CN118440899A - 一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用 - Google Patents
一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN118440899A CN118440899A CN202311170337.2A CN202311170337A CN118440899A CN 118440899 A CN118440899 A CN 118440899A CN 202311170337 A CN202311170337 A CN 202311170337A CN 118440899 A CN118440899 A CN 118440899A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- promoting hair
- engineered
- hair regeneration
- sigroup
- snvs
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000003660 hair regeneration Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 title claims abstract description 41
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 210000003780 hair follicle Anatomy 0.000 claims abstract description 21
- 201000004384 Alopecia Diseases 0.000 claims abstract description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 12
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 208000003024 Diffuse alopecia Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 231100000360 alopecia Toxicity 0.000 claims abstract description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 22
- 208000024963 hair loss Diseases 0.000 claims description 15
- 230000003676 hair loss Effects 0.000 claims description 14
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 10
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 claims description 9
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 4
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 3
- 201000001297 telogen effluvium Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 2
- 230000003658 preventing hair loss Effects 0.000 claims description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 10
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 abstract description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 6
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 5
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 5
- 102100031873 Transcriptional coactivator YAP1 Human genes 0.000 description 5
- 101710193680 Transcriptional coactivator YAP1 Proteins 0.000 description 5
- 230000003779 hair growth Effects 0.000 description 5
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 5
- ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N Minoxidil Chemical compound NC1=[N+]([O-])C(N)=CC(N2CCCCC2)=N1 ZFMITUMMTDLWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 4
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 4
- 201000002996 androgenic alopecia Diseases 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229960003632 minoxidil Drugs 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 230000003797 telogen phase Effects 0.000 description 4
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 3
