CN109414459B - 源自脐带血的外泌体用于组织修复的用途 - Google Patents
源自脐带血的外泌体用于组织修复的用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体接触，从而促进患者的伤口愈合。本申请还提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含一种或多种miRNA和药学上可接受的载体的组合物接触，从而促进患者的伤口愈合。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年5月16日提交的美国临时申请号62/336,907和2016年3月24日提交的美国临时申请号62/313,002的优先权，其各自的全部内容通过引用合并于此。
技术领域
在整个申请中，引用了各种出版物，包括在括号中引用的出版物。权利要求之前的说明书末尾列出了括号中引用的出版物的完整出处。所有引用的出版物的公开内容通过引用其全部内容并入本申请中，以便更全面地描述本发明所属领域的现状。
背景技术
慢性伤口定义为在3个月内无法愈合的伤口(Nunan等人，2014)。伤口是皮肤正常结构和功能的破坏。与急性伤口相反，慢性伤口的修复没有一个可以使皮肤得到持续恢复的有序和及时的修复过程。
在发达国家，据估计1-2％的人口在其一生中会经历慢性伤口(Gottrup，2004)。此外，全世界约有1.5亿糖尿病患者，其中约15％患有足部溃疡，可演变成不愈合的慢性伤口(Boulton等人，2005)。
慢性和不愈合的伤口治疗成本非常高，因为与急性伤口治疗相比需要几种治疗。由于医疗保健成本增加，人口老龄化以及全球糖尿病和肥胖症急剧增加，慢性伤口造成的负担正在增加(Sen,2009)。
最常见的慢性伤口类型是：(i)动脉溃疡，(ii)静脉溃疡，(iii)糖尿病溃疡和(iv)压迫溃疡。
在患有高血压、动脉粥样硬化和血栓形成的患者中形成动脉溃疡，其中血液供应减少导致缺血状态。
静脉溃疡占溃疡病例的一半以上，并且它们主要发生在下肢(主要是腿)中，并且它们与深静脉血栓形成、静脉曲张和静脉高压相关(Eberhardt&Raffetto，2005)。据估计，在美国，大约有50万患者患有静脉溃疡(Abbade&Lastoria，2005)。
糖尿病溃疡发生在患有糖尿病的个体中，其具有免疫功能受损、缺血(由于血液循环不良)和神经病变(神经损伤)。除非接受治疗，否则糖尿病神经病变会增加下肢截肢的可能性。2004年，糖尿病患者进行了约71,000例非创伤性下肢截肢术(Sen，2009)，截肢率随年龄增长而增加。
压迫溃疡由于局部区域上的体重的恒定压力和摩擦而发生，这可能导致皮肤破裂和溃疡。易受伤害的患者包括老年人、中风患者、糖尿病或痴呆患者、脊髓损伤患者、轮椅患者或行动障碍或感觉障碍的患者。每年仅在急救护理设施中就有250万例压迫溃疡在美国接受治疗(Reddy等人，2006)。
伤口愈合过程
伤口愈合是动态过程，其由四个连续和重叠阶段组成：止血、炎症、增殖和组织重塑。(Guo等人，2010)。为了最佳的伤口愈合，每个阶段的事件必须以精确和规范的方式发生。过程中的中断、异常或延长可导致伤口愈合延迟或慢性伤口愈合不愈。(Guo等人，2010)。
伤口愈合的止血阶段在损伤后立即开始，且特征在于血管收缩、血小板聚集、脱粒和纤维蛋白凝块形成。(Guo等人，2010)。具体地，在损伤部位与暴露的细胞外基质接触导致血小板释放凝血因子，导致血凝块的形成。此外，接触还将导致血小板释放促炎细胞因子和生长因子，例如转化生长因子(TGF)-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子(IGF)。这些分子激活并吸引嗜中性粒细胞和巨噬细胞，从而引发伤口愈合的炎症阶段。这些分子还吸引内皮细胞和成纤维细胞，这将影响增殖和组织重塑的后期阶段。(Guo等人，2010；Velnar等人，2009)。
伤口愈合的炎症阶段特征在于嗜中性粒细胞浸润、单核细胞浸润和分化成巨噬细胞以及淋巴细胞浸润。嗜中性粒细胞的主要功能是通过吞噬作用，通过产生诸如蛋白酶和活性氧物质(ROS)的物质来清除伤口部位中的入侵微生物和细胞碎片。巨噬细胞在伤口愈合过程中发挥多种功能，包括释放细胞因子以募集和激活白细胞并清除凋亡细胞(包括嗜中性粒细胞)。巨噬细胞还释放生长因子，例如TGF-β和FGF，其激活角质形成细胞、成纤维细胞和内皮细胞，从而启动伤口愈合的增殖期。淋巴细胞也在晚期炎症阶段迁移到伤口，然而，它们对伤口愈合的作用尚不完全清楚。(Guo等人，2010；Velnar等人，2009)。
增殖期的特征在于再上皮化、血管生成、胶原合成和细胞外基质形成。在修复性真皮中，成纤维细胞和内皮细胞是存在的最突出的细胞类型，且它们起到支持毛细血管生长、胶原形成和损伤部位的肉芽组织形成的作用。(Guo等人，2010；Velnar等人，2009)。
重塑阶段是伤口愈合的最后阶段，并且其可持续长达一年或两年，有时持续甚至更长的时间段。重塑阶段是降解和合成之间的微妙平衡，其特征在于胶原重塑和血管成熟和消退。具体地，细胞外基质被重塑为接近正常组织的结构，并且伤口经历由肌成纤维细胞介导的收缩。(Guo等人，2010；Velnar等人，2009)。
糖尿病
糖尿病代表一系列以慢性高血糖症为特征的代谢紊乱。I型糖尿病，也称为幼发型糖尿病，是由分泌胰岛素的胰岛β细胞的自身免疫性破坏引起的。II型糖尿病，也称为成年型糖尿病，其特征在于胰岛素分泌过多、组织胰岛素抵抗和随后的β细胞功能障碍。(Goutos等人，2015)。
糖尿病对伤口愈合过程的影响
糖尿病个体表现出急性伤口的愈合受损，并且易于发展慢性伤口，例如糖尿病足溃疡。(Guo等人，2010)。
糖尿病对伤口愈合过程的几个方面产生不利影响，例如，糖尿病改变巨噬细胞的不同表型之间的平衡，这导致炎性细胞数量增加并阻碍向增殖期的转变。糖尿病还与伤口部位的生长因子水平降低、异常细胞外基质沉积和血管形成抑制有关。(Goutos等人，2015；Guo等人，2010)。
外泌体
外泌体是由大多数类型的细胞分泌的脂质体样小泡(30-200nm)，其在称为多泡体(MVB)的区室中的分泌细胞内形成，并且随后通过内体区室与质膜的融合而释放，导致内容物释放到细胞外环境(Raposo和Stoorvogel，2013)。它们含有特定组的蛋白质、脂质和RNA，取决于分泌细胞和刺激的类型，而不是随机的细胞质内容物样本(Raposo和Stoorvogel，2013；Mathivanan S.和Simpson R.J.，2009)。它们以mRNA和微小RNA的形式携带遗传物质，这一特征促使它们成为有前景的生物衍生基因传递系统(O'Loughlin等人，2012)。
用于受损组织的实验再生的细胞类型，如间充质干细胞(MSC)或造血干细胞(HSC)，是外泌体的丰富来源，其已被提议用以成功替代不同损伤模型中的基于细胞的疗法(Bian等人，2014；Shabbir等人，2015；Zhang B.等人，2015；Zhang J.等人；Lai RC,2010；Zhou Y，2013；Sahoo S，2011)。
MSC是多功能的非造血成体干细胞，其可以从脐带(Erices等人，2000；Gang等人，2004)、胎盘或脂肪组织和骨髓中分离。这些细胞可以分化成几种细胞类型，例如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞(Pittenger等人，1999；Crapnell等人，2013)。最近已经证明，除了它们通过分化的直接再生潜能外，这些细胞还可以通过旁分泌刺激诱导修复，例如外泌体分泌(Lai等人，2011；Lai等人2010)。MSC分泌的外泌体已被证明可诱导不同小鼠疾病模型的修复，例如心肌梗死(Lai等人，2010)以及伤口愈合(Lai等人，2010)(Zhang等人，干细胞2014；Shabir等人，干细胞工程2015；Zhang等人，化医学杂志2015)。
尽管许多论文证明源自MSC的外泌体可以诱导组织再生，例如伤口愈合，但对于源自脐带血单核细胞(UCBMNC)的外泌体并非如此。此外，尚未评估人脐带血单核细胞分泌的外泌体的生物活性，也未评估其治疗慢性伤口的治疗潜力。
发明内容
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体接触，从而促进患者的伤口愈合。
本发明还提供了一种包含由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体的组合物，用于促进有此需要的患者的伤口愈合。
本发明还提供了一种制备包含由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体的组合物的方法，包括：步骤a)从所述UCBMNC中分离所述外泌体，和步骤b)将所述外泌体悬浮于药学上可接受的载体中。
本发明还提供了一种伤口护理产品，其包括由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体。优选地，外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。
本发明还提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含miRNA hsa-miR-150-5p的组合物接触，从而促进患者的伤口愈合。
