCW.

[0221] En otra realización, producción de lípidos se incrementa mediante el cultivo de un microbio productor de lípidos (p. ej., las microalgas) en presencia de uno o más cofactor(es) para una enzima de la ruta de los lípidos (p. ej., una enzima sintética de material de ácido graso). Generalmente, la concentración del (de los) cofactor(es) es suficiente para aumentar lípido microbiano (p. ej., ácido graso) de rendimiento sobre el rendimiento de lípidos microbianos en ausencia del (de los) cofactor(es). En una realización particular, los cofactores se proporcionan al cultivo incluyendo en el cultivo un microbio (p. ej., microalgas) que contiene un gen exógeno que codifica el (los) cofactor(es). Alternativamente, se pueden proporcionar cofactores a un cultivo incluyendo un microbio (p. ej., microalgas) que contiene un gen exógeno que codifica una proteína que participa en la síntesis del cofactor. En ciertas realizaciones, los cofactores adecuados incluyen cualquier vitamina requerida por una enzima de la ruta de lípidos, tal como, por ejemplo: biotina o pantotenato. Los genes que codifican cofactores adecuados para su uso en la invención o que participan en la síntesis de dichos cofactores son bien conocidos y pueden introducirse en microbios (p. ej., microalgas), utilizando construcciones y técnicas como las descritas en el presente documento.

[0222] Las condiciones del proceso pueden ajustarse para aumentar los rendimientos de lípidos adecuados para usos múltiples que incluyen, pero no se limitan a, biodiesel. Las condiciones del proceso también se pueden ajustar para reducir el costo de producción. Por ejemplo, en ciertas realizaciones, se cultiva un microbio (p. ej., una microalga) en presencia de una concentración limitante de uno o más nutrientes, como, por ejemplo, nitrógeno, fósforo y/o azufre. Esta condición tiende a aumentar el rendimiento de lípidos microbianos sobre el rendimiento de lípidos microbianos en un cultivo en el que el nutriente se proporciona en exceso. En realizaciones particulares, el aumento del rendimiento de lípidos es al menos aproximadamente: 10% 20 a 500%.

[0223] Limitar un nutriente también puede tender a reducir la cantidad de biomasa producida. Por lo tanto, la concentración limitante es típicamente una que aumenta el rendimiento porcentual de lípidos para una biomasa dada pero no reduce indebidamente la biomasa total. En realizaciones ejemplares, la biomasa se reduce en no más de aproximadamente 5% a 25%. El microbio se puede cultivar en presencia de una cantidad limitante de nutrientes para una parte del período de cultivo total o para todo el período. En realizaciones particulares, la concentración de nutrientes se cicla entre una concentración limitante y una concentración no limitante al menos dos veces durante el período de cultivo total.

[0224] La biomasa de microalgas generada por los métodos de cultivo descritos en la presente memoria comprende aceite de microalgas (lípidos) así como otros constituyentes generados por los microorganismos o incorporados por los microorganismos del medio de cultivo durante la fermentación.

[0225] La biomasa de microalgas con un alto porcentaje de acumulación de aceite/lípidos por peso seco se ha generado usando diferentes métodos de cultivo conocidos en la técnica. La biomasa de microalgas con un mayor porcentaje de acumulación de aceite/lípidos es útil en los métodos de la presente invención. Li y col. describen cultivos de Chlorella vulgaris con hasta 56,6% de lípidos por peso de células secas (DCW) en cultivos estacionarios cultivados en condiciones autotróficas utilizando altas concentraciones de hierro (Fe) (Li et al, Bioresource Technology 99 (11): 4717-22 (2008) Rodolfi et al. Describen cultivos de Nanochloropsis sp. y Chaetoceros calcitrans con 60% de DCW lipídico y 39,8% de DCW lipídico, respectivamente, cultivados en un fotobiorreactor bajo condiciones de falta de nitrógeno (Rodolfi et al, Biotechnology & Bioengineering (2008) [18 de junio de Epub delante de la impresión]). Solovchenko et al, describen cultivos de Parietochloris incise con aproximadamente 30% de acumulación de lípidos (DCW) cuando se cultivan fototrópicamente y en condiciones de bajo nitrógeno (Solovchenko et al, Journal of Applied Phycology 20: 245-251 (2008). Chlorella protothecoides pueden producir hasta 55% de lípidos (DCW) cultivado bajo ciertas condiciones heterotróficas con hambre de nitrógeno (Miao y Wu, Bioresource Technology 97:. 841-846 (2006) Se ha descrito que otras especies de Chlorella incluyendo Chlorella emersonii, Chlorella Sorokiniana y Chlorella Minutissima acumularon hasta 63% de aceite (DCW) cuando se cultivaron en biorreactores de tanque agitado en condiciones de medios bajos en nitrógeno (Illman et al, Enzyme and Microbial Technology 27: 631-635 (2000) Se ha informado un porcentaje aún mayor de acumulación de lípidos por peso de células secas, incluida una acumulación de lípidos del 70% (DCW) en cultivos de Dumaliella tertiolecta cultivados en condiciones de NaCl aumentadas (Takagi et al, Journal of Bioscience and Bioengineering 101 (3): 223-226 (2006)) y 75% de acumulación de lípidos en cultivos de Botryococcus braunii (Banerjee et al, Critical Reviews in Biotechnology 22 (3): 245-279 (2002)).

[0226] Estos y otros aspectos y realizaciones de la invención se ilustran, pero no se limitan, por los ejemplos a continuación; los ejemplos también destacan las ventajas de los métodos de la invención. Cualquier ejemplo que quede fuera del alcance de la invención reivindicada se proporciona como ejemplos comparativos.

IV. EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Cultivo de microalgas para lograr un alto contenido de aceite

[0227] Las cepas de microalgas se cultivaron para lograr un alto porcentaje de aceite por peso de células secas. Las células crioconservadas se descongelaron a temperatura ambiente y se añadieron 500 pl de células a 4,5 ml de medio (4,2 g/LK2HPO4, 3,1 g/L NaH2PO4, 0,24 g/L MgSO4'7H2O, 0,25 g/L monohidrato de ácido cítrico, 0,025 g/L CaCh 2H2O, 2 g/L extracto de levadura) más 2% de glucosa y cultivado durante 7 días a 28°C con agitación (200 rpm) en una placa de 6 pocillos. Los pesos de las células secas se determinaron centrifugando 1 ml de cultivo a 14.000 rpm durante 5 minutos en un tubo Eppendorf previamente pesado. El sobrenadante de cultivo se desechó y el sedimento celular resultante se lavó con 1 ml de agua desionizada. El cultivo se centrifugó nuevamente, se descartó el sobrenadante y los sedimentos celulares se colocaron a -80°C hasta que se congelaron. Las muestras se liofilizaron durante 24 horas y se calcularon los pesos de las células secas. Para la determinación del lípido total en cultivos, se retiraron 3 ml de cultivo y se sometieron a análisis usando un sistema Ankom (Ankom Inc, Macedonia, NY) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las muestras se sometieron a extracción con disolvente con un extractor Ankom XT10 de acuerdo con el protocolo del fabricante. El lípido total se determinó como la diferencia en masa entre las muestras secas hidrolizadas con ácido y las muestras secas extraídas con disolvente. Las mediciones de porcentaje de peso de células secas de aceite se muestran a continuación en la tabla 5.

Tabla 5. Cultivo de microalgas para lograr un alto contenido de aceite.

Cultivar Chlorella protothecoides para lograr un alto contenido de aceite

[0228] Se realizaron tres procesos de fermentación con tres formulaciones de medios diferentes con el objetivo de generar biomasa de algas con alto contenido de aceite. La primera formulación (Medios 1) se basó en el medio descrito en Wu et al. (1994 Science in China, vol. 37, núm. 3, págs. 326-335) y consistió en por litro: KH2PO4, 0,7 g; K2HPO4, 0,3 g; MgSO4-7H2O, 0,3 g; FeSO4-7H2O, 3 mg; clorhidrato de tiamina, 10 |jg; glucosa, 20 g; glicina, 0,1 g; H3BO3, 2,9 mg; MnCh-4H2O, 1,8 mg; ZnSO4 -7H2O, 220 jg ; CuSO4-5H2O, 80 jg ; y NaMoO4-2H2O, 22,9 mg. El segundo medio (Medio 2) se obtuvo del medio del matraz descrito en el Ejemplo 1 y consistió en por litro: K2HPO4, 4,2 g; NaH2PO4, 3.1 g; MgSO4-7H2O, 0,24 g; monohidrato de ácido cítrico, 0,25 g; cloruro de calcio deshidratado, 25 mg; glucosa, 20 g; extracto de levadura, 2g. El tercer medio (Medios 3) era un híbrido y consistía en por litro: K2HPO4, 4,2 g; NaH2PO4, 3.1 g; MgSO4-7H2O, 0,24 g; monohidrato de ácido cítrico, 0,25 g; cloruro de calcio deshidratado, 25 mg; glucosa, 20 g; extracto de levadura, 2 g; H3BO3, 2,9 mg; MnCh-4H2O, 1,8 mg; ZnSO4-7H2O, 220 jg ; CuSO4-5H2O, 80 jg ; y NaMoO4-2H2O, 22,9 mg. Las tres formulaciones de medios se prepararon y se esterilizaron en autoclave en recipientes de fermentación a escala de laboratorio durante 30 minutos a 121°C. Se añadió glucosa estéril a cada recipiente después del enfriamiento después de la esterilización en autoclave.

