CN108354947A - 负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物上的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物的用途。与现有技术相比，本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以大大增强其在治疗难愈性皮肤创面相关疾病方面的效果。

Description

负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗难愈性皮肤 创面相关疾病药物上的用途

技术领域

本发明属于细胞生物学、分子生物学及药物研发技术领域，尤其是涉及负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物上的用途。

背景技术

外泌体是一类由细胞分泌的直径约30-150nm的细胞外囊泡，其携带供体细胞来源的多种生物活性物质包括DNA、RNA、蛋白等进入效应细胞，有效调控机体细胞信号转导。研究表明，干细胞分泌的外泌体通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，生理性修复或者清除机体损伤、病变和衰老的细胞，发挥抗炎、调节免疫、促进效应细胞增殖、迁移和分化、促进血管新生等功能。

胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESCs)与诱导人多能干细胞(inducedpluripotent stem cells,iPSCs)具有体外培养无限增殖、自我更新和多向分化的特性。ESCs和iPSCs具有多能性(Pluripotency)，即ESCs和iPSCs可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency)，即只能分化成为有限的几种细胞。因而ESCs和iPSCs与组织成体干细胞相比在促进组织器官再生更新方面功能更强大。ESCs或iPSCs分泌的外泌体可能包裹了与多能性相关的因子、转录因子、mRNA、microRNA等，表现出比成体组织干细胞外泌体更强大的功能。人多能干细胞产生的外泌体，可以抑制细胞衰老过程，改变靶细胞表观遗传特征，使效应细胞逆转至低分化状态，从而促进修复组织损伤。同时人多能干细胞来源的外泌体，也可以起到与组织干细胞类似的作用，如修复血管、抑制炎症、促进组织干细胞增殖分化等功能。

外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，外泌体作为药物的纳米载体得到了广泛的关注与研究。与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。由于外泌体继承了细胞的磷脂、表面蛋白等物质，具有丰富的生理功能，可以提高药物的传递效率，实现药物的特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。外泌体自身携带的蛋白、基因等物质具有细胞调控能力，可以对特定的疾病起到治疗作用。

目前，多种细胞外泌体构建的纳米药物递送系统已经用于疾病治疗的探索。Wood课题组最先利用未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDC)来源的外泌体负载siRNA治疗阿尔兹海默症。iDC分泌的外泌体表面缺乏T细胞激活蛋白(例如MHC-I，MHC-II，CD86)，具有免疫惰性。他们通过基因转染的方法，在外泌体表面蛋白Lamp2b上修饰乙酰胆碱受体识别多肽片段RVG，进而赋予iDC外泌体定位脑部神经细胞的能力；随后，利用电转的方法，将BACE-1的siRNA导入到iDC外泌体中，通过小鼠动物模型，验证了这些载药外泌体治疗阿尔兹海默症的潜力。然而，iDC细胞提取过程繁琐，细胞数量有限，成本高昂，难以产业化生产。同样，肿瘤细胞来源的外泌体也被用于药物递送系统的构建。虽然肿瘤细胞可以无限扩增，制备大量的外泌体，但是它们潜在的安全性风险限制其在临床的使用。最近，研究人员报道了利用牛奶来源外泌体构建的纳米药物递送系统。与细胞来源的外泌体相比，牛奶来源的外泌体提取简便、成本低，实现可以大规模制备满足临床需求。但是，由于牛奶外泌体中含有大量的非人源的基因与蛋白质等物质，其通过静脉全身注射的安全性仍有待进一步确认，而且该研究的重点主要集中于外泌体的药物载体功能，并没有充分发挥外泌体自身所携带的物质对疾病与损伤的治疗潜力。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体在制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物上的用途。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明第一方面：

提供人多能干细胞外泌体，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体。

在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：

采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。

在本发明的一个实施方式中，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。

旋转超滤结合低温超速离心方法主要步骤是：将一定容积的培养基于4℃400g离心10min，去除游离细胞，得到的上清移入另一管中，4℃15000g 20min，去除细胞碎片，获得的上清液倒入millipore超滤装置中，用PBS洗脱收集滤膜(100KD)上的浓缩液体，即再次加入PBS，经millipore超滤装置再次超滤，得到的浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100800g离心210分钟，收集底部蔗糖/重水密度垫，加入两倍体积PBS，转移至可截留100KD分子的超滤细心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到Exosomes悬液，分装保存至-80℃。