本发明还提供了一种包含miRNA hsa-miR-150-5p和药学上可接受的载体的组合物，用于促进有此需要的患者的伤口愈合。
本发明还提供了一种制备包含miRNA hsa-miR-150-5p和药学上可接受的载体的组合物的方法，包括：步骤a)将miRNA hsa-miR-150-5p与转染剂混合，和步骤b)将混合物悬浮在药学上可接受的载体中。
附图说明
图1A-图1B为脐带血单核细胞的表征和冷冻保存的影响，如血液分析仪所分析的。
(A)脐带血中存在的不同白细胞亚群(淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的详细组成。
(B)处理脐带血单核细胞(总淋巴细胞和单核细胞)的组成相对于总白细胞的影响。
图2A-图2E为脐带血单核细胞分泌的外泌体的表征。
(A)通过DLS的外泌体的大小分布。
(B)通过DLS评估的外泌体的ζ电位。
(C.l)通过TEM评估的UCBMNC分泌的外泌体的大小和形态。(C.2)通过TEM评估的UCBMNC分泌的外泌体的大小和形态。
(D)如通过流式细胞术分析的，在低氧和对照条件(常氧)中预处理的UCBMNC分泌的外泌体中的表面标志物的表达。结果是平均值+/-SEM，n＝3。
(E)总蛋白质含量，如通过在缺氧(Exo-Hyp)和常氧(Exo_Nor)中预处理的UCBMNC分泌的外泌体的Biorad的DC蛋白质测定所定量的。结果是平均值+/-SEM，n＝3。通过t检验进行统计学分析。*p<0.05。
图3A-图3D为内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞中的外泌体细胞毒性和外泌体摄取。
(A)通过碘化丙啶/赫斯特染色评估的外泌体(来自3个不同供体)在HUVEC中的细胞毒性。将细胞暴露于外泌体24小时，并在72小时后评估生存力。结果是平均值+/-SEM，每个供体n＝3。在每个图像中量化约2000个细胞。
(B)如通过流式细胞术评估的，内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞对外泌体的摄取。结果是平均值+/-SEM，n＝4-6。
(C)在外耗竭培养基中暴露于Syto®RNASelectTM标记的外泌体(1-20μg/ml)并孵化16小时的皮肤细胞的共聚焦显微镜检查。
(D)在HUVEC、HaCaT细胞和成纤维细胞中定量Syto®RNASelectTM标记的外泌体。结果是平均值+/-SEM，n＝4。
图4A.1-图4B.4为在皮肤细胞中的生物活性UCBMNC-Exo。
(A)经受缺血预处理(Exo_Hyp)的CD34耗尽的UCBMNC细胞分泌的外泌体增加内皮细胞和角质形成细胞的存活，但不增加成纤维细胞的存活。获得从3个不同供体收集的外泌体的结果。结果是平均值+/-SEM，每个供体n＝3。血管内皮生长因子(VEGF，50ng/mL)或血小板衍生生长因子(PDGF-BB，50ng/mL)用作对照。
(B)用Exo_Hyp或Exo_Nor处理后，内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞的增殖。获得从3个不同供体收集的外泌体的结果。结果是平均值+/-SEM，每个供体n＝3。
*p<0,05；**p<0,01；***p<0,001。
图5A.1-图5B为在皮肤细胞中的生物活性UCBMNC-Exo。
(A)用Exo_Hyp或Exo_Nor处理后在角质形成细胞和成纤维细胞中的划痕测定。
(B)基质胶中的内皮管测定。用Exo Hyp或Exo Nor处理HUVEC。
在(A)和(B)中，获得了从3个不同供体收集的外泌体的结果。结果是平均值+/-SEM，每个供体n＝3。*p<0,05；**p<0,01；***p<0,001。
6A.1-图6B.2为UCBMNC-Exo miRNA谱的表征。
(A)在两个不同供体中在Exo_Hyp和Exo_Nor中鉴定的miRNA。
(A.1)在由hUCBMNC分泌的外泌体中鉴定出69种不同的miRNA，其中CD34-耗尽来自经受通过RNASeq的缺氧(HYP)和对照条件(NOR)的两个不同供体(A和B)，在所分析的所有外泌体中计数超过20个读数。
(A.2)具有在缺氧(HYP)和常氧(NOR)中处理两种供体的hUCBMNC后获得的外泌体的超过50个读数的44个miR的树视图表示。
(B)10个供体的miRNA的平均表达。
(B.1)通过RNASeq检测的来自缺氧处理的hUCBMNC的外泌体的15种最多表达的miRNA的相对表达。RNU6用作对照。获得从10个不同供体收集的外泌体的结果。结果是平均值+/-SEM，每个供体n＝3-4。
(B.2)来自缺氧(HYP)与常氧(NOR)处理的hUCBMNC的外泌体的12种最多表达的miRNA的相对表达。RNU6用作对照。获得从10个不同供体收集的外泌体的结果。结果是平均值+/-SEM，每个供体n＝3-4。通过单因素方差分析和Newman-Keuls多重比较检验进行统计学分析，*p<0,05；**p<0,01；***p<0,001。
图7A.1-图7C为UCBMNC-Exo刺激正常和I型和II型糖尿病小鼠模型中的伤口愈合。
(A.l)来自供体1的UCBMNC-Exo；(A.2)来自供体2的UCBMNC-Exo；(A.3)来自施用给非糖尿病动物的供体1的UCBMNC-Exo；(A.4)来自施用给遗传性糖尿病动物(db/db)的供体1的UCBMNC-Exo；
(B)第10天对照和治疗的伤口(1型糖尿病)的H&E染色；
(C)用对照盐水溶液(对照伤口)处理的伤口之间的伤口闭合率的比较，当UCBMNC-Exo在第1天仅在远处伤口施用一次(CT Exo单次施用)，或每天施用两次(CT Exo 1)双次施用和CT Exo 2双次施用)时。UCBMNC-Exo每天施用两次于远处切除伤口，刺激对照伤口处的伤口愈合。
图8A.1-图8B.2为MiR-150-5p在体外增强成纤维细胞对缺血和角质形成细胞迁移的存活，并在体内增强伤口愈合。
(A)miR-150-5p在(A.1)缺血条件下的存活和(A.2)内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞的增殖、(A.3)成纤维细胞和角质形成细胞的划痕测定和(A.4)内皮细胞在基质胶中的管形成中的体外作用。血管内皮生长因子(VEGF，50ng/mL)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB，50ng/mL)用作所有测定的对照。结果是平均值+/-SEM，n＝3-6。通过曼-惠特尼检验进行统计学分析，*p<0,05；**p<0,01；***p<0,001。
(B.1)miR-150在C57B1/6中造成的切除伤口的伤口愈合中的体内作用。结果是平均值+/-SEM，n＝5-6。通过t检验进行统计学分析，对于加扰治疗(*)，p<0.05；对于“无治疗”＝PBS(#)。(B.2)用miR-150-5p、加扰和PBS治疗的伤口的第0天；第7天和第10天的代表性图像(无治疗)。
具体实施方式
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体的组合物接触，从而促进患者的伤口愈合。
在一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。
在一个实施方案中，UCBMNC包含淋巴细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一个实施方案中，UCBMNC包含淋巴细胞。在一个实施方案中，在一个实施方案中，UCBMNC由淋巴细胞构成。在一个实施方案中，UCBMNC基本上由淋巴细胞构成。
在一个实施方案中，UCBMNC包含单核细胞。在一个实施方案中，UCBMNC由单核细胞构成。在一个实施方案中，UCBMNC基本上由单核细胞构成。
在一个实施方案中，UCBMNC包含嗜中性粒细胞。在一个实施方案中，UCBMNC包含嗜酸性粒细胞。在一个实施方案中，UCBMNC包含嗜碱性粒细胞。
在一个实施方案中，UCBMNC包含淋巴细胞和单核细胞。在一个实施方案中，UCBMNC基本上由淋巴细胞和单核细胞构成。在一个实施方案中UCBMNC由淋巴细胞和单核细胞构成。
在一个实施方案中，UCBMNC包含淋巴细胞和嗜中性粒细胞。在一个实施方案中UCBMNC包含单核细胞和嗜中性粒细胞。
在一个实施方案中，UCBMNC包含CD34+细胞。在另一个实施方案中，UCBMNC不包含CD34+细胞。
在一个实施方案中，UCBMNC未暴露于缺血性病症。在另一个实施方案中，UCBMNC暴露于缺血性病症。在一个实施方案中，UCBMNC暴露于低氧条件。在一个实施方案中，UBCMNC未暴露于低氧条件。
在一个实施方案中，暴露于缺血和/或缺氧条件刺激来自UCBMNC的外泌体的分泌增加。在另一个实施方案中，暴露于缺血和/或缺氧条件增加了分泌的外泌体的生物活性。在一个实施方案中，生物活性是促存活的生物活性。在另一个实施方案中，生物活性是促增殖生物活性。在另一个实施方案中，生物活性是促迁移生物活性。
在一个实施方案中，至少一个外泌体呈现球形形态。
