KR20210127510A - 트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 당뇨병성 피부질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 유래한 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 조성물을 함유하는 약학 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 트롬빈 처리된 줄기세포에서 분리한 엑소좀이 당뇨병 동물 모델에서 당뇨병성 피부병증을 회복시키는 효과가 우수함을 확인하였다. 또한, 엑소좀 기반 치료제는 cell-free 제제이기 때문에 DNA가 포함되어 있지 않아 발암의 위험성이 적고 세포 표면항원이 없으므로 이식거부 반응의 문제가 없어 안전하며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 트롬빈 처리된 줄기세포 유래 엑소좀은 당뇨병에 의해 유발될 수 있는 다양한 난치성의 만성 피부질환에 대한 치료제로 개발될 수 있으며, 더욱이 피부 재생과 관련된 분야에 적용되어 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

트롬빈 처리 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 포함하는 당뇨병성 피부질환 예방 또는 치료용 조성물{Compositions for Preventing or Treating Diabetic skin disease Comprising Exosome Derived from Stem Cell Treated with Thrombin}

본 발명은 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 분리된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 상기 조성물을 함유하는 약학 제제 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

당뇨병은 인슐린의 분비량이 부족하거나 정상적인 기능이 이루어지지 않는 등의 대사질환의 일종으로, 혈중 포도당의 농도가 높아지는 고혈당을 특징으로 하며, 고혈당으로 인하여 여러 증상 및 징후를 일으키고 소변에서 포도당을 배출하게 된다. '소아 당뇨병'이라고도 불리는 제1형 당뇨병은 자가면역 기전에 의해 췌장의 베타세포가 파괴되어 인슐린의 절대적 또는 상대적 생산 결핍이 원인으로 발생하는 반면, 제2형 당뇨병은 인슐린 저항성에 의해 유도되며 비만, 인슐린 수용체의 감소, 인슐린 분비 저하, 유전적 요인 등 다양한 요인에 의해서 생기는 것으로 알려져 있다.

대한당뇨병학회의 2016년 발표에 따르면, 2014년 기준 국내 30세 이상 성인 인구의 당뇨병 유병률이 13.7%로 역대 최고치를 기록하였으며, 당뇨병의 동반질환 위험도 역시 심각한 수준으로 당뇨병 환자의 비만과 복부비만 유병률이 48.6%와 58.9%에 이르며 고혈압과 고콜레스테롤혈증 역시 각각 54.7%, 31.6%가 동반되어 있는 것으로 나타났다. 이처럼 당뇨병은 그 자체의 위험성뿐만 아니라 심혈관계 질환, 망막증, 신부전, 말초신경합병증, 피부질환 등 심각한 합병증을 초래할 수 있다.

당뇨병에 의해 유발되는 질환 중 하나인 당뇨병성 피부질환(Diabetic skin disease)은 당뇨환자의 경우 오랫동안 혈액 속의 포도당 수치가 높게 유지되면서 유발될 수 있는 것으로, 구체적으로 당뇨병성 궤양, 흑색가시세포증, 당뇨성 유지방성괴사, 당뇨병성 피부병증, 발진황색종, 물렁섬유종, 소양증, 고리육아종, 세균 및 곰팡이 감염 등이 있다. 특히, 피부 병증의 경우 혈중 높은 당 농도로 인해 회복이 잘 되지 않아 만성적인 병증이 될 수 있다. 따라서 당뇨병에 의해 유발될 수 있는 다양한 피부질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과적인 제제의 개발이 필요하다.

한편, 줄기세포는 그 다분화능과 함께, 조직의 재생, 치료 및 면역반응에 관여하는 세포로 알려져 있어, 이와 같은 특성을 이용하여 제대혈, 골수 등으로부터 중간엽 줄기세포를 분리 배양하여 다양한 질환, 증상에 대한 치료제로 개발하고자 하는 노력이 있어왔다.