在本发明的一个实施方式中，无血清培养体系选择市售的型号为E8^TM或mTeSR1或mTeSR2的培养基。

在本发明的一个实施方式中，收集外泌体后，通过电镜、粒径分析、免疫印迹等方法对外泌体的特性进行鉴定，结果符合外泌体特征：直径范围30-150nm，透射电子显微镜下呈双层膜囊状结构，其膜结构表面含有CD9，CD63等标志物。

在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体采用深低温保存，所述深低温保存指-80℃以下保存。

本发明第二方面：

提供所述人多能干细胞外泌体作为制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物的用途。包括以下用途中的一种或几种：

A.作为制备治疗感染性皮肤疾病药物的应用，如各种条件或非条件致病菌引起的临床伤口感染；

B.作为制备各种原因引起的经久不愈的皮肤溃疡的药物的应用，包括压疮等；

C.作为制备烧烫伤创面治疗的药物的应用；

D.作为制备创伤性皮肤缺损的药物的应用；

E.作为制备糖尿病性皮肤溃疡的药物的应用；

F.作为制备抑制增生性皮肤瘢痕的药物的应用。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗临床皮肤伤口感染。以皮肤金葡菌感染实验动物为模型，伤口局部涂抹(或皮下注入)多能干细胞外泌体悬液，观察外泌体对感染伤口的愈合率、炎性反应及生长因子的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗皮肤压疮。以压力性皮肤溃疡实验动物为模型，伤口局部涂抹(或皮下注入)多能干细胞外泌体悬液，观察外泌体对创面愈合、炎性指标以及新生血管的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗皮肤烧烫伤，以皮肤深Ⅱ度烫伤实验动物为模型，伤口局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察外泌体对创面愈合、局部组织再生及新生血管的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗创伤性皮肤缺损，以创伤性皮肤全层缺损实验动物为模型，伤口局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察外泌体对创面愈合率、组织结构、胶原排列的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗糖尿病性皮肤缺损，以糖尿病模性皮肤缺损实验动物为模型，伤口局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察外泌体对创面大体愈合、组织病理学及新生血管的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用人多能干细胞外泌体治疗皮肤增生性瘢痕，以皮肤增生性瘢痕实验动物为模型，局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察外泌体对瘢痕组织学变化，Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的改善情况。

本发明第三方面：

提供基于所述人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：

A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

B、缓释外泌体的复合物：由人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

C、以人多能干细胞外泌体作为添加剂：以人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。

在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或直接在组织损伤部位注射或喷雾等形式进行使用；缓释外泌体复合物主要为壳聚糖水凝胶，可在伤口局部涂抹进行使用。

本发明第四方面：

提供负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体，包括人多能干细胞外泌体及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。

在本发明的一个实施方式中，所述人多能干细胞外泌体为本发明第一方面所述外泌体。

在本发明的一个实施方式中，所述白藜芦醇的包裹浓度为5-100μg/mL。

本发明第五方面：

提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制备方法，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将一定剂量的白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。

在本发明的一个实施方式中，孵育的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度下孵育一定时间。随后将上述溶液置于一定截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/mL–1×10¹²/mL，优选为1×10¹⁰/mL；孵育温度的范围为4℃–50℃，优选为37℃；孵育时间范围为1h–48h，优选为4h；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，冻融的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液和药物溶液混合，置于一定温度的冰箱中进行冷冻。随后解冻，再冷冻，如此循环一定次数。最后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/mL–1×10¹²/mL，优选为1×10¹⁰/mL；冷冻温度范围为-10℃--200℃,，优选为-80℃；循环次数为1–20次，优选为3次；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，电转的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液和电转液混合，置于电转仪中，在一定条件下电转一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/mL–1×10¹²/mL，优选为1×10¹⁰/mL；电转液为KCl、K3PO4和OptiPrep^TM细胞梯度离心液的混合溶液，其中KCl的浓度范围为1mM–1M，优选为25mM，K3PO4的浓度范围为0.01mM-1M，优选为1.15mM，OptiPrep^TM细胞梯度离心液的体积分数范围为80％-0.1％，优选为21％；电转参数中电压的范围为10KV–0.1V，优选为400V，电容的范围为0.1–1000F，优选为150F；电转时间范围为0.1s–1min，优选为10s；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，超声的处理技术主要按以下方法进行：将一定浓度的外泌体悬浮液与药物溶液混合，利用针式超声仪在一定条件下对上述混合溶液超声一定时间。随后，将上述溶液置于一定的截留分子量的超滤管中，利用生物相容性介质超滤洗涤三次，得到载药的外泌体。本方法中，外泌体悬液的浓度范围为1×10⁶/mL–1×10¹²/mL，优选为1×10¹⁰/mL；超声条件中，电压的范围为1KV–1V，优选为500V，频率的范围为1Hz–20KHz，优选为2KHz，循环次数的范围为1–100次，优选为6次，循环中超声输出时间为1s–60s，优选为5s，间隔时间的范围为1s–300s，优选为5s；超滤管的截留分子量范围为10KDa–5000KDa，优选为100KDa；生物相容性介质为生理盐水，生理缓冲液，细胞培养基等。