在一个实施方案中，外泌体的平均粒径为100nm至200nm。在一个实施方案中，外泌体的平均粒径为120nm至170nm。在一个实施方案中，外泌体的平均粒径为130nm至150nm。在一个实施方案中，外泌体的平均粒径为140nm。
在一个实施方案中，外泌体具有-lO mV至-50mV的负ζ电位。在一个实施方案中，外泌体具有-2O mV至-40mV的负ζ电位。在一个实施方案中，外泌体具有-30mV的负ζ电位。
在一个实施方案中，至少一个外泌体表达标志物CD9、CD34、CD81和/或Hsc70。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p和hsa-miR-146b-5p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-146a-5p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p和hsa-miR-342-3p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p和hsa-miR-26a-l-5p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p和hsa-miR-21-5p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，至少一个外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。在一个实施方案中，至少10％的外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。在一个实施方案中，至少25％的外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。在一个实施方案中，至少50％的外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。在一个实施方案中，至少75％的外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。在一个实施方案中，至少90％的外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。
在一个实施方案中，miRNA hsa-miR-150-5p在外泌体中的浓度高于外泌体中的任何其它miRNA的浓度。
在一个实施方案中，外泌体富含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p，从而增加所述外泌体中的miRNA的浓度。
在一个实施方案中，外泌体富含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p，从而增加所述外泌体中的miRNA的浓度。
在一个实施方案中，外泌体富含miRNA hsa-miR-150-5p，从而增加所述外泌体中的miRNA的浓度。
外泌体可以使用本领域已知的常规方法富集miRNA，包括但不限于差速离心、密度梯度/缓冲离心、尺寸排阻色谱、沉淀、珠上的免疫亲和捕获，和RNA装载技术如基于电穿孔的技术、分泌细胞的病毒感染以及通过与囊泡蛋白融合的序列识别结构域特定RNA序列的靶向嵌入。
在一个实施方案中，该组合物是液体。在一个实施方案中，该组合物是乳膏。在一个实施方案中，该组合物是凝胶。
在一个实施方案中，在单一涂覆中施用该组合物。在另一个实施方案中，定期施用该组合物。在另一个实施方案中，该组合物的施用频率低于每日一次。在另一个实施方案中，每天施用一次该组合物。在另一个实施方案中，该组合物的给药频率高于每日一次。在另一个实施方案中，每日施用两次该组合物。在另一个实施方案中，每日施用三次该组合物。
在一个实施方案中，局部施用该组合物。在一个实施方案中，通过皮下注射施用该组合物。在一个实施方案中，通过皮肤注射施用该组合物。在一个实施方案中，通过腹膜内注射施用该组合物。在一个实施方案中，通过静脉内注射施用该组合物。
在一个实施方案中，组合物中的外泌体的浓度为0.01μg/mL-10μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为1μg/mL-3μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为0.5μg/mL-1.5μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为约1μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为0.01μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为0.25μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为0.5μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为0.75μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为1.0μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为1.25μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为1.5μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为1.75μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为2.0μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为2.25μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为2.5μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为2.75μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为3.0μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为5.0μg/mL。在一个实施方案中，外泌体的浓度为10μg/mL。
在一个实施方案中，组合物还包含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p，其中miRNA不包含在外泌体中。
在一个实施方案中，组合物还包含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p，其中miRNA不包含在外泌体中。
在一个实施方案中，组合物还包含miRNA hsa-miR-150-5p，其中miRNA hsa-miR-150-5p不包含在外泌体中。
在一个实施方案中，通过加快伤口愈合速率促进伤口愈合。在一个实施方案中，通过诱导血管形成促进伤口愈合。
在一个实施方案中，通过增加细胞存活来促进伤口愈合。在一个实施方案中，通过增加角质形成细胞的存活来促进伤口愈合。在另一个实施方案中，通过刺激内皮细胞的存活来促进伤口愈合。
在一个实施方案中，通过增加细胞增殖来促进伤口愈合。在一个实施方案中，通过增加成纤维细胞的增殖来促进伤口愈合。
在一个实施方案中，通过增加细胞向伤口的迁移来促进伤口愈合。在一个实施方案中，通过增加成纤维细胞向伤口的迁移来促进伤口愈合。在另一个实施方案中，通过增加角质形成细胞向伤口的迁移来促进伤口愈合。
在一个实施方案中，通过增加伤口部位处和/或附近的管形成来促进伤口愈合。在一个实施方案中，通过诱导内皮细胞的管形成来促进伤口愈合。
在一个实施方案中，外泌体有效增加形成的血管的总数。在另一个实施方案中，外泌体有效增加所形成的血管网络的复杂性。在一个实施方案中，通过增加数量的分支点来评估所形成的血管网络的复杂性。
在一个实施方案中，角质形成细胞已暴露于缺血性病症。在一个实施方案中，角质形成细胞已暴露于低氧条件。在一个实施方案中，成纤维细胞已暴露于缺血条件。在一个实施方案中，成纤维细胞已暴露于低氧条件。在一个实施方案中，内皮细胞已暴露于缺血条件。在一个实施方案中，内皮细胞已暴露于低氧条件。
在一个实施方案中，暴露于缺血条件的外泌体比未暴露于缺血条件的外泌体更有效地诱导成纤维细胞的增殖。在一个实施方案中，暴露于缺血条件的外泌体在浓度为1μg/mL下诱导成纤维细胞增殖方面比在浓度为1μg/mL下未暴露于缺血条件的外泌体更有效。在一个实施方案中，暴露于缺血条件的外泌体在浓度为2μg/mL下诱导成纤维细胞增殖方面比在浓度为2μg/mL下未暴露于缺血条件的外泌体更有效。
在另一个实施方案中，暴露于低氧条件的外泌体在诱导成纤维细胞增殖方面更有效。在一个实施方案中，暴露于低氧条件的外泌体在浓度为1μg/mL下诱导成纤维细胞的增殖方面更有效。在一个实施方案中，暴露于低氧条件的外泌体在浓度为2μg/mL下诱导成纤维细胞的增殖方面更有效。
在一个实施方案中，通过miRNA hsa-miR-150-5p促进伤口愈合。