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000019058 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Human genes 0.000 description 3
- 108010051975 Glycogen Synthase Kinase 3 beta Proteins 0.000 description 3
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 3
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 3
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000004761 scalp Anatomy 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 3
- NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 17-β-hydroxy-5-α-Androstan-3-one Chemical compound C1C(=O)CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CC[C@H]21 NVKAWKQGWWIWPM-ABEVXSGRSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101000864743 Homo sapiens Secreted frizzled-related protein 1 Proteins 0.000 description 2
- -1 Lats1 Proteins 0.000 description 2
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 2
- 102100030058 Secreted frizzled-related protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 2
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 2
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229960004039 finasteride Drugs 0.000 description 2
- DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N finasteride Chemical compound N([C@@H]1CC2)C(=O)C=C[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H](C(=O)NC(C)(C)C)[C@@]2(C)CC1 DBEPLOCGEIEOCV-WSBQPABSSA-N 0.000 description 2
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 2
- 230000003781 hair follicle cycle Effects 0.000 description 2
- 230000017945 hippo signaling cascade Effects 0.000 description 2
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 1
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 1
- 206010020112 Hirsutism Diseases 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000029549 Muscle injury Diseases 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 201000001880 Sexual dysfunction Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000043168 TGF-beta family Human genes 0.000 description 1
- 108091085018 TGF-beta family Proteins 0.000 description 1
- 102100026508 Tafazzin Human genes 0.000 description 1
- 101710175789 Tafazzin Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 229960003473 androstanolone Drugs 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003778 catagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 230000002222 downregulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000003721 exogen phase Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 230000001815 facial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003648 hair appearance Effects 0.000 description 1
- 230000003700 hair damage Effects 0.000 description 1