在本发明的一个实施方式中，通过常规的超滤、超速离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。

在本发明的一个实施方式中，通过高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)对人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的效率进行检测分析，最终获得人多能干细胞外泌体负载白藜芦醇的纳米药物递送体系。

本发明第六方面：

提供所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物的用途。包括以下用途中的一种或几种：

A.作为制备治疗感染性皮肤疾病药物的应用，如各种条件或非条件致病菌引起的临床伤口感染；

B.作为制备各种原因引起的经久不愈的皮肤溃疡的药物的应用，包括压疮等；

C.作为制备烧烫伤创面治疗的药物的应用；

D.作为制备创伤性皮肤缺损的药物的应用；

E.作为制备糖尿病性皮肤溃疡的药物的应用；

F.作为制备抑制增生性皮肤瘢痕的药物的应用。

在本发明的一个实施方式中，应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗临床皮肤伤口感染。以皮肤金葡菌感染实验动物为模型，伤口局部涂抹(或皮下注入)多能干细胞外泌体悬液，观察负载白藜芦醇的外泌体对感染伤口的愈合率、炎性反应及生长因子的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗皮肤压疮。以压力性皮肤溃疡实验动物为模型，伤口局部涂抹(或皮下注入)多能干细胞外泌体悬液，观察负载白藜芦醇的外泌体对创面愈合、炎性指标以及新生血管的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗皮肤烧烫伤，以皮肤深Ⅱ度烫伤实验动物为模型，伤口局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察负载白藜芦醇的外泌体对创面愈合、局部组织再生及新生血管的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗创伤性皮肤缺损，以创伤性皮肤全层缺损实验动物为模型，伤口局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察负载白藜芦醇的外泌体对创面愈合率、组织结构、胶原排列的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗糖尿病性皮肤缺损，以糖尿病模性皮肤缺损实验动物为模型，伤口局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察负载白藜芦醇的外泌体对创面大体愈合、组织病理学及新生血管的改善情况。

在本发明的一个实施方式中，应用负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体治疗皮肤增生性瘢痕，以皮肤增生性瘢痕实验动物为模型，局部皮下注入多能干细胞外泌体悬液，观察负载白藜芦醇的外泌体对瘢痕组织学变化，Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达的改善情况。

本发明第七方面：

提供基于所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体的制剂，所述制剂选择以下形式中的任一种：

A、悬浮剂：将所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

B、缓释外泌体的复合物：由所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

C、以负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。

在本发明的一个实施方式中，悬浮剂的溶剂为生理盐水或磷酸盐缓冲液或基础细胞培养基。所述悬浮剂可通过口服、静脉注射，或直接在组织损伤部位注射或喷雾等形式进行使用。

在本发明的一个实施方式中，所述缓释外泌体的复合物采用植入组织损伤部位的形式使用。

白藜芦醇是一种天然存在的多酚类化合物，众多研究结果表明，白藜芦醇具有抗炎、抗肿瘤、心血管保护、保肝、神经系统保护、免疫调节、抗衰老等多种药理作用。也有研究结果确切表明白藜芦醇对于多种皮肤病具有一定的预防或治疗作用。白藜芦醇难溶于水，化学性质不稳定，易被氧化分解，口服后在体内迅速代谢，体内生物利用度低，制约了其广泛应用。脂质体及纳米乳等是白藜芦醇的剂型研究的热点。

外泌体是细胞分泌的天然纳米载体，与人工合成的纳米载体相比，外泌体在药物释放领域的应用具有独特的优势。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成的脂质体、高分子、纳米硅等材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。人多能干细胞外泌体具有抗炎、免疫调节、促进细胞增殖与迁移，清除衰老细胞等功能，且外泌体可通过粘膜屏障或皮肤屏障或血脑屏障直接进入组织细胞内。

