CN113768861A - 一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法，主要针对生理性脱发，包括相应配比的脐带间充质干细胞外泌体装载β‑烟酰胺单核苷酸、甘草次酸、齐墩果酸、6‑姜酚、生育酚的混合物，通过使用微针导入，达到防脱发、育发黑发的功效。包括以下步骤：使用获赠的健康母体的脐带制备出间充质干细胞，通过超高速离心获得脐带间充质干细胞外泌体溶液，通过超声孵育以及电穿孔作用，将脐带间充质干细胞外泌体装载β‑烟酰胺单核苷酸；将脐带间充质干细胞外泌体装载β‑烟酰胺单核苷酸、甘草次酸、齐墩果酸、6‑姜酚、生育酚按照一定比例混合，制备出具有改善毛囊微环境，达到防脱发、育发黑发功效的外泌体美容液。

Description

一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物细胞护肤品的技术领域，尤其涉及一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)是广泛分布的细胞，具有自我更新和多向分化的能力。间充质干细胞目前已用于恶性白血病、移植物抗宿主病、急性心梗等疾病。在再生医学上，间充质干细胞用于改善亚健康状态、延缓衰老。脐带间充质干细胞数量多，增殖能力强，具有基因稳定、不易突变、免疫原性低，使用时无需配型。外泌体是由细胞分泌的直径为30-150nm的微细胞囊泡，具有脂质双层膜结构。它包含成千上万种细胞特异性蛋白质、脂质和核酸，并且在许多生理和病理过程中发挥重要作用，例如免疫力中的抗原呈递，组织损伤的修复等，并且是细胞免疫的通讯载体，也是细胞分裂和再生的重要物质。间充质干细胞可较其他细胞种类（如成肌细胞、胚肾细胞等）分泌出更多的外泌体。外泌体可对毛囊的微环境进行改善、修复，从而达到防脱育发、黑发的功效。

β-烟酰胺单核苷酸是科学界的新宠儿，具有增加细胞能量、释放长寿蛋白Sirtuins，促进细胞再生，激活DNA修复酶、关闭异常表达的基因，维持毛细血管的再生能力。β-烟酰胺单核苷酸被外泌体装载后，可增强外泌体的作用，再搭配具有消炎功能的甘草次酸、齐墩果酸、6-姜酚以及具有抗氧化功能的生育酚制备出一种具有防脱育发功能的外泌体美容液，具有改善毛囊微环境、防脱发、育发黑发的功能。

头发作为身体的重要组成部分，有美化仪表、保护头皮、减少和避免外来机械性和化学性损伤、防止或减少紫外线对头皮和头皮内组织器官的伤害。病理脱发是指异常或过度脱发，除了季节性因素，主要是由于先天性因素，如遗传，或背景压力，饮食等。脱发是常见的皮肤病之一。脱发主要分为雄激素性脱发、斑秃、生长期脱发、休止期脱发以及化学/物理脱发等类型。

近年来，随着现代人工作和生活压力的加大以及环境因素的影响，脱发人数一直在增加。国家卫生委员会在2019年发布的最新报告中指出，中国有超过2.5亿人脱发，每6人中就有1人脱发。在过去五年中，脱发的人数从1.6亿增加到2.5亿，脱发群体正日益年轻化。阿里健康公司公布的数据显示，80后以38.5%的脱发率位居第一，其次是90后，为36.1%，70年代出生的人为17.8%，70年代以前出生的人仅占7.6%。随着脱发问题越来越普遍，预防脱发的需要越来越迫切，各种防脱发产品和治疗方法进入消费者的视野。

针对生理性脱发，目前防脱育发的主要治疗手段有：药物治疗，抗脱发药物常见的有米诺地尔、非那雄胺、螺内酯等，但药物治疗具有副作用；毛发移植，主要分为毛囊单位移植（follicular unit transplatation，FUT）和毛囊单位抽取（follicular unitextraction，FUE）2种，是相对安全的植发技术，但价格高昂；防脱育发的化妆品，常见有防脱生发洗发水、精华液等。但是大多数较为新颖的植物提取物多是进行细胞试验以及小鼠实验，还未在人体上进行实际的功效研究，最终的防脱发效果还需要进一步进行实践研究；中胚层方法，又称美塑方法。美塑方法采用超微渗透技术，定位、定层、定量地把多种营养成分作用到皮肤的 1~1.5 mm处，营养成分缓慢释放，具有较长的持久性，使用量较低，但是鉴于美塑方法的特殊性，上述方式的安全性以及更多种测试还有待研究。因此开发一个效果良好且安全的应对生理性脱发的防脱育发的产品是一个急需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有防脱育发功能的外泌体美容液及其制备方法，针对生理性脱发并解决现有技术问题，实现防脱育发的功效。

本发明的目的是这样实现的：

脐带间充质干细胞外泌体的制备：

采用公开号：CN111643442A提供的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法制备出脐带间充质干细胞外泌体：将脐带从脐带装载瓶中取出，用生理盐水洗涤，并剪成1.5-2厘米的段状，继续用生理盐水洗涤2-3次，取出华氏胶，洗涤后剪碎呈米粒大小，平铺于培养皿，倒置15-30分钟，加入人间充质干细胞培养基和添加剂开始培养，3天后换液，之后每隔2-3天换液一次，至细胞达到80-85%融合结束原代培养，用0.25%胰酶消化，镜下观察细胞呈圆形，加入同体积的胎牛血清终止消化，用PBS洗涤后加入人间充质干细胞培养基重悬，按1:2传代，分瓶培养，取第2-3代细胞生存状态比较好的细胞，用无血清培养基培养48h，收集培养上清液，除去细胞碎片，采用100-280分钟离心力为200000g的超速离心，底部沉淀用无菌人间充质干细胞培养基稀释后，进而使用qEV凝胶过滤层析柱过滤，制备出10-100nm的脐带间充质干细胞外泌体，将滤液在离心力为2000g下离心5分钟，沉淀为外泌体。

脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸的制备：

将β-烟酰胺单核苷酸溶于无菌人间充质干细胞培养基中，再加入20倍重量的外泌体，在10W/cm²的超声强度下，设置为10个开30s/关2min周期，每两个周期冷却2min，结束后再室温下孵育2h，再添加到冷却的电穿孔比色杯中，使用 EppendorfEporator 在 850 kV下电穿混合物 7ms，最后在 37℃温育1h，之后将混合物用离心力为200000g下离心5分钟，沉淀为脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸、外泌体，其中脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸的包封率为81%，装载率为32.5%。

外泌体美容液的制备：

按照质量分数比，包括19-30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，8-10份甘草次酸、8-10份齐墩果酸、5-7份6-姜酚、1-2份生育酚，41-59份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀；按质量分数比，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸包括16-30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及70-84份PBS缓冲液。

具体实施方式

以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：

实施例1

本发明提供了一种外泌体美容液，按照质量分数比，包括19份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，8份甘草次酸、8份齐墩果酸、5份6-姜酚、1份生育酚，59份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀；按质量分数比，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸包括16份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及84份PBS缓冲液。

实施例2

本发明提供了一种外泌体美容液，按照质量分数比，包括30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，10份甘草次酸、10份齐墩果酸、7份6-姜酚、2份生育酚，41份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀；按质量分数比，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸包括30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及70份PBS缓冲液。

实施例3

本发明提供了一种外泌体美容液，按照质量分数比，包括19份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，8份甘草次酸、8份齐墩果酸、5份6-姜酚、1份生育酚，59份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀；按质量分数比，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸包括30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及70份PBS缓冲液。

实施例4

本发明提供了一种外泌体美容液，按照质量分数比，包括30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，10份甘草次酸、10份齐墩果酸、7份6-姜酚、2份生育酚，41份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀；按质量分数比，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸包括16份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及84份PBS缓冲液。

实施例5

本发明提供了一种外泌体美容液，按照质量分数比，包括26份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，8份甘草次酸、8份齐墩果酸、6份6-姜酚、2份生育酚，50份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀；按质量分数比，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸包括23份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及77份PBS缓冲液。

过敏性实验：

首先在100只裸鼠背部涂抹实施例1-5例配比生成的外泌体美容液，检测人员观察裸鼠背部无有红肿、瘙痒、长痘等不良反应；进而选取60名20-50周岁的成年志愿者分为5组进行试验，分别使用上述5组实施例的产品进行过敏性实验，检测人员在测试人员的颈脖上涂抹，经检测人员检测，所有测试人员的颈脖上都未出现红肿、瘙痒、起痘等不良反应。因此该美容液不会对人体产生不良反应。

疗效测试：

选取25-35岁、36-45岁、46-55岁年龄段的生理性脱发男性女性50人，每个年龄段的男性女性继续分成5组，每组10人，选取发量较少区域（4cm²）分别使用实施例1-5的产品，每隔7天用微针导入一次，每次导入5ml，持续使用4次，测试者对毛发脱落量、绒发生成量、硬发生成量、头皮状态三项进行评估（平均数），检测结果如下：

对上述结果进行分析，该外泌体美容液对于毛发脱落量、绒发生成量、硬发生成量、头皮状态都有显著的效果。并且实施例2的效果优于实施例1、3、4、5，结合表的结果得出实施例2为最佳实施例。

上述实施例为本发明优选的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明所做的改变均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种外泌体美容液，其特征在于，按照质量分数比，包括19-30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，8-10份甘草次酸、8-10份齐墩果酸、5-7份6-姜酚、1-2份生育酚，41-59份PBS缓冲液，常温下搅拌均匀。

2.如权利要求1所述一种外泌体美容液，其特征在于，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸按质量分数比，包括16-30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸以及70-84份PBS缓冲液。

3.如权利要求2所述的一种外泌体美容液，所述脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸，其特征在于，包括以下步骤：

采用公开号：CN111643442A提供的脐带间充质干细胞外泌体的制备方法制备出脐带间充质干细胞外泌体；将β-烟酰胺单核苷酸溶于无菌人间充质干细胞培养基中，再加入20倍重量的脐带间充质干细胞外泌体，在10W/cm²的超声强度下，设置为10个开30s/关2min周期，每两个周期冷却2min，结束后再室温下孵育2 h，再添加到冷却的电穿孔比色杯中，使用EppendorfEporator在 850 kV 下电穿混合物 7ms，冷却1h后，在 37℃温育1h，之后将混合物用离心力为200000g下离心5分钟，沉淀为脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸、外泌体，其中脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸的包封率为81%，装载率为32.5%，按照质量分数比，将16-30份脐带间充质干细胞外泌体装载β-烟酰胺单核苷酸储存于70-84份PBS缓冲液中。