- 210000000442 hair follicle cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003661 hair follicle regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000001875 irritant dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 108091051828 miR-122 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091066112 miR-122-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091057488 miR-122-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000003170 nutritional factors Nutrition 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920006324 polyoxymethylene Polymers 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001020 rhythmical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000872 sexual dysfunction Toxicity 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037314 wound repair Effects 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
- A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
- C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
本发明涉及一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用。所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡，以人诱导多能干细胞来源的挤压囊泡为载体，且所述挤压囊泡负载有siGroup，所述siGroup包括siTGF‑β1、siLats1和siSFRP1，所述siTGF‑β1的核苷酸序列为：5’‑CGACAAGTTGAACGCATATTGCACA‑3’；所述siLats1的核苷酸序列为：5’‑CATGAACACTTTCGCTGTAAGTAAA‑3’；所述siSFRP1的核苷酸序列为：5’‑TCAAGAGACAAACACTTCGAGTGAA‑3’。与现有技术相比，本发明方法制得的工程化纳米囊泡，利用hiPSCs为来源的挤压囊泡做为载体，替代传统的脂质体或纳米颗粒的治疗方式，且协同装载的活性分子的基因货物，具有多功能、治疗效果好的特性，可用于治疗脂溢性脱发和休止期脱发中毛囊的再生和损伤修复。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，尤其是涉及一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用。
背景技术
毛发生长是一个连续的循环过程，包括四个阶段：生长(生长期)、消退(退行期)、休止(休止期)和脱落(外生期)。脱发是由毛囊阶段的改变引起的，毛囊在其宿主的整个生命周期中，进行有节奏地、自发地、周期性的器官转化。毛囊在相对“静止”状态(休止期)之间循环。许多外源的、系统的、神经的、内分泌的和营养的因素都会影响毛囊的这些循环转化，导致脱发的出现。雄激素性脱发是最常见的脱发形式，雄激素脱发患者的毛囊周期在静止期(休止期)延长，在活跃期(生长期)缩短。目前主要的治疗方式为米诺地尔和非那雄胺，但这些药物的副作用限制了使用的长期性。米诺地尔可引起刺激性皮炎和短暂性面部多毛，非那雄胺可引起性功能障碍、不孕症等不良反应。因此，寻找能够促进头发生长的新替代品仍然是当务之急。
许多研究表明，毛囊再生与损伤修复受多组信号通路的调控，如经典的Wnt/β-catenin信号通路，TGF-β/Smad信号通路，Hippo信号通路以及PI3K-Akt信号通路。研究证实雄激素脱发患者的毛囊细胞中可显著观察到β-catenin表达减少和GSK-3β活性上调。最近研究证实GSK-3β抑制剂可以抑制毛乳头干细胞中的GSK-3β的活性，提升β-catenin的表达及稳定性，从而进一步的上调人毛乳头干细胞的毛发生长标志蛋白的活性和表达。
在TGF-β信号通路中，雄激素脱发患者体内双氢睾酮(DHT)处于较高水平，DHT会降低β-catenin的表达水平，并促进毛囊干细胞的生长负向调节因子TGF-β1的表达。研究证实，miR-122-5p可以通过下调TGF-β/Smad通路的功能，发挥在毛发再生以及骨骼肌损伤修复再生的过程中的积极作用。最新研究还显示出作为TGF-β家族的骨形态发生蛋白(BMPs)通过阻止表皮发育过程中的细胞增殖和分化，通过阻止毛囊休止期的生长，从而发挥控制毛囊生长期的启动。
Hippo信号通路是一条抑制细胞生长的通路。受到胞外生长抑制信号影响后，激活一系列激酶级联磷酸化反应，最终磷酸化下游效应因子Yes相关蛋白1(YAP)和Tafazzin蛋白(TAZ)，降低因子的细胞核活性，从而实现对器官大小和体积的调控。一项研究指出YAP的释放使机体显示出更强的伤口修复能力和新生毛囊形成能力。YAP磷酸化主要受到大肿瘤抑制基因1(Lats1)的调控，研究证实Lats1的高表达会导致YAP的磷酸化水平增加，进而导致会导致毛囊干细胞耗竭和脱发。这提示了针对脱发疾病中的毛囊修复可以采用小RNA干扰技术对靶向基因进行抑制，进而达到促进毛发再生的作用。
与小分子和蛋白质药物不同的是，RNA分子必须在胞内才能发挥作用。
目前用于RNA递送的非病毒载体可分类四类：基于脂质的纳米粒、聚合物纳米粒、无机纳米粒和仿生纳米粒，但因为在体内的毒性和有效性，大部分研究都仅停留在临床前的研究阶段。
发明内容
为了克服纳米颗粒获得技术存在的缺陷，本发明提供一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明第一方面：