그러나, 이러한 줄기세포 자체를 이용한 치료법은 다음과 같은 한계와 부작용의 문제가 있어 왔다. 첫째, 기본적으로 세포 치료제는 DNA transfer로 인한 발암(tumorigenicity) 가능성을 배제할 수 없고, 둘째, 줄기세포 자체의 큰 사이즈로 인하여 혈관 폐색(vascular obstruction)이나 심근경색을 유발할 수 있으며, 셋째, 제대혈과 같은 동종세포를 사용하여 이식 시(동종이식) 세포 표면항원(surface antigen)으로 인한 거부반응의 문제가 있으며, 넷째, 일반적으로 세포치료제는 제조공정이 까다롭고 보관 및 운송에 제약이 많아 생산비용이 높다는 한계가 있다. 이와 같이, 줄기세포가 갖고 있는 원천적 한계로 인하여 부작용을 줄이면서도 치료효과를 증진시키기 위한 방안들로서 유전자 조작을 이용한 효능개선 방법이 개발된 바 있으나, 현재까지 뚜렷한 대안은 없는 실정이다.

엑소좀은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭(대략 30-100 nm의 직경)으로서, 전자현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 한다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다.

특히, 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배제할 수 있다. 이러한 엑소좀의 특성을 고려할 때 엑소좀을 이용한 세포치료법은 기존의 줄기세포 치료법의 한계를 극복할 수 있는 새로운 패러다임이 될 것으로 기대된다.

이와 관련하여, 다능성 줄기세포를 이용한 당뇨병성 피부 궤양의 치료 효과가 개시되어 있으나(KR10-2018-0104196), 트롬빈 처리된 줄기세포 유래 엑소좀의 당뇨병성 피부질환 치료 용도에 대해서는 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 당뇨병성 피부질환에 적용하여 연구 노력한 결과, 당뇨병성 피부질환의 일례로 당뇨병 동물 모델에 피부 병변을 유발시킨 경우 상기 엑소좀에 의한 우수한 치료 효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 치료용 약학 제제를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포 유래된 엑소좀(exosome)을 포함하는, 당뇨병성 피부질환 개선용 의약외품 제제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포 (mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 당뇨병성 피부질환은 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer), 발진황색종(eruptive xanthomatosis), 피부감염(cutaneous infection), 당뇨병성 피부병증(diabetic dermopathy), 물렁섬유종(skin fibroma), 흑색가시세포증(acanthosis nigricans), 소양증(pruritus), 당뇨병성 경화부종(scleredema diabeticorum) 및 고리육아종(granuloma annulare)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 치료용 약학 제제를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 약학 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 피부질환 개선용 의약외품 제제를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 의약외품 제제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제 및 에어로졸제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 상기 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

(a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계;

(b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및

(c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계.

본 발명의 일구현예로, 상기 단계 (a)의 트롬빈은 배지 내에 1-1000 unit/ml 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단계 (b)의 엑소좀은 원심분리를 3,000-100,000 g에서 10분 내지 5시간 수행함으로써 분리될 수 있다.

또한, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의, 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 트롬빈 처리된 줄기세포에서 분리한 엑소좀이 당뇨병 동물 모델에서 당뇨병성 피부병증을 회복시키는 효과가 우수함을 확인하였다. 또한, 엑소좀 기반 치료제는 cell-free 제제이기 때문에 DNA가 포함되어 있지 않아 발암의 위험성이 적고 세포 표면항원이 없으므로 이식거부 반응의 문제가 없어 안전하며, 세포가 아닌 분리물질로써 off the shelf 제품으로의 약제 개발이 가능하므로 제조단가를 줄일 수 있다. 이에, 본 발명에 따른 트롬빈 처리된 줄기세포 유래 엑소좀은 당뇨병에 의해 유발될 수 있는 다양한 난치성의 만성 피부질환에 대한 치료제로 개발될 수 있으며, 더욱이 피부 재생과 관련된 분야에 적용되어 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 분리한 엑소좀을 주사전자현미경(SEM) 및 투과전자현미경(TEM)으로 각각 관찰한 이미지이다.
도 2는 트롬빈이 처리된 줄기세포에서 분리한 산물이 엑소좀임을 확인하기 위해 웨스턴 블롯을 통해 엑소좀 마커인 CD9, CD63 및 CD81 수준을 측정한 결과이다.
도 3은 트롬빈 처리된 줄기세포 유래 엑소좀의 당뇨병성 피부병증에 대한 치료효과를 검증하기 위해 당뇨병이 유발된 동물모델을 제작한 결과를 보여주는 것으로, 도 3a는 랫트에 식염수를 복강 투여한 정상군(Saline)과 스트렙토조토신을 복강 투여하여 당뇨병을 유발시킨 군(STZ)의 평균 혈당 수치를 나타낸 결과이고, 도 3b는 당뇨병성 피부 병증을 유발시키고 식염수(Saline), 아무 처리도 하지 않은 줄기세포 유래 엑소좀(naive exo), 및 트롬빈이 처리된 중간엽 줄기세포에서 분리된 엑소좀(thrombin exo)을 투여한 실험군 간에 혈당 차이가 없음을 보여주는 결과이다.
도 4는 당뇨가 유발된 랫트 모델의 등에 상처를 내어 피부 병증을 유발시킨 직후 식염수(Saline), 아무 처리도 하지 않은 줄기세포 유래 엑소좀(naive exo), 및 트롬빈이 처리된 중간엽 줄기세포에서 분리된 엑소좀(thrombin exo)을 각각 상처에 직접 도포한 후 5일 간격으로 상처 치료 효과를 비교한 결과이다.