[0229] El inóculo para cada fermentador fue Chlorella protothecoides (UTEX 250), preparado en dos etapas de matraz usando las condiciones de medio y temperatura del fermentador inoculado. Cada fermentador se inoculó con 10% (v/v) de cultivo a mitad de registro. Los tres fermentadores a escala de laboratorio se mantuvieron a 28°C durante la duración del experimento. El crecimiento celular de microalgas en el Medio 1 también se evaluó a una temperatura de 23°C. Para todas las evaluaciones de fermentadores, el pH se mantuvo a 6,6-6,8, las agitaciones a 500 rpm y el flujo de aire a 1 vvm. Los cultivos de fermentación se cultivaron durante 11 días. La acumulación de biomasa se midió por densidad óptica a 750 nm y peso de células secas.

[0230] La concentración de lípidos/aceite se determinó usando transesterificación directa con métodos de cromatografía de gases estándar. Brevemente, las muestras de caldo de fermentación con biomasa se transfirieron a papel secante y se transfirieron a tubos de centrífuga y se secaron en un horno de vacío a 65-70°C durante 1 hora. Cuando las muestras se secaron, 2 ml de 5% H2SO4 en metanol se añadió a los tubos. A continuación, los tubos se calentaron en un bloque de calor a 65-70°C durante 3,5 horas, mientras se agitaban en vórtice y se sonicaban intermitentemente. Luego se añadieron 2 ml de heptano y los tubos se agitaron vigorosamente. 2 ml de 6% K2CO3 se añadió y los tubos se agitaron vigorosamente para mezclar y después se centrifugaron a 800 rpm durante 2 minutos. A continuación, el sobrenadante se transfirió a viales de GC que contenían agente de secado Na2SO4 y corrió usando métodos de cromatografía de gas estándar. El porcentaje de aceite/lípido se basó en el peso de la célula seca. Los pesos de las células secas para las células cultivadas usando: Medio 1 a 23°C fueron 9,4 g/L; El medio 1 a 28°C fue de 1,0 g/l, el medio 2 a 28°C fue de 21,2 g/l; y el medio 3 a 28°C fue de 21,5 g/L. La concentración de lípido/aceite para células cultivadas usando: el medio 1 a 23°C fue de 3 g/L; el medio 1 a 28°C fue 0,4 g/l; el medio 2 a 28°C fue 18 g/L; y el medio 3 a 28°C fue de 19 g/L. El porcentaje de aceite basado en el peso de las células secas para las células cultivadas usando: el medio 1 a 23°C fue del 32%; El medio 1 a 28°C fue del 40%; El medio 2 a 28°C fue del 85%; y el medio 3 a 28°C fue del 88%. Los perfiles de lípidos (en % de área, después de la normalización al estándar interno) para la biomasa de algas generada usando las tres formulaciones de medios diferentes a 28°C se resumen a continuación en la Tabla 6.

Tabla 6. Perfiles de lípidos para Chlorella protothecoides cultivados en diferentes condiciones de medios.

Cultivo de levadura oleaginosa para lograr un alto contenido de aceite

[0231] La cepa de levadura Rhodotorula glutinis (DSMZ-DSM 70398) se obtuvo de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección Alemana de Microorganismos y Cultivo Celular, InhoffenstralJe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania. Las células crioconservadas fueron descongeladas y añadidas a 50 ml de medio YPD (descrito anteriormente) con 1x solución de vitamina DAS (1000x: 9 g/L de tricina; 0,67 g/L de tiamina-HCl; 0,01 g/L de d-biotina; 0,008 de cianocabalamina; 0,02 de pantotenato de calcio; y 0,04 g/L de ácido p-aminobenzoico) y se cultivó a 30°C con agitación de 200 rpm durante 18-24 horas hasta que la lectura de OD fue superior a 5 OD (A600). El cultivo se transfirió luego a fermentadores de 7 L y se cambió a medio YP1 (8,5 g/L Base de nitrógeno de levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonio, 3 g/L de sulfato de amonio, 4 g/L de extracto de levadura) con solución de vitamina 1x DAS. Se tomaron muestras de cultivos dos veces al día y se analizaron para determinar el OD (A600), peso de células secas (DCW) y concentración de lípidos. Cuando los cultivos alcanzaron más de 50 g/L DCW, los cultivos fueron cosechados. Según el peso de las células secas, la biomasa de levadura contenía aproximadamente un 50% de aceite. Dos muestras de biomasa de levadura se sometieron a transesterificación directa y se analizaron mediante GC/FID para un perfil lipídico. Los resultados se expresan en porcentaje de área y se muestran en la Tabla 7, a continuación.

Tabla 7. Perfil lipídico de muestras de biomasa de levadura transesterificada.

Cultivo de Rhodococcus opacus para lograr un alto contenido de aceite

[0232] Se generó un cultivo de semillas de Rhodococcus opacus PD630 (DSM 44193, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkuttwen GmbH) utilizando 2 ml de un material crioconservado inoculado en 50 ml de medio MSM con sacarosa al 4% (ver Schlegel, et al, (1961) Arch Mikrobiol 38, 209-22) en un matraz deflector de 250 ml. El cultivo de semillas se cultivó a 30°C con agitación a 200 rpm hasta que alcanzó una densidad óptica de 1,16 a 600 nm. 10 ml del matraz de siembra se usó para inocular cultivos para la producción de lípidos en dos condiciones de nitrógeno diferentes: 10 mM de NH4Cl y 18,7 mM de NH4Cl (cada una por duplicado). Los cultivos de crecimiento se hicieron crecer a 30°C con agitación a 200 rpm durante 6 días. Las células cultivadas en la condición de 10 mM de NH4Cl alcanzaron un máximo de 57,2% (promedio) de lípidos por DCW después de 6 días de cultivo. Las células cultivadas en la condición de 18,7 mM de NH4Cl alcanzaron un máximo de 51,8% (promedio) de lípidos por DCW después de 5 días en cultivo.

[0233] Una muestra de biomasa de Rhodococcus opacus se sometió a transesterificación directa y se analizó mediante GC/FID para un perfil lipídico. Los resultados fueron: C14: 0 (2,33); C15: 0 (9,08); C16: 0 (24,56); C16: 1 (11,07); C17: 0 (10,50); 2 especies C17 de doble enlace equivalente (2DBE) (19,90); C18: 0 (2,49); C18: 1 (17,41); C18: 2 (0,05); C19: 0 (0,75) y especies 2DBE C19 (1,87).

EJEMPLO 2

Diversidad de cadenas lipídicas en especies de microalgas

[0234] Las muestras de lípidos de un subconjunto de cepas cultivadas en el Ejemplo 1, y enumeradas en la Tabla 5, se analizaron para el perfil de lípidos usando HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 8.

Tabla 8. Diversidad de cadenas lipídicas en especies de microalgas.

EJEMPLO 3

Biomasa de microalgas de secado de tambores

[0235] Se usó un lote F-tanque de Chlorella protothecoides (UTEX 250) (aproximadamente 4,542 L (aproximadamente 1,200 galones)) para generar biomasa para procesos de extracción. Se dejó correr el lote durante aproximadamente 100 horas, mientras se controlaban los niveles de glucosa a 16 g/L, después de lo cual se terminó la alimentación de jarabe de maíz. Los niveles residuales de glucosa cayeron a aproximadamente 0 g/L dos horas después. El volumen final de caldo fue de 4,240 L (1,120 galones). Tanto las verificaciones de contaminación en proceso como un análisis exhaustivo de una muestra de caldo final no mostraron signos de contaminación. La biomasa de microalgas contenía 38% de aceite basado en el peso de las células secas (DCW).

[0236] La biomasa de microalgas se secó luego en un secador atmosférico de doble tambor. El caldo se alimentó a través de una boquilla a los dos tambores calentados por vapor que giraban en sentido opuesto entre sí. El caldo se extendió mecanicamente por la acción de los tambores contrarrotativos en láminas delgadas divididas en ambos cilindros calientes. Las capas de caldo delgadas que se adhirieron se secaron rápidamente de forma conductiva por el alto flujo de calor del vapor de condensación dentro de los tambores. La presión de vapor varió de 3,1 a 7,2 bares (45 a 105 psig) y la velocidad de rotación del tambor se ajustó entre 2 y 20 rpm. El contenido de humedad de la biomasa después del secado en tambor fue entre 3-10% (en peso).

Biomasa microbiana de acondicionamiento térmico

[0237] Se produjeron Chlorella protothecoides y se secaron en tambor usando los métodos descritos en el Ejemplo 6. La biomasa de microalgas secada en tambor se acondicionó térmicamente usando un acondicionador apilado vertical de 4 pisos (modelo 424, French Oil Mill Machine, Piqua, Ohio). Cada plataforma contenía hasta 0,0793 m3 (2,8 pies cúbicos) de material. El acondicionador apilado vertical fue precalentado usando vapor de 3,1 a 6,9 bar (45 a 100 psig) durante aproximadamente una hora antes del acondicionamiento térmico de la biomasa. Después del precalentamiento, la biomasa de microalgas se cargó en la cubierta superior del acondicionador apilado vertical y se guió a una tolva que conduce a la siguiente cubierta a continuación mediante un brazo de barredora en cada cubierta, que se montó en un eje vertical común alimentado por un sistema de motor eléctrico. Una carga de 150 libras de biomasa de microalgas secada en tambor llenó el acondicionador vertical, y para garantizar un acondicionamiento térmico uniforme, la biomasa se hizo circular abriendo la válvula de compuerta de descarga inferior del acondicionador apilado vertical y devolviendo la biomasa a la parte superior del acondicionador vertical. La temperatura de la biomasa en cada plataforma se monitoreó y controló entre 82 y 121°C (180 y 250°F) para evitar la abrasión. Los tiempos de residencia de acondicionamiento térmico variaron de 10 a 60 minutos para obtener biomasa con contenido de humedad variable. La biomasa acondicionada con calor se descargó en carros de polietileno cubiertos e inmediatamente se presionó en una prensa de semillas oleaginosas. Se analizaron muestras de biomasa antes y después del acondicionamiento térmico para determinar el contenido de humedad y aceite.

