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CN113577272B - 一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法及其制剂 - Google Patents

一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法及其制剂 Download PDF

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CN113577272B CN202110861801.7A CN202110861801A CN113577272B CN 113577272 B CN113577272 B CN 113577272B CN 202110861801 A CN202110861801 A CN 202110861801A CN 113577272 B CN113577272 B CN 113577272B
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Abstract

本发明公开了一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法及其制剂，该制剂的制备包括以：过氧化氢酶‑光敏剂胶束的制备，载过氧化氢酶‑光敏剂胶束的ROS响应脂质体的制备，外泌体的提取及分离纯化，将脂质体与外泌体混合，挤出法介导脂质体与外泌体间的膜融合，将膜融合载体与凝胶混合，搅拌均匀制得。本发明制备的制剂将光动力治疗与生物治疗联用，利用膜融合载体包裹过氧化氢酶‑光敏剂胶束，于创面消除堆积的过氧化氢并补氧，光敏剂产生可控的单线态氧抗炎杀菌，为外泌体治疗创面创造有利条件，同时凝胶本身对于伤口创面愈合也提供了有利的湿润环境，安全性高，稳定性好，敷用方便，加工工艺简单，成本低，有着良好的应用前景。

Description

一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法及其 制剂
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)的制备方法及其制剂。
背景技术
创面愈合依赖于许多生理过程，包括细胞迁移(炎症细胞向损伤部位转移)、细胞增殖(血管母细胞和成纤维细胞)、细胞凋亡以及通过合成细胞外基质(ECM)蛋白重建真皮层，当炎症细胞因过度反应而产生过量活性氧(ROS)如超氧阴离子、H2O2时、单线态氧等引起组织坏死、血管功能障碍等使创面难以愈合，长期不愈合的创面又会引起其他感染，进入恶性循环。一个良好的创面愈合过程需要抑制或杀死引起严重感染的病原菌，减少活性氧的产生，以为后续血管及组织新生等关键阶段创造有利环境。
脐带间充质干细胞来源的外泌体近年成为创面愈合中的研究热点，其表面表达的CD73、CD90、CD105等细胞因子，既可以通过定位损伤和炎症部位，也可以通过释放旁分泌因子如组织修复因子、血管生成素、免疫调节因子等促进创面愈合，参与创面愈合过程中的炎症调节、血管新生、上皮胶原沉积等一系列重要过程，且无免疫原性，但由于其易受创面部位缺氧环境的影响而难以发挥最佳生物活性，同时其产量低、载药量差也进一步限制了其应用。因此，有必要发明一种新型载体，在保留外泌体生物活性的同时，提高其载药效果，同时与其他成分协同起效，有效促进创面愈合。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题及创面的治疗需求，本发明提供一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)的制备方法，本发明制备的制剂是一种载有过氧化氢酶-光敏剂胶束的ROS响应型脂质体-外泌体膜融合制剂。本发明利用创面部位ROS堆积的特点，制备ROS响应的脂质体-外泌体膜融合制剂，其中过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)释放后，CAT于原位清除创面部位因炎症反应产生的过量H2O2，并产生O2，同时Ce6在激光与O2作用下产生可控的、适量的单线态氧，抗炎同时有效杀灭创面微生物，为后续外泌体发挥强大的免疫调节、促进组织及血管新生创造有利环境。
本发明还提供所述协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂。
技术方案：为了实现上述方案，本发明提供所述一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：将光敏剂Ce6溶解于溶剂中，加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为催化剂，室温下避光搅拌，得到活化的Ce6，加入过氧化氢酶进行酯化反应，得到过氧化氢酶-光敏剂(CAT-Ce6)单体，透析法制备得到CAT-Ce6-m；