본 발명자들은 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 당뇨병성 피부질환의 치료에 적용하여 연구 노력한 결과, 당뇨병성 피부질환의 일례로 당뇨병 동물 모델에 피부 병변을 유발시킨 경우 상기 엑소좀에 의한 우수한 치료 효과를 확인하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “트롬빈(thrombin)”은 혈액 응고에 관여하는 단백질 분해효소로서, 혈액 속의 가용성 피브리노겐(fibrinogen)을 가수분해하여 불용성인 피브린으로 변화시키는 반응을 촉매하는 역할을 한다. 본 발명에서는 줄기세포에 처리하여 상기 줄기세포에서 분리된 엑소좀의 당뇨병성 피부질환의 치료효과를 효과적으로 향상시키는 기능을 나타낸다.

본 발명에서 사용되는 용어, “줄기세포(stem cell)”란 분화능력은 가지고 있으나 아직 분화가 일어나지 않은 ‘미분화 세포’로서, 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래의 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 줄기세포는 본 발명의 줄기세포는 배아줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽줄기세포 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다.

상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 ‘제대혈’은 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취된 혈액을 의미한다. 제대혈은 출산 시 자연적으로 발생하는 부산물로서, 여러 차례의 수술을 필요로 하는 골수 등의 일반 간엽조직보다 훨씬 채취가 용이하고, 골수 이식에 비해 제대혈 보관산업이 활성화되어 이미 인프라가 구축되어 있으므로 공여자를 구하는 것도 용이하다. 이와 더불어, 제대혈 유래 세포는 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR(class Ⅱ)이 발현되지 않는 세포이므로, 기존의 이식수술 시 문제가 되었던 거부반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어, 자가유래 제대혈은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “엑소좀(exosome)”은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은(대략 30-100 nm의 직경) 소낭을 의미하며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예방”이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병성 피부질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 당뇨병성 피부질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에 있어서, “당뇨병성 피부질환”은 인슐린저항성 및 인슐린 분비 이상으로 인한 혈당의 증가로 인해 피부에 동반되는 다양한 질환으로, 구체적으로는 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer), 발진황색종(eruptive xanthomatosis), 피부감염(cutaneous infection), 당뇨병성 피부병증(diabetic dermopathy), 물렁섬유종(skin fibroma), 흑색가시세포증(acanthosis nigricans), 소양증(pruritus), 당뇨병성 경화부종(scleredema diabeticorum) 및 고리육아종(granuloma annulare)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 당뇨병성 피부질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 약학적 조성물은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료 또는 진단에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 진단하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 다른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

구체적으로 본 발명의 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성률 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 ㎏ 당 0.001 내지 150 ㎎, 바람직하게는 0.01 내지 100 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나, 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감 될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 치료용 약학 제제를 제공한다.