Extracción de aceite de microalgas usando una prensa de sobremesa Taby Pressen

[0238] La biomasa de Chlorella Protothecoides (UTEX 250) secada en tambor preparada de acuerdo con los métodos anteriores se secó de manera que el contenido de humedad resultante fuera aproximadamente 5-5,5%. La biomasa microalgal contenía 48,5% de aceite basado en el peso de las células secas (DCW). La biomasa se alimentó a través de una prensa de aceite Taby Pressen Tipo 70 con un motor de 2,2 Hp y un diámetro de tornillo de 70 mm. La prensa fue precalentada a una temperatura del barril de 100°C. No se extrajo aceite en estas condiciones. Se realizó otra operación de prensado usando el mismo lote de biomasa secada en tambor con la humedad ajustada a 0,5% de humedad en peso usando un horno de aire forzado a 70°C durante 30 minutos como paso de acondicionamiento antes de alimentarlo a la prensa. El barril de la prensa se calentó a 82°C y la biomasa de microalgas acondicionada secada en tambor se alimentó a través de la prensa de sobremesa. Aproximadamente el 68% del aceite disponible (en peso) se recuperó y la torta prensada, o biomasa gastada, se extrajo con disolvente para recuperar el aceite residual. Después de múltiples experimentos con biomasa de microalgas de contenido variable de aceite (entre 40-55% de DCW de aceite), la torta prensada tenía aproximadamente 30% de aceite según lo medido por métodos analíticos cada vez.

[0239] El método analítico para determinar el porcentaje de lípidos/aceite en una muestra se basó en un método Soxlet modificado. En resumen, se pesó 1 gramo de muestra y se sometió a hidrólisis ácida seguida de extracción con disolvente de éter de aceite. Tanto la hidrólisis ácida como la extracción de aceite se aceleraron mediante calor usando el sistema de reacción acelerado por microondas MARS. El disolvente de éter de aceite se evaporó luego y la cantidad de lípido extraído se determinó gravimétricamente.

Extracción de solventes a pequeña escala

[0240] La torta prensada generada a partir de la prensa de mesa se extrajo con disolvente para recuperar el aceite residual. Se añadió un exceso de éter de aceite a la torta prensada (5:1 en peso por volumen) y se mezcló durante un mínimo de una hora a temperatura ambiente. La mezcla de éter de aceite se pasó luego a través de un embudo Buchner que contenía un filtro de 5 pm. Los sólidos se recogieron del filtro y luego se sometieron a 3 lavados adicionales con éter de aceite de 2x volumen cada uno. La mezcla de éter de aceite filtrada y los lavados se agruparon y se colocaron en un RotoVap (2 l) para destilar el éter de aceite. El aceite restante se recogió y se pesó. Tras la inspección microscópica de la torta extraída con éter de aceite, no se detectó aceite libre en la torta después de la extracción con éter de aceite. Sin embargo, todavía se observaron vesículas lipídicas en células de algas intactas. Este método recuperará el 100% del aceite libre en la torta prensada, pero no en las células de algas intactas. Este proceso de extracción de solventes a pequeña escala se puede usar para determinar la efectividad de una prensa de expulsión para romper o agrietar las células de algas.

EJEMPLO 4

Extracción de aceite de microalgas utilizando una prensa de Komet a escala de laboratorio

[0241] Treinta (30) kilogramos de biomasa microalgal de Chlorella prototecoides secados al tambor (UTEX 250) que contiene aproximadamente 48% de aceite por DCW con un contenido de humedad de aproximadamente 5% a través de una prensa de semillas oleaginosas Komet con un diámetro de 65 mm en un paso de acondicionamiento previo a la prensa con el cono de descarga completamente desacoplado. Bajo esta condición de pre-prensa de baja presión, no se liberó aceite; sin embargo, la biomasa microalgal seca se convirtió de escamas sueltas en gránulos preprensados. La figura 2a muestra el material de biomasa secado en tambor que se alimentó a la prensa. La figura 2b muestra los gránulos preprensados. Los gránulos preprensados se recogieron y pasaron por la misma prensa en condiciones de prensa completa con el cono de descarga completamente enganchado para la presión máxima. El resultado fue una recuperación del 69% del aceite de los gránulos.

[0242] La torta gastada de la prensa se sometió luego a extracción con disolvente usando isohexano en un extractor de tipo percolación. La extracción de isohexano produjo 1 kg adicional de aceite. La combinación del prensado condicionado seguido de la extracción con hexano recuperó un total de 76% del aceite total disponible de la biomasa de microalgas secas. Estos resultados se resumen en la Tabla 9 a continuación.

Tabla 9. Resumen de resultados de prensado Kome.

EJEMPLO 5

Prensado a escala piloto de microalgas con ayuda de prensa

[0243] La biomasa de microalgas (prototipos de Chlorella UTEX 250) que contenía 38% de aceite por DCW se secó usando un secador de tambor con un contenido de humedad resultante de aproximadamente 3,5% (medido por un analizador de humedad). En los siguientes experimentos se utilizó una prensa de tornillo de semillas oleaginosas a escala piloto L-250 (8,89 cm) (3,5" de diámetro) (French Oil Mill Machinery Company, Piqua, Ohio). El barril principal (o jaula) del núcleo tenía un diámetro de 8,89 cm (3,5 pulgadas) El tornillo consistía en gusanos y collarines alternos configurados para una relación de compresión de 7 a 18. El accionamiento principal funcionaba con un motor eléctrico de 20 caballos de fuerza y la velocidad de rotación del eje principal era de 20 rpm. precalentado a entre 82 y 127°C (180°F y 260°F) usando vapor indirecto. Se usó un espacio de cono de 0,5 pulgadas, medido entre el soporte de cono y la placa de montaje del cono. El espacio de cono se ajustó usando las válvulas direccionales de 3 posiciones y la bomba manual del cilindro de cono hidráulico.

[0244] El switchgrass seco se usó como ayuda de prensa para microalgas. La biomasa de algas secadas en tambor de 38% de DCW de aceite se mezcló con hierba de cambio para formar un 20% de hierba de cambio/biomasa, 5% de hierba de cambio/biomasa, o muestras de biomasa solamente. Las tres muestras de biomasa de algas se acondicionaron por calor por separado en un acondicionador apilado vertical (como se describe anteriormente) durante 30 minutos a 121°C. La prensa se calentó a una temperatura del barril de 93°C antes de la adición de la biomasa. Aproximadamente el 39,5% del aceite total disponible (en peso) se recuperó de prensar el 20% de hierba de cambio/biomasa y también produjo una torta prensada de buena calidad para la extracción de hexano. Aproximadamente el 25% del total de aceite disponible (en peso se recuperó de prensar el 5% de hierba de cambio/biomasa y también produjo una torta prensada de buena calidad para la extracción de hexano. La condición de solo biomasa produjo una menor recuperación de aceite, aproximadamente el 5% del total de aceite (en peso), y la torta prensada era de menor calidad para la extracción de hexano.

[0245] Las cáscaras de soja también se usaron como ayuda de prensa con microalgas. Se mezcló biomasa de algas secadas al tambor con 38% de DCW de aceite con cáscaras de soja para formar un 20% de cáscara de soja/biomasa, 10% de cáscara de soja/biomasa o muestras de biomasa solamente. Las tres muestras de biomasa de algas se acondicionaron por calor por separado en un acondicionador apilado vertical durante 30 minutos a 121°C. La prensa se calentó a una temperatura del barril de 93°C antes de la adición de la biomasa. La mezcla de cáscara de soja/biomasa al 20% no se alimentó a través de la prensa; por lo tanto, no se recuperó aceite. Aproximadamente el 22,5% del total de aceite disponible (en peso) se recuperó al prensar la cáscara de soja/biomasa al 10% y también produjo una torta prensada de buena calidad para la extracción de hexano. La condición de solo biomasa no produjo aceite y obstruyó el conjunto de tornillo de la prensa del expulsor. En las condiciones de 5%, 20% de hierba de cambio y 10% de cáscara de soja, había aproximadamente 25% de sólidos en peso en el aceite recuperado. Los resultados se resumen en la Tabla 10 a continuación, que muestra el porcentaje total de aceite recuperado en peso con el peso de los sólidos restados.

Tabla 10. Microalgas prensadas con el uso de ayudas de prensa.

EJEMPLO 6

Efectos del contenido de humedad en la recuperación de aceite

[0246] La biomasa de algas Chlorella Protothecoides (UTEX 250) de 38% de aceite DCW se secaron en tambor de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 3. El contenido de humedad se midió en aproximadamente 3 a 5% y no se acondicionó antes de alimentarlo a la prensa de tornillo. Se alimentaron 32,66 kg (72 libras) de biomasa en una prensa de tornillo de semillas oleaginosas de 8,89 cm (3,5”) (French Oil Mill Company, Piqua, OH) precalentada a 93°C (200°F). se empujó entre las barras de la jaula en todas las secciones de la prensa. Se recuperó aproximadamente un 5% de aceite (después de eliminar los sólidos). La extracción con disolvente de la torta prensada recuperó un 58% adicional del total de aceite disponible (aproximadamente 7 kg). El análisis de la torta extraída con disolvente mostró que había aproximadamente un 18,6% de aceite residual. La recuperación total (extracción con prensa y disolvente) del aceite fue del 62%, lo que indica que la prensa solo rompió o lisó el 62% de las células de microalgas. La mala recuperación de aceite (5%) y el pesado equilibrio que se observó indicó que las condiciones (p. ej., contenido de humedad de la biomasa microbiana) no eran óptimas.