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束的ROS响应型脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：称取磷脂，胆固醇在有机溶剂中超声溶解，减压成膜，除去有机溶剂，加入过氧化氢酶-光敏剂胶束水合，得到CAT-Ce6-m@lip；
(3)干细胞外泌体(exo)的提取及分离纯化：培养间充质干细胞，超速离心法提取外泌体；
(4)将步骤(2)中的脂质体与步骤(3)中的外泌体混合，利用挤出器挤出，得脂质体-外泌体膜融合载体(CAT-Ce6-m@lip-exo)；
(5)将步骤(4)的膜融合载体与凝胶混合，搅拌均匀，即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
其中，步骤(1)中进行酯化反应，室温下搅拌过夜。
其中，步骤(2)所述磷脂为不饱和磷脂具有ROS响应的不饱和磷脂，所述有机溶剂为低链醇。
作为优选，所述磷脂为大豆卵磷脂，所述有机溶剂为无水乙醇。
其中，步骤(2)所述磷脂与胆固醇的质量比8:1-3:1。
其中，步骤(2)中所述减压成膜中的成膜及水合温度优选为25℃，水合时间优选为30min，探头超声条件优选为100W功率下10min。本发明中制备的脂质体由磷脂和胆固醇组成，具有与皮肤相似的脂双层结构，对脂溶性及水溶性药物均具有良好的包载效果，在皮肤中可以发挥药物储库作用，将其应用于创面愈合，具有缓释、高效、安全等优点。
其中，步骤(3)所述间充质干细胞复苏后于Xeno-Free间充质干细胞培养基中培养，传至第三代后，收集细胞培养基上清，使用超高速离心仪离心，提取分离外泌体。
作为优选，所述干细胞为人脐带间充质干细胞，所述培养条件为37℃、5％CO2培养箱中培养，超速离心条件优选为4℃、130000g下离心70min。
其中，步骤(4)所述脂质体与外泌体的质量比为5:1-1:5。
其中，步骤(4)所述挤出过程为：分别通过孔径直径为5μm、1μm、500nm、200nm的聚碳酸酯膜挤出，每种孔径反复挤出10-15次。
其中，步骤(5)所述凝胶采用的凝胶基质为卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941中的一种或几种，所述凝胶基质浓度为1％-5％。
其中，步骤(5)所述膜融合载体与凝胶的质量比为3:1-1:3。
作为优选，步骤(5)所述凝胶为空白凝胶，其制备为称取凝胶基质，均匀分散于纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH，得到凝胶。
本发明所述的一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法所制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂。
本发明所述的一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法所制备的一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂在制备促进创面愈合药物中的应用。
本发明的设计原理为：利用光动力疗法与生物疗法协同起效应用于创面愈合。过氧化氢酶(Catalase,CAT)是生物防御体系的关键酶之一，其主要作用是催化H2O2分解为H2O与O2，O2的补充对创面愈合有很大益处，一方面，O2是创面愈合恢复大/微循环过程中最主要、最直接的需求之一，另一方面，充足的O2对于新血管与结缔组织的重建和构建感染防御能力具有重要意义，O2的补充也可以使创面局部保持干燥，从而使机体免于过量H2O2的损害。二氢卟吩(Ce6)是一种典型的光敏剂，具有热响应温度适宜、单线态氧产生效率高等优点。利用Ce6疏水性及结构中含有的羧基，将其与含有羟基的CAT通过酯键连接形成两亲性分子，进一步在水溶液中自组装形成胶束，发挥协同作用以增强疗效。本发明中的脂质体为ROS响应型脂质体，其特点为脂质体中的不饱和磷脂可在活性氧的作用下快速氧化，引起药物的释放，具有灵敏度高、响应性好等优势。