提供一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡，以人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)来源的挤压囊泡(human induced pluripotent stem cells-small nanovesicles,hiPSC-sNVs)为载体，且所述挤压囊泡负载有siGroup，所述siGroup包括siTGF-β1、siLats1和siSFRP1，
所述siTGF-β1的核苷酸序列为：
5’-CGACAAGTTGAACGCATATTGCACA-3’；
所述siLats1的核苷酸序列为：
5’-CATGAACACTTTCGCTGTAAGTAAA-3’；
所述siSFRP1的核苷酸序列为：
5’-TCAAGAGACAAACACTTCGAGTGAA-3’。
本发明中，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡即为负载有siTGF-β1、siLats1和siSFRP1的hiPSC-sNVs，简称为hiPSC-sNVs/siGroup，可促进毛发再生。
在本发明的一个实施方式中，所述挤压囊泡为将人诱导多能干细胞(humaninduced pluripotent stem cells,hiPSCs)通过机械挤压形成的均一囊泡，也称之为人诱导多能干细胞sNVs或hiPSC-sNVs。
在本发明的一个实施方式中，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡的平均粒径为30-150nm，优选为80-120nm。
在本发明的一个实施方式中，所述挤压囊泡为将人诱导多能干细胞(humaninduced pluripotent stem cells,hiPSCs)通过机械挤压形成的均一囊泡，也称之为人诱导多能干细胞sNVs或hiPSC-sNVs。
在本发明的一个实施方式中，促进毛发再生的工程化纳米囊泡以悬浮剂的形式存在，且hiPSC-sNVs的浓度范围为1×108/mL–1×1012/mL，优选为1×1010/mL。
在本发明的一个实施方式中，促进毛发再生的工程化纳米囊泡以悬浮剂的形式存在，且siGroup的浓度为100nM。
本发明的第二方面：
提供一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制备方法，包括以下步骤：
S1、采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养hiPSCs，收集hiPSCs；
S2、用脂质体挤压器，将hiPSCs依次通过5μm、1μm、400nm、200nm、100nm孔径的聚碳酸酯滤膜，获得粗制混悬液；
S3、粗制混悬液采用梯度离心结合切向流的方法收集纯化挤压囊泡，获得hiPSC-sNVs；
S4、将步骤S3获得的hiPSC-sNVs与siGroup进行孵育获得hiPSC-sNVs/siGroup，即为促进毛发再生的工程化纳米囊泡，所述siGroup包括siTGF-β1、siLats1和siSFRP1。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，以商品化人诱导多能干细胞(RC01001-A)，采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养hiPSCs后收集细胞。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，无血清培养体系选择市售的型号为RP01020或RP01001的培养基。
在本发明的一个实施方式中，步骤S1中，培养hiPSCs后，将人诱导多能干细胞进行4℃400g离心10min，进而收集hiPSCs。
步骤S2中，将收集hiPSCs通过脂质体挤压的方式获得粗制混悬液，即，将hiPSCs依次通过5μm、1μm、400nm、200nm、100nm孔径的聚碳酸酯滤膜进行挤压，得到粗制混悬液。
在本发明的一个实施方式中，采用梯度离心结合切向流的方法收集纯化挤压囊泡，主要步骤是：
将粗制混悬液经4℃1500g离心20min，去除细胞碎片，获得上清液1；
将所述上清液1在4℃10000g离心1h，去除大囊泡，获得上清液2；
上清液2进一步用切向流过滤(TFF)设备进行纯化与浓缩，获得纯化hiPSC-sNVs。
在本发明的一个实施方式中，用切向流过滤(TFF)设备进行纯化与浓缩具体操作工艺为：流速设置为100mL/min，跨膜压设置为1.0psi。
在本发明的一个实施方式中，步骤S3中，收集sNVs后，通过电镜、粒径分析等方法进行鉴定，结果符合纳米级囊泡特征：直径范围30-150nm，透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构。
在本发明的一个实施方式中，步骤S4中，孵育处理，按以下方法进行：
将一定浓度的含有hiPSC-sNVs的悬浮液和siGroup进行混合，所述siGroup包括siTGF-β1、siLats1和siSFRP1，置于一定温度下孵育一定时间；
随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到含有促进毛发再生的工程化纳米囊泡的悬浮剂。
在本发明的一个实施方式中，含有hiPSC-sNVs的悬浮液的浓度范围为1×108/mL–1×10 12/mL，优选为1×10 10/mL；孵育温度的范围为4℃–50℃，优选为37℃；孵育时间范围为1h–48h，优选为4h；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水、生理缓冲液、细胞培养基等。
在本发明的一个实施方式中，含有促进毛发再生的工程化纳米囊泡的悬浮剂中，siGroup的浓度为100nM，hiPSC-sNVs的浓度范围为1×10 8/mL–1×10 12/mL，优选为1×1010/mL。
本发明第三方面：提供基于所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡(即hiPSC-sNVs/siGroup)的制剂，所述制剂为悬浮剂：将所述hiPSC-sNVs/siGroup溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在。