[0247] Se realizaron una serie de pruebas para establecer un rango óptimo de contenido de humedad para la biomasa microbiana seca que produciría la mayor recuperación de aceite en una prensa de expulsión. La biomasa de microalgas que contiene 51,3% de aceite por DCW se secó usando un secador de tambor. Se usó una prensa de semillas oleaginosas de 8,89 cm (3,5”) (comparable a la prensa francesa L250) y la configuración fue idéntica a la descrita en el Ejemplo 5. La biomasa de algas secas se acondicionó por calor en un acondicionador apilado vertical a 121°C (250°F). El tiempo de acondicionamiento térmico se varió para alcanzar los diferentes niveles de contenido de humedad. El cilindro de la prensa se precalienta y mantiene a 93°C (200°F) durante todos los experimentos, a menos que se indique lo contrario. La biomasa de microalgas acondicionada por calor se introdujo lentamente en la prensa de semillas oleaginosas, mientras se controlaba la carga eléctrica de la prensa. La velocidad de alimentación se controló mediante un transportador de tornillo de velocidad variable. La velocidad de alimentación se determinó agregando los pesos de aceite crudo y torta prensada recogidos durante 2-3 minutos. Las muestras de cada una de las tortas prensadas de las diferentes condiciones se analizaron usando métodos analíticos descritos anteriormente para medir el contenido de lípidos/aceites.

[0248] Se realizó un segundo conjunto de experimentos con el mismo lote de biomasa de microalgas secada en tambor que anteriormente. Un lote de biomasa de microalgas se acondicionó en el acondicionador apilado vertical a 93°C (200°F) y tenía un contenido final de humedad del 1,2%. Otro lote de biomasa de microalgas se acondicionó en el acondicionador apilado vertical a 143°C (290°F) y tenía un contenido final de humedad del 0,7%. Ambos lotes se prensaron en la prensa de semillas oleaginosas L250 de 8,89 cm (3,5”) de diámetro con la temperatura del barril a 93°C (200°F). El lote con un contenido de humedad del 1,2% produjo 54,3% de recuperación de aceite (en peso), que es comparable a los resultados del lote anterior de 1,2% de contenido de humedad de biomasa, que produjo 48,2% de recuperación de aceite. La condición de contenido de humedad de 0,7% produjo los mejores resultados, produciendo una torta de buena calidad para la posterior extracción de solventes y un rendimiento de 73% de aceite Sin embargo, el aceite era ligeramente más oscuro que el aceite producido a partir de la biomasa que se acondicionó a 93°C (200°F). La Tabla 11 a continuación resume el contenido de humedad de prueba y el porcentaje de aceite recuperado (después de restar los sólidos) de estos dos conjuntos de experimentos.

Tabla 11. Efectos del contenido de humedad en la recuperación de aceite.

[0249] Los resultados de estos dos conjuntos de experimentos indicaron que el contenido óptimo de humedad para lograr el porcentaje de recuperación de aceite más alto y una torta prensada de buena calidad para la extracción subsiguiente con solvente en este Ejemplo está entre 0,7% y 1,2%. Este rango de contenido de humedad en la biomasa de microalgas también produjo menos sólidos en el aceite (menos del 25% en peso). Otros experimentos similares mostraron que un contenido de humedad por debajo del 0,5% resultó en una fuerte base (sólidos) en el aceite (más del 40% en peso), lo que afecta el rendimiento general, y produjo una torta quemada, en polvo y de baja calidad que no era adecuada para la posterior extracción con solvente (Ver Figura 3a). Con un contenido de humedad superior al 1,2%, el rendimiento global de aceite fue menor, pero la torta prensada producida fue de muy buena calidad para la extracción subsiguiente con solvente (Ver Figura 3b). Este resultado indica que el contenido de humedad juega un papel importante en la calidad y textura de la torta prensada de la biomasa microbiana, y existe una inhibición del porcentaje de rendimiento de aceite si el contenido de humedad es demasiado alto.

EJEMPLO 7

Prototheca in Lab Press con perfil lipídico de materiales prensados, extraídos y combinados

[0250] Se prensaron aproximadamente 2 kg de biomasa de alga Prototheca moriformis secada al tambor con DCW al 60% de lípidos usando una prensa de sobremesa Taby Tipo 70 (véase el Ejemplo 8 anterior para las condiciones de la prensa). La biomasa seca se acondicionó térmicamente en un horno de aire forzado a 100°C (212°F) durante 30 minutos. La prensa se precalentó a 93°C (200°F) y se recuperaron 235,5 gramos de aceite (19%), después de eliminar los sólidos. El aceite se recogió y analizó para determinar el perfil de lípidos (expresado como % de área), clorofila y contenido de carotenoides utilizando métodos estándar. El aceite residual en la torta prensada se recuperó mediante una extracción discontinua con éter de aceite (como se describe en el Ejemplo 3). Se extrajeron un total de 311 gramos de aceite de 961 gramos de torta prensada. El aceite extraído también se analizó para el perfil de lípidos (expresado como % de área), clorofila y carotenoides, que se resumen a continuación. En general, el perfil lipídico, el contenido de clorofila y carotenoide del aceite prensado y el aceite extraído con disolvente fueron muy similares.

Tabla 12. Perfil lipídico del aceite extraído de Prototheca moriformis.

Tabla 13. Contenido de carotenoides y clorofila en el aceite extraído de Prototheca morifomis.

[0251] Además, el análisis elemental también se realizó en aceite prensado y aceite extraído con disolvente de Prototheca moriformis usando espectrometría de masas ICP. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 14.

Tabla 14. Análisis elemental del aceite extraído de Prototheca moriformis.

(continúa)

EJEMPLO 8

Prensado de escala piloto de Prototheca moriformis

[0252] Prototheca moriformis (UTEX 1435) que contenía aproximadamente 66% de aceite (por peso de células secas) se secó en tambor usando los métodos descritos en el Ejemplo 3. Después del secado en tambor, el contenido de humedad de la biomasa fue de aproximadamente 2,7%. La biomasa seca se acondicionó luego con calor usando los métodos descritos en el Ejemplo 3. El contenido de humedad de la biomasa después del acondicionamiento con calor fue de aproximadamente 0,6-1,4%. La biomasa de algas se alimentó luego a una prensa de tornillo de semillas oleaginosas de 8,89 cm (3,5”) (French Oil Mill Company, Piqua OH) con la jaula precalentada a 91-104°C (195-220°F). Se observó el empujado entre las barras de la jaula, lo que indica que las condiciones no eran óptimas. Aproximadamente el 47,9% de aceite (basado en el peso y el cálculo teórico del aceite disponible en la biomasa) se recuperó con finos (sólidos). Los sólidos se eliminaron por centrifugación y el rendimiento total de aceite fue del 31,9% después de la clarificación. El análisis de la torta prensada mostró que había aproximadamente un 22% (en peso de la torta prensada) de aceite residual. Otro lote de biomasa que se preparó de manera similar también se pasó por la prensa con un rendimiento similar en recuperación de aceite (57,3% incluyendo sólidos en el aceite).

EJEMPLO 9

Uso de ayudas de prensa con extracción de aceite de Prototheca moriformis

[0253] Se realizaron una serie de pruebas con diferentes ayudas de prensa en la prensa Taby de sobremesa a escala de laboratorio para ver si la adición de una ayuda de prensa puede aumentar los rendimientos de aceite. Se agregaron diferentes ayudas de prensa al caldo de fermentación después de cosechar la biomasa. El auxiliar de prensa/biomasa se secaron juntos en un secador de tambor y luego se acondicionaron con calor. Esta mezcla de ayuda de prensa/biomasa se alimentó luego a una prensa Taby a escala de laboratorio en las condiciones descritas anteriormente en el Ejemplo 3. Se usó una condición sin ayuda de prensa adicional como control negativo.

[0254] Para el control negativo, se secaron 3 litros de caldo de fermentación que contenía biomasa con 63,4% de aceite en un secador de tambor. La biomasa seca se alimentó a través de la prensa de sobremesa y produjo una cantidad mínima de aceite. La siguiente condición fue 3L de caldo de fermentación con 150 g (5% en peso húmedo del caldo de fermentación) ayuda de filtro celulósico (PB20, EP Minerals, Nevada). La mezcla se secó luego en un secador de tambor y tenía un contenido de humedad del 2,25% después del secado en tambor. La celulosa/biomasa se acondicionó luego con calor en un horno a 110°C durante 20-30 minutos, hasta un contenido de humedad final del 1,2%. Esta celulosa/biomasa acondicionada se alimentó luego a la prensa a escala de laboratorio. Según los cálculos teóricos del aceite disponible, había aproximadamente 145 gramos de aceite disponible en la biomasa. Se recuperaron aproximadamente 148 gramos de aceite usando la prensa a escala de laboratorio, lo que hace que la recuperación total de aceite sea aproximadamente del 100%.