本发明人多能干细胞来源的外泌体是来自ESCs或iPSCs多能干细胞，现有技术主要是研究成体干细胞来源的外泌体；ESCs和iPSCs具有多能性(Pluripotency)，即ESCs和iPSCs可分化成三胚层的任意细胞，具有发育成多种组织的能力，参与部分组织的形成。而成体干细胞仅具备多种分化潜能(multipotency)，即只能分化成为有限的几种细胞。多能干细胞促进组织细胞再生防治衰老的功能明显比成体干细胞强。多能干细胞分泌的外泌体亦具有强大的促进组织细胞再生，防治衰老，治疗皮肤创面疾病的功能，因而显示出更大的应用价值。

利用干细胞外泌体作为纳米载体既可以实现药物的有效递送，同时又可以充分发挥干细胞外泌体的功能，起到更好的疾病治疗效果。在众多种类的干细胞中，多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞)具有强大的增殖扩增能力，可以实现产业化生产以满足治疗需求。

本发明利用胚胎干细胞与诱导人多能干细胞来源的外泌体作为白藜芦醇的药物载体，可大大提高白藜芦醇的生物学效应，再结合人多能干细胞外泌体自身的功能，可以增强其在治疗难愈性皮肤创面相关疾病方面的效果。

附图说明

图1：人多能干细胞分泌的外泌体(ES-exo)粒径分布图。

图2：外泌体标志物鉴定。

图3：Res的HPLC标准定量曲线。

图4：ES-exo包裹Res的HPLC检测结果。

图5A：不同治疗时间点三组创面大体愈合情况。

图5B：三组治疗后创面炎性因子及生长因子表达情况。

图6A：不同治疗时间点三组创面大体愈合情况。

图6B：免疫组化及荧光显示不同治疗时间点三组创面血管新生情况。

图7A：HE染色显示不同治疗时间点三组创面愈合情况。

图7B：免疫组化显示不同治疗时间点三组创面PCNA表达情况。

图8A：大鼠全层皮肤缺损伤后21d各组创面愈合组织中皮肤附件情况。

图8B：大鼠全层皮肤缺损伤后21d各组创面愈合组织中胶原排列。

图9A：各组糖尿病大鼠皮肤创面大体观察。

图9B：各组糖尿病大鼠皮肤创面上皮化和瘢痕形成程度比较。

图9C：各组糖尿病大鼠皮肤伤口血管新生程度的比较。

图10A：各组瘢痕组织HE染色比较。

图10B：各组瘢痕组织Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组化结果比较。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

人胚胎干细胞(ESCs)的培养和外泌体的提取与鉴定

在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将ESCs移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCellVancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO₂，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求定容至一定体积，得到外泌体悬液ES-exo，分装保存至-80℃。

ES-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

ES-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。结果显示粒径范围为50-150nm，见图1。

通过western blot检测ES-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。见图2。

实施例2

人诱导人多能干细胞(iPSCs)的培养和外泌体的提取与鉴定

在培养皿中铺一层胚胎干细胞基质胶(ESC-Qualified BD Matrigel,BDSparks,MD,USA)，将iPSC移入该培养皿，加入mTeSR1无血清培养基(StemCellVancouver,BC,Canada)，在温箱内(37℃，5％CO₂，饱和湿度)培养，收集每天更换的培养基。将培养基通过0.22微米孔径滤膜过滤及4℃10000g离心30分钟，去除细胞碎片；采用100KD分子量的超滤管，离心(3500g，15min)截留浓缩上清中的外泌体，得到外泌体浓缩液；将浓缩液转移至30％蔗糖/重水密度垫(1.210g/cm³)，4℃100000g离心210分钟，收集底部5ml蔗糖/重水密度垫，加入PBS稀释，转移至可截留100KD分子量的超滤离心管中，4℃3500g离心15min；PBS洗涤3次，最终按后续实验要求以PBS定容至一定体积，得到外泌体悬液iPS-exo，分装保存至-80℃。

iPS-exo的形态通过透射电镜(TEM)观察。将载样铜网(孔径2nm)固定在支架上，将20μL样本滴加到铜网上，室温静置3分钟后，在铜网一侧用滤纸将液体吸去，滴加3％磷钨酸溶液30μL对样本进行负染(室温，5分钟)。用滤纸吸去负染液，将铜网转移至透射电子显微镜下，观察外泌体形态。

iPS-exo的粒径和浓度通过纳米粒子分析系统(iZon qNano,New Zealand)进行检测，按照操作说明书调节仪器各项参数：将Nanopore(NP100)安装到加样孔下方，调节Stretch至43cm，向加样孔内加入40μL PBS，使电流稳定在100-120nA范围内。吸去PBS，加入40μL 1：100稀释的CPC100标准品(粒径70nm)，测量粒子数和浓度，通过软件得到标准曲线。吸去标准品，PBS洗3次，加入40μL 1:1000稀释的待测样品，测定粒子数和浓度，重复测量3次。通过软件进行数据分析，得出分析报告。