本发明中制备的脂质体与皮肤脂质成分接近，局部应用于皮肤后可以发挥药物储库作用，载药效果好，但空白脂质体不具备任何治疗效果；外泌体对于创面愈合具有积极作用，但存在载药量低、稳定性差等缺陷，因此，本发明通过将脐带间充质干细胞来源的外泌体与特定制备的脂质体进行膜融合，所构建的膜融合载体在保持了外泌体原有生物特性的同时显著提高载药量，并将过氧化氢酶与光敏剂形成的胶束包裹于具有ROS响应的脂质体-外泌体膜融合载体，应用于创面后，利用载体的ROS响应特性引起包载的CAT-Ce6-m释放，CAT首先于清除创面堆积的过量H2O2并释放O2，Ce6在O2与激光作用下产生可控的单线态氧，发挥抗炎杀菌作用，避免创面炎性环境及微生物的存在破坏外泌体的稳定性及生物活性，为后续外泌体的生物治疗创造有利环境。同时凝胶本身的湿润环境对于创面愈合也极为有益。本发明制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂安全性高，稳定性好，敷用方便，加工工艺简单，成本低，有良好的应用前景。
有益结果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
(1)该制剂光动力、生物疗法协同起效、级联靶向：先利用光动力疗法清除创面堆积的过量活性氧及微生物等细菌感染，为后续外泌体的免疫调节、促进血管及组织新生创造有利环境；局部应用光动力疗法可最大限度的发挥其治疗优势，避免全身激光照射的风险；
(2)亲脂性的光敏剂(Ce6)与亲水性的过氧化氢酶(CAT)通过酯化反应生成两亲性分子并自组装形成纳米胶束，有效改善Ce6的溶解性及CAT的稳定性，同时保留过氧化氢酶的酶活性及Ce6的光敏响应；
(3)将过氧化氢酶-光敏剂胶束包裹于脂质体-外泌体膜融合载体，可避免胶束在生理环境下发生自我聚集，以增加胶束在创面部位的稳定性；
(4)脂质体适用于多种难溶性药物的包封，应用于皮肤可以发挥药物储库作用，但空白载体不具备治疗效果，外泌体对于创面愈合具有积极作用，但载药量低、稳定性差，膜融合技术将外泌体与脂质体膜进行融合后可以显著改善外泌体的载药量及稳定性，在保留两种载体原有优点的同时规避缺陷；
(5)采用来源天然、生物相容性高的不饱和磷脂制备ROS响应的脂质体，应用于创面安全性高，ROS响应释药，灵敏可控；
(6)采用凝胶作为敷料基质，为创面愈合提供湿润环境的同时与创面紧密贴合，且易清洗，使用方便，安全稳定。
附图说明
图1为透射电镜对胶束、脂质体、外泌体和脂质体-外泌体膜融合载体的结构表征示意图，其中a.胶束(CAT-Ce6-m)；b.脂质体；c.外泌体；d.脂质体-外泌体膜融合载体。
图2为马尔文粒度仪对脂质体、外泌体和脂质体-外泌体膜融合载体溶液的粒径分布测定，其中a.脂质体；b.外泌体；c.脂质体-外泌体膜融合载体。
图3为倒置荧光显微镜对脂质体-外泌体膜融合载体中脂质体与外泌体膜融合的验证，其中a.脂质体；b.外泌体；c.脂质体-外泌体膜融合载体。
图4为对过氧化氢酶-光敏剂胶束催化产生溶解氧能力的表征。
图5为对过氧化氢酶光敏剂胶束细胞内产生ROS能力的表征。
图6为协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂对动物皮肤刺激性的影响。
图7为协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂对动物创面愈合的影响，其中，模型组不做治疗处理，实验组1敷用0.2g实施例1制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂，实验组2敷用0.2g实施例1制备的胶束与外泌体物理混合物凝胶，实验组3敷用0.2g实施例1制备的过氧化氢酶光敏剂胶束凝胶，阳性对照组涂抹0.2g红霉素软膏。
具体实施方式
为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步说明本发明，并不以任何方式限制本发明，这些实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所做的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂家建议的条件。
其中，过氧化氢酶(5000U/g)，Ce6均购自上海源叶生物科技有限公司；人脐带间充质干细胞购自上海ATCC细胞库；大豆卵磷脂、胆固醇购自上海艾伟特医药科技有限公司。
实施例1
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：称取Ce6(60mg)溶解于10mLDMSO，加入EDCI(100mg)和NHS(150mg)，室温下避光搅拌6h，加入过氧化氢酶CAT(20mg)，室温下避光搅拌24h，将反应液用截留量为3.5kD的透析袋室温下透析24h，得到胶束溶液，将透析后的胶束溶液置于真空冷冻干燥机中冻干，即得到CAT-Ce6-m粉末。
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：取大豆卵磷脂(223mg)和胆固醇(28mg)，溶于5mL无水乙醇，25℃下减压成膜15min，氮气干燥除去有机溶剂，加入含有过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)2mg/mL的PBS溶液(pH 7.4)5mL，25℃水合30min，于100W功率下探头超声10min，4℃保存备用；