在另一个实施方案中，miRNA hsa-miR-150-5p增加角质形成细胞向伤口的迁移，从而促进伤口愈合。
在另一个实施方案中，miRNA hsa-miR-150-5p增加成纤维细胞存活的存活率，从而促进伤口愈合。
在一个实施方案中，在外泌体接触位点的局部位点促进伤口愈合。在另一个实施方案中，在远离外泌体的接触位点的位点促进伤口愈合。
在另一个实施方案中，伤口是慢性伤口。
在一个实施方案中，伤口是压迫溃疡。在另一个实施方案中，伤口是静脉溃疡。在另一个实施方案中，伤口是手术后溃疡。在另一个实施方案中，伤口是创伤性溃疡。在另一个实施方案中，伤口是下肢伤口。在另一个实施方案中，伤口是动脉溃疡。
在一个实施方案中，伤口是口腔溃疡。
在一个实施方案中，伤口是眼睛伤口或角膜溃疡。
在一个实施方案中，患者患有糖尿病。在一个实施方案中，患者未患有糖尿病。
在另一个实施方案中，患者患有I型糖尿病。在另一个实施方案中，患者患有II型糖尿病。
在一个实施方案中，伤口是糖尿病溃疡。在一个实施方案中，糖尿病溃疡是糖尿病足溃疡。
在一个实施方案中，伤口是开放性伤口。在一个实施方案中，开口伤口是割伤。在一个实施方案中，开放伤口是划伤。在一个实施方案中，开放伤口是撕裂伤。在一个实施方案中，开放伤口是擦伤。在一个实施方案中，开放伤口是撕脱伤。在一个实施方案中，开放伤口是刺伤。
在一个实施方案中，伤口是切除伤口。在另一个实施方案中，伤口是感染性伤口。在另一个实施方案中，伤口是缺血性伤口。在另一个实施方案中，伤口是辐射中毒伤口。在另一个实施方案中，伤口是手术伤口。
在一个实施方案中，伤口是烧伤。在一个实施方案中，烧伤是热灼伤。在一个实施方案中，烧伤是化学灼伤。在一个实施方案中，烧伤是辐射烧伤。
在一个实施方案中，伤口涉及包括诸如痤疮、牛皮癣、红斑痤疮、皮炎、湿疹、脓疱病、间质或毛囊炎的伤口的皮肤病症或疾病。
在一个实施方案中，伤口愈合速率在第2天显著加快。在另一个实施方案中，伤口愈合速率在第3天显著加快。在另一个实施方案中，伤口愈合速率在第10天显著加快。
在一个实施方案中，通过伤口闭合评估伤口愈合。在一个实施方案中，伤口闭合改善至少10％。在另一个实施方案中，伤口闭合改善至少20％。在另一个实施方案中，伤口闭合改善至少30％。在另一个实施方案中，伤口闭合改善至少50％。在另一个实施方案中，伤口闭合改善至少80％。在另一个实施方案中，伤口闭合改善超过100％。
在一个实施方案中，完全伤口闭合所需的时间减少至少10％。在另一个实施方案中，完全伤口闭合所需的时间减少至少20％。在另一个实施方案中，完全伤口闭合所需的时间减少至少30％。在另一个实施方案中，完全伤口闭合所需的时间减少至少50％。在另一个实施方案中，完全伤口闭合所需的时间减少至少80％。在另一个实施方案中，完全伤口闭合所需的时间减少超过100％。
本发明提供了一种组合物，其包括由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体。
本发明提供了一种包含由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体的组合物，用于促进有此需要的患者的伤口愈合。
本发明提供了一种组合物，其包括含有选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA的外泌体：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-
101-3p。
在一个实施方案中，外泌体由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌。
在一个实施方案中，外泌体含有miRNA hsa-miR-150-5p。
本发明提供了一种制备包含由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体的组合物的方法，包括：步骤a)从所述UCBMNC中分离所述外泌体，和步骤b)将所述外泌体悬浮于药学上可接受的载体中。
在一个实施方案中，药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是液体悬浮液。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是聚合物。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是水凝胶。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是蛋白质基质。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是脂质体悬浮液。在一个实施方案中，药学上可接受的载体是泡沫。
在一个实施方案中，通过离心从UCBMNC中分离外泌体。在一个实施方案中，通过差速离心从UCBMNC中分离外泌体。
纯化外泌体的最常用技术是差异超速离心，但其它技术也可用于本发明，包括但不限于密度梯度中的超速离心、高压液相色谱-凝胶排阻层析(HPLC-GEC)、溶剂沉淀、超滤、免疫亲和捕获(IAC)和场流分级(FFF)。
溶剂沉淀是一种在没有超速离心机的情况下以相对较慢的旋转速度成功分离外泌体的技术。使用溶剂沉淀的商业试剂盒的三个实例是外泌体分离试剂盒(美国生命技术公司)、ExoQuick(系统生物科学)和Exo-spinTM(细胞导向系统)。
IAC依赖于抗体与其特异性抗原的结合。随着外泌体亚组分的知识增长，鉴定出可用于特异性鉴定外泌体的更多的单个抗原靶标(通常是蛋白质)。
FFF是粒子通过它们在层流速度梯度中的位置而分开的一种技术。在非对称流场流分级中，垂直于下通道流动的错流将粒子推向约束通道的膜。
扩散导致粒子从膜迁移离开，与错流相反。
在一个实施方案中，该方法还包括在步骤b)之前将外泌体富集在一种或多种miRNA中的步骤，其中miRNA选自：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，该方法还包括在步骤b)之前将外泌体富集在一种或多种miRNA中的步骤，其中miRNA选自：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，该方法还包括在步骤b)之前将外泌体富集在miRNA hsa-miR-150-5p中的步骤。
在一个实施方案中，组合物还包含一种或多种不包含在外泌体中的miRNA，并且该方法还包括将miRNA与转染剂混合并将混合物悬浮在药学上可接受的载体中的步骤，其中miRNA选自：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，miRNA选自：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，miRNA是hsa-miR-150-5p。
本发明还提供了一种组合物，其包括通过本文描述的方法制备的由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体。
本发明还提供了一种伤口护理产品，其包括由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体。
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA的组合物接触：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA的组合物接触：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA的组合物接触：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-
3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
本发明提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与包含miRNA hsa-miR-150-5p的组合物接触，从而促进患者的伤口愈合。
在一个实施方案中，施加的miRNA hsa-miR-150-5p的量在100pmol至1nmol之间。在一个实施方案中，施加的miRNA hsa-miR-150-5p的量在100pmol至800pmol之间。在一个实施方案中，施加的miRNA hsa-miR-150-5p的量在300pmol至500pmol之间。在一个实施方案中，施用的miRNA hsa-miR-150-5p的量为400pmol。
本发明提供了包含选自下列各项所构成之组的miRNA的组合物：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p，用于促进有此需要的患者的伤口愈合。
在一个实施方案中，miRNA中的一种是hsa-miR-150-5p。
在一个实施方案中，该组合物还包含药学上可接受的载体。
本发明提供了一种制备包含一种或多种miRNA和药学上可接受的载体的组合物的方法，包括步骤a)将所述miRNA与转染剂混合，和b)将所述混合物悬浮于药学上可接受的载体中，其中所述miRNA选自：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