[0255] El siguiente acondicionamiento probado fue la adición de cáscaras de soja de tierra gruesa al 5% (en peso húmedo). Se mezclaron 150 gramos de cáscaras de soja con 3L de caldo de fermentación que contenía biomasa de Prototheca moriformis. Durante el proceso de mezcla, se observó que las cáscaras de soja de tierra gruesa tendían a asentarse fuera de la solución, por lo que se requería una mezcla constante. La mezcla se secó luego en el secador de tambor y tenía un contenido de humedad del 6,5% después del secado de tambor. La cáscara de soja/biomasa seca luego se acondicionó con calor en un horno a 110°C durante 20-30 minutos, hasta un contenido de humedad final del 2,5%. La cáscara de soja/biomasa climatizada se alimentó luego a través de la prensa de tornillo a escala de laboratorio. De los 162 gramos calculados de aceite disponible, se recuperaron 46 gramos de aceite de la prensa de tomillo a escala de laboratorio, con lo que la recuperación total de aceite fue del 28%. Estos experimentos se repitieron con otro lote de caldo de fermentación Prototheca moriformis y se añadieron 2% de cáscaras de soja molidas gruesas, 1% de cáscaras de soja, 2% de celulosa añadida y 1% de celulosa añadida. También se probó un control negativo con solo caldo de fermentación secado en tambor. Se recuperó una cantidad mínima de aceite del control negativo. De la condición de cáscara de soja al 2%, se recuperó el 42% del aceite disponible y se recuperó el 30% del aceite disponible de la condición de cáscara de soja al 1%. De la condición de celulosa al 2%, se recuperó el 40% del aceite disponible y se recuperó el 10% del aceite disponible de la condición de celulosa al 1%.

[0256] Se realizaron experimentos adicionales usando cáscaras de soja finamente fresadas y adición por secado en seco al caldo de fermentación como ayudas de prensa. Debido a que las cáscaras de soja molidas tienen tendencia a asentarse, las cáscaras de soja molidas se molieron finamente utilizando un molinillo de café en el mejor entorno. Después del fresado, las cáscaras de soja finamente molidas tenían una textura en polvo. Dryback (2x pastel prensado de biomasa de Prototheca moriformis con 5% de contenido de aceite) también se molió para este experimento. La condición de control fue la biomasa de Prototheca moriformis con aproximadamente 60% de aceite, sin la adición de ayuda de prensa. Se añadieron 150 gramos de cáscaras de soja finamente molidas (5%) o secas molidas (5%) a 3 L de caldo de fermentación que contiene biomasa de Prototheca moriformis. La biomasa de algas y la mezcla auxiliar de prensa se secaron luego en un secador de tambor. La condición de control (solo biomasa de Prototheca moriformis) tenía un contenido de humedad del 4% después del secado en tambor, la condición de la cáscara de soja finamente triturada del 5% tenía un contenido de humedad del 2,3% después del secado en el tambor y la condición de 5% de secado posterior tenía un contenido de humedad de 2,5% después del secado en tambor. Cada una de las biomasas se secó en un horno a 110°C durante 20-30 minutos para calentar la biomasa. El contenido de humedad final para la biomasa de control fue del 2%, el contenido de humedad final para la adición de cáscara de soja finamente molida al 5% fue de 1,3% y el contenido de humedad final para la adición de secado posterior al 5% fue de 1,01%. Después del acondicionamiento térmico, cada una de las biomasas se alimentó a través de una prensa de tornillo Taby a escala de laboratorio en las condiciones descritas anteriormente en el Ejemplo 3. El aceite extraído y la torta prensada se recogieron y analizaron para obtener un rendimiento estimado. Para la condición de control, se recogieron 6,7 gramos de aceite (después de eliminar los sólidos del aceite), con un rendimiento aproximado del 2,8%. Se observó una fuerte pisada a lo largo de la prensa y la torta prensada obstruyó el extremo de descarga de la prensa. En la condición de 5% de cáscara de soja finamente molida añadida, se recogieron 148,2 gramos de aceite (después de la eliminación de los sólidos del aceite), para un rendimiento aproximado del 79,2% de recuperación. Hubo una cantidad mínima durante el prensado y una cantidad muy baja de sólidos en el aceite prensado antes de la clarificación. En la condición de 5% de fase de secado agregada, se recogieron 195,9 g de aceite (después de la eliminación de sólidos del aceite), para un rendimiento aproximado del 54,6%. Hubo una cantidad mínima de pisado durante el prensado y una cantidad muy pequeña de sólidos en el aceite prensado antes de la clarificación. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores, donde la adición de auxiliares de prensa al caldo de fermentación (que contiene biomasa de microalgas) seguido de un secado conjunto en un secador de tambor produjo biomasa que tuvo un rendimiento de aceite mayor cuando se presionó en una prensa de tornillo en comparación con biomasa microalgal sin ayuda de prensa añadida.

Prensado a escala piloto de Prototheca moriformis con ayuda de una prensa

[0257] Se realizaron ensayos piloto a escala de planta para evaluar las cáscaras de soja fresadas como ayudas de prensa cuando se mezcla en seco con biomasa de microalgas Prototheca moriformis secada en tambor. Las cáscaras de soja molidas se mezclaron con biomasa secada en tambor a 10 y 20% p/p en base al peso final de la mezcla. Luego, la mezcla de microalgas de biomasa/cáscara de soja se acondicionó térmicamente en un acondicionador apilado vertical 424 francés antes de prensarse en una prensa de tornillo de 8,89 cm (3,5”) (French Oil Mill Company, Piqua, OH). El aceite y la torta prensada se recuperaron y pesaron para estimar rendimientos.

[0258] Se preparó un lote de control de biomasa de Prototheca moriformis de manera similar pero sin la inclusión de cáscaras de soja. El lote de control tenía un contenido de aceite del 52% (DCW) y un contenido de humedad del 2,57% después del secado en tambor. 31,75 kg (70 libras) del lote de control se acondicionaron térmicamente durante 30 minutos en un acondicionador apilado vertical a 91-106°C (195-223°F) y el contenido de humedad se redujo a 0,81-0,95%. Se acondicionaron 32,66 kg (72 libras) de cáscara de soja al 10% de biomasa con un contenido de humedad inicial del 3,30% a 91-106,4°C (195-223,5°F) durante 30 minutos y el contenido de humedad se redujo al 1,06%. 31,75 kg (70 libras) del 20% de biomasa añadida a los cascos de soja con un contenido de humedad inicial del 3,07% se acondicionaron térmicamente a 98-108°C (208-227°F) durante 30 minutos y el contenido de humedad se redujo al 1,47%. La biomasa acondicionada por calor se alimentó luego a la prensa de tornillo. En el lote de control, 13,61 kg (30 libras) (de los 31,75 kg (70 libras) que se acondicionaron con calor) se alimentaron a través de la prensa antes de que la prensa se obstruyera. Aproximadamente 1,81 kg (4,0 libras) de aceite se recuperaron (incluidos los sólidos) de los 13,61 kg (30 libras) de biomasa que se alimentaron, lo que hace que el rendimiento sea aproximadamente del 20,5%. En la condición de cáscara de soja al 10%, 27,67 kg (61 libras) (de los 32,66 kg (72 libras) que estaban acondicionados con calor) se alimentaron a través de la prensa y se recuperaron aproximadamente 3,18 kg (7,0 libras) de aceite (incluidos los sólidos), haciendo que el rendimiento sea aproximadamente del 20%. En la prueba de cáscaras de soja al 20%, todos los 31,75 kg (70 libras) del material acondicionado por calor se alimentaron a través de la prensa, pero se recuperaron cantidades mínimas (no medidas) de aceite.

[0259] Con el éxito de los experimentos de prensa a escala de laboratorio descritos anteriormente, la adición de ayudas a la prensa al caldo de fermentación después de la cosecha de la biomasa de algas se amplió para una semilla oleaginosa de prensa de tornillo de aceite a presión piloto (8,89 cm (3,5”) (French Oil Mill Company, Piqua, OH)). La biomasa de Prototheca moriformis se preparó en tres condiciones experimentales diferentes: un control negativo sin celulosa añadida (PB20), biomasa con 25 g/L de celulosa añadida al caldo de fermentación después de la cosecha, y biomasa con 50 g/L de celulosa añadida al caldo de fermentación después de la cosecha. La biomasa de las tres condiciones se secó en un secador de tambor. La biomasa de control negativo tenía aproximadamente 58% de contenido de aceite (DCW) y un contenido de humedad de 6,68%. Luego se acondicionaron 63,50 kg (140 libras) de la biomasa de control negativo en un acondicionador apilado vertical a 107°C (225°F) durante 45 minutos y el contenido de humedad después del acondicionamiento térmico fue de 2,5-3,5%. La biomasa con celulosa añadida de 25 g/L tenía un contenido de humedad del 5,30% después del secado en tambor. A continuación, se acondicionaron 90,72 kg (200 libras) de la biomasa añadida a celulosa 25 g/l en un acondicionador apilado vertical a 93°C (200°F) durante 45 minutos y el contenido de humedad después del acondicionamiento térmico fue del 2,5-3,5%. La biomasa añadida a celulosa de 50 g/l tenía un contenido de humedad del 4,35% después del secado en tambor. Luego se acondicionaron 52,16 kg (115 libras) de la biomasa añadida a celulosa 50 g/l en un acondicionador apilado vertical a 93°C (200°F) durante 45 minutos y el contenido de humedad después del acondicionamiento térmico fue del 2,5-3,5%. La biomasa de cada condición experimental se alimentó luego a través de la prensa de semillas oleaginosas de 8,89 cm (3,5”). En la condición de control negativo, se recuperaron 14,65 kg (32,3 libras) de aceite (incluidos sólidos o finos en el aceite). La torta prensada de la condición de control negativo se analizó para determinar el contenido de aceite residual y la torta contenía 42-52% (en peso) de aceite residual. En la condición de celulosa de 25 g/L, se recuperaron 39,73 kg (87,6 libras) de aceite (incluidos los sólidos en el aceite). La torta prensada se analizó para determinar el contenido de aceite residual y la torta contenía 10-11% (en peso) de aceite residual. No se recuperó aceite de la condición de 50 g/L de celulosa añadida. La biomasa no se alimentó a través de la prensa y obstruyó la prensa después de 5 minutos.