상기 약학 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형일 수 있으며, 이에 제한되지 않고 당업자가 해당 당뇨병성 피부질환의 치료에 적절한 제형을 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명에서는 구체적인 실시예를 통해 트롬빈이 처리된 줄기세포 유래 엑소좀이 당뇨병성 피부질환, 구체적으로 당뇨병성 피부병증에 우수한 치료효과가 있음을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 제대혈 유래 중간엽줄기세포에 트롬빈을 처리하고 배양한 후 원심분리를 통해 엑소좀을 분리하였다. 이어서 상기 분리된 엑소좀을 주사전자현미경 및 투과전자현미경으로 관찰하였으며, 엑소좀 특이적 마커인 CD9, CD63 및 CD81의 발현수준을 측정함으로써 엑소좀이 잘 분리된 것을 확인하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 엑소좀의 당뇨병성 피부질환에 대한 치료효과를 평가하기에 앞서 당뇨병을 유발시킨 랫트 모델의 혈당을 측정하여 정상군에 비해 당뇨병이 효과적으로 유발된 것을 확인하였다. 이에, 혈당 차이가 없는 동일한 수준의 혈당을 갖는 당뇨병 랫트 모델을 대상으로 하여 등쪽 피부에 상처를 내어 피부 병증을 유발하고, 이어서 식염수, 아무 처리도 하지 않은 줄기세포 유래 엑소좀, 및 트롬빈이 처리된 줄기세포 유래 엑소좀을 각각 처리하고 5일 간격으로 피부 병증의 회복 정도를 평가하였다. 그 결과, 본 발명에 따른 트롬빈 처리된 줄기세포 유래 엑소좀을 처리한 경우 현저한 치료효과가 있음을 확인하였다(실시예 2 참조).

이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 당뇨병성 피부질환 개선용 의약외품 제제를 제공한다.

상기 의약외품 제제는 본 발명에서 의약외품 제제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제 및 에어로졸제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태일 수 있으며, 구체적으로 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제 조성물로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업자가 당뇨병성 피부질환 개선을 위해 적절히 선택하여 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 상기 약학적 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 트롬빈 처리 농도는 줄기세포/엑소좀의 효능을 강화시키는 데 적합한 농도라면 특별한 제한은 없으나, 배지에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 엑소좀을 분리하는 방법에는 제한이 없으며, 예를 들면 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동, 폴리머를 이용한 분리 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 분리할 수 있으며, 바람직하게는 원심분리/초원심분리를 이용할 수 있다. 이때, 원심분리/초원심분리는, 4℃, 3,000-100,000 g에서 10분 내지 5시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 세포 배양에 이용되는 배지는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(in vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium) 및 KnockOut DMEM 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

본 발명에서 “개체”란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물의 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용도를 제공한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 줄기세포에서 트롬빈 처리에 의한 엑소좀 분비 유도

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(3×10⁵개)를 100mm 배양접시(orange scientific cat# 4450200)에 분주한 후 1주일 동안 배양하였다. 배양접시에 세포가 포화 증식된 것을 확인한 후, 50unit/ml 트롬빈(REYON Pharmaceutical. Co., LTD)이 희석되어 있는 무혈청-배양배지(MEM alpha media)로 교체하고, 다시 6시간 동안 배양하였다. 이후 상기 배양액을 원심분리 튜브에 나누어 담아 4℃, 6,000rpm에서 30분간 원심분리하였으며, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 잔여물(debris)을 제거하였다. 다시, 상기 상층액을 4℃, 100,000rpm에서 2~4시간 동안 초원심분리한 후, 상층액을 추가로 제거하여 엑소좀을 수득하였다.

상기 과정에 따라 분리한 엑소좀을 주사전자현미경(SEM)과 투과전자현미경(TEM)을 통해 관찰하고 이미지화한 결과, 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이 상기 방법을 통해 트롬빈 자극에 의해 분비된 엑소좀을 확인하였다.

또한, 상기 수득한 산물이 엑소좀이 맞는지 명확하게 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯을 실시하여 공지의 엑소좀 마커인 CD9, CD63 및 CD81의 발현 여부를 검증하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 트롬빈 처리된 줄기세포에서 수득한 산물이 CD9, CD63 및 CD81을 정상적으로 발현하는 것으로 나타나 상기 산물이 엑소좀임을 확인하였다.

실시예 2. 트롬빈 처리된 줄기세포 유래 엑소좀의 당뇨병성 피부병증 치료 효과 검증

본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법을 통해 수득한 엑소좀이 당뇨성 만성 피부 질환에 치료 효과가 있는지 여부를 검증하기 위하여 하기 in vivo 실험을 실시하였다.