在一个实施方案中，miRNA中的一种是hsa-miR-150-5p。
本发明还提供了包含miRNA和通过本文所述方法制备的药学上可接受的载体的组合物。
本发明还提供了包含本文所述组合物的伤口护理产品。
在一个实施方案中，伤口护理产品是敷料或药物制剂。
在一个实施方案中，敷料或药物制剂是移植材料、贴剂、垫、膏药、薄膜、胶带、粘合剂、凝胶、泡沫、乳膏、涂油膏、药膏、擦剂、涂抹剂、软膏、泥敷剂、油膏、润肤剂、涂膜剂、药水、软膏、乳液、喷雾剂、悬浮剂、粉末剂、注射器、喷雾器或气溶胶容器。
在一个实施方案中，伤口护理产品是：
a)包含至少一个成纤维细胞层的移植物材料；
b)包含纤维蛋白基质和成纤维细胞的凝胶或移植物材料；
c)包含至少一种结构蛋白的基质的移植物材料；
d)包含交联胶原的基质和糖胺聚糖的移植物材料；
e)凝胶、贴剂、垫、膏药、薄膜或粘合剂，其包括分散在水中的亲水性聚合物基质；
f)聚氨酯薄膜和/或泡沫；
g)包含细胞外基质蛋白、海藻酸盐和水的药物制剂；或
h)气溶胶容器，其包括含有所述外泌体的气溶胶。
在一个实施方案中，伤口护理产品还包含防腐剂或抗菌剂。
本发明还提供了包含本文所述的组合物的密封包装。
本发明还提供了一种促进有此需要的患者的伤口愈合的方法，包括使患者的伤口与本文所述的组合物接触，从而促进患者的伤口愈合。
本发明还提供了如本文所述的组合物用于促进有此需要的患者的伤口愈合的用途。
本发明还提供了如本文所述的组合物在制备用于促进有此需要的患者的伤口愈合的药物中的用途。
本发明提供了一种促进有此需要的患者的组织修复的方法，包括使患者的组织与由脐带血单核细胞(UCBMNC)分泌的外泌体接触，从而促进患者的组织修复。
本申请还提供了一种促进有此需要的患者的组织修复的方法，包括使患者组织与包含选自下列各项所构成之组的一种或多种miRNA的组合物接触：hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
本发明提供了一种促进有此需要的患者的组织修复的方法，包括使患者的组织与包含miRNA hsa-miR-150-5p的组合物接触，从而促进患者的组织修复。
预期本文公开的每个实施方案适用于每个其它公开的实施方案。因此，本文描述的各种元素的所有组合都在本发明的范围内。
术语
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所用，并且除非另有说明或上下文另有要求，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的定义。
如本文所用，术语“伤口”是指对任何活组织的损伤。伤口可能由行为、传染病或潜在病症引起。伤口可以是慢性的或急性的。伤口的实例包括但不限于切口、溃疡、糖尿病溃疡、缺血性组织损伤、缺血性心脏损伤等。
本文提及的所有出版物和其它参考文献均通过引用其全部内容并入本文，如同每个单独的出版物或参考文献被具体和单独地指出以通过引用并入。本文引用的出版物和参考文献不被承认为是现有技术。
通过参考下面的实验细节将更好地理解本发明，但本领域技术人员将容易理解，详述的具体实验仅仅是对随后的权利要求中限定的本发明的说明。
实验细节
实施例1.缺血预处理刺激脐带血单核细胞(UCBMNC)以分泌外泌体并增加其对皮肤细胞的生物活性。
使用LymphoprepTM分离UCBMNC的总级分，并使用血液分析仪表征细胞。冷冻保存后，群体富含淋巴细胞和单核细胞(MNC)，而大部分嗜中性粒细胞丢失(图1A和图1B)。用于分泌外泌体的库主要由淋巴细胞和单核细胞组成。
实验证明缺血预处理(0.5％的O2，5％的CO2，0％的FBS，18h)刺激UCBMNC以分泌生物活性外泌体，其通过不同类型的皮肤细胞(成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞)以特定动力学内化。实验还证明，这些外泌体(UCBMNC-Exo)在体外发挥有效的促再生作用，其涉及增加皮肤细胞(成纤维细胞、角质形成细胞和内皮细胞)的存活和增殖，以及刺激成纤维细胞和角质形成细胞的迁移以及通过内皮细胞的管形成。此外，实验证明，在正常和1型和2型糖尿病动物模型中，每天两次局部施用UCBMNC-Exo显著加速了切除伤口的愈合。
实施例1.1：外泌体的表征
实验程序：
如Thery C.(2006)等人所述，通过差速离心纯化外泌体，其全部内容并入本文。
简言之，将上清液进行300g(10分钟)，2000g(20分钟)和10,000g(30分钟)两次的连续离心步骤，分别除去细胞、细胞碎片和微泡。在SW41Ti或SW32Ti浮桶式转头(贝克曼)中以100000g离心2小时后，用7mL的PBS洗涤沉淀，并在100000g下离心另外2小时。将含有外泌体的沉淀重悬于250μL的PBS中。使用来自BioRadTM的DC蛋白质测定试剂盒，基于其蛋白质含量对外泌体进行定量。
最初使用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)表征UCBMNC分泌的外泌体。DLS分析在ζPALSζ电位分析仪中进行，该分析仪含有ZetaPlus颗粒尺寸测量软件，v.2.27(布鲁克海文仪器公司)。对于粒径，将外泌体(50μL)在PBS(200μL)中稀释，并且在25℃下获得每个样品的5次测量，n＝17。对于ζ电位，将外泌体(50μL)用通过0.2孔过滤的生物分子级水稀释25倍(最终的PBS浓度为5mM)。每个样品测量5次，结果呈现n＝4的算术平均值。TEM分析在Jeol JEM 1400透射电子显微镜(东京)中进行。将样品固定在300目的弗姆瓦铜网上，用1％乙酸双氧铀染色。使用Gatan SC 1000ORIUS CCD相机(沃伦代尔，宾夕法尼亚州，美国)以数字方式记录图像，并且使用Adobe Photoshop CS软件(Adobe Systems，圣何塞，加利福尼亚州)，在HEMS/IBMC-葡萄牙波尔图大学的分子与细胞生物学研究所(IBMC)进行集锦照相。
结果：
我们的结果表明外泌体的平均大小为140nm(图2A)，负ζ电位(-30mV)(图2B)和球形形态(图2C.1和图2C.2)。此外，这些外泌体表达标志物CD9、CD81和HSC70，如通过FACS分析的(图2D)。
缺氧中分泌的外泌体和常氧中分泌的外泌体的生物物理特性(对照条件)之间没有显著差异。然而，数据表明缺氧刺激了由UCBMNC增加的外泌体分泌，如从增加的蛋白质含量(图2E)观察到的，其被标准化为相同数量的分泌细胞并重新悬浮在相等的最终体积中。
实施例1.2：皮肤细胞的外泌体摄取动力学
1.2.1皮肤细胞的百分比
实验程序：
皮肤细胞摄取源自UCBMNC的外泌体，然而，摄取动力学和量级取决于细胞类型。为了证明皮肤细胞对外泌体摄取动力学的差异，最初用荧光染料(NBD-DPPE和Syto绿色)标记外泌体。简言之，将NBD-DPPE(16μM的乙醇溶液)或Syto绿(10μM的DMSO溶液)染料加入到外泌体悬浮液中(100μL；蛋白质浓度范围为60至70μg/mL)(DMSO和EtOH<1％)并在37℃下孵化30分钟。用牛血清白蛋白(BSA，1％，w/v)封闭反应后，用PBS(6mL)洗涤外泌体，并通过以
100,000g超速离心1小时除去游离染料。然后，将外泌体重悬于PBS(100μl)中。该程序总是用新鲜的外泌体进行。标记的外泌体立即用于内化实验。
我们通过流式细胞术评估了在孵化4小时后能够摄取UCBMNC衍生的外泌体的皮肤细胞的百分比。将HUVEC(80,000细胞/孔)、HaCaT细胞(160,000细胞/孔)和成纤维细胞(50,000细胞/孔)接种在24孔板中并使其生长18-24小时。将融合细胞与NBD-DPPE标记的外泌体在不含胎牛血清(FBS)的细胞培养基中孵化4小时，终浓度为1μg/mL、2μg/mL和3μg/mL。然后，用PBS洗涤细胞一次，用胰蛋白酶(HUVEC和NDHF)或tripLETM表达(HaCaT)分离，在PBS中洗涤两次，并在与Cell-Quest软件(BD生物科学)整合的FACS-Calibur仪器上通过流式细胞术分析。
结果：
外泌体对内皮细胞没有细胞毒性，浓度高达10μg/mL(图3A)。
我们的结果还显示，对于1至3μg/mL的外泌体浓度，对于更高浓度的外泌体观察到更高的内化水平(图3B)。此外，角质形成细胞和成纤维细胞都比内皮细胞更容许外泌体内化。
1.2.2：孵化时间的影响
实验程序：
接下来，我们使用共聚焦显微镜评估了孵化时间和外泌体浓度对通过皮肤细胞的外泌体摄取动力学的影响(图3C)。使用Zeiss LSM 710共聚焦扫描设备，使用405和488的激发波长和Plan-Apochromat40χ/1.4油浸物镜获得快照(图3C)。通过使用高含量显微镜(内嵌式细胞分析仪，通用电气医疗集团)在不同时间点分析细胞质强度24小时也获得动力学曲线。显微镜配备有加热孵化器，其设定在37℃并且CO2供应设定为5％。对于活细胞显微镜实验，HUVEC细胞在IBIDITMμ-载玻片血管生成板中生长24小时。将Syto®RNASelectTM标记的外泌体(1-20μg/ml)加入到外耗尽的培养基中的汇合细胞中，并孵化不同的时间点。用PBS洗涤细胞两次，并在实验过程期间保持在含有FBS的培养基中。
结果：