(3)间充质干细胞外泌体的提取分离：人脐带间充质干细胞，于Xeno-Free培养基，37℃，5％CO2中培养，传至第三代，细胞贴壁生长至培养皿90％时(约1×107个)，收集细胞培养基，在4℃、130000g条件下超高速离心70min，吸取上清弃去，用500μLPBS(pH 7.4)重悬得外泌体溶液；
(4)将步骤(2)中所得脂质体溶液与步骤(3)中所得外泌体溶液按1:1质量比混合均匀，用挤出器依次通过5μm、1μm、500nm和200nm聚碳酸酯膜，每种反复挤出10次再换下一种滤膜，得脂质体-外泌体膜融合载体溶液；
(5)称取卡波姆934粉末(1g)，均匀分散于100g纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH至6，得空白凝胶；
(6)将步骤(4)中的脂质体-外泌体膜融合载体与步骤(5)中的凝胶按1：1质量比混合，搅拌均匀即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
利用透射电镜(TEM)、对过氧化氢酶光敏剂胶束、脂质体、外泌体及脂质体-外泌体膜融合载体的形态表征如图1所示；利用马尔文粒度仪对脂质体、外泌体和脂质体-外泌体膜融合载体溶液的粒径分布测定如图2所示；利用倒置荧光显微镜对脂质体-外泌体膜融合载体中脂质体与外泌体膜融合的验证，如图3所示。图1及图2证明所制备的胶束、脂质体、外泌体及膜融合载体均具有纳米结构，图3说明脂质体与外泌体膜融合的成功。
实施例2
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：同实施例1；
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：取大豆卵磷脂(200mg)和胆固醇(50mg)，溶于5mL无水乙醇，25℃下减压成膜15min，氮气干燥除去有机溶剂。加入含有过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)2mg/mL的PBS溶液(pH 7.4)5mL，25℃水合30min，于100W功率下探头超声10min，4℃保存备用；
(3)间充质干细胞外泌体的提取分离，同实施例1；
(4)将步骤(2)中所得脂质体溶液与步骤(3)中所得外泌体溶液按2:1质量比混合均匀，用挤出器依次通过5μm、1μm、500nm和200nm聚碳酸酯膜，反复挤出10次再换下一种滤膜，得脂质体-外泌体膜融合载体溶液；
(5)称取卡波姆934粉末(2g)，均匀分散于100g纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH至6，得空白凝胶；
(6)将步骤(4)中的脂质体-外泌体膜融合载体与步骤(5)中的凝胶按1:2质量比混合，搅拌均匀即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
实施例3
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：同实施例1；
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：取大豆卵磷脂(160mg)和胆固醇(40mg)，溶于5mL无水乙醇，25℃下减压成膜15min，氮气干燥除去有机溶剂。加入含有过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)2mg/mL的PBS溶液(pH 7.4)5mL，25℃水合30min，于100W功率下探头超声10min，4℃保存备用；
(3)间充质干细胞外泌体的提取分离，同实施例1；
(4)将步骤(2)中所得脂质体溶液与步骤(3)中所得外泌体溶液按1:5质量比混合均匀，用挤出器依次通过5μm、1μm、500nm和200nm聚碳酸酯膜，反复挤出10次再换下一种滤膜，得脂质体-外泌体膜融合载体溶液；
(5)称取卡波姆940粉末(1g)，均匀分散于100g纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH至6，得空白凝胶；
(6)将步骤(4)中的脂质体-外泌体膜融合载体与步骤(5)中的凝胶按1:3质量比混合，搅拌均匀即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
实施例4
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：同实施例1；