通过western blot检测iPS-exo特异性表面标志物CD9和CD63的表达。具体步骤：外泌体总蛋白提取，通过BCA蛋白分析试剂盒检测样本蛋白浓度，制胶配制10％的分离胶，电泳，转膜，封闭及抗体孵育，化学发光成像分析仪观察条带显影情况。结果所提取的外泌体均表达特异性表面标志物CD9和CD63。

实施例3

人ESC来源外泌体(ES-exo)通过共孵育法包裹白藜芦醇(Res)

ES-exo溶液来自实施例1。

Res的定量标准曲线测定：准确称取1mg的Res粉末溶解于1mL的甲醇中，随后将该溶液用甲醇进行稀释，配置成50μg/mL，20μg/mL，10μg/mL的Res的甲醇标准溶液，HPLC进样。色谱条件如下：

色谱柱：Zorbax Extend C-18，150*4.6μm，5–micro

流动相：甲醇：水＝95:5

流速：1mL/min

柱温：室温

检测波长：305nm

获得相应的实验结果后，将色谱峰的峰面积(PA)作为Res浓度(C，μg/mL)的函数作图(如附图3)，得到如下该色谱分离条件下Res的定量标准曲线：

PA＝38.42C+71.12，R²＝0.9991

白藜芦醇的包裹：配制1mg/mL的白藜芦醇(Res)的生理盐水溶液(pH＝4.0)，随后用1N的氢氧化钠水溶液调节溶液pH至6左右。取ES-exo溶液100μL(浓度1.0*10¹²/mL)，向其中加入1mL的Res溶液。37℃孵育1h后，用5mL的生理盐水超滤洗涤溶液两次，留取200μL液体，得到负载Res的ES-exo溶液。随后，取50μL该溶液，利用200μL的乙腈进行稀释，12000rad/min下离心，除去蛋白沉淀，上清液在标准曲线的测定条件下，进行HPLC检测。检测结果附图4所示，Res的包裹浓度为5μg/mL。

实施例4

应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗临床皮肤伤口感染。

选择正常6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重25-30g，共45只。实验分为3组，每组15只。首先建立皮肤金葡菌感染模型，腹腔注射0.4％戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉，麻醉成功后用剃毛器剃去小鼠背部毛发，面积约3×3cm，用无菌手术剪剪去直径为5mm的圆形皮肤，剪至筋膜，以1×10⁸CFU/ml感染伤口。对照组予以200ulPBS创面皮下注入；治疗第一组予以1*10⁸个ESC-Exos皮下注入；治疗第二组予以1*10⁸个ESC-Exos-Res皮下注入。在治疗第3、5、7、9天时对伤口愈合情况、炎性反应以及生长因子分泌情况进行评价。

首先在不同治疗时间点对各组小鼠创面拍照，观察创面分泌物、边缘收缩以及结痂情况，并计算创面愈合率。之后对创面进行取材，通过HE染色评价新生肉芽、炎性细胞及再上皮化；Masson染色评价创面胶原纤维的形成；通过western blot技术检测不同组小鼠创面MMP3、MMP1、TIMP1、VEGF、IL-6、TGF-β的蛋白表达水平.

实验结果：第3天时，对照组伤口炎症反应较强，伤口边缘肿胀，两组实验组炎症不明显，创口边缘收紧，创面结痂，伤口面积较对照组小；第5天对照组小鼠伤口脓性分泌物减少，ESC-Exos组少许脓性分泌物，ESC-Exos-Res组无明显脓性分泌物，伤口面积ESC-Exos-Res组小于ESC-Exos组；第7天时，ESC-Exos-Res组创面已基本愈合且结痂脱落，ESC-Exos组创面少许结痂，而对照组创面大于以上两实验组，创面仍有较大结痂；第9天时，ESC-Exos-Res组已基本愈合、皮肤表面毛发再生，ESC-Exos组创面也已基本愈合，少许瘢痕组织，毛发再生不明显，对照组创面仍有少许结痂。以上结果表明ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能加速感染创面的愈合，并且ESC-Exos-Res显示出更加强大的治疗效果。HE染色及Masson染色结果显示ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能促进感染创面肉芽组织的形成，减轻过度的炎症反应，加速创面的再上皮化以及局部胶原的分泌，并且ESC-Exos-Res的这种作用更加明显。此外，Western blot结果显示ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显降低MMP3、MMP1、TIMP1表达，增加VEGF、IL-6、TGF-β表达，并且ESC-Exos-Res的作用更明显，见图5。