我们的结果显示，在测试的三种类型的细胞中，外泌体位于整个细胞质中。细胞质中的外泌体的积累在接触后约16小时达到峰值(图3D)。
1.2.3：外泌体的功能效应
实验程序：
为了确定外泌体对皮肤细胞的功能影响，我们评估了外泌体内化是否可以诱导(i)缺血条件下的细胞存活，(ii)细胞增殖，(iii)细胞迁移和(iv)内皮管形成(图4A.1-图4B.4和图5A.1-图5B)。
对于细胞存活实验，在EGM-2(瑞士龙沙集团)中培养HUVEC(1×104)，在96板中，在具有0.5％青霉素-链霉素和10％FBS的DMEM(英杰公司)中培养2％FBS、NDHF(1×103)和HaCaT(2×104)。20小时后，用PBS洗涤细胞并与单独的外-耗尽的培养基(100μl或含有1μg/mL、2μg/mL，3μg/mL或5μg/mL的外泌体(100μL)一起孵化48小时。
然后，将细胞在缺血条件下孵化48小时(没有VEGF和FBS的EGM-2中的HUVEC；以及37℃，5％CO2,0.1％O2下不含FBS的DMEM中的HaCaT)或72h(37℃，5％CO2，0.1％O2下不含FBS的DMEM中的成纤维细胞)。最后，通过高含量显微镜监测细胞，并通过赫斯特/碘化丙啶(PI)染色定量细胞活力。根据以下等式计算细胞存活。(细胞存活治疗组-细胞存活∞对照组)/细胞存活对照组。
采用以下程序证明外泌体的增殖诱导特性。在EGM-2(瑞士龙沙集团)中培养HUVEC(2.5×103)，在96板中，在具有0.5％青霉素-链霉素和10％FBS的DMEM(英杰公司)中培养2％FBS、成纤维细胞(5×103)和HaCaT(2.5×103)。20小时后，将细胞用赫斯特(33342，美国生命技术公司)染色15分钟，用PBS洗涤并在单独的外耗尽的培养基中(100μL)或用外泌体(1μg/mL，2μg/mL或3μg/mL)孵化24小时。然后，更换培养基并将细胞在外耗尽的培养基(200μL)中(37℃，5％CO2，0.1％O2)孵化72小时。将细胞用赫斯特染色并每隔24小时拍照(内嵌式，通用电气医疗集团)，并通过计数细胞核计算细胞数。通过将处理后72小时的细胞数除以与外泌体孵化时的细胞数(时间零-T0)来获得增殖比。
将成纤维细胞(1×104)和HaCaT细胞(2×104)在含有0.5％青霉素-链霉素和10％FBS的DMEM(英杰公司)中在96板中培养。20小时后，在孔的中间用200μl移液管尖端制作垂直划痕，并用PBS洗涤细胞。然后，将单独的外耗尽培养基(100μl或补充有外泌体(1μg/mL，2μg/mL或3μg/mL)加入细胞中，并在内嵌式分析仪(通用电气医疗集团)中拍摄孔的图像(时间零T0)。4个小时后，加入另外的外耗尽的培养基(100μl)并将细胞孵化18小时。然后，细胞培养基更换为含有0.5％FBS的外耗尽的DMEM，并将细胞在37℃，5％CO2，20％O2中孵化持续48小时。在刮擦48小时后拍照，并在AxioVision软件4.6.3(卡尔蔡司成像解决方案，德国的勃林格殷格翰制药公司)中测量伤口面积。
为了确定外泌体对内皮细胞中的管形成的影响，在24孔板中在EGM-2(瑞士龙沙集团)中培养HUVEC(5×104/孔，第3-5代)过夜。20小时后，将细胞在200μL的单独的外耗尽培养基中与外泌体(1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL和5μg/mL)一起孵化。48小时后，将细胞胰蛋白酶化并在15孔易必迪板中接种在聚合的基质胶顶部上的EBM-2中(BD生物科学，每孔10μL，37℃下30分钟)。细胞接种后12小时，通过相差显微镜拍摄细胞，并使用WimTube软件(Wimasis)评估和定量管形成。
结果：
我们的结果显示，从缺氧条件(Exo_Hyp)而不在常氧条件下(Exo_Nor)下培养的UCBMNC中分离的外泌体，在诱导缺血条件下培养48小时的内皮细胞存活方面非常有效(图4A.1-4)。
根据我们的结果，存活率对于2μg/mL的外泌体浓度达到峰值。有趣的是，尽管Exo_Hyp和Exo_Nor均诱导在缺血条件下培养的角质形成细胞存活，但它们对成纤维细胞的存活没有影响。因此，我们的结果表明外泌体的促存活是细胞和浓度依赖性的。
我们的结果显示外泌体在浓度为1和2μg/mL的Exo_Hyp，以及浓度为2和3μg/mL的Exo_Nor下诱导成纤维细胞的增殖(图4B.1-4)。有趣的是，外泌体对内皮细胞和角质形成细胞的增殖没有显著影响，表明外泌体诱导的特性是细胞和浓度依赖性的另一种类型。
我们的结果显示外泌体，特别是Exo_Hyp，显著增加成纤维细胞和角质形成细胞的迁移率，表明这些外泌体也表现出促迁移生物活性(图5A.1-3)。
我们的结果显示UCBMNC-Exo显著增加了血管的总数和形成的血管网络的复杂性，如从增加的分支点数观察到的(图5B)。
实施例2.UCBMNC-Exo的RNA含量的表征
实验程序：
通过RNA深度测序表征UCBMNC-Exo的RNA含量。使用来自两个不同供体的缺氧和常氧分泌的UCBMMSC-Exo。使用以下方法。
使用来自培养动物细胞方案的裂解物制备物，用miRCURY RNA分离试剂盒-细胞和植物(EXIQON)从外泌体沉淀中提取总RNA。使用RNA 6000Pico试剂盒和安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技)中的小RNA试剂盒分别评估总RNA和小RNA的量和质量。使用离子总RNA测序试剂盒v2用户指南(生命科技公司)中描述的全转录组(WT)和小RNA文库方案进行cDNA文库构建的样品。
所有程序均按照制造商的说明进行，除了在制备整个转录组文库的构建时跳过的RNA片段化步骤之外，因为起始材料已经具有所需的长度。
简言之，分别使用2.1-4.5ng的小RNA和20ng的总RNA构建小和WT文库。将RNA衔接头在16℃下连接到小RNA时间为16小时，并在30℃下连接到WT文库时间为1小时。合成第一和第二cDNA链，然后通过PCR用特异性条形码引物扩增纯化的cDNA，并用磁珠选择所得片段的正确大小。将cDNA文库定量，并使用用于WT RNA文库的安捷伦高灵敏度DNA试剂盒和用于2100生物分析仪(安捷伦科技)中的小文库的安捷伦DNA 1000试剂盒评估其质量。制备两个条形码文库库(WT和小RNA)并使用Ion PI模板OT2 200试剂盒v2和Ion OneTouch 2系统(生命科技公司)以及富含Ion OneTouchES机器(生命科技公司)中的正离子球粒子通过乳液PCR进行克隆扩增。最后，将阳性球加载到单个Ion PI芯片v2中，并在Genoinseq(葡萄牙坎塔涅迪)的离子质子系统(生命科技公司)中测序。所有程序均按照制造商的说明进行。使用Torrent Suite软件(生命科技公司)修剪离子质子衔接头序列和低质量碱基。
然后按长度过滤序列读数，其中从小文库中移除小于15bp的读数，对于大文库移除18bp。接下来，使用TMAP 4.1版通过将每个样品的读数与其特定文库(rRNA：5S-NR_023379.1、5.8S-NR_003285.2、18S-NR_003286.2、28S-NR_003287.2；tRNA：从UCSC；mir：mirbase提取的tRNA文库；mRNA：来自Ensembl的CDS文库；来自Ensembl和ENCODE的ncRNA文库)进行比对来鉴定rRNA、tRNA、miRNA、mRNA和ncRNA。
接下来，我们通过qRT-PCR验证了从10名个体收集的外泌体中的15种miRNA的表达(图6B.1)。在通过10个不同供体的单核细胞分离缺氧和常氧分泌的外泌体的总RNA后，样品中的所有miRNA均被多聚腺苷酸化，并使用NCodeTMmiRNA第一链cDNA合成和qRT-PCR试剂盒(InvitrogenTM，生命科技公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)和通过RNASeq数据确定的15种最多表达的微小RNA的表达构建cDNA文库，
通过使用BioMarkTM系统中的Fluidigm动态阵列的qRT-PCR证实(Fluidigm公司，南旧金山，加利福尼亚州，美国)，遵循制造商的说明。根据NCode试剂盒说明书设计每种微小RNA的特异性引物，并使用U6snRNA作为内源对照(Wang Y等人，2015)。
结果：
我们的结果显示Exo-Hyp和Exo_Nor都有大量的miRNA(图6A.1-图6A.2)。就总读数而言，两种外泌体的30种最具代表性的miRNA是：hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-181a-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
30种最具代表性的miRNA的登录号和成熟序列总结在下表I中。
表I-UCBMNC外泌体中的成熟微小RNA、miRBASE登录号和序列
#名称登录号成熟序列
1 hsa-mir-150-5p MIMAT0000451 UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG
2 hsa-mir-16-5p MIMAT0000069 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