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：取大豆卵磷脂(186mg)和胆固醇(62mg)，溶于5mL无水乙醇，25℃下减压成膜15min，氮气干燥除去有机溶剂。加入含有过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)2mg/mL的PBS溶液(pH 7.4)5mL，25℃水合30min，于100W功率下探头超声10min，4℃保存备用；
(3)间充质干细胞外泌体的提取分离，同实施例1；
(4)将步骤(2)中所得脂质体溶液与步骤(3)中所得外泌体溶液按1:2质量比混合均匀再换下一种滤膜，用挤出器依次通过5μm、1μm、500nm和200nm聚碳酸酯膜，反复挤出10次，得脂质体-外泌体膜融合载体溶液；
(5)称取卡波姆940粉末(2g)，均匀分散于100g纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH至6，得空白凝胶；
(6)将步骤(4)中的脂质体-外泌体膜融合载体与步骤(5)中的凝胶按2:1质量比混合，搅拌均匀即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
实施例5
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：同实施例1；
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：取大豆卵磷脂(44mg)和胆固醇(6mg)，溶于5mL无水乙醇，25℃下减压成膜15min，氮气干燥除去有机溶剂。加入含有过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)2mg/mL的PBS溶液(pH 7.4)5mL，25℃水合30min，于100W功率下探头超声10min，4℃保存备用；
(3)间充质干细胞外泌体的提取分离：同实施例1；
(4)将步骤(2)中所得脂质体溶液与步骤(3)中所得外泌体溶液按1:3质量比混合均匀再换下一种滤膜，用挤出器依次通过5μm、1μm、500nm和200nm聚碳酸酯膜，反复挤出10次，得脂质体-外泌体膜融合载体溶液；
(5)称取卡波姆941粉末(5g)，均匀分散于100g纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH至6，得空白凝胶；
(6)将步骤(4)中的脂质体-外泌体膜融合载体与步骤(5)中的凝胶按3:1质量比混合，搅拌均匀即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
实施例6
(1)过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)的制备：同实施例1；
(2)载过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体(CAT-Ce6-m@lip)的制备：取大豆卵磷脂(128mg)和胆固醇(21mg)，溶于5mL无水乙醇，25℃下减压成膜15min，氮气干燥除去有机溶剂。加入含有过氧化氢酶-光敏剂胶束(CAT-Ce6-m)2mg/mL的PBS溶液(pH 7.4)5mL，25℃水合30min，于100W功率下探头超声10min，4℃保存备用；
(3)间充质干细胞外泌体的提取分离，同实施例1；
(4)将步骤(2)中所得脂质体溶液与步骤(3)中所得外泌体溶液按5:1质量比混合均匀再换下一种滤膜，用挤出器依次通过5μm、1μm、500nm和200nm聚碳酸酯膜，反复挤出10次，得脂质体-外泌体膜融合载体溶液；
(5)称取卡波姆941粉末(2.5g)，均匀分散于100g纯化水溶液表面，室温下溶胀过夜，搅拌均匀，三乙醇胺调节pH至6，得空白凝胶；
(6)将步骤(4)中的脂质体-外泌体膜融合载体与步骤(5)中的凝胶按1：2质量比混合，搅拌均匀即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)。
试验例1
过氧化氢酶光敏剂胶束产生溶解氧能力表征。
实验材料：30％H2O2(购于南京慧杰诚生物科技有限公司)。
30％H2O2溶液用PBS(pH7.4)稀释为10％H2O2，取10mL加入50mL离心管中，通入氮气以除去溶液中原有的溶解氧，分别加入10mL本发明实施例1制备的CAT-Ce6胶束(CAT-Ce6-m)的PBS溶液(其中CAT浓度为0.1mg/mL)、载有CAT-Ce6胶束的脂质体-外泌体膜融合载体PBS溶液(其中CAT浓度为0.1mg/mL)、CAT的PBS溶液(其中CAT浓度为0.1mg/mL)、Ce6的PBS溶液(其中Ce6浓度为0.1mg/mL)，以PBS(pH7.4)为空白对照组，各组溶液表面添加10mL植物油以隔绝空气中的氧气，利用溶解氧探针检测不同时间点氧含量变化(图4)。