在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或细胞培养基。所述悬浮剂可通过微针注射、涂抹导入或喷雾等形式进行使用。
本发明第四方面：
提供所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡(即hiPSC-sNVs/siGroup)在制备治疗和/预防脱发的药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡(即hiPSC-sNVs/siGroup)在制备脱发疾病中毛囊修复的药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡(即hiPSC-sNVs/siGroup)在制备治疗脂溢性脱发和休止期脱发中毛囊的再生和损伤修复的药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，应用所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡(即hiPSC-sNVs/siGroup)治疗脱发。将含有所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡(即hiPSC-sNVs/siGroup)的悬液通过微针注射的方式进入头皮，观察所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡对脱发的治疗作用。还研究所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡对脱发的预防效果。
本发明验证所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡对脱发的治疗和预防作用的方法为：
T01、将hiPSC-sNVs/siGroup与293T细胞共孵育后进行沉默效率验证；
T02、将hiPSC-sNVs/siGroup与人角质形成细胞共孵育进行毒性水平检测；
T03、将hiPSC-sNVs/siGroup悬浮剂使用微针注射的方式注入小鼠的背部皮肤进行动物水平验证；
T04、对人体头皮微针注射hiPSC-sNVs/siGroup悬浮剂，进行皮肤毛囊修复效率检测。
本发明针对脱发疾病特征设计了可实现靶向治疗的包含有siTGF-β1、siLats1和siSFRP1的人多能干细胞来源的工程化纳米囊泡(sNVs)。
通过控制微囊泡所携带具有功能性siRNAs等生物活性物质，可以发挥调控毛囊干细胞活性参与毛发再生的生物学作用。根据临床应用的安全性以及较高的实施性，选用hiPSCs做为挤压囊泡的来源细胞。hiPSCs具有易获得性、低免疫原性、低致瘤性、低细胞毒性以及固有的归巢特性。以hiPSCs做为来源制作药物递送介质-挤压囊泡，因囊泡包含有细胞的磷脂、表面蛋白等物质，具有较好的细胞相容性，实现装载货物的特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。同时，本申请研究证明囊泡结构可以装载siRNA(siTGF-β1、siLats1和siSFRP1)，该工程化囊泡可从Hippo、Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号通路促进毛囊干细胞群的增殖分化进而促进毛发生长。
与现有技术相比，本发明方法制得的工程化纳米囊泡，利用hiPSCs为来源的挤压囊泡做为载体，替代传统的脂质体或纳米颗粒的治疗方式，且协同装载的活性分子的基因货物，具有多功能、治疗效果好的特性，可用于治疗脂溢性脱发和休止期脱发中毛囊的再生和损伤修复。
附图说明
图1：人诱导多能干细胞挤压形成的sNVs粒径分布及电镜图。
图2：hiPSC-sNVs/siGroup的RNA干扰效率检测结果。
图3：hiPSC-sNVs/siGroup细胞毒性水平检测结果。
图4：hiPSC-sNVs/siGroup加速休止期的毛发再生。
图5：三组脱发区HE染色显示完整毛囊数目情况。
图6：hiPSC-sNVs/siGroup促进人毛发再生。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例提供hiPSCs来源的sNVs的具体制备方法，包括以下步骤：
1.将保存在液氮中hiPSCs的取出，放入37℃预热的水浴锅中，一边摇匀一边解冻，肉眼观察细胞悬液内冰晶快完全时消失时取出。
2.立即吸取细胞悬液至15mL离心管中，逐滴加入9mL预热的细胞完全培养基ncEpic，混匀；同时取1mL预热的细胞培养液洗涤冻存管。
3.200g×5min离心去除上清，收集细胞，加入1-2mL完全培养基重悬细胞，将细胞接种在六孔板中，加入适量预热的新鲜的完全培养基，放入细胞培养箱中进行培养。
6.待hiPSCs生长至所需细胞数时，将hiPSCs消化后400g离心10min后，收集在50ml的离心管中。
7.将收集细胞使用PBS重悬后，经脂质体挤压器进行挤压，通过5μm、1μm、400nm、200nm、100nm孔径的聚碳酸酯滤膜，挤压10次得到粗制混悬液。本发明对所述脂质体挤压器的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售脂质体挤压器即可。
8.将所述粗制混悬液经4℃15000g 20min，去除细胞碎片，获得上清液1。将所述上清液1在4℃10000g离心1h，获得上清液2。
9.如上所述上清液2直接进行TFF过滤。TFF系统使用KR2i TFF系统，配用750kD改性聚醚砜中空纤维过滤器(MidiKros膜表面积115cm2)。将流速设置为100mL/min(不超过120mL/min)，跨膜压设置为1.0psi(在润洗、样品运行和漂洗中，跨膜压不应超过3.0psi)，过滤浓缩获得纯化hiPSC-sNVs。
实施例2
利用实施例1中收集的囊泡为例，进一步的对囊泡进行初步检测，包含以下步骤：
1.取样品10μL，滴在铜网上，并静置90s，用吸水纸吸干多余液体。
2.在避光条件下，滴加10μL醋酸双氧铀在铜网上，染色30s后用吸水纸吸干多余液体。
3.将制备好的铜网放置在避光盘中，干燥2h后，进行TAE透射电镜检查。
4.TAE透射电镜图像(图1)显示，制备的囊泡形状呈杯托状椭圆形。
另一方面，对所制备囊泡，取样后利用纳米流式检测法检测纳米粒度分布情况，具体步骤如下：