3 hsa-mir-142-3p MIMAT0000434 UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA
4 hsa-mir-223-3p MIMAT0000280 UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA
5 hsa-let-7g-5p MIMAT0000414 UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU
6 hsa-mir-21-5p MIMAT0000076 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA
7 hsa-let-7f-5p MIMAT0000067 UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU
8 hsa-mir-19b-3p MIMAT0000074 UGUGCAAAUCCAUGCAAAACUGA
9 hsa-let-7a-5p MIMAT0000062 UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
10 hsa-mir-26a-l-5p MIMAT0000082 UUCAAGUAAUCCAGGAUAGGCU
11 hsa-mir-20a-5p MIMAT0000075 UAAAGUGCUUAUAGUGCAGGUAG
12 hsa-miR-181a-5p MIMAT0000256 AACAUUCAACGCUGUCGGUGAGU
13 hsa-miR-451a MIMAT0001631 AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
14 hsa-miR-23a-3p MIMAT0000078 AUCACAUUGCCAGGGAUUUCC
15 hsa-miR-342-3p MIMAT0000753 UCUCACACAGAAAUCGCACCCGU
16 hsa-miR-191-5p MIMAT0000440 CAACGGAAUCCCAAAAGCAGCUG
17 hsa-miR-103a-3p MIMAT0000101 AGCAGCAUUGUACAGGGCUAUGA
18 hsa-miR-15a-5p MIMAT0000068 UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG
19 hsa-miR-142-5p MIMAT0000433 CAUAAAGUAGAAAGCACUACU
20 hsa-miR-146a-5p MIMAT0000449 UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU
21 hsa-miR-19a-3p MIMAT0000073 UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA
22 hsa-miR-15b-5p MIMAT0000417 UAGCAGCACAUCAUGGUUUACA
23 hsa-miR-26b-5p MIMAT0000083 UUCAAGUAAUUCAGGAUAGGU
24 hsa-miR-30d-5p MIMAT0000245 UGUAAACAUCCCCGACUGGAAG
25 hsa-miR-146b-5p MIMAT0002809 UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU
26 hsa-miR-106b-5p MIMAT0000680 UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU
27 hsa-miR-29a-3p MIMAT0000086 UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA
28 hsa-miR-17-5p MIMAT0000070 CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG
29 hsa-miR-29b-3p MIMAT0000100 UAGCACCAUUUGAAAUCAGUGUU
30 hsa-miR-101-3p MIMAT0000099 UACAGUACUGUGAUAACUGAA
用于成熟miRNA和RNU6的qRT-PCR的正向引物的序列总结于下表II中。
表II-用于qRT-PCR的成熟微小RNA和RNU6登录号(miRBase和基因库)和正向引物
的序列
| # | 名称 | 登录号 | 正向引物 |
| 1 | hsa-mir-150-5p | MIMAT0000451 | TCTCCCAACCCTTGTACC |
| 2 | hsa-mir-16-5p | MIMAT0000069 | TAGCAGCACGTAAATATTG |
| 3 | hsa-mir-142-3p | MIMAT0000434 | TGTAGTGTTTCCTACTTTATGGA |
| 4 | hsa-mir-223-3p | MIMAT0000280 | TGTCAGTTTGTCAAATACCC |
| 5 | hsa-let-7g-5p | MIMAT0000414 | TGAGGTAGTAGTTTGTACAGTT |
| 6 | hsa-mir-21-5p | MIMAT0000076 | TAGCTTATCAGACTGATGTTGA |
| 7 | hsa-let-7f-5p | MIMAT0000067 | TGAGGTAGTAGATTGTATAGTT |
| 8 | hsa-mir-19b-3p | MIMAT0000074 | TGTGCAAATCCATGCAAAA |
| 9 | hsa-let-7a-5p | MIMAT0000062 | TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT |
| 10 | hsa-mir-26a-1-5p | MIMAT0000082 | TTCAAGTAATCCAGGATAGGCT |
| 11 | hsa-mir-20a-5p | MIMAT0000075 | TAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG |
| 12 | hsa-miR-181a-5p | MIMAT0000256 | AACATTCAACGCTGTCGGG |
| 13 | hsa-miR-451a | MIMAT0001631 | AAACCGTTACCATTACTGAGTT |
| 14 | hsa-miR-23a-3p | MIMAT0000078 | ATCACATTGCCAGGGATT |
| 15 | hsa-miR-342-3p | MIMAT0000753 | TCTCACACAGAAATCGCAC |
| Ctr | RNU6 | NR_004394 | ACACGCAAATTCGTGAAG |
我们的分析还证实hsa-miR-150-5p表达最多，大约是下一个最多表达的微小RNAhsa-miR-342a-3p的表达的4倍以上(图6B.1-图6B.2)。
先前的报告(Gray等人，2015)已经鉴定了7种miRNA，这些miRNA在从常氧和缺氧培养的心脏祖细胞中收集的外泌体中差异表达：miR-292、miR-210、miR-103、miR-17、miR-199a、miR-20a和miR-15b。重要的是要注意，在该专利中鉴定的大多数miRNA(miR-20a和miR-15b除外)是新的并且之前未公开。
实施例3.UCBMNC-Exo在体内加速伤口愈合
实验程序：
在1型模型中，通过在购自查尔斯河(威尔明顿，马萨诸塞州，美国)的雄性C57BL/6小鼠(10-12周龄)中腹膜内注射链脲佐菌素(西格玛奥德里奇)诱导糖尿病。
对于2型糖尿病模型，db/db基因修饰小鼠从查尔斯河(威尔明顿，马萨诸塞州，美国)获得。
在确认葡萄糖水平大于300mg/dL(1型模型中糖尿病诱导后6至8周)后，将动物麻醉，腰背皮肤剃毛和消毒，并在每只动物中用无菌活检穿孔器产生两个6mm直径的背侧全层切除伤口。
然后，用PBS(10μL；每天两次)覆盖伤口，Exo_Hyp(10μL的外泌体悬浮液，2μg/mL；每天两次；因此，每个伤口0.4μg，持续10天整体治疗)或PDGF-BB(100μg/mL，派普泰克；4μg/2cm2；每天一次)。
在手术后，将动物保持在温度和湿度受控的环境中的可自由采食食物和水的笼子中，一个笼子中关一只动物。在10-15天内，每天测量伤口。在研究结束时，通过颈脱位处死动物并收集10mm直径的皮肤活组织检查用于进一步分析。
结果：
我们的结果显示外泌体治疗显著加快了1型糖尿病切除伤口的愈合速率(图7A.1和A.2)。早在第2天就观察到伤口愈合的加速(较小的伤口大小)，这在供体2中具有统计显著性。10天后，观察到应用UCBMNC-Exo时伤口闭合的一致性55％改善(治疗伤口的大小是对照大小的一半)，与供体无关。对正常小鼠应用相同的治疗方案，并且观察到伤口闭合的加速，从第3天开始显著，最后在第10天总体改善39％(图7A.3)。