结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显促进皮肤感染性伤口的愈合，且以ESC-Exos-Res的效果最显著。

实施例5

应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗临床皮肤压力性溃疡。

选择正常6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重25-30g，共36只。实验分为3组，每组12只。皮肤溃疡模型的建立，采用磁铁构建皮肤溃疡模型，12h/12h缺血再灌注为1个循环，持续3天；缺血再灌注7天后，形成典型溃疡模型。对照组予以200ulPBS创面皮下注入；治疗第一组予以1*10⁸个ESC-Exos皮下注入；治疗第二组予以1*10⁸个ESC-Exos-Res皮下注入。在治疗第3、7、14天时对伤口愈合情况、炎性反应以及血管新生情况进行评价。

首先在不同治疗时间点对各组小鼠创面拍照，观察创面分泌物、边缘收缩以及结痂情况，并计算创面愈合率。组织病理学和免疫荧光检测：小鼠生理盐水及4％多聚甲醛灌注后，置于4％多聚甲醛溶液固定(4℃，24-48h)，15％、20％、30％蔗糖梯度脱水后，OCT包埋，冰冻切片机进行厚度为10um连续切片，用于CD68(巨噬细胞)、CD3(T淋巴细胞)、MMP13(基质金属蛋白酶)、CD31(新生血管)、CD31/α-SMA(成熟血管)免疫荧光染色。

实验结果：第3天时，对照组创面可见少许炎性渗出，创面面积减小不明显，两实验组创面未见明显渗出，创面边缘收缩，创面缩小；第7天时，对照组创面可见大量结痂，ESC-Exos及ESC-Exos-Res组创面面积均小于对照组，后者更明显且结痂较少；第14天时，ESC-Exos-Res组创面已愈合、表皮毛发再生，未遗留明显瘢痕，ESC-Exos组次之，对照组创面仍未完全愈合。以上结果表明ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能加速感染创面的愈合，并且ESC-Exos-Res显示出更加强大的治疗效果。HE染色及Masson染色结果显示ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能促进感染创面肉芽组织的形成，减轻过度的炎症反应，加速创面的再上皮化以及局部胶原的分泌，并且ESC-Exos-Res的这种作用更加明显。免疫荧光结果显示：ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能减轻局部炎症反应，降低CD68、CD3、MMP13的表达，促进新生血管的形成及成熟，并且ESC-Exos-Res的这种作用更加明显，见图6。

结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显促进压力性皮肤溃疡的愈合，且以ESC-Exos-Res的效果最显著。

实施例6

应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗皮肤烧烫伤。

选择正常6周龄雄性C57BL/6小鼠，体重25-30g，共27只。实验分为3组，每组9只。皮肤烧烫伤模型的建立，10％水合氯醛腹腔注射进行麻醉(0.1ml/20g)，背部剃毛，常规消毒。水煮沸，采用自制水浴烫伤板水平贴于小鼠背部脊柱左右两侧皮肤，形成深Ⅱ度烫伤模型。对照组予以200ulPBS创面皮下注入；治疗第一组予以1*10⁸个ESC-Exos皮下注入；治疗第二组予以1*10⁸个ESC-Exos-Res皮下注入。在治疗第7、14天时对伤口愈合情况、表皮再生、附属结构再生以及血管新生情况进行评价。

首先在不同治疗时间点对各组小鼠创面拍照，观察创面愈合情况，并计算创面愈合率。在不同治疗时间点通过病理组织切片的HE染色评价和免疫组化/荧光方式评价ESC-Exos及ESC-Exos-Res对损伤皮肤细胞的作用，检测指标包括CK19、PCNA、CD31，同时采用western blot技术对上述指标进行验证。PCR技术检测Ⅰ/Ⅲ型胶原比例评价创面的瘢痕化程度。