1.首先对纳米流式仪进行液流初始化和气泡排出。
2.按照说明使用标准品对纳米流式仪进行质控调试，使其达到最佳检测状态(散射和荧光通道的信号均达到最强且均一，质控标准品颗粒数计数值范围通常在5000-7000)。
3.在LabelledExo样品测量参数下检测磷酸盐缓冲液的颗粒数，确定磷酸盐缓冲液的洁净度，颗粒数计数小于200的磷酸盐缓冲液才能作为空白对照的数据采集并用于后续的样品稀释。
4.用洁净的磷酸盐缓冲液将挤压囊泡样品预稀释100倍，在囊泡样品测量参数对挤压囊泡样本进行数据采集。纳米流式仪颗粒计数在4000-8000之间为准确测量范围，若样品颗粒数计数过高或过低，则需调整样品的稀释倍数，再进行测定，记下样品的最终稀释倍数。
5.如图1显示，本申请所制备囊泡的主要直径为100nm,囊泡范围在30nm-150nm之间，属于典型的纳米级囊泡。
实施例3
利用实施例2中收集的囊泡，进一步的对囊泡进行孵育载药，包含以下步骤：
1.通过基因库对设计和构建siTGF-β1、siLats1和siSFRP1
所述siTGF-β1的核苷酸序列为：
5’-CGACAAGTTGAACGCATATTGCACA-3’；
所述siLats1的核苷酸序列为：
5’-CATGAACACTTTCGCTGTAAGTAAA-3’；
所述siSFRP1的核苷酸序列为：
5’-TCAAGAGACAAACACTTCGAGTGAA-3’。
2.采用单纯孵育法的方式将siTGF-β1、siLats1和siSFRP1装载到实施例2中的囊泡，具体操作为：
取100μL实施例1所获得hiPSC-sNVs(>109/mL)于EP管中，加入各30μL的siTGF-β1、siLats1和siSFRP1的2μM储存液，颠倒混匀置于37℃孵育24h。
将上述步骤中的得到的混合物通过超速离心去除游离的siTGF-β1、siLats1和siSFRP1，即得共载siTGF-β1、siLats1和siSFRP1的hiPSC-sNVs/siGroup。
实施例4
以实施例3所制备囊泡为例，进一步进行了角质形成细胞的沉默效率和毒性实验，具体步骤如下：
(一)hiPSC-sNVs/siGroup的沉默效率实验
具体实验过程为：
首先，将293T细胞以2×105铺板于3mL细胞培养皿中，待细胞贴壁并生长至融合度50％时；取3mL浓度为1×109颗粒数/mL的hiPSC-sNVs/siGroup(对照组采用空载的hiPSC-sNVs)，放置于培养箱24h，更换完全培养基，再培养24h。去除细胞培养基，将细胞用trizol裂解后，提取细胞总RNA，通过qRT-PCR检测TGF-β1、Lats1和SFRP1的表达水平。结果如图2所示，与对照组相比，hiPSC-sNVs/siGroup与细胞共孵育后，TGF-β1、Lats1和SFRP1的表达水平显著下降。
(二)hiPSC-sNVs/siGroup细胞毒性实验
将人角质形成细胞(HACAT)铺板于96孔板中，待细胞贴壁生长后，取200μL浓度为1×109颗粒数/mL的hiPSC-sNVs/siGroup，放置于培养箱24h，更换完全培养基，再培养24h。同时作为对照，以实施例2中未载药的纳米囊泡(参考前述操作进行制备即可)进行对照实验。
利用CCK8试剂盒检测纳米囊泡(hiPSC-sNVs/siGroup)对HACAT细胞增殖与活性的影响，结果如图3所示，相较于对照组，hiPSC-sNVs/siGroup并未对细胞的增殖造成影响。
实施例5
应用人诱导多能干细胞sNVs负载了siGroup的hiPSC-sNVs/siGroup促进毛发再生
选择7周龄的C57BL/6小鼠，背部剃毛后，分别应用生理盐水(作为对照组)、hiPSC-sNVs/siGroup悬液(作为hiPSC-sNVs/siGroup治疗组)、米诺地尔(作为米诺地尔治疗组)进行背部皮肤微针注射。处理治疗到21天，取7、14、21天的不同组皮肤进行多聚甲醛固定，梯度脱水及二甲苯透明后，进行石蜡包埋并切片。切片在脱蜡复水后，进行切片苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin,HE)染色，并对完整毛囊进行统计。通过皮肤病理切片以及组织学统计评估hiPSC-sNVs/siGroup悬液对C57BL/6小鼠毛发再生的影响。实验结果显示，hiPSC-sNVs/siGroup悬液能明显促进C57BL/6小鼠的毛囊再生，见图4，5。
实施例6
应用人诱导多能干细胞sNVs负载了siGroup的hiPSC-sNVs/siGroup促进毛发再生的应用实例
将脱发志愿者的头皮使用hiPSC-sNVs/siGroup微针注射治疗，所选区域具备有还未完全萎缩的毛囊。并在使用后的第30天，第60天，第90天进行统计。结果如图6，显示在hiPSC-sNVs/siGroup处理第30天、第60天、第90天的使用结果。实验结果显示，虽然在第30天出现了掉发的现象，但在用至第90天时显示出较多毛发的生长。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉该领域技术的人员可以轻松地对这些实施例进行各种修改，并将本文中所述的一般原理应用于其他实施例，而无需进行创造性的工作。因此，本发明并不限于上述实施例，根据本发明所披露的内容，该领域技术人员所做出的改进和修改应属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡，其特征在于，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡，以人诱导多能干细胞来源的挤压囊泡为载体，且所述挤压囊泡负载有siGroup，所述siGroup包括siTGF-β1、siLats1和siSFRP1，
所述siTGF-β1的核苷酸序列为：
5’-CGACAAGTTGAACGCATATTGCACA-3’；
所述siLats1的核苷酸序列为：
5’-CATGAACACTTTCGCTGTAAGTAAA-3’；
所述siSFRP1的核苷酸序列为：
5’-TCAAGAGACAAACACTTCGAGTGAA-3’。
2.根据权利要求1所述的一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡，其特征在于，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡的平均粒径为30-150nm，优选为80-120nm。