먼저, 당뇨병이 유발된 동물모델을 제작하기 위하여 12~16주 사이의 SD 랫트(rat)에 스트렙토조토신(Streptozotocin) 약물을 100mg/kg/body로 4일 동안 매일 1회 복강 투여한 후 2주간 꼬리에서 채혈하여 혈당을 측정하였다. 혈당 측정 결과 혈당이 300mg/dL 이상인 랫트만 선별하여 실험에 사용 하였다. 도 3a에 나타낸 바와 같이 실험에 사용한 정상군은 식염수(Saline)를 동일한 조건으로 복강 투여하였으며 혈당이 100mg/dL인 것으로 측정되었고, 당뇨를 유발시킨 군은 평균 혈당이 350mg/dL 이상인 것을 확인하였다.

이후 상기 당뇨를 유발시킨 랫트의 등에 일정 크기의 상처를 내어 당뇨병성 피부 병증을 유발시켰다. 상처를 낸 직후, 아무 처리도 하지 않은 중간엽 줄기세포(naive MSC)에서 분리된 엑소좀(naive exo) 및 트롬빈이 처리된 중간엽 줄기세포에서 분리된 엑소좀(thrombin exo)을 각각 병증 부위에 직접 도포(10ug/마리)하였다. 이때, 각 실험군에 해당하는 랫트의 그룹별 혈당을 측정한 결과, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 그룹 간의 혈창 차이는 없는 것을 확인하였다.

이후 5일 간격으로 해당 부위를 촬영하여 병증 면적의 변화를 측정해 치료 효과를 비교한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 각각 식염수(saline)와 naive MSC 유래 엑소좀을 처리한 경우에 비하여 트롬빈 처리된 MSC 유래 엑소좀이 처리된 경우 피부 병증의 치료 정도가 현저히 높게 나타났다. 상기 결과를 통해, 트롬빈 처리된 MSC에서 분리한 엑소좀이 당뇨병성 피부질환에 대한 우수한 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

1. 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포 (mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 다분화능 줄기세포 및 양막상피세포로 구성된 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 피부, 양막 또는 태반에서 유래된 것임을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 당뇨병성 피부질환은 당뇨병성 궤양(diabetic ulcer), 발진황색종(eruptive xanthomatosis), 피부감염(cutaneous infection), 당뇨병성 피부병증(diabetic dermopathy), 물렁섬유종(skin fibroma), 흑색가시세포증(acanthosis nigricans), 소양증(pruritus), 당뇨병성 경화부종(scleredema diabeticorum) 및 고리육아종(granuloma annulare)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 약학적 조성물은 배양배지, 사이토카인, 성장인자 및 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 보조성분을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
   
6. 제1항의 조성물을 포함하는, 당뇨병성 피부질환의 치료용 약학 제제.
   
7. 제6항에 있어서,
   상기 약학 제제는 주사제형, 주입제형, 분무제형, 액상제형 또는 패취제형인 것을 특징으로 하는, 약학 제제.
   
8. 트롬빈 처리된 줄기세포에서 유래된 엑소좀(exosome)을 유효성분으로 포함하는, 당뇨병성 피부질환 개선용 의약외품 제제.
   
9. 제8항에 있어서,
   상기 의약외품 제제는 액제, 연고제, 크림제, 스프레이제, 패취제, 겔제 및 에어로졸제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 피부 외용제 형태인 것을 특징으로 하는, 의약외품 제제.
   
10. 하기의 단계를 포함하는, 제1항의 약학적 조성물의 제조방법:
    (a) 줄기세포 배양 후 트롬빈을 처리하는 단계;
    (b) 상기 단계 (a)의 배양액에서 엑소좀을 분리하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)에서 분리한 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물을 제조하는 단계.
    
11. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 트롬빈은 배지 내에 1-1000 unit/ml 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 제조방법.
    
12. 제10항에 있어서,
    상기 단계 (b)의 엑소좀은 원심분리를 3,000-100,000 g에서 10분 내지 5시간 행함으로써 분리하는 것을 특징으로 하는, 제조방법.

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