[0260] Los resultados de este experimento fueron consistentes con los resultados de la prensa de sobremesa de escala de laboratorio. Aunque se recuperó una cantidad modesta de aceite de la condición de control negativo, todavía quedaba una cantidad significativa de aceite residual en la torta prensada. La condición de celulosa de 25 g/l tuvo el mejor rendimiento, produciendo la mayor cantidad de aceite con la menor cantidad de aceite residual en la torta prensada. La condición de celulosa de 50 g/L no produjo ningún aceite y obstruyó la prensa después de 5 minutos de funcionamiento. Estos resultados mostraron que la adición de un auxiliar de prensa al caldo de fermentación de la biomasa microalgal cosechada y el secado en seco puede aumentar el rendimiento del aceite cuando se presiona en una prensa de tornillo de semillas oleaginosas.

Prensa completa de dos pasos de escala piloto de Prototheca moriformis

[0261] Prensa completa de dos pasos de biomasa de Prototheca moriformis se llevó a cabo mediante la cual biomasa seca, condicionada Prototheca moriformis se presionó en una prensa de torta de presión y entonces la biomasa agotada se acondicionó durante una segunda vez y se prensa en una prensa de expulsor para una segunda vez.

[0262] Prototheca moriformis (UTEX 1435) que contenía aproximadamente 62% de aceite (por peso de células secas) se secó en tambor usando los métodos descritos anteriormente en el Ejemplo 3. Después del secado en tambor, el contenido de humedad de la biomasa fue de aproximadamente 2,7%. La biomasa seca se acondicionó luego con calor usando los métodos descritos en el Ejemplo 3. El contenido de humedad de la biomasa después del acondicionamiento con calor fue de aproximadamente 1,7-2,1%.

[0263] Se realizó un prensado de primer paso sobre la biomasa climatizada usando una prensa de tornillo de semillas oleaginosas de 8,89 cm (3,5”) (French Oil Mill Company, Piqua, OH) con la jaula precalentada a 90-104°C (194-220°F). Aproximadamente el 77,1% del aceite (en peso) se recuperó de la biomasa de microalgas durante este primer paso. El análisis de la torta prensada mostró que había aproximadamente un 21% en peso de aceite residual.

[0264] La torta prensada se acondicionó por calor una segunda vez, de modo que la torta prensada tenía aproximadamente 74-92°C (166-197°F). El contenido de humedad de la torta prensada acondicionada con calor fue de aproximadamente 1,8%. La torta acondicionada con calor se alimentó luego a la prensa con la jaula precalentada a 82-113°C (180-235°F). Aproximadamente el 72,5% del aceite en la torta se recuperó en este segundo pase, basado en el peso del aceite recuperado en este segundo, la torta prensada de la segunda prensa y el aceite disponible calculado en la torta prensada después del primer paso a través del tornillo prensado. Al agregar el aceite recuperado en ambas pasadas a través de la prensa, la recuperación total de aceite lograda con ambas pasadas fue aproximadamente del 92,9%.

Composición de monosacárido de biomasa sin lípidos Prototecas moriformis

[0265] La biomasa de Prototheca moriformis con alto contenido de aceite se cosechó luego y se secó usando un secador de tambor. La biomasa de algas secas se lisó y el aceite se extrajo usando una prensa de expulsión como se describe en este documento. El aceite residual en la biomasa prensada se extrajo con solvente usando éter de aceite.

El éter de aceite residual se evaporó de la comida delipidada usando un Rotovapor (Buchi Labortechnik AG, Suiza). El análisis de la composición de glucosilo (monosacárido) se realizó luego en la comida delipidada usando cromatografía de gases combinada/espectrometría de masas (GC/MS) de los derivados de per-O-trimetilsililo (TMS) de los metilglicósidos de monosacárido producidos a partir de la muestra por metanólisis ácida. Una muestra de comida delipidada se sometió a metanolisis en 1 M HCl en metanol a 80°C durante aproximadamente 20 horas, seguido de re-N-acetilación con piridina y anhídrido acético en metanol (para la detección de azúcares amino). Las muestras fueron luego per-O-trimetilsiladas por tratamiento con Tri-Sil (Pierce) a 80°C durante 30 minutos (ver métodos en Merkle y Poppe (1994) Methods Enzymol. 230: 1-15 y York et al, (1985) Methods Enzymol. 118: 3-40). El análisis GC/MS de los metilglicósidos de TMS se realizó en un Hp 6890 GC conectado a un MSD 5975b, usando una columna capilar de sílice fundida All Tech EC-1 (30 mx 0,25 mm ID). Los monosacáridos se identificaron por sus tiempos de retención en comparación con los estándares, y el carácter de carbohidratos se autentica por sus espectros de masas. Se agregaron 20 microgramos por muestra de inositol a la muestra antes de la derivatización como patrón interno. El perfil de monosacáridos de la biomasa delipidada Prototheca moriformis (UTEX 1435) se resume en la Tabla 15 a continuación.

Tabla 15. Análisis de la composición de monosacáridos (glicosilo) de la biomasa delipidada Prototheca moriformis

(UTEX 1435).

[0266] También se analizaron dos muestras de biomasa de Prototheca moriformis (UTEX 1435) delipidada para determinar el contenido de fibra dietética usando el Método AOAC 991,43. El contenido de fibra dietética para las dos muestras fue del 22,89% y del 33,06%.

EJEMPLO 10

Extracción solvente de torta prensada de biomasa de microalgas

[0267] Para maximizar el rendimiento total de aceite de la biomasa de microalgas, la torta prensada (como se describe en los ejemplos anteriores) se sometió a extracción con disolvente usando un extractor de tambor de tipo discontinuo y hexano comercial como disolvente. La biomasa prensada se mezcló con el hexano comercial en el extractor. La extracción de aceite se realizó en el extractor de tambor lavando la torta prensada tres veces con hexano comercial usando una relación de disolvente a sólidos de entre 0,7:1 a 2:1. La temperatura del extractor se mantuvo entre 50 y 55°C (122°F y 131°F), durante un tiempo de residencia de 1 hora por cada lavado y un ligero vacío de 2,54 a 5,08 cm (1 a 2 pulgadas) de agua. El extractor de tambor se hizo girar continuamente durante cada lavado para mejorar la mezcla de la eficiencia de extracción.

[0268] La miscela de aceite-hexano que abandona el extractor se filtró a través de un filtro de un micrón y después se evaporó hasta un contenido de disolvente mínimo en un recipiente de evaporación por lotes. El disolvente se eliminó por evaporación a 77 a 93°C (170°F a 200°F) y un vacío de 50,8 a 61 cm (20 a 24 pulgadas) de Hg. Se roció de 0,5% a 2% de nitrógeno para lograr un disolvente residual bajo en el aceite crudo. El aceite crudo desolventizado se empaquetó en contenedores de 18,9 L (5 galones). La comida húmeda gastada se desolventizó en el mismo recipiente extractor de tambor después de bombear la miscela de aceite-hexano. La desolventización y el secado del orujo se realizó en el extractor de tambor calentando la biomasa a 104 a 116°C (220°F a 240°F) usando solo vapor indirecto. La comida desolventizada se empaquetó en bidones de fibra de 166,56 L (44 galones).

[0269] Los vapores de disolvente del extractor de tambor y el evaporador de aceite se condensaron y se recuperaron en el tanque de agua de disolvente donde se eliminaron el agua y los sólidos. El solvente recuperado se almacenó y puede reutilizarse en futuras extracciones de solvente.

EJEMPLO 11

Secado y extracción de aceite de levadura oleaginosa

[0270] La cepa de levadura oleaginosa Rhodotorula glutinis (DSMZ-DSM 70398) se cultivó de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 para producir biomasa de levadura oleaginosa con aproximadamente 50% de lípidos por DCW. El caldo de levadura cosechado se secó usando tres métodos diferentes para la comparación: (1) bandeja secada en un horno de aire forzado a 75°C durante la noche; (2) secar en un secador de tambor sin concentración; y (3) el caldo de levadura se concentró hasta 22% de sólidos y la suspensión se secó luego en un secador de tambor. El material de cada una de las tres condiciones de secado diferentes se acondicionó térmicamente y se alimentó a través de una prensa de tornillo para extracción de aceite. La temperatura de la prensa fue de 66°C (150°F) y la biomasa de levadura seca acondicionada se mantuvo a aproximadamente 88°C (190°F) hasta que estuvo lista para ser suministrada a la prensa.

[0271] El contenido de humedad del caldo de levadura secado por tambor sin concentración era 5,4% y luego la levadura se secó en tambor estaba condicionado en un horno a 90°C durante 20 minutos. El contenido de humedad después del acondicionamiento fue del 1,4%. La levadura secada en tambor acondicionada se alimentó luego a una prensa de tornillo Taby de sobremesa para extracción de aceite. Este material aceita bien, con una base mínima.

[0272] El contenido de humedad del caldo de levadura concentrado secado por tambor fue del 2,1% y la levadura concentrada secada por tambor luego fue acondicionada en un horno a 90°C durante 20 minutos. El contenido de humedad después del acondicionamiento fue del 1,0%. La levadura concentrada secada en tambor acondicionada se alimentó luego a una prensa de tornillo Taby de mesa para extracción de aceite. Este material aceita bien, con una base mínima.

EJEMPLO 12

Secado y extracción de aceite de bacterias oleaginosas

[0273] La cepa de bacterias oleaginosas Rhodococcus opacus PD630 (DSMZ-DSM 44193) se cultivó de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1 para producir biomasa de bacterias oleaginosas con aproximadamente 32% de lípidos por DCW.