在2型糖尿病小鼠模型(db/db遗传模型)中，结果显示UCBMNC-Exo也加速伤口愈合，在第2天显示出显著效果，在第10天显示出20％的改善，并且愈合时间总计17天，这比对照治疗早4天(图7A.4)。
也用治疗人糖尿病溃疡的已知商业化产品的活性剂(PDGF-BB)以推荐方案(每天一次，建议最大浓度)治疗这些动物。令人惊讶的是，UCBMNC-Exo明显更有效，因为它们开始更早加速伤口闭合(第2天，与第5天相比)，在第10天表现出更高的改善(20％，与使用PDGF-BB为10％相比)，并且更快地完全闭合伤口(第17天，与使用PDGF-BB为第18天相比)(图7A.4)。有趣的是，当UCBMNC-Exo在糖尿病小鼠的一个伤口中每天施用两次时，在第一天期间的对照远处伤口中伤口愈合加速，表明它们还刺激远处位点的愈合(图7C)。
伤口的组织学分析表明UCBMNC-Exo处理增加了再上皮化，刺激了纤维化组织的形成，并且与细胞浸润增加有关，这可能表明巨噬细胞的增加的浸润，这对于伤口愈合是必需的(图7B)。
实施例4.MiR-150-5p在体外增强成纤维细胞对缺血和角质形成细胞迁移的存活。
实验程序：
对于体外测定，用miR-150-5p(5nM，miRIDIAN微小RNA人hsa-miR-150-5p模拟MIMAT0000082，Dharmacon，拉菲特，科罗拉多，埃瓦岛)和Lipofectamine®RNAiMAX转染剂(InvitrogenTM)在100μl的完全培养基中的溶液转染内皮细胞、成纤维细胞和角质形成细胞48小时(细胞存活和管形成测定)或24小时(细胞增殖和划痕测定)。
仅使用脂质体转染的转染用作阴性对照。
血管内皮生长因子(VEGF，50ng/mL)和血小板衍生生长因子(PDGF-BB，50ng/mL)用作阳性对照。
如外泌体生物活性评估所述进行所有体外测定。
结果：
我们的结果显示，用miR-150-5p转染的成纤维细胞在缺血72小时后比未转染的细胞具有更高的存活率(图8A.1-图8A.4)。对于内皮细胞和角质形成细胞也是如此。我们将分析扩展到迁移、增殖和血管生成测定。如通过划痕测定评估的，用miR-150-5p而非成纤维细胞转染的角质形成细胞具有改善的迁移性质。对于增殖和血管生成的细胞没有观察到统计学差异。
实施例5.MiR-150-5p增强体外伤口愈合。
我们评估了hsa-miR-150-5p在非疾病伤口愈合模型中的体内作用。
实验程序：
将购自查尔斯河(法国)且重量在20至30g之间的6只雄性C57BL/6野生型小鼠(8周龄)麻醉并进行两次全厚度切除，每次直径6mm，间隔5cm，在每只动物的背部用无菌活检穿孔。
在伤口创造之后立即将与DharmaFECT 1(120μL)siRNA转染试剂(Dharmacon，拉菲特，科罗拉多，埃瓦岛)复合的单剂量miR-150-5p(5μM)立即皮下注射到伤口边缘(2×40μL)。
使用加扰miR(微小RNA模拟阴性对照，Dharmacon，拉菲特，科罗拉多，埃瓦岛)和PBS作为阴性对照。
将动物保存在可自由采食食物和水的笼中，一个笼子中关一只动物，并且在实验的整个期间每天观察伤口面积。每天将伤口区域追踪到醋酸纸上，以掌握伤口闭合的速率直至受创伤后10天。用ImageJ软件(NIH)测定伤口大小。数据表示为原发伤口的百分比(第0天)。在创伤后10天处死动物。
结果：
我们的结果显示用hsa-miR-150-5p处理的伤口比用阴性miR-对照(加扰)处理的伤口和未处理(PBS)的伤口愈合更快(图8B.1-图8B.2)。
值得注意的是，hsa-miR-150-5p是单核特异性miR(Li等人，2013；Allantaz等人，2012；Zhang等人，2010)。以前的研究表明，hsa-miR-150-5p靶向VEGF并具有抗血管生成和促血管生成活性(He等人，2016；Yang等人，2015；Li等人，2013)。此外，hsa-miR-150-5p也被描述为与内皮细胞迁移(Yang等人，2015；Zhang等人，2010)和细胞增殖和凋亡(Gu等人，2014；Shi等人，2007年)有关。我们的结果首次显示hsa-miR-150-5p作为伤口愈合诱导miRNA的参与。
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Claims (13)
1.药物组合物在制备促进伤口愈合产品中的应用，其特征在于，所述药物组合物包括由脐带血单核细胞UCBMNC分泌的外泌体，所述UCBMNC为CD34+细胞耗尽的，通过将所述UCBMNC在不含胎牛血清FBS的培养基中于缺氧条件下培养18小时后分离制备所述外泌体，所述药物组合物中外泌体的浓度为1-10μg/mL。
2.根据权利要求1中所述的应用，其中，所述外泌体含有：
hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18la-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-106b-5p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-17-5p、hsa-miR-29b-3p和hsa-miR-101-3p。
3.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外泌体含有：
hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18la-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146a-5p、hsa-miR-19a-3p、hsa-miR-15b-5p、hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-30d-5p和hsa-miR-146b-5p。
4.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外泌体含有：
hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18la-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-191-5p、hsa-miR-103a-3p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-142-5p和hsa-miR-146a-5p。
5.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外泌体含有：
hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p、hsa-miR-26a-l-5p、hsa-miR-20a-5p、hsa-miR-18la-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-23a-3p和hsa-miR-342-3p。
6.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外泌体含有：
hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p、hsa-miR-21-5p、hsa-let-7f-5p、hsa-miR-19b-3p、hsa-let-7a-5p和hsa-miR-26a-l-5p。
7.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外泌体含有：
hsa-miR-150-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-142-3p、hsa-miR-223-3p、hsa-let-7g-5p和hsa-miR-21-5p。
8.根据权利要求1所述的应用，其中，所述外泌体含有：hsa-miR-150-5p。
9.根据权利要求1所述的应用，其中，至少一个外泌体表达标志物CD9、CD34、CD81和/或Hsc70。
10.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物组合物中外泌体的浓度为1μg/mL至3μg/mL。
11.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物组合物中外泌体的浓度为1μg/mL至1.5μg/mL。
12.根据权利要求1所述的应用，其中，所述药物组合物中外泌体的浓度为1.0μg/mL、1.25μg/mL、1.5μg/mL、1.75μg/mL、2.0μg/mL、2.25μg/mL、2.5μg/mL、2.75μg/mL、3.0μg/mL、5.0μg/mL或10μg/mL。
13.一种用于制备如权利要求1-12任一项中所述的药物组合物的方法，其包括以下步骤：
a)将所述UCBMNC在不含胎牛血清FBS的培养基中于缺氧条件下培养18小时后分离制备所述外泌体；
b)将所述外泌体悬浮在载体中，所述载体为磷酸盐缓冲盐水PBS。
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