如图4所示，过氧化氢酶与光敏剂形成胶束或者制成膜融合载体后，其催化H2O2产生溶解氧的能力与形成胶束前过氧化氢酶的催化能力基本一致，表明形成胶束或制成膜融合载体后并不会影响酶的结构及活性，过氧化氢酶及光敏剂由形成纳米载体，在保留原有活性的同时，其稳定性也得到改善。
试验例2
过氧化氢酶光敏剂胶束体内产生ROS能力表征。
实验材料：DCFH-DA探针(购于sigma公司)，小鼠成纤维细胞(购于上海ATCC细胞库)。
采用DCFH-DA探针进行胞内ROS生成评估。将小鼠成纤维细胞以1×105个/孔细胞密度种于6孔板中，贴壁生长至90％时，分别加入本发明实施例1制备的CAT-Ce6胶束(CAT-Ce6-m)溶液、载有CAT-Ce6胶束的脂质体-外泌体膜融合载体(CAT-Ce6-m@lip-exo)及Ce6溶液，溶剂均为不含血清的DMEM培养基，加入后使各组中Ce6的终浓度控制在8nM，以空白溶剂作为对照，于37℃，5％CO2孵箱中培养4h后，PBS洗涤细胞两次，于660nm进行激光辐照，辐照时间10min，辐照强度为5mW/cm2，加入DCFH-DA探针(终浓度25μM)继续孵育2h。于倒置荧光显微镜下观察细胞内的ROS产生情况，蓝色荧光代表细胞核，红色荧光代表细胞内ROS产生。
如图5所示，将Ce6与CAT形成胶束后，在细胞内观察到的ROS产生与单独的Ce6相比明显增加，载有胶束的脂质体-外泌体膜融合载体组观察到了相似的ROS产生，是由于形成纳米载体后，细胞对含有Ce6的组分摄取显著增加，因此经激光照射后观察到的细胞内ROS产生也显著增加，意味着在后续治疗中，产生相同水平发挥抗炎杀菌作用的ROS时候，由于本发明制剂的ROS生成效率更高，所需的激光照射频率及时间也会更短，因而对皮肤产生的损伤及刺激也会更小，大大提高应用的安全性。
试验例3
协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂对动物皮肤刺激性的影响。
实验动物：ICR雄性小鼠6只(20±2g)，购自南京青龙山动物场。
选用健康且皮肤完好的雄性ICR小鼠6只，腹腔注射2％的水合氯醛麻醉，剔除其腹部被毛，去毛面积为2cm×1cm，四肢固定于鼠板。取本发明实施例1制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂0.2g，涂于去毛皮肤表面，作为给药组；以涂抹空白凝胶的小鼠作为对照组，每组3只小鼠。12h后去除覆盖，用温水清洗皮肤表面，观察涂抹部位皮肤反应，处死并取下给药部位皮肤，小心剔除脂肪组织，HE染色，光学显微镜下观察红斑及水肿情况。
与空白对照相比，试验动物皮肤表面未见任何红斑、红肿、发炎现象(图6)，表明本发明制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂对试验动物皮肤无刺激性。
试验例4
实验动物：ICR雄性小鼠30只(20±2g)，购自南京青龙山动物场；红霉素软膏，购自芜湖国药集团三益药业有限公司。
协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂与市场常用药物相比对小鼠创面愈合的影响。
采用实施例1中协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂制备方法，选用健康且皮肤完好的雄性ICR小鼠，每组3只小鼠，设置以下10组：模型组(空白凝胶，不含药物及膜融合载体)、阳性对照组(红霉素软膏)、实验组1：CAT-Ce6-m@lip-exo-gel(实施例1制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂)、实验组2：CAT-Ce6-m+exo-gel(将实验例1步骤(1)制备的胶束与步骤(3)制备的外泌体混合并搅拌均匀，胶束与外泌体的使用量与实施例1相同，再与步骤(5)的凝胶等质量混匀)、实验组3：CAT-Ce6-m-gel(实施例1步骤(1)制备的过氧化氢酶光敏剂胶束与步骤(5)的凝胶等质量混匀)、实验组4：CAT-Ce6-m@lip-gel(实施例1步骤(2)制备的过氧化氢酶-光敏剂胶束脂质体与步骤(5)的凝胶等质量混匀)、实验组5：exo-gel(实施例1步骤(3)制备的外泌体与步骤(5)的凝胶等质量混匀)、实验组6：lip-exo-gel(实施例1步骤(2)制备的不含胶束的空白脂质体与步骤(3)的外泌体制成空白脂质体-外泌体膜融合载体，再与步骤(5)的凝胶等质量混匀)、实验组7：CAT-gel(与实施例1胶束中CAT等浓度的CAT溶液与步骤(5)的凝胶等质量混匀)、实验组8：Ce6-gel(与实施例1胶束中Ce6等浓度的Ce6溶液与步骤(5)的凝胶等质量混匀)。