[0274] El caldo cosechado Rhodococcus opacus se concentró usando centrifugación y después se lavó con agua desionizada y se resuspendió en 1,8 l de agua desionizada. Se añadieron 50 gramos de celulosa purificada (PB20-Pre-co-Floc, EP Minerals, Nevada) a la biomasa resuspendida y el total de sólidos se ajustó con agua desionizada al 20%. La biomasa de Rhodococcus se secó luego en un secador de tambor y el contenido de humedad del Rhodococcus después del secado de tambor fue aproximadamente del 3%.

[0275] El material secado en tambor se acondicionó luego con calor en un horno a 130°C durante 30 minutos con un contenido de humedad resultante de aproximadamente 1,2%. La biomasa acondicionada con calor se alimentó luego a través de una prensa Taby de mesa (prensa de tornillo) para extracción de aceite. La temperatura de la prensa fue de 98°C (209°F) y la biomasa de levadura seca acondicionada se mantuvo a aproximadamente 116°C (240°F) hasta que estuvo lista para ser alimentada a la prensa. La recuperación de aceite estuvo acompañada de un gran equilibrio.

EJEMPLO 13

Genotipado de cepas de microalgas

[0276] Las muestras de microalgas de las 23 cepas enumeradas en la Tabla 5 anterior se genotiparon. El ADN genómico se aisló de la biomasa de algas como sigue. Las células (aproximadamente 200 mg) se centraron a partir de cultivos líquidos 5 minutos a 14.000 x g. Las células se volvieron a suspender en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14.000 x g y se desechó el sobrenadante. Se añadió una sola perla de vidrio de ~2 mm de diámetro a la biomasa y los tubos se colocaron a -80°C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pl de tampón de fresado (Sarcosilo al 1%, sacarosa 0,25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, RNasa A 0,5 pg/ul). Los gránulos se resuspendieron mediante agitación vorticial brevemente, seguido de la adición de 40 ul de NaCl 5M. Las muestras se sometieron a vórtice brevemente, seguido de la adición de 66 ul de 5% de CTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) y un breve vórtice final. A continuación, las muestras se incubaron a 65°C durante 10 minutos, después de lo cual se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 ul de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 14.000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0,7 vol de isopropanol (~190 ul), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4°C. El a Dn se recuperó por centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos. El sedimento resultante se lavó dos veces con etanol al 70%, seguido de un lavado final con etanol al 100%. Los pellets se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente seguido de resuspensión en 50 ul de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).

[0277] Cinco ul de ADN de algas totales, preparados como se describe anteriormente, se diluyeron 1:50 en Tris 10 mM, pH 8,0. Las reacciones de PCR, volumen final 20 ul, se prepararon como sigue. Diez ul de 2 x mezcla maestra iProof HF (BIO-RAD) se añadió a 0,4 ul de cebador SZ02613 (5'-TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3' (SEQ ID NO: 24) en 10 mM de concentración de reserva). Esta secuencia de cebador va desde la posición 567-588 en la entrada del Gen Bank n° L43357 y está altamente conservada en plantas superiores y genomas de plastidios de algas. Esto fue seguido por la adición de 0,4 ul de cebador SZ02615 (5'-CAGTGAGCTAt Ta CGCACTC-3' (SEQ ID NO: 25) a una concentración de stock de 10 mM). Esta secuencia de cebador es complementaria a la posición 1112-1093 en el número de registro de Gen Bank. L43357 y está altamente conservado en plantas superiores y genomas de plastidios de algas. A continuación, 5 ul de ADN total diluido y se añadieron 3,2 ul dH2O. Las reacciones de PCR se realizaron de la siguiente manera: 98°C, 45"; 98°C, 8"; 53°C, 12”; 72°C, 20" durante 35 ciclos seguidos de 72°C durante 1 minuto y manteniendo a 25°C. Para la purificación de los productos de PCR, se agregaron 20 ul de Tris 10 mM, pH 8,0, a cada reacción, seguido de extracción con 40 ul de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, agitación en vórtex y centrifugación a 14.000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se aplicaron a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3.000 x g. Los productos de PCR purificados se clonaron posteriormente con TOPO en PCR8/GW/TOPO y se seleccionaron clones positivos para placas LB/Spec. El ADN plasmídico purificado fue secuenciado en ambas direcciones usando cebadores M13 hacia adelante y hacia atrás. Las secuencias de las 23 cepas de microalgas se enumeran como SEQ ID NO: 1-23 en el Listado de secuencias adjunto (consulte la Tabla 5 para la correlación). Además, varias cepas de microalgas Prototheca (véase la Tabla 16, a continuación) también se genotiparon utilizando los métodos y cebadores descritos anteriormente. Las secuencias genómicas de 23S ARNr se enumeran como SEQ ID NOs: 26-34 en el Listado de secuencias adjunto y se describen a continuación.

Tabla 16. Cepas de microalgas de Prototheca.

Especies____________ Tensión SEQ ID NO.

Prototheca kruegani UTEX 329 SEQ ID NO: 26 Prototheca wickerhamii UTEX 1440 SEQ ID NO: 27 Prototheca stagnora UTEX 1442 SEQ ID NO: 28 Prototheca moriformis UTEX 288 SEQ ID NO: 29 Prototheca moriformis UTEX 1439; 1441; 1435; 1437 SEQ ID NO: 30 Prototheca wikerhamii UTEX 1533 SEQ ID NO: 31 Prototheca moriformis UTEX 1434 SEQ ID NO: 32 Prototheca zopfii UTEX 1438 SEQ ID NO: 33 Prototheca moriformis UTEX 1436 SEQ ID NO: 34

Genotipado de cepas de levadura oleaginosa

[0278] Se realizó el genotipado de 48 cepas diferentes de levadura oleaginosa. Se aisló ADN genómico de cada una de las 48 cepas diferentes de biomasa de levadura oleaginosa de la siguiente manera. Las células (aproximadamente 200 mg) se centrifugaron de cultivos líquidos 5 minutos a 14.000 x g. Las células se volvieron a suspender en agua destilada estéril, se centrifugaron 5 minutos a 14.000 x g y se desechó el sobrenadante. Se añadió una sola cuenta de vidrio de ~2 mm de diámetro a la biomasa y los tubos se colocaron a -80°C durante al menos 15 minutos. Se retiraron las muestras y se añadieron 150 pl de tampón de fresado (Sarcosilo al 1%, sacarosa 0,25 M, NaCl 50 mM, EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, RNasa A 0,5 pg/ul). Los gránulos se resuspendieron mediante agitación vorticial brevemente, seguido de la adición de 40 ul de NaCl 5M. Las muestras se sometieron a vórtice brevemente, seguido de la adición de 66 pl de 5% de CTAB (bromuro de cetil trimetilamonio) y un breve vórtice final. A continuación, las muestras se incubaron a 65°C durante 10 minutos, después de lo cual se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se extrajo una vez con 300 ml de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, seguido de centrifugación durante 5 minutos a 14.000 x g. La fase acuosa resultante se transfirió a un tubo nuevo que contenía 0,7 vol de isopropanol (< 190 pl), se mezcló por inversión y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos o durante la noche a 4°C. El a DN se recuperó por centrifugación a 14.000 x g durante 10 minutos. El sedimento resultante se lavó dos veces con etanol al 70%, seguido de un lavado final con etanol al 100%. Los pellets se secaron al aire durante 20-30 minutos a temperatura ambiente seguido de resuspensión en 50 pl de TrisCl 10 mM, EDTA 1 mM (pH 8,0).

[0279] Se diluyeron cinco pl de ADN de algas totales, preparado como se describió anteriormente, 1:50 en Tris 10 mM, pH 8,0. Las reacciones de PCR, volumen final 20 pl, se prepararon como sigue. Se añadieron diez pl de 2 x mezcla maestra iProof HF (BIO-RAD) a 0,4 pl de cebador SZ5434 cebador directo (5' GTCCCTGCCCTTTGTACACAC -3' (SEQ ID NO: 35) a una concentración de reserva de 10 mM) y 0,4 pl de cebador SZ5435 cebador inverso (5'-TTGATATGCTTAAGTTCAGCGGG -3' (SEQ ID NO: 36) a una concentración de reserva de 10 mM). Los cebadores se seleccionaron en base a la conservación de la secuencia entre tres regiones principales de 18S y cinco regiones principales de genes de ARNr 26S fúngicos. Por referencia, el cebador directo es idéntico a los nucleótidos 1632-1652 de Genbank Ascension n° AY550243 y el cebador inverso es idéntico a los nucleótidos 464271-464293 de Genbank Ascension n° NC_001144. A continuación, se añadieron 5 pl de ADN total diluido y 3,2 pl dH2O. Las reacciones de PCR se realizaron de la siguiente manera: 98°C, 45 segundos; 98°C, 8 segundos; 58°C, 12 segundos; 72°C, 36 segundos durante 35 ciclos seguidos de 72°C durante 1 min y manteniéndose a 4°C. Para la purificación de los productos de PCR, se agregaron 20 |jl de Tris 10 mM, pH 8,0, a cada reacción, seguido de extracción con 40 |jl de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico 12: 12: 1, agitación en vórtex y centrifugación a 14.000 x g durante 5 minutos. Las reacciones de PCR se aplicaron a columnas S-400 (GE Healthcare) y se centrifugaron durante 2 minutos a 3.000 x g. Los productos resultantes de PCR purificados se clonaron y se transformaron en E. coli usando el kit de vector ZeroBlunt PCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las reacciones de secuenciación se llevaron a cabo directamente en colonias resistentes a ampicilina. El ADN plasmídico purificado fue secuenciado en ambas direcciones usando cebadores M13 hacia adelante y hacia atrás.

[0280] Una lista de las 48 cepas de levadura oleaginosa que se genotiparon se resume a continuación en la Tabla 17 junto con las correspondientes SEQ ID NO.