实验结果：大体照片可以发现，ESC-Exos及ESC-Exos-Res可以明显促进损伤后皮肤组织创面的愈合，第1周ESC-Exos及ESC-Exos-Res组创面结痂过早脱落，表明新生表皮开始生长，第2周后ESC-Exos-Res组表皮再生化完成，ESC-Exos尚未完全再生化，而对照组创面无明显改变。以上结果表明ESC-Exos-Res具有强大的促进烫伤创面愈合作用。病理组织切片的HE染色和免疫组化/荧光方式验证ESC-Exos及ESC-Exos-Res对损伤皮肤细胞的作用，HE结果显示1周后ESC-Exos及ESC-Exos-Res组有核细胞增多，以后者明显，对照组无明显肉芽组织形成；2周后ESC-Exos-Res组表皮再生化明显，皮肤附属结构再生增多，ESC-Exos组仅有少量附属结构形成，而对照组皮肤结构依然紊乱，无明显的组织结构；免疫组化显示ESC-Exos-Res组在治疗1周、2周时PCNA明显高于其它两组，对照组最少，并且PCNA的阳性区域集中在表皮的基底部和毛囊等附属结构的根部。Ⅰ型和Ⅲ型胶原的分布也是反应修复进程的重要指标，PCR显示ESC-Exos及ESC-Exos-Res组胶原Ⅰ/Ⅲ型比例高于对照组，其中以ESC-Exos-Res组最为明显，表明ESC-Exos-Res可以更好的使损伤组织胶原类型分布的合理化；免疫荧光显示ESC-Exos-Res组CK19表达阳性的表皮角质细胞的数量较其它组显著上调，ESC-Exos效果次之，对照组最少。CD31检测也显示出类似结果，表明ESC-Exos-Res可以明显的促进损伤组织新生血管的密度，见图7。

结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显促进皮肤烧烫伤的愈合，且以ESC-Exos-Res的效果最显著。

实施例7

应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗创伤性皮肤缺损。

取18只SD大鼠，适应性饲养1周，硫化钠常规脱去背部毛发，腹腔注射10g/L戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉。于每只大鼠背部距脊柱两侧各1cm处，分别制备2个面积为1cm x 1cm的全层皮肤缺损创面。实验分为对照组、ESC-Exos组、ESC-Exos-Res组，分别于创面四周皮下多点均匀注射总体积100uL的PBS、100ug/mL Esc-Exos以及100ug/mL Esc-Exos-Res。在治疗7天、14天、21天对创面愈合率、组织结构(HE染色)、胶原排列(Masson染色)进行评价。

实验结果：治疗后各观察时间点中ESC-Exos-Res组创面愈合率均明显高于其余两组，ESC-Exos组在各观察时间点中均高于对照组。组织学评估显示在治疗第21天时，对照组、ESC-Exos组、ESC-Exos-Res组创面愈合组织中皮肤附件数量分别为(1.8±0.6)、(4.3±1.4)、(5.1±1.6)个，ESC-Exos-Res组皮肤附件数量明显多于其余两组。Masson染色显示d，对照组创面愈合组织中胶原纤维排列紊乱；ESC-Exos组创面愈合组织中胶原纤维排列虽较紊乱，但较对照组整齐；ESC-Exos-Res组创面愈合组织中胶原纤维排列方向高度一致，见表1、图8。

结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显促进创伤性皮肤缺损的愈合，且以ESC-Exos-Res的效果最显著。

表1 大鼠全层皮肤缺损伤后各时相点各组创面愈合率比较

(％,平均数±标准差)

实施例8

应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗糖尿病皮肤缺损。

糖尿病模型的建立：适应性饲养SD大鼠1周，造模前大鼠禁食12-16h，随机取20只大鼠称重，临时配1％(质体比)STZ溶液，按65mg/kg进行腹腔注射(仅注射一次即可)。72h后每天监测随机血糖，若连续三次随机血糖浓度均>16.7mmol/L，即视为糖尿病模型造模成功。观察14天后建立皮肤损伤模型。皮肤损伤模型的建立：①腹腔注射适量4％水合氯醛(0.1mL/10g)将造模成功的大鼠(保证至少10只)麻醉，将其背部毛发使用电推工具剪短后，再涂抹6％硫酸钠溶液用来除掉毛发，毛发溶解后迅速使用清水冲洗；②消毒大鼠背部皮肤，在大鼠脊柱两侧切除3块1.5×1.5cm全层皮肤，可见深筋膜存在。实验分为对照组、ESC-Exos组、ESC-Exos-Res组，分别于创面四周皮下多点均匀注射总体积100uL的PBS、100ug/mLEsc-Exos以及100ug/mL Esc-Exos-Res。于治疗第4天、7天、14天进行观察，观察指标包括创面大体愈合情况，组织病理学观察(HE染色、Masson染色)、新生血管情况。