造模方法：取健康且皮肤完好的雄性ICR小鼠15只，腹腔注射2％水合氯醛溶液麻醉，使用脱毛膏脱去背部毛，用消毒的手术器具在脱毛处切割直径为10mm的圆形创面，随机分为5组，每组3只小鼠。其中，模型组不做治疗处理(涂抹0.2g空白凝胶)，阳性对照组涂抹0.2g红霉素软膏，其他实验组均涂抹0.2g制备的凝胶制剂，每隔2d进行光照治疗(光照强度0.5W，光照时间2min)，观察并拍照记录6d内创面愈合情况。
以实验组1-3的结果为例(图7)进行说明，相同时间内，实验组1(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)展现出最佳的创面治疗效果，创面愈合程度高，速度快，甚至明显优于阳性对照红霉素软膏，相比之下，实验组2(CAT-Ce6-m+exo-gel)将具有治疗作用的胶束与间充质干细胞外泌体的物理混合物应用于创面后的治疗效果明显不如实验组1，主要原因是由于实验组1将胶束包裹于脂质体-外泌体膜融合载体后，整体保持纳米结构的同时利于保持胶束及外泌体在创面环境中的稳定性，协同效应增强，因而治疗效果更好。CAT-Ce6-m单独应用(实验组3)时对动物皮肤创面也有一定改善，但明显不如将CAT-Ce6-m与lip-exo联用的效果好，另外，实验组4-8对动物创面愈合的改善效果均明显不如实验组1，说明本发明中各成分的联用具有一定的实际意义，且最好是将胶束包裹于脂质体-外泌体膜融合载体，即本发明的最终制剂(CAT-Ce6-m@lip-exo-gel)对创面愈合良好的促进作用。

Claims (10)

1.一种协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）过氧化氢酶-光敏剂胶束CAT-Ce6-m的制备：将光敏剂Ce6溶解于溶剂中，加入1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺进行反应，继续加入过氧化氢酶进行酯化反应，反应后进行透析得到CAT-Ce6-m；
（2）载过氧化氢酶-光敏剂胶束的ROS响应型脂质体CAT-Ce6-m@lip的制备：称取磷脂，胆固醇在有机溶剂中超声溶解，减压成膜，除去有机溶剂，加入过氧化氢酶-光敏剂胶束水合，得到CAT-Ce6-m@lip；步骤（2）所述磷脂为具有ROS响应的不饱和磷脂；
（3）干细胞外泌体exo的提取及分离纯化：培养间充质干细胞，超速离心法提取外泌体；
（4）将步骤（2）中的脂质体与步骤（3）中的外泌体混合，利用挤出器挤出，得脂质体-外泌体膜融合载体CAT-Ce6-m@lip-exo；
（5）将步骤（4）的膜融合载体与凝胶混合，搅拌均匀，即得协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂CAT-Ce6-m@lip-exo-gel。
2.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述有机溶剂为低链醇。
3.根据权利要求1或2所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述磷脂为大豆卵磷脂，所述有机溶剂为无水乙醇。
4.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述磷脂与胆固醇的质量比8:1-3:1。
5.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述减压成膜和水合的温度为25-30℃。
6.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述脂质体与外泌体的质量比为5:1-1:5。
7.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（4）所述挤出过程为：分别通过孔径直径为5 μm、1 μm、500 nm、200 nm的聚碳酸酯膜挤出，每种孔径反复挤出10-15次。
8.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述凝胶采用的凝胶基质为卡波姆934、卡波姆940、卡波姆941中的一种或几种，所述凝胶基质浓度为1%-5%。
9.根据权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法，其特征在于，步骤（5）所述膜融合载体与凝胶的质量比为3:1-1:3。
10.一种权利要求1所述的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂的制备方法所制备的协同促进创面愈合的外泌体仿生制剂。
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