Tabla 17. Cepas de levadura oleaginosas. Número de tensión

Nombre de la cepa Número de la cepa SEO id NO

Rhodotorula glutinis DSMZ-OSM 70398 SEQ ID NO:37 Lipomycos totrasponrs CBS 5911 SEQ ID NO:70 Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 3044 SEQ ID NO:38 Upomycos totrasporus CBS 8664 SEQ ID NO:71 Lipomycos totrasporus CBS 1808 SEQ ID NO:39 Lipomycos totrasporus CBS 1810 SEQ ID NO:39 Upomycos starkoyi CBS 1809 SEQ ID NO:40 Trichosporon montovidoonso CBS 8261 SEQ ID NO:72 Y arroma lipolytíca CBS 6331 SEQ ID NO:41 Cryptococcus curvatus CBS 5324 SEQ ID NO:42 Rhodotorula muciiaginosa var. muciagínosa CBS 316 SEQ ID NO:73 Cryptococcus curvatus CBS 570 SEQ ID NO:42 Cryptococcus curvatus CBS 2176 SEQ ID NO:42 Cryptococcus curvatus CBS 2744 SEQ ID NO:42 Cryptococcus curvatus CBS 2754 SEQ ID NO:42 Cryptococcus curvatus CBS 2829 SEQ ID NO:42 Cryptococcus curvatus CBS 5163 SEQ ID NO:42 Cryptococcus curvatus CBS 5358 SEQ ID NO:42 Trichosporon sp. CBS 7617 SEQ ID NO:43 Sporobolomycos alboruboscons CBS 482 SEO ID NO:44 Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 324 SEQ ID NO:45 Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 4476 SEQ ID NO:46 Trichosporon bohrond CBS 5581 SEQ ID NO:47 Gootrichum histondamm CBS 9892 SEQ ID NO:48 Rhodotorula aurantiaca CBS 8411 SEQ ID NO:49 Cryptococcus curvatus CBS 8126 SEQ ID NO:74 Trichosporon domosticum CBS 8111 SEQ ID NO:50 Rhodotorula toruloidos CBS 8761 SEQ ID NO:51 Rhodotorula torpondoidahs CBS 8445 SEQ ID NO:52 Yarroma lipolytíca CBS 10144 SEQ ID NO:53 Rhodotorula glutinis var. glutinis CBS 5805 SEQ ID NO:54 Yarrowia lipolytíca CBS 10143 SEQ ID NO:55 Lipomycos totrasporus CBS 5607 SEQ ID NO:56 Yarroma lipolytíca CBS 5589 SEQ ID NO:57 Lipomycos totrasporus CBS 8724 SEQ ID NO:58 Rhodosporidium sphaorocarpum CBS 2371 SEQ ID NO:59 Trichosporon brassicao CBS 6382 SEQ ID NO60 Cryptococcus curvatus CBS 2755 SEQ IDN061 Upomycos totrasporus CBS 7656 SEQ ID NO:75 Lipomycos starkoyi CBS 7786 SEQ ID NO$2 Yarroma lipolytica CBS 6012 SEQ ID NO63 Trichosporon loubioti var. loubioh CBS 8265 SEQ ID NO64 Gootrichum vulgaro CBS 10073 SEQ ID NO65 Rhodosporidium toruloidos CBS 14 SEQ ID NO:66

(continúa)

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para extraer lípidos de biomasa microbiana que comprende

a. secar la biomasa microbiana para producir biomasa microbiana seca que tiene un contenido de humedad del 3% al 15%, menos del 6%, menos del 5%, menos del 4%, del 0,1% al 5%, del 0,1% al 3%, o de 0,5% a 3,5% en peso y constituyendo al menos 20% de aceite en peso;

b. acondicionar la biomasa microbiana seca para producir materia prima acondicionada calentando la biomasa microbiana seca a una temperatura en el rango de 70°C a 150°C, teniendo los piensos acondicionados un contenido de humedad de 0,5% a 2,5% en peso de la biomasa microbiana; y c. someter los piensos acondicionados a una presión suficiente para separar al menos el 5% del aceite en la biomasa de otros componentes,

dejando biomasa gastada de contenido reducido de aceite en relación con los piensos acondicionados.

2. El método de la reivindicación 1, en el que se agrega un agente de carga a la biomasa microbiana seca antes de acondicionar la biomasa microbiana seca.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los lípidos se extraen mediante una prensa de expulsión.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biomasa gastada contiene un rango de menos del 50% de aceite a menos del 1% de aceite en peso, y en donde el contenido de aceite en la biomasa gastada es menor que el contenido de aceite en el biomasa microbiana

5. El método de la reivindicación 3, en donde la biomasa microbiana se somete a uno o más ciclos de presión oscilante, en donde cada ciclo consiste en una presión más baja durante un primer período de tiempo seguido de una presión más alta durante un segundo período de tiempo, en donde, si se lleva a cabo más de un ciclo, entonces la presión promedio ejercida sobre la biomasa durante el transcurso del último ciclo es al menos 2 veces mayor que la presión promedio ejercida sobre la biomasa durante el curso del primer ciclo o de cualquier otro ciclo anterior.

6. El método de la reivindicación 3 o la reivindicación 5, en el que la prensa del expulsor es un eje helicoidal que gira continuamente dentro de una jaula que tiene un alimentador en un extremo y un estrangulador en un extremo opuesto al mismo, y que tiene aberturas dentro de la jaula, en donde la jaula tiene un interior longitud que es entre al menos diez veces y al menos 20 veces su diámetro interno y comprende una pluralidad de barras alargadas con al menos algunas de las barras alargadas separadas por uno o más espaciadores, las barras se apoyan en un marco, en donde el uno o más los separadores entre las barras forman las aberturas, y los aceites se liberan a través de las aberturas a un recipiente colector acoplado fluidamente con la jaula,

en donde los espaciadores entre las barras alargadas son de diferentes espesores, permitiendo así la variación del espacio entre cada barra alargada, en donde los espaciadores o los espacios entre las barras tienen un espesor de 0,13 mm a 0,76 mm (0,005 a 0,030 pulgadas),

en donde la biomasa ingresa a la jaula a través del alimentador, y la rotación del eje helicoidal avanza la biomasa a lo largo de la jaula y aplica presión a la biomasa dispuesta entre la jaula y el estrangulador, las células de la biomasa que lisan la presión y liberan aceite a través de las aberturas de la jaula, y la biomasa gastada de contenido reducido de aceite se extruye desde el extremo del estrangulador de la jaula.

7. El método de la reivindicación 6, en el que la presión aumenta en un factor de entre 10 y 20 desde el extremo del alimentador hasta el extremo del estrangulador de la jaula y no aumenta en más del 100% de la presión en el extremo del alimentador de la jaula por pie lineal de la jaula entre el alimentador y los extremos del estrangulador de la jaula.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además extraer lípidos de la biomasa gastada de contenido reducido de aceite con un disolvente orgánico.

9. El método de la reivindicación 8, en donde el solvente orgánico es hexano.

10. El método de cualquiera de las reclamaciones anteriores, en el que el material de alimentación acondicionado tiene un contenido de humedad entre 0,5% y 2,0% en peso, opcionalmente entre 1,0% y 2,0% en peso, antes de someter la biomasa microbiana a presión.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa de acondicionamiento comprende calentar la biomasa durante un período de tiempo entre 10 y 60 minutos.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que un agente de carga es hierba de cambio, cáscaras de soja, romero seco, rastrojo de maíz, celulosa, bagazo de caña de azúcar o biomasa microbiana gastada que comprende entre 40% y 90% de polisacárido y menos del 10%. aceite, y se agrega a la biomasa microbiana antes de una etapa de deshidratación de la biomasa microbiana a un contenido de humedad de menos del 6%.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la biomasa microbiana se seleccionó del grupo que consiste en biomasa microalgal, biomasa bacteriana, biomasa de levadura oleaginosa y biomasa de hongos oleaginosa y no de levadura, y se deriva de un cultivo que se cultivó a través de un proceso seleccionado del grupo que consiste en un proceso heterotrófico, uun proceso fotoautotrófico y un proceso mixotrófico.

14. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la biomasa microbiana es biomasa microalgal derivada de una microalga que tiene un perfil de ácido graso de:

menos del 2% de C14: 0; aproximadamente 13-16% C16: 0; aproximadamente 1-4% de C18: 0; aproximadamente 64-71% de C18: 1; aproximadamente 10-15% de C18: 2; aproximadamente 0,5-2% de C18: 3; y menos del 1% de longitud de cadena de carbono de 20 o más;

aproximadamente 1-2% de C14: 0; aproximadamente 16-26% C16: 0; aproximadamente 2-6% de C18: 0; aproximadamente 58-68% de C18: 1; y aproximadamente 7-11% de C18: 2;

al menos 4% de C8-C14, en donde la microalga contiene un gen exógeno que codifica una tioesterasa con preferencia por una o más longitudes de cadena de ácido graso de 8, 10, 12 y 14 átomos de carbono; entre 10 y 40% C8-C14; o

al menos 15% de ácidos grasos C: 16, al menos 50% de ácidos grasos C18: 1, al menos 7% de ácidos grasos C18: 2 y menos del 3% de ácidos grasos C10: 0-C14: 0.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el lípido extraído tiene una o más propiedades seleccionadas de:

menos de 0,01 miligramos de clorofila por kilogramo de lípido; o

uno o más de los siguientes: no más de 8 ppm de cloruro, no más de 2 ppm de fósforo, no más de 26 ppm de potasio, no más de 12 ppm de sodio y no más de 5 ppm de azufre.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la biomasa microbiana es del género microalgal Chlorella, Parachlorella o Prototheca, opcionalmente Chlorella o Prototheca.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la biomasa de microalgas es de la especie Prototheca moriformis o Chlorella prototecoides.