实验结果：相对于对照组，ESC-Exos组、ESC-Exos-Res组大鼠的伤口愈合速度加快，且ESC-Exos-Res组愈合速度最快。HE染色图片显示，在术后14天，ESC-Exos组、ESC-Exos-Res组大鼠皮肤伤口再上皮化程度相对于对照组增高，疤痕形成减低，且其ESC-Exos-Res促上皮化和抑制疤痕形成的作用最显著。在术后第14天切取糖尿病大鼠皮肤创面，将创面内面翻转朝上，对创面新生血管进行图片采集结果显示，对照组大鼠皮肤创面的再生血管数目稀少，而ESC-Exos组大鼠的皮肤创面有较多新生血管形成，且ESC-Exos-Res对大鼠皮肤创面的促血管新生作用最为明显，Micro-CT及免疫荧光也显示出类似结果，见图9。

结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显促进糖尿病皮肤缺损的愈合，且以ESC-Exos-Res的效果最显著。

实施例9

应用人多能干细胞外泌体(ESC-Exos)及负载了白藜芦醇的人多能干细胞外泌体(ESC-Exos-Res)治疗皮肤增生性瘢痕。

动物模型制备：将人增生性瘢痕组织分别置于DMEM+双抗(青霉素1×10⁶U/L、链霉素I×10⁶U/L)组织培养液中，削去瘢痕表皮和皮下组织，4℃保存备用。每只裸鼠按60mg/kg戊巴比妥钠腹腔麻醉，切开裸鼠背部皮肤0.5cm，将增生性瘢痕组织切成若干块，约0.2g/块，移植于12只裸鼠背部皮下，切口缝合，分笼饲养。实验分为对照组(瘢痕内注入PBS)、ESC-Exos组、ESC-Exos-Res组，于治疗14天后取出背部移植物4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片。观察各组瘢痕组织学变化，Ⅰ型、Ⅲ型胶原表达情况。

实验结果：HE染色显示对照组胶原纤维呈致密状态，排列紊乱，细胞和血管数量少；ESC-Exos组可见胶原排列较密，排列稍紊乱，可见少量细胞和血管；ESC-Exos-Res组胶原排列疏松、有序，可见较多细胞和血管。免疫组化结果显示Ⅰ、Ⅲ型胶原比对照组最低，ESC-Exos组及ESC-Exos-Res组明显高于对照组，且以ESC-Exos-Res组明显，见图10。

结果表明，ESC-Exos和ESC-Exos-Res均能明显抑制增生性皮肤瘢痕，且以ESC-Exos-Res的效果最显著。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.人多能干细胞外泌体作为制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述人多能干细胞外泌体为人胚胎干细胞来源的外泌体或人诱导多能干细胞来源的外泌体，

所述人多能干细胞外泌体是通过以下方法获得的：

采用无饲养层培养方法，在无血清培养体系培养人ESCs或iPSCs，收集培养基，收集纯化培养基中的外泌体，即为人多能干细胞外泌体。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，采用旋转超滤结合低温超速离心方法收集纯化培养基中的外泌体。

4.负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为制备治疗难愈性皮肤创面相关疾病药物的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体包括：人多能干细胞外泌体，及包裹在人多能干细胞外泌体内的白藜芦醇。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述白藜芦醇的包裹浓度为5-100μg/mL。

7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，通过孵育、电转、挤压、超声、冻融或皂素处理的方法将白藜芦醇包裹入人多能干细胞外泌体。

8.根据权利要求5所述应用，其特征在于，通过超滤、离心或者脱盐柱等手段将包裹药物白藜芦醇的外泌体与游离的药物白藜芦醇分离。

9.如权利要求1或4所述应用，其特征在于，包括以下用途：

A.作为制备治疗感染性皮肤疾病药物的应用，如各种条件或非条件致病菌引起的临床伤口感染；

B.作为制备各种原因引起的经久不愈的皮肤溃疡的药物的应用，包括压疮等；

C.作为制备烧烫伤创面治疗的药物的应用；

D.作为制备创伤性皮肤缺损的药物的应用；

E.作为制备糖尿病性皮肤溃疡的药物的应用；

F.作为制备抑制增生性皮肤瘢痕的药物的应用。

10.如权利要求1或4所述应用，其特征在于，制剂选择以下形式中的任一种：

A、悬浮剂：将所述人多能干细胞外泌体或负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体溶于溶剂中，以悬浮剂的形式存在；

B、缓释外泌体的复合物：由所述人多能干细胞外泌体或负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体形成缓释外泌体的复合物；

C、以人多能干细胞外泌体作为添加剂：以所述人多能干细胞外泌体或负载白藜芦醇的人多能干细胞外泌体作为功效成分的添加剂。