3.权利要求1或2所述的一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养hiPSCs，收集hiPSCs；
S2、用脂质体挤压器，将hiPSCs依次通过5μm、1μm、400nm、200nm、100nm孔径的聚碳酸酯滤膜，获得粗制混悬液；
S3、粗制混悬液采用梯度离心结合切向流的方法收集纯化挤压囊泡，获得hiPSC-sNVs；
S4、将步骤S3获得的hiPSC-sNVs与siGroup进行孵育获得hiPSC-sNVs/siGroup，即为促进毛发再生的工程化纳米囊泡，所述siGroup包括siTGF-β1、siLats1和siSFRP1。
4.根据权利要求3所述的一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤S1中，无血清培养体系选择市售的型号为RP01020或RP01001的培养基；
步骤S1中，培养hiPSCs后，将人诱导多能干细胞进行4℃400g离心10min，进而收集hiPSCs。
5.根据权利要求3所述的一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤S3中，采用梯度离心结合切向流的方法收集纯化挤压囊泡，主要步骤是：
将粗制混悬液经4℃1500g离心20min，去除细胞碎片，获得上清液1；
将所述上清液1在4℃10000g离心1h，去除大囊泡，获得上清液2；
上清液2进一步用切向流过滤设备进行纯化与浓缩，获得纯化hiPSC-sNVs。
6.根据权利要求5所述的一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制备方法，其特征在于，用切向流过滤设备进行纯化与浓缩具体操作工艺为：流速设置为100mL/min，跨膜压设置为1.0psi。
7.根据权利要求3所述的一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制备方法，其特征在于，步骤S4中，孵育处理，按以下方法进行：
将一定浓度的含有hiPSC-sNVs的悬浮液和siGroup进行混合，所述siGroup包括siTGF-β1、siLats1和siSFRP1，置于一定温度下孵育一定时间；
随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到含有促进毛发再生的工程化纳米囊泡的悬浮剂；
含有hiPSC-sNVs的悬浮液的浓度范围为1×10 8/mL–1×10 12/mL，孵育温度的范围为4℃–50℃，孵育时间范围为1h–48h，超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，生物相容性介质为生理盐水、生理缓冲液、细胞培养基。
8.基于权利要求1所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡的制剂，其特征在于，所述制剂为悬浮剂：将所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；
悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或细胞培养基。
9.权利要求1所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡的应用，其特征在于，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡在制备治疗和/预防脱发的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡的应用，其特征在于，所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡在制备脱发疾病中毛囊修复的药物中的应用；或，
所述促进毛发再生的工程化纳米囊泡在制备治疗脂溢性脱发和休止期脱发中毛囊的再生和损伤修复的药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311170337.2A CN118440899A (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311170337.2A CN118440899A (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118440899A true CN118440899A (zh) | 2024-08-06 |
Family
ID=92328680
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311170337.2A Pending CN118440899A (zh) | 2023-09-12 | 2023-09-12 | 一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN118440899A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004248632A (ja) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Osaka Industrial Promotion Organization | 男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法、男性型脱毛症治療薬の製造方法および男性型脱毛症治療薬。 |
| CN107847428A (zh) * | 2015-05-07 | 2018-03-27 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 用于促进毛发生长的方法和组合物 |
| CN113768861A (zh) * | 2021-10-09 | 2021-12-10 | 热休(厦门)细胞生物科技有限公司 | 一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法 |
| CN116568333A (zh) * | 2020-12-23 | 2023-08-08 | 生物欧赛加有限责任公司 | miRNA-485抑制剂用于诱导毛发生长的用途 |
-
2023
- 2023-09-12 CN CN202311170337.2A patent/CN118440899A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004248632A (ja) * | 2003-02-21 | 2004-09-09 | Osaka Industrial Promotion Organization | 男性型脱毛症治療薬のスクリーニング方法、男性型脱毛症治療薬の製造方法および男性型脱毛症治療薬。 |
| CN107847428A (zh) * | 2015-05-07 | 2018-03-27 | 纽约市哥伦比亚大学理事会 | 用于促进毛发生长的方法和组合物 |
| CN116568333A (zh) * | 2020-12-23 | 2023-08-08 | 生物欧赛加有限责任公司 | miRNA-485抑制剂用于诱导毛发生长的用途 |
| CN113768861A (zh) * | 2021-10-09 | 2021-12-10 | 热休(厦门)细胞生物科技有限公司 | 一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| NATHAN J. HAWKSHAW ET AL.: "Identifying novel strategies for treating human hair loss disorders: Cyclosporine A suppresses the Wnt inhibitor, SFRP1, in the dermal papilla of human scalp hair follicles", 《BIOLOGY》, 8 May 2018 (2018-05-08), pages 1 - 17 * |
| 刘国英，姚航平: "斑秃患者血清转化生长因子β水平及与脱发面积关系的观察", 《中华皮肤科杂志》, vol. 33, no. 1, 29 February 2000 (2000-02-29), pages 46 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109414459B (zh) | 源自脐带血的外泌体用于组织修复的用途 | |
| EP3417887B1 (en) | Construction of microrna gene-mediated novel tissue engineered nerve and applications thereof in repairing nerve defect | |
| EP3862009A1 (en) | Composition for skin regeneration and wound healing, comprising induced exosomes | |
| EP2582791B1 (en) | Hair follicle neogenesis | |
| US20210032598A1 (en) | Activation-induced tissue-effector cells suitable for cell therapy and extracelluar vesicles derived therefrom | |
| CN111073881A (zh) | 用于毛发再生的含有诱导的外泌体的组合物 | |
| EP3515459A1 (en) | Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders | |
| CN106659741B (zh) | 小尺寸干细胞的毛发生长促进功能及其用途 | |
| CN108354947A (zh) | 负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物上的用途 | |
| Sun et al. | A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair | |
| CN111643527B (zh) | 转基因干细胞外泌体在制备药物或美白化妆品中的用途 | |
| CN109852578A (zh) | 一种人毛囊毛乳头细胞来源的外泌体提取方法 | |
| US10695293B2 (en) | Method of preventing or treating radiation-induced dermatitis with extracellular vesicles | |
| EP3600151A1 (en) | Methods of treating systemic graft-versus-host disease with extracellular vesicles | |
| CN115970001A (zh) | 多巴胺修饰的水凝胶微球、其负载人脱落乳牙牙髓干细胞外泌体及制备方法和应用 | |
| CN111956668B (zh) | 一种皮肤再生修复细胞组合物及制备方法 | |
| CN118440899A (zh) | 一种促进毛发再生的工程化纳米囊泡及其制备方法与应用 | |
| CN116410918B (zh) | 一种皮肤类器官外泌体及其制备方法和应用 | |
| CN115461059A (zh) | 与源自人真皮乳头细胞的外泌体有关的组合物和方法 | |
| US20140011227A1 (en) | Fibrous structure | |
| CN113621569A (zh) | 一种基于氧浓度梯度的自体脂肪干细胞外泌体及其制备方法与应用 | |
| JPWO2005035739A1 (ja) | 再生治療システム | |
| CN113144221A (zh) | 外泌体制剂及其制备方法和应用 | |
| EP4321614A1 (en) | Method for preparing oligodendrocytes and use | |
| CN111876390B (zh) | 负载化合物的转基因干细胞外泌体在制备药物或美白化妆品中的用途 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |