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CN118284809A - 少量抗体副产物的定量 - Google Patents

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CN118284809A
CN118284809A CN202280077307.4A CN202280077307A CN118284809A CN 118284809 A CN118284809 A CN 118284809A CN 202280077307 A CN202280077307 A CN 202280077307A CN 118284809 A CN118284809 A CN 118284809A
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T·施洛特豪尔
C·斯皮克
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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本发明涉及用于使用表面等离子体共振确定样品中双特异性抗体的同二聚体亲合结合副产物的方法，所述样品包含经正确组装的异二聚体亲和结合双特异性抗体和所述双特异性抗体的错误组装的同二聚体亲合结合副产物，其中所述经正确组装的异二聚体亲和结合双特异性抗体包含一个或多个针对第一抗原的结合位点和一个或多个针对第二抗原的结合位点，其中所述双特异性抗体的所述错误组装的同二聚体亲合结合副产物包含两个或更多个但至少多于经正确组装的双特异性抗体的与第一抗原的结合位点，其中所述经正确组装的双特异性抗体为异二聚体并且错误组装的双特异性抗体为同二聚体，其中如果在SPR分析的溶解相中可以确定残余结合，即增加的SPR信号，则确定存在所述同二聚体亲合结合副产物。

Description

少量抗体副产物的定量
本发明属于分析方法领域。本发明涉及用于确定和定量由抗体链的错误配对，特别是引起副产物(例如，异源多特异性抗体的副产物)不希望的亲合结合特性增加而产生的抗体相关副产物的方法。与经正确组装的多特异性抗体相比，此类副产物具有增加的生物活性且可能引起不希望的副作用。
背景技术
表面等离子体共振(SPR)是一种用于检测分子相互作用的光学技术。移动分子(分析物)与固定在金属薄膜(配体)上的分子的结合会改变薄膜的折射率。偏振光照射到膜后反射的光的消光角会发生改变，作为探测器位置的变化来监测反射强度的下降(表面等离子体共振现象)。由于该方法严格检测质量，因此无需标记相互作用的组分，从而消除了其分子性质可能发生的变化(Drescher,D.G.等人，Meth.Mol.Biol.493(2009)323-343)。
SPR结合分析方法用于研究分子相互作用。一种相互作用的配偶体通过化学反应(例如，胺偶联反应)直接固定，或通过在传感器芯片上形成结合对(例如，生物素-链霉亲和素)间接进行。然后，将芯片插入SPR仪器的流动腔室中，例如从BIAcore(BIAcore，乌普萨拉，瑞典)可获得的。将第二相互作用的配偶体(流通分析物)添加到腔室中，导致其与经固定的第一相互作用配偶体结合，在金表面处产生折射率的微小变化。这种变化可以高精度地定量。结合亲和力可以由速率常数的比率获得，产生蛋白质-蛋白质相互作用的直接表征(Drescher，D.G.等人，Meth.Mol.Biol.493(2009)323-343)。
不幸的是，SPR检测的普遍性也构成了基本的限制：由于每个结合事件都会引起相似的折射率信号，因此不可能区分导致相似质量变化的不同结合事件。对传统SPR信息内容快速增长兴趣的领域可能限定在双特异性结合剂(例如，双特异性抗体)的研究中。在此，需要专门的测定形式，并且必须按顺序而不是并行地研究两种物种的结合。相关的案例是基于竞争的测定，其中分析物分子在相同或相似的结合位点处结合表面物种。原则上，可以使用SPR通过计算残余结合来进行竞争测定。然而，这对于小分子竞争者来说是非常重要的，因为样品中有机溶剂载体(即DMSO)的微小浓度差异可能会对可实现的信噪比产生很大的负面影响，并干扰准确确定残余结合信号的能力(Eng，L.等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.497(2018)133-138)。
Eng等人(上文)报道了一种标记增强SPR(LE-SPR)技术，通过使用标准的商业单波长SPR仪器对两种不同的同时结合的物种进行定性区分和定量监测来增加SPR的信息内容。LE-SPR是基于用专门染料标记对结合分子进行标记，并在结合反应期间与整个SPR下降的读数和基于软件的形状分析相结合。他们展示了双物种检测的三个示例：i)在经混合的本体溶液样品中两种不同物种的准确定量测定；ii)将两种不同的同时结合物种的常规传感图定性解构为两种物种的单独结合曲线，然后如实地重建原始传感图；iii)同时测定混合物中两种不同物种与表面上的蛋白质结合的结合解离常数。
T细胞依赖性双特异性抗体(TDB或TCB)是有前途的癌症免疫疗法，它可以募集患者的T细胞来杀死癌细胞。临床试验中的TBD数量不断增加，证明了其广泛认可的治疗潜力。由于TDB经由抗CD3(aCD3)臂参与并激活T细胞，aCD3同二聚体(aCD3 HD)和高分子量物种(HMWS)是产品相关的杂质，它会通过T细胞受体(TCR)的二价衔接和二聚化来触发脱靶T细胞激活而引起潜在的安全风险。这种脱靶(也称为非靶细胞依赖性)T细胞激活能够诱导细胞因子分泌，引发患者不希望的免疫反应。aCD3 HD的脱靶T细胞激活是一种不希望的活性，与终杀死靶肿瘤细胞的TDB的T细胞激活不同。因此，控制TDB药品中aCD3 HD的水平非常重要，并且需要灵敏的测定来实现其定量(Lee,H.Y.等人，Nature Sci.Rep.9(2019)3900)。
为了监测和控制非特异性T细胞激活的水平，Lee等人(上文)报道了一种灵敏且定量的基于细胞的T细胞激活测定，该测定能够通过利用其在缺乏靶细胞的情况下激活T细胞的能力来检测TDB药品中的aCD3 HD。
WO 2020/200941中报道了包含第一蛋白质性部分和第二蛋白质性部分的异二聚体融合多肽，其中该第一蛋白质性部分和该第二蛋白质性部分是双特异性抗体的第一抗原和第二抗原，该双特异性抗体包含与该第一蛋白质性部分特异性结合的第一结合位点和与该第二蛋白质性部分特异性结合的第二结合位点，其中该第一蛋白质性部分融合到IgG1亚型的第一抗体重链Fc区多肽的N末端，其中该第二蛋白质性部分融合到IgG1亚型的第二抗体重链Fc区多肽的N末端，其中该第一重链Fc区多肽和该第二重链Fc区多肽形成二硫键连接的异二聚体，其中该重链Fc区多肽中的一者或两者在其C末端包含用于固定到固相的标签，并且其中该第一Fc区多肽和该第二Fc区多肽分别包含突变T366W和T366S/L368A/Y407V；以及该融合多肽用于在表面等离子体共振方法中确定双特异性抗体对第一抗原和第二抗原的基于亲合力的结合强度的用途，该双特异性抗体包含与该第一抗原特异性结合的第一结合位点和与该第二抗原特异性结合的第二结合位点。
Amaral,M.等人报道了多特异性抗体形式的工程化技术和生物分析(J.Appl.Bioanal.2020(6)26-51)。
US2017/003295报道了基于SPR的桥接测定形式，其用于确定多价、多特异性分子的生物活性。
WO 2014/177460报道了人FcRn结合修饰的抗体及其使用方法。
JP 2020/202848报道了经修饰的抗原结合多肽构建体及其用途。
发明内容
本文报道了一种用于确定或/和定量治疗性抗体相关副产物的方法，该方法基于表观结合亲和力的差异、即基于经正确组装的治疗性抗体与治疗性抗体相关副产品之间的结合亲合力的增加。
不受此理论的束缚，假设与经正确组装的抗体相比，具有增加的结合效价的任何抗体相关副产物都可以使用本文报道的方法来确定和/或定量。同样地，可以使用适合于确定表观结合亲和力差异的任何方法，例如ELISA和SPR。
具有增加的表观结合亲合力的抗体相关副产物与经正确组装的抗体相比包含更多的与相应靶标(即抗原)的结合位点，例如两个结合位点而不是一个，四个结合位点而不是两个等。
本文描述的测定原理可以应用于使用不同检测方法的不同生物测定，例如ELISA(酶联免疫吸附测定)、SPR(表面等离子体共振)或BLI(生物层干涉测量法)。
例如，可以在ELISA中对抗体与一个或多个价数增加的抗体相关副产物之间的结合亲合力增加所导致的表观亲和力差异进行定量。其中，通过应用适当的清洗条件，将抗体-配体相互作用在让副产物-配体复合物保持完整的情况下溶解。然后，所得到的信号将与样品中一种或多种多价副产物的含量成正比。该量可以通过利用校准曲线来定量。
同样地，SPR可以用于利用副产物特定的相互作用特性，从而产生不同的溶解动力学，导致残余结合信号的时间依赖性差异。
更详细地，一方面，本发明涉及基于SPR的测定，其允许确定先前低于已建立的定量方法的检测限的(双特异性)抗体相关副产物的量。
根据本发明的方法特别适合于确定或/和定量与靶标具有增加的结合价的一种或多种抗体相关副产物。
对于双特异性抗体的形成，促进异二聚体形成的不同方法是已知的。一种是杵臼设计(参见，例如，WO 96/027011,Ridgway,J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant，A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO 98/050431)。在双特异性抗体的开发期间，通常将产生不良事件的可能性较高的结合物以杵臼抗体形式与杵链连接。与臼-臼同二聚体的形成相比，杵-杵同二聚体的形成在空间上是不利的。这导致在抗体生产期间作为一种或多种抗体相关副产物的错误配对的杵-杵分子的量非常低，因为这种抗体组合物是不利的。
尽管这些杵-杵副产物仅占抗体产品的很小一部分，但仍需要对其进行集中监测，因为它们能够引起不良副作用(例如，毒理学)，或降低药物的效率(例如，无法执行预期的生物作用)。这些不希望的事件是由于亲合力(亲合结合)导致药物-靶标复合物稳定性增强而引起的。
本发明至少部分地基于以下发现：可以在SPR测定中利用这种亲合力的增加来检测副产物浓度，该副产物浓度低于先前通过已建立的方法(例如SEC或MS)可检测到的浓度。所建立的方法使用相对于经分离的药物的残余结合，而根据本发明的方法使用由于亲合力而引起的富集，这在其他定量方法中没有使用。
在根据本发明的SPR方法中，抗体靶标(即，抗原)被固定在SPR传感器芯片上。此后，注射含抗体和待检测的抗体相关副产物的样品。这导致传感器表面上形成抗体-靶标复合物。之后，将不含抗体且不含抗体相关副产物的缓冲液注入系统中，以便抗体-靶标复合物解离。由此产生解离谱，其中与经正确组装的抗体的解离相比、抗体相关副产物的解离更慢。与没有抗体相关的亲合结合副产物的抗体样品相比，这种较慢的解离导致在规定的解离时间后增加的SPR结合信号。该信号增加是由于一种或多种抗体相关的同二聚体副产物的亲合力而导致的残余结合。因此，可以定量样品中存在的一种或多种抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的量，并由此最终一种或多种抗体相关的亲合结合同二聚体副产物的浓度具有非常低的检测限。
本发明至少部分基于这样的发现：抗体靶标(＝抗原)必须以最小密度或在密度范围内固定，这取决于待检测的多特异性(例如双特异性)抗体的形式。在某些实施方案中，抗体靶标必须以至少1000RU固定。在一个优选的实施方案中，靶标以至少2000RU固定。在某些实施方案中，靶标以至少4000RU固定。在某些实施方案中，靶标以至少2000-4000RU固定。
本发明至少部分基于以下发现：通过延长抗体注射时间可以降低该方法的检测限，因为在缔合时间内能够亲合结合的抗体相关副产物将积聚在芯片表面上。在某些实施方案中，缔合时间是至少240秒。在某些实施方案中，缔合时间是至少300秒。在一个优选实施方案中，注射时间为至少360秒。在某些实施方案中，缔合时间是至少420秒。
本发明至少部分基于以下发现：SPR芯片上抗体复合物稳定性与抗体相关副产物复合物稳定性之间的差异可以用于定量抗体相关副产物。在一种优选的实施方案中，确定残余结合时的解离时间为至少1200秒。在某些实施方案中，确定残余结合时的解离时间为至少1800秒。
残余结合取决于样品中抗体相关亲合结合副产物的量或分数以及抗体相关副产物与靶标的复合物稳定性，即，与经正确组装的抗体相比，复合物稳定性的差异。
因此，在残余结合较小的情况下，可以调整测定条件以增加残余结合。这可以在本发明的知识中通过本领域技术人员基于一般知识已知的不同措施来完成，例如，关于经分离的抗体和待检测的抗体相关副产物的热力学和动力学特性。下表列出了示例性措施。
根据本发明的一个方面是用于确定样品中抗体的错误组装副产物的方法，该样品包含经正确组装的抗体和该抗体的错误组装副产物，
其中经正确组装的抗体和错误组装的抗体副产物与(第一)靶标结合，其中抗体的错误组装副产物与经正确组装的抗体相比包含更多的与靶标的结合位点，
该方法包括以下步骤：
i)将靶标以高密度、优选以至少1000RU、更优选以至少1500RU、最优选以至少2000RU固定在SPR芯片的表面上，
ii)将包含经正确组装的抗体(作为与靶标结合的唯一物种)的缓冲溶液施加至在步骤i)中获得的表面以产生上样表面，优选持续至少5min、更优选持续至少7min、最优选持续至少10min，流量优选为30μL/min或更小/在50μL/min至5μL/min的范围内、更优选为25μL/min或更小/在40μL/min至7.5μL/min的范围内、最优选20μL/min或更小/在30μL/min至10μL/min的范围内，
iii)将不包含与靶标结合的化合物(即，不包含经正确组装的抗体或错误组装的抗体副产物)的(缓冲的)溶液施加至在步骤ii)中获得的上样表面，优选持续至少7.5min、更优选持续至少15min、最优选持续至少20min，并且记录SPR信号的衰减，
iv)任选地再生SPR表面，
v)将怀疑包含抗体的错误组装副产物的(缓冲的)样品溶液施加至与在步骤i)类似地获得的SPR表面或施加至步骤iv)的再生SPR表面、以产生上样表面，优选持续至少5min、更优选持续至少7min、最优选持续至少10min，流量优选为30μL/min或更小/在50μL/min至5μL/min的范围内、更优选25μL/min或更小/在40μL/min至7.5μL/min的范围内、最优选20μL/min或更小/在30μL/min至10μL/min的范围内，
vi)将不包含与靶标结合的化合物的(缓冲的)溶液施加至在步骤v)中获得的上样表面，优选持续至少7.5min、更优选持续至少15min、最优选持续至少20min，并记录SPR信号的衰减，
vii)如果在开始施用不包含与靶标结合的化合物的(缓冲的)溶液之后、优选在开始施用不包含与靶标结合的化合物的(缓冲的)溶液之后至少7.5min、更优选在开始后至少15min、最优选在开始之后20min在步骤vi)中确定的SPR信号高于/保持在步骤iii)中确定的SPR信号，则确定抗体的错误组装副产物。
根据本发明的一个方面是用于使用表面等离子体共振确定样品中的双特异性抗体的错误组装副产物的方法，该样品包含正确组装的双特异性抗体和双特异性抗体的错误组装副产物，
其中，经正确组装的双特异性抗体恰好包含一个针对第一抗原的结合位点以及一个或多个针对第二抗原的结合位点，即，双特异性抗体具有一个与第一抗原(特异性地)结合的结合位点和一个或多个与第二抗原(特异性地)结合的结合位点，
其中，双特异性抗体的错误组装副产物包含两个或更多个与第一抗原的结合位点和零至两个针对第二抗原的结合位点，
其中，相对于Fc区，经正确组装的双特异性抗体为异二聚体，并且错误组装的双特异性抗体为同二聚体，优选异二聚体通过杵臼法形成，
该方法包括以下步骤：
i)将第一抗原以高密度、优选以至少1000RU、更优选以至少1500RU、最优选以至少2000RU固定在SPR芯片的至少一个流动池的表面上，
ii)将包含经分离的双特异性抗体作为与抗原结合的唯一物种的缓冲溶液(或包含经正确组装的双特异性抗体和上限量的双特异性抗体的错误组装副产物的参考标准)施加至在步骤i)中获得的至少一个流动池，优选地持续至少5min、更优选地持续至少7min、最优选地持续至少10min，流量优选为30μL/min或更小/在50μL/min至5μL/min的范围、更优选25μL/min或更小/在40μL/min至7.5μL/min的范围内、最优选20μL/min或更小/在30μL/min至10μL/min的范围内，
iii)将不包含与抗原结合的化合物(即，不包含双特异性抗体或双特异性抗体的错误组装副产物)的缓冲溶液施加至在步骤ii)中获得的至少一个流动池，优选地持续至少7.5min、更优选持续至少15min、最优选持续至少20min，并记录SPR信号的衰减，并且任选地此后再生该至少一个流动池，
iv)将怀疑包含双特异性抗体的错误组装副产物(或双特异性抗体的错误组装副产物的量高于上限量)的缓冲样品溶液施加至与在步骤i)中获得的、或在步骤iii)中获得的经再生的流动池类似地获得的至少一个流动池，优选持续至少5min、更优选持续至少7min、最优选持续至少10min，流量优选为30μL/min或更小/在50μL/min至5μL/min的范围内、更优选25μL/min或更小/在40μL/min至7.5μL/min的范围内、最优选20μL/min或更小/在30μL/min至10μL/min的范围内，
v)将不包含与抗原结合的化合物(即，不包含双特异性抗体或双特异性抗体的错误组装副产物)的缓冲溶液施加至在步骤iv)中获得的至少一个流动池，优选地持续至少7.5min、更优选持续至少15min、最优选持续至少20min，并记录SPR信号的衰减，
vi)如果在开始施用不包含与抗原结合的化合物的缓冲溶液之后(即，不包含双特异性抗体或双特异性抗体的错误组装副产物)、优选在开始施用不包含与靶标结合的化合物的(缓冲的)溶液之后至少7.5min、更优选在开始后至少15min、最优选在开始之后20min在步骤v)中确定的SPR信号高于在步骤iii)中确定的SPR信号，则确定双特异性抗体的错误组装副产物。
根据本发明的一个方面是用于使用表面等离子体共振确定样品中双特异性抗体的亲合结合副产物的方法，该样品包含经正确组装的双特异性抗体和双特异性抗体的一种或多种亲合结合副产物，
其中，经正确组装的双特异性抗体包含一个或多个针对第一抗原的结合位点以及一个或多个针对第二抗原的结合位点，
其中，双特异性抗体的亲合结合副产物包含两个或更多个与第一抗原的结合位点并且与经正确组装的双特异性抗体相比包含更多的与第一抗原的结合位点，
该方法包括以下步骤：
i)将包含经正确组装的双特异性抗体的上样溶液施加于其上已经以至少1000RU固定该第一抗原的SPR表面，以产生SPR信号，随后将不包含与第一抗原结合的化合物的溶解溶液施加于SPR芯片并记录SPR信号的衰减，
ii)将怀疑包含双特异性抗体的亲合结合副产物的样品溶液施加于其上已经以至少1000RU固定第一抗原的SPR表面，以产生SPR信号，随后将不包含与第一抗原结合的化合物的溶解溶液施加于SPR芯片并记录SPR信号的衰减，
iii)如果在步骤ii)中确定的SPR信号的衰减比在步骤i)中确定的SPR信号的衰减慢，则确定双特异性抗体的亲合结合副产物。
具体实施方式
本发明涉及用于使用表面等离子体共振确定样品中双特异性抗体的同二聚体亲合结合副产物的方法，该样品包含经正确组装的异二聚体亲和结合双特异性抗体和双特异性抗体的错误组装的同二聚体亲合结合副产物，其中经正确组装的异二聚体亲和结合双特异性抗体包含一个或多个针对第一抗原的结合位点和一个或多个针对第二抗原的结合位点，其中双特异性抗体的错误组装的同二聚体亲合结合副产物包含两个或更多个但至少多于经正确组装的双特异性抗体的与第一抗原的结合位点，其中经正确组装的双特异性抗体是异二聚体、并且错误组装的双特异性抗体是同二聚体，其中如果在SPR分析的溶解相中可以确定残余结合，即增加的SPR信号，则确定存在同二聚体亲合结合副产物。
本发明至少部分地基于这样的发现：可以在SPR测定中利用由于多特异性抗体的错误组装导致的亲合力增加来检测副产物浓度，该浓度低于先前通过已建立的方法(例如，SEC或MS)可检测到的浓度。所建立的方法使用相对于经分离的药物的残余结合，而根据本发明的方法使用由于亲合力而引起的富集，这在其他定量方法中没有使用。
因此，本发明涉及一种用于确定或/和定量治疗性抗体相关副产物的方法，该方法基于表观结合亲和力的差异、即基于经正确组装的治疗性抗体与治疗性抗体相关副产品之间的结合亲合力的增加。
根据本发明的方法允许确定与经正确组装的抗体相比具有增加的结合效价的抗体相关副产物的存在。
换句话说，具有增加的表观结合亲合力的抗体相关副产物与经正确组装的抗体相比包含更多的与相应靶标(即，抗原)的结合位点，例如，两个结合位点而不是一个，四个结合位点而不是两个等。
定义
术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-20％范围。在某些实施方案中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-10％范围。在某些实施方案中，术语“约”表示其后所跟随的数值的+/-5％范围。
“亲和力”或“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(＝靶标)(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，抗体和靶标(抗原))之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(KD)表示，所述解离常数是解离速率常数与缔合速率常数(分别为koff和kon)的比率。因此，等效亲和力可以包括不同的速率常数，只要速率常数的比率保持相同即可。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。测量亲和力的特定方法是表面等离子体共振(SPR)。
本文中的术语“抗体”用于定义至少异二聚体多特异性抗体(例如，双特异性抗体、三特异性抗体)。
Y型全长抗体通常包含两个所谓的轻链多肽(轻链)和两个所谓的重链多肽(重链)。重链多肽和轻链多肽中的每一者都含有可变结构域(可变区)(通常是多肽链的氨基末端部分)，该可变结构域包含能够与抗原相互作用的结合区。一对轻链可变结构域和重链可变结构域形成抗体的结合位点。重链多肽和轻链多肽中的每一者都包含恒定区(通常是羧基末端部分)。重链的恒定区介导抗体i)与携带Fcγ受体(FcγR)的细胞(诸如吞噬细胞)或ii)与携带新生儿Fc受体(FcRn)(也称为Brambell受体)的细胞的结合。它还介导与一些因子的结合，这些因子包括经典补体系统的因子，诸如组分(C1q)。抗体重链的恒定结构域包含CH1结构域、CH2结构域和CH3结构域，而轻链仅包含一个恒定结构域CL，它可以是κ同种型或λ同种型。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些抗体中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
术语“(与抗原的)结合”表示抗体在体外测定中与其抗原的结合，在结合测定的某些实施方案中，其中靶标与表面结合并且抗体与靶标的结合是通过表面等离子体共振(SPR)测量的。结合是指例如抗体对靶标A或靶标B或对捕获分子(例如，抗体的抗人Fab捕获)的结合能力的测量。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式呈递)之外，包含该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，待根据本发明的供使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
如在本申请中所用的术语“价”表示抗体中存在指定数目的结合位点。因此，术语“二价”“四价”和“六价”分别表示抗体中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。双特异性抗体例如包含至少两个结合位点，其中结合位点与不同的靶标特异性结合。
术语“结合亲和力”表示单个结合位点与其相应靶标的相互作用的强度。实验上，可以例如通过测量平衡状态下抗体与抗原的缔合(kA)和解离(kD)动力学常数确定亲和力。
术语“结合亲合力”表示一个抗体的多个结合位点与同一靶标的相互作用的组合强度。因此，亲合力是键亲和力的组合协同强度，而不是键的总和。亲合力的必要条件是：抗体或功能性多聚体对一个靶标(抗原)的多价性，一个可溶性靶标上的多个可接近表位或抗体对各位于多个固定靶标上的一个表位的多重结合。因此，这种抗体显示出与其靶标的亲合结合。
原则上，亲和结合与亲合结合之间的复合物缔合没有区别。然而，复合物解离在亲合结合的情况下取决于所涉及的所有结合位点的同时解离。因此，由于亲合结合(与亲和结合相比)导致的结合强度的增加取决于解离动力学/复合物稳定性。因此，例如，与多价结合物相比，单价结合物解离得更快。根据本发明的方法在延长的时间段内富集多价结合可以用于增加该方法的灵敏度。
“经分离的”抗体是已从其自然环境的组分中分离的抗体。在一些实施方案中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。有关评估抗体纯度的方法的综述，参见例如：Flatman等人，J.Chromatogr.B 848(2007)79-87。
多特异性抗体
在根据本发明的方法中，确定了至少异二聚体和至少双特异性抗体的亲合结合副产物的量。
多特异性抗体是对至少两个不同靶标(即，抗原)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，结合特异性中的一个针对第一抗原，而另一个针对不同的第二抗原。在某些实施方案中，多特异性抗体与同一抗原的两个不同的表位结合。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein,C.和Cuello,A.C，Nature 305(1983)537-540,WO 93/08829，以及Traunecker,A.等人，EMBO J.10(1991)3655-3659)和“杵臼结构”工程化(参见例如US 5,731,168)。多特异性抗体还可以通过工程化静电操纵效应来制备抗体Fc异二聚体分子(WO 2009/089004)或使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny，S.A.等人，J.Immunol.148(1992)1547-1553。
抗体也可以是多特异性抗体，如WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254、WO 2010/112193、WO 2010/115589、WO 2010/136172、WO 2010/145792或WO 2010/145793中所描述的。
双特异性抗体通常是与同一抗原上的两个不同的、不重叠的表位或与不同抗原上的两个表位特异性结合的抗体分子。
不同的双特异性抗体形式是已知的。
可以使用根据本发明的方法的示例性双特异性抗体形式是
-CrossMab形式(＝CrossMab)：包含第一Fab片段和第二Fab片段的多特异性IgG抗体，其中在第一Fab片段中
a)仅CH1和CL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VL和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VH和CL结构域)；
b)仅VH和VL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CL结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CH1结构域)；或
c)CH1和CL结构域相互替换并且VH和VL结构域相互替换(即第一Fab片段的轻链包含VH和CH1结构域，并且第一Fab片段的重链包含VL和CL结构域)；并且
其中第二Fab片段包含轻链和重链，该轻链包含VL和CL结构域，该重链包含VH和CH1结构域；
CrossMab可以包含第一重链和第二重链，该第一重链包含CH3结构域，该第二重链包含CH3结构域，其中两个CH3结构域通过各自的氨基酸取代以互补方式工程化，从而支持第一重链和修饰的第二重链的异二聚化，例如如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、或WO 2013/096291中公开的(以引用方式并入本文)；
-单臂单链形式(＝单臂单链抗体)：包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，由此单独的链如下：
-轻链(可变轻链结构域+轻链κ恒定结构域)
-组合轻链/重链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽接头+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有杵突变的CH3)
-重链(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有臼突变的CH3)；
-T细胞双特异性形式(TCB形式)：多特异性IgG抗体，其包含
a)第一Fab片段和第二Fab片段，每者结合第一抗原，
b)特异性结合第二抗原的一个结构域交换Fab片段，在该结构域交换Fab片段中CH1结构域和CL结构域彼此交换，
c)包含第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽的一个Fc区，其中第一Fab片段的CH1结构域的C末端连接至重链Fc区多肽之一的N末端，且结构域交换Fab片段的CL结构域的C末端连接到其他重链Fc区多肽的N末端，并且
其中第二Fab片段的CH1结构域的C末端连接至第一Fab片段的VH结构域的N末端，或连接至结构域交换Fab片段的VH结构域的N末端，并且
其中第一抗原或第二抗原是人CD3；
或包括
a)第一Fab片段和第二Fab片段，每者结合第一抗原，
b)特异性结合第二抗原的一个结构域交换Fab片段，在该结构域交换Fab片段中VH结构域和VL结构域彼此交换，
c)包含第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽的一个Fc区，其中第一Fab片段的CH1结构域的C末端连接至重链Fc区多肽之一的N末端，且结构域交换Fab片段的CH1结构域的C末端连接到其他重链Fc区多肽的N末端，并且
其中第二Fab片段的CH1结构域的C末端连接至第一Fab片段的VH结构域的N末端，或连接至结构域交换Fab片段的VL结构域的N末端，并且
其中第一抗原或第二抗原是人CD3；
-具有结构域交换和额外的重链C末端结合位点(2+1形式)的全长抗体：多特异性IgG抗体包括
a)一种全长抗体，其包含各有全长抗体轻链和全长抗体重链的两个对，其中由全长重链和全长轻链对中的每个对形成的结合位点特异性结合至第一抗原，以及
b)一个额外的Fab片段，其中额外的Fab片段与全长抗体的一条重链的C末端融合，其中额外的Fab片段的结合位点与第二抗原特异性结合，
其中与第二抗原特异性结合的额外的Fab片段i)包含结构域交叉，使得a)轻链可变结构域(VL)和重链可变结构域(VH)被彼此替换，或b)轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1)被彼此替换，或ii)是单链Fab片段；
-双臂单链形式(＝双臂单链抗体)：包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，由此单独的链如下：
-组合轻链/重链1(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽接头+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有臼突变的CH3)
-组合轻链/重链2(可变轻链结构域+轻链恒定结构域+肽接头+可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有杵突变的CH3)；
-共同轻链双特异性形式(＝共同轻链双特异性抗体)：包含第一结合位点和第二结合位点的抗体，所述第一结合位点与第一表位或抗原特异性结合，所述第二结合位点与第二表位或抗原特异性结合，由此单独的链如下：
-轻链(可变轻链结构域+轻链恒定结构域)
-重链1(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有臼突变的CH3)
-重链2(可变重链结构域+CH1+铰链+CH2+具有杵突变的CH3)。
如本文所使用的，术语“TCB”表示T细胞双特异性抗体。此类抗体可以具有例如在WO 2013/026831中所描述的形式。这些分子可以同时结合T细胞上的CD3(第一特异性)和靶(例如肿瘤)细胞上的抗原(第二特异性)，从而诱导杀伤靶细胞。TCB是由四种多肽或多肽链组成的三价双特异性抗体：一条轻链，其为全长轻链；另一条轻链，其为结构域交换全长轻链；一条重链，其为全长重链；以及另一条重链，其为包含额外的结构域交换重链或轻链Fab片段的延伸的重链。
如本文所使用的，术语“结构域交叉”表示在抗体重链VH-CH1片段及其相应的同源抗体轻链对中，即在抗体Fab(片段抗原结合)中，结构域序列偏离天然抗体中的序列是因为至少一个重链结构域由其相应的轻链结构域取代，反之亦然。结构域交叉有三种常见类型：(i)CH1结构域和CL结构域的交叉，这由轻链中的结构域交叉导致产生VL-CH1结构域序列、并由重链片段中的结构域交叉导致产生VH-CL结构域序列(或者具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列的全长抗体重链)；(ii)VH结构域和VL结构域的结构域交叉，其由轻链中的结构域交叉导致产生VH-CL结构域序列、并由重链片段中的结构域交叉导致产生VL-CH1结构域序列；以及(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域交叉(“Fab交叉”)，其由结构域交叉导致产生具有VH-CH1结构域序列的轻链、并由结构域交叉导致产生具有VL-CL结构域序列的重链片段(所有前述结构域序列在N末端到C末端方向表示)。
如本文所用，关于相应重链结构域和轻链结构域的术语“彼此替换”是指前述结构域交叉。因此，当CH1结构域和CL结构域“彼此替换”时，是指项目(i)下提及的结构域交叉以及所得重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“彼此替换”时，是指在第(ii)项中提到的结构域交叉；以及当CH1和CL结构域“彼此替换”并且VH和VL结构域“彼此替换”时，是指在第(iii)项中提到的结构域交叉。例如，在WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192中报告了包括结构域交叉的双特异性抗体。此类抗体通常称为CrossMab。
在某些实施方案中，多特异性或双特异性抗体是CrossMab形式的。
在某些实施方案中，多特异性或双特异性抗体是TCB-形式的。
在某些实施方案中，多特异性或双特异性抗体是2+1形式的。
在某些实施方案中，双特异性抗体是单臂单链抗体。
在某些实施方案中，双特异性抗体是双臂单链抗体。
在某些实施方案中，多特异性或双特异性抗体是共有轻链抗体。
异二聚化
存在几种对CH3修饰以实施异二聚化的方法，这些方法例如在WO 96/27011、WO98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012058768、WO 2013157954、WO 2013096291中详细描述。通常，在所有此类方法中，第一CH3结构域和第二CH3结构域均以互补方式工程化，使得每个CH3结构域(或包含它的重链)不再与其自身形成同二聚体，而是被迫与互补工程化的其他CH3结构域异二聚化(以便第一和第二CH3结构域异二聚化，并且两个第一或两个第二CH3结构域之间不形成同二聚体)。根据本发明，这些用于改进重链异二聚化的不同方法被认为是与多特异性抗体中的重-轻链修饰(在一个结合臂中VH和VL交换/取代，以及在CH1/CL界面中引入带相反电荷的带电氨基酸的取代)相结合的不同替代方案，其减少轻链错配的Bence-Jones型副产品。
引入CH3结构域中的示例性突变以促进异二聚体Fc区的形成，例如下文概述了用于生产多特异性或双特异性抗体的方法。
此类突变的实例是所谓的“杵臼”取代(参见例如WO 96/027011，Ridgway，J.B.等人，Protein Eng.9(1996)617-621；Merchant，A.M.等人，Nat.Biotechnol.16(1998)677-681；WO 98/050431；US 7,695,936和US2003/0078385)。已发现IgG1亚类IgG抗体Fc区的各个多肽链中的以下杵和臼取代可以增加异二聚体形成：1)一条链中为Y407T、且另一条链中为T366Y；2)一条链中为Y407A、且另一条链中为T366W；3)一条链中为F405A、且另一条链中为T394W；4)一条链中为F405W、且另一条链中为T394S；5)一条链中为Y407T、且另一条链中为T366Y；6)一条链中为T366Y和F405A、且另一条链中为T394W和Y407T；7)一条链中为T366W和F405W、且另一条链中为T394S和Y407A；8)一条链中为F405W和Y407A、且另一条链中为T366W和T394S；9)一个重链Fc区中为T366W、且相应的另一重链Fc区中为T366S、L368A和Y407V，其中最后列出的尤其适合，并且因此是一个优选实施方案的主题。另外，允许在两个Fc区多肽链之间形成新的二硫桥的取代促进异二聚体形成(参见，例如，Merchant，A.M.等人，Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell，S.等人，J.Mol.Biol.270(1997)26-35；US2003/0078385)。已经发现，在IgG1亚类的IgG抗体的Fc区的各个多肽链中产生适当间隔开半胱氨酸残基以用于形成新的链内二硫键的以下取代能够增加异二聚体的形成：在一个优选实施方案中，一个重链Fc区中为Y349C、且相应的另一重链Fc区中为S354C；一条链中为Y349C、且在另一条链中为E356C；一条链中为Y349C、且另一条链中为E357C；在一条链中为L351C、且另一条链中为S354C；一条链中为T394C、且另一条链中为E397C；或者一条链中为D399C、且在另一条链中为K392C。
促进氨基酸变化的异二聚化的进一步实例是所谓的“电荷对取代”(参见例如WO2009/089004)。已经发现IgG1亚类的IgG抗体Fc区的各个多肽链中的以下电荷对取代能够增加异二聚体形成：1)一条链中为K409D或K409E、且另一条链中为D399K或D399R；2)一条链中为K392D或K392E、且另一条链中为D399K或D399R；3)一条链中为K439D或K439E、且另一条链中为E356K或E356R；4)一条链中为K370D或K370E、且另一条链中为E357K或E357R；5)一条链中的K409D和K360D加上另一条链中的D399K和E356K；6)一条链中的K409D和K370D加上另一条链中的D399K和E357K；7)一条链中的K409D和K392D加上另一条链中的D399K、E356K和E357K；8)一条链中为K409D和K392D、且另一条链中为D399K；9)一条链中为K409D和K392D、且另一条链中为D399K和E356K；10)一条链中为K409D和K392D、且另一条链中为D399K和D357K；11)一条链中为K409D和K370D、且另一条链中为D399K和D357K；12)一条链中为D399K、且另一条链中为K409D和K360D；以及13)一条链中为K409D和K439D、且另一条链中为D399K和E356K。
在所有方面和实施方案的一个优选实施方案中，第一Fc区多肽包含突变Y349C、T366S、L368A和Y407V(“臼”)、并且第二Fc区多肽包含突变S354C和T366W(“杵”)。
用于实施异二聚化的其他CH3修饰技术被设想为待在本发明的方法中使用的替代方案，并且描述于例如WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291。
可替代地使用WO 2013/157953中描述的异二聚化方法。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366K突变，并且第二CH3结构域多肽包含氨基酸L351D突变。在某些实施方案中，第一CH3结构域进一步包含氨基酸L351K突变。在某些实施方案中，第二CH3结构域还包含选自由Y349E、Y349D和L368E(优选L368E)组成的组的氨基酸突变。
可替代地使用WO 2012/058768中描述的异二聚化方法。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在某些实施方案中，第二CH3结构域包含在T411、D399、S400、F405、N390或K392位的进一步氨基酸突变，例如选自：a)T411 N、T411 R、T411Q、T411 K、T411D、T411E或T411W，b)D399R、D399W、D399Y或D399K，c S400E、S400D、S400R或S400K、F405I、F405M、F405T、F405S、F405V或F405W、N390R、N390K或N390D、K392V、K392M、K392R、K392L、K392F或K392E。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸L351Y、Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366V、K409F突变。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸Y407A突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸T366A、K409F突变。在某些实施方案中，第二CH3结构域包含进一步的氨基酸K392E、T411E、D399R和S400R突变。
在某些实施方案中，可以替代地使用WO 2011/143545中描述的异二聚化方法，例如在选自由368和409组成的组的位置处进行氨基酸修饰。
替代地使用WO 2011/090762中描述的异二聚化方法，该异二聚化方法也可以使用上述杵臼技术。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366W突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407A突变。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸T366Y突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸Y407T突变。
可替代地使用WO 2009/089004中描述的异二聚化方法。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含用带负电荷的氨基酸对K392或N392进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K392D或N392D)，并且第二CH3结构域包含用带正电荷的氨基酸对D399、E356、D356或E357进行的氨基酸取代(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R)，优选D399K、E356K、D356K或E357K，并且在一个优选的实施方案中为D399K和E356K)。在某些实施方案中，第一CH3结构域还包含用带负电荷的氨基酸对K409或R409进行的氨基酸取代(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)，优选K409D或R409D)。在某些实施方案中，第一CH3结构域进一步或替代地包含用带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E)或天冬氨酸(D))对K439和/或K370进行的氨基酸取代。
可替代地使用WO 2007/147901中描述的异二聚化方法。在某些实施方案中，第一CH3结构域包含氨基酸K253E、D282K和K322D突变，并且第二CH3结构域包含氨基酸D239K、E240K和K292D突变。
在某些实施方案中，可替代地使用WO 2007/110205中描述的异二聚化方法。
重组方法和组合物
可以使用重组方法和组合物来产生抗体，例如，如在US 4,816,567中所描述的。在某些实施方案中，提供了编码抗体的一种或多种经分离的核酸。此类核酸可以编码包含抗体的VL的氨基酸序列和/或包含抗体的VH(例如，抗体的轻链和/或重链)的氨基酸序列。在某些实施方案中，提供包含此类核酸的一种或多种质粒(例如表达质粒)。在某些实施方案中，提供包含此类核酸的宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经用以下各项转化)：(1)包含核酸的质粒，该核酸编码包含抗体的VL的氨基酸序列和包含抗体的VH的氨基酸序列；或(2)第一质粒和第二质粒，该第一质粒包含编码包含抗体的VL的氨基酸序列的核酸，该第二质粒包含编码包含抗体的VH的氨基酸序列的核酸。在某些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp2/0细胞)。在某些实施方案中，根据本发明的方法进一步包括制备如本文所测试的抗体，其中该方法包括在适合表达该抗体的条件下培养包含编码如上所提供的抗体的核酸的宿主细胞，回收来自宿主细胞(或宿主细胞培养基)的抗体，并使该抗体经历根据本发明的用于测量或确定一种或多种抗体相关的亲合结合副产物的含量的方法。
对于使用如上所述的方法的抗体的重组生产，将编码抗体的核酸(例如，如上所述)分离并插入至一个或多个质粒中以用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序来容易地对此类核酸进行分离和测序(例如，通过使用能够与编码抗体的突变的Fc区多肽或重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
用于克隆或表达编码抗体的质粒的合适宿主细胞包括真核细胞。
例如，诸如丝状真菌或酵母等真核微生物也是用于编码抗体的质粒的合适克隆或表达宿主，该真核微生物包括这样的真菌和酵母菌株：其糖基化途径已经“人源化”，从而使得产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体。参见Gerngross,T.U.,Nat.Biotech.22(2004)1409-1414；以及Li,H.等人，Nat.Biotech.24(2006)210-215。
例如，适于在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他示例是由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾细胞系(如在例如Graham,F.L.等人，J.Gen Virol.36(1977)59-74中所述的HEK293或293细胞)；小仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利氏细胞(例如在Mather,J.P.,Biol.Reprod.23(1980)243-252中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)p；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562)；TRI细胞，如例如在Mather,J.P.等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44-68中所描述的；MRC 5细胞；以及FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub,G.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216-4220)；以及骨髓瘤细胞系，诸如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如Yazaki,P.和Wu,A.M.,Methods in Molecular Biology,第248卷,Lo,B.K.C.(编辑),Humana Press,Totowa,NJ(2004)，第255-268页。在一个优选的实施方案中，宿主细胞为CHO或HEK细胞。
现有技术的表面等离子体共振方法
可以例如通过使用BIAcore仪器(GE医疗生物科学公司，乌普萨拉，瑞士)进行表面等离子体共振来研究抗体对它们的相应抗原的动力学结合参数。
简而言之，为了确定亲和力，捕获剂(例如，抗体的靶标/抗原)共价地固定在芯片上(例如，通过胺偶联在CM5芯片上)，以用于捕获并呈现给待分析的各个抗体。
例如，通过使用GE医疗提供的胺偶联套件，在pH 5.0、流量为10-30μl/min的条件下，将约2,000-12,000个响应单元(RU)的10-30μg/ml的靶标溶液耦合到BIAcore T200仪器中CM5传感器芯片的所有流动池上。
在HBS缓冲液(HBS-P(10mM的HEPES，150mM的NaCl，0.005％的吐温20，pH 7.4)、或HBS-EP+(0.01M的HEPES，0.15M的NaCl，3mM的EDTA，0.05％v/v的表面活性剂PS20，pH 7.4)、或HBS-ET(10mM的HEPES pH 7.4，150mM的NaCl，3mM的EDTA，0.005％w/v吐温20))或任何其他适用缓冲液中，在25℃(或可替代地在4℃至45℃范围内的不同温度下)测量结合。
因此，抗体以10nM至1μM的范围内的浓度注射30秒，并与活性流动池(例如，2、3和4或2和3)结合，留下其他流动池作为参考流动池。
然后根据抗体的亲和力，将对应的抗原(次级靶标)以各种浓度加入溶液中，例如，144nM、48nM、16nM、5.33nM、1.78nM、0.59nM、0.20nM和0nM。
通过抗原注射来测量缔合。
通过用不含分析物的缓冲液清洗芯片表面来测量解离。
利用制造商的软件和说明，通过1:1Langmuir结合模型来估计KD值。从样品曲线中减去负控制数据(如缓冲曲线)，用于校正系统固有基线漂移和降低噪声信号。
在根据本发明的方法的实施例和示例性实施方案
根据本发明使用2+1形式抗体的方法
根据本发明的方法在下面的第一实施例中用双特异性抗-Aβ/转铁蛋白受体抗体来举例说明。这仅仅是为了对本发明进行举例说明，并且不应解释为限制。本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。
本实施例中使用的双特异性抗Aβ/转铁蛋白受体抗体由Y形全长抗体形成，该抗体包含与人Aβ蛋白特异性结合的两个结合位点和与人转铁蛋白受体特异性结合的一个额外的单特异性Fab，该人转铁蛋白受体已经经由肽接头融合至一个Aβ抗体重链的C末端。
为了正确穿梭通过血脑屏障，双特异性抗Aβ/转铁蛋白受体抗体对于人转铁蛋白受体必须是单价的，因为二价结合极大地减少或甚至消除了穿梭(参见，例如WO 2016/207245，其通过引用并入本文中)。
由于双特异性抗Aβ/转铁蛋白受体抗体包含两条不同的重链，因此重链的CH3结构域已经根据杵臼异二聚化方法进行了修饰(参见Merchant等人，同上)。与额外的Fab缀合的重链包含杵突变，而另一条未延伸的重链包含臼突变。
对于该示例性抗体，在根据本发明的方法中待检测的抗体相关的亲合结合副产物是包含与额外的Fab缀合的两条重链的同二聚体，即包含两个与Aβ蛋白的结合位点以及两个与人转铁蛋白受体的结合位点的抗体。如上所述，经正确组装的双特异性抗体包含两个与人Aβ蛋白的结合位点，但仅包含一个与人转铁蛋白受体的结合位点。必须检测到这种与抗体相关的亲合结合副产物，因为与人转铁蛋白受体的二价结合不再能够正常穿梭通过血脑屏障。
根据本发明的方法，与经正确组装的抗体相比，已经固定在SPR芯片的表面上的待检测的副产物所针对的抗原包含增加数量的结合位点，即，在该实施例中为两个而不是一个。在该实施例中，固定是间接固定。在将预包被在芯片上的单链DNA与其带有链霉亲和素的补体链杂交后，抗原(即，人转铁蛋白受体)已经与生物素标签缀合并捕获在链霉亲和素修饰的CAP芯片(Cytiva)的表面上(参见图1)。
固定在本实施例中进行至约2250RU。
将包含经正确组装的双特异性抗Aβ/转铁蛋白受体抗体的样品施加到具有固定化的人转铁蛋白受体的表面。所述经正确组装的抗体与固定化的人转铁蛋白受体特异性结合，从而与芯片表面结合。这会生成SPR信号。为了从芯片表面溶解抗体，将不包含双特异性抗体或与人转铁蛋白受体结合的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减，并将其作为参考值。
为了在根据本发明的方法中确定与人转铁蛋白受体亲合结合的抗体相关副产物的存在/量，已经如前所述的制备了固定化转铁蛋白受体芯片表面。将包含经正确组装的抗体以及同二聚体抗体相关的亲合结合副产物的样品施加到具有固定化的人转铁蛋白受体的表面。抗体以及副产物与固定化的人转铁蛋白受体结合，从而与芯片表面结合。
在低副产物浓度下，经正确组装的抗体和抗体相关的同二聚体副产物的重量差异非常小，以至于与将样品应用于芯片表面后仅结合经正确组装的抗体相比、SPR信号基本上没有可检测到的差异。
然而，抗体相关的同二聚体副产物由于其二价和与固定化转铁蛋白受体的亲合结合而在上样阶段期间积聚在芯片表面上，因为它取代了经正确组装的抗体，而该抗体仅对固定化转铁蛋白受体是单价的并且仅具有亲和结合。亲合结合副产物与转铁蛋白受体的复合物与经正确组装的亲和结合抗体的复合物相比具有更高的复合物稳定性，从而实现其积累。
为了溶解经正确组装的抗体以及来自芯片表面的亲合结合副产物，将不包含所述抗体或与人转铁蛋白受体结合的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减，并将其作为信号值。
在溶解开始后的规定时间点，确定信号值与参考值之间的差异。这种差异是所谓的残余结合。
残余结合取决于样品中抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的量。
示例性SPR传感图如图2所示(RS＝经正确组装的抗体；k/k＝杵-杵同二聚体)。
通过将已知量的抗体相关同二聚体亲合结合副产物掺入经分离的正确组装的抗体样品中，制备不同的标准品并生成校准曲线。校准曲线在抗体相关同二聚体亲合结合副产物含量至少为5％(w/w)时呈线性(参见图3)，R2值为0.9785。
因此，所测定的残余结合可以与所施加的样品中抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的量直接相关。
通过应用根据本发明的方法，现在可以定量样品中少量的抗体相关的同二聚体亲合结合副产物。特别是可以对远低于2％的抗体相关合力结合副产物的量进行定量。
本实施例针对2+1形式的抗体的条件：
·抗体的固定水平＝2250RU
·抗体浓度＝100nM
·分析物流量＝30μl/min
·缔合时间＝180秒。
·解离时间＝600秒。
·温度＝25℃
·缓冲液组成＝HBS-EP+
必须指出的是，除了参考值和信号值的顺序确定/记录之外，这还可以使用SPR芯片的不同流动池或不同的SPR装置并行地完成。
然而，必须考虑应用于空白池的标准参考，即减去用空白池获得的结果。这样做是为了排除任何独立/非特异性结合的影响。
根据本发明使用TCB-形式抗体的方法
这是根据本发明的方法的第二实施例。下面用双特异性抗CD3/抗原2抗体举例说明根据本发明的方法。这仅仅是为了对本发明进行举例说明，并且不应解释为限制。本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。
本实施例中使用双特异性抗CD3/抗原2抗体。该抗体基于Y形全长抗体，其包含与抗原2(特异性)结合的两个Fab和与CD3(特异性)结合的一个附加的单特异性Fab，该单特异性Fab已经插入与抗原2和铰链区(特异性)结合的全长抗体的Fab的一者之间。这种抗体形式称为TCB(T细胞激活双特异性抗体形式)。
TCB通过其CD3结合位点与T细胞衔接，该位点与T细胞表面的T细胞受体(TCR)复合物(特异性)结合。针对TCB，包含两个CD3结合位点的同二聚体副产物会带来显著的安全风险，因为它能够在没有靶细胞的情况下通过TCR二聚化激活T细胞。这种脱靶(也称为非靶细胞依赖性)T细胞激活能够诱导细胞因子分泌或引发患者不希望的免疫反应。包含两个CD3结合位点的抗体相关同二聚体亲合结合副产物引起的脱靶T细胞激活是不希望的活性，并且与经正确组装的TCB引起的预期T细胞激活不同。因此，确定包含两个CD3结合位点的抗体相关同二聚体亲合结合副产物的量是重要的。
由于双特异性抗CD3/抗原2抗体包含两条不同的重链，因此重链的CH3结构域已经根据杵臼异二聚化方法进行了修饰(参见Merchant等人，同上)。具有与CD3(特异性)结合的插入的额外Fab的延伸重链包含杵突变，而其他未延伸的重链包含臼突变。
对于该示例性抗体，在根据本发明的方法中待检测的抗体相关亲合结合副产物是包含两条重链的同二聚体，每条重链具有插入的Fab，即包含两个CD3结合位点的化合物。经正确组装的双特异性抗体仅包含一个如上所述的CD3结合位点。必须检测这种副产物，因为它与CD3的二价结合会影响脱靶T细胞激活。
根据本发明的方法，与经正确组装的抗体相比，已经固定在SPR芯片的表面上的待检测副产物所针对的抗原包含增加数量的结合位点，即在这种情况下是两个而不是一个。在该实施例中，固定是直接固定。根据制造商的说明，抗原(即CD3)已经通过胺偶联固定到芯片表面。
根据制造商的说明，使用胺偶联将约6900RU的CD3固定在CM5芯片上。
将包含经正确组装的双特异性抗体的样品施加到以CD3固定的表面。所述经正确组装的双特异性抗体与固定的CD3结合并由此与芯片表面结合。这会生成SPR信号。为了从芯片表面溶解双特异性抗体，将不包含双特异性抗体或与CD3结合的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减，并将其作为参考值。
在该方法的第二部分中，如前所述制备了固定CD3芯片表面。将包含经正确组装的双特异性抗体以及双特异性抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的样品施加到具有固定的CD3的该表面。两者都与固定的CD3结合，从而与芯片表面结合。
经正确组装的抗体和抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的重量差异非常小，以至于与仅经正确组装的抗体的结合相比，SPR信号基本上没有可检测的差异。
然而，同二聚体副产物由于其二价且与固定的CD3亲合结合而积聚在芯片表面上。它取代了经正确组装的双特异性抗体，该抗体仅对固定的CD3是单价的，并且在上样阶段期间仅具有亲和结合。与经正确组装的亲和结合双特异性抗体的复合体相比，亲合结合的双特异性抗体相关副产物的复合体具有更高的复合体稳定性，因此可以在上样阶段期间积累。
为了溶解经正确组装的双特异性抗体以及来自芯片表面的亲合结合副产物，已经将不包含所述抗体或结合CD3的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减，并将其作为信号值。
在溶解开始后的规定时间点，确定信号值与参考值之间的差异。这种差异是所谓的残余结合。
残余结合取决于样品中双特异性抗体相关同二聚体亲合结合副产物的量。
使用了两种不同的方法来确定校准曲线。在第一曲线中(图4中的上部曲线)，将亲合结合副产物(杵-杵同二聚体；KK)掺入经分离的双特异性抗体，即不含可检测量的亲合结合副产物的制剂(R2值为0.9994)。在第二曲线中(图4中的下部曲线)，在已经包含可检测量的亲合结合副产物的参考材料中掺入亲合结合副产物(R2值为0.9998)。可见，这种情况下也可以建立校准曲线。校准曲线至少在同二聚副产物达到2％(w/w)之前呈线性。
因此，所测定的残余结合可以与所施加的样品中双特异性抗体同二聚体亲合结合副产物的量相关。
通过应用根据本发明的方法，现在可以定量样品中少量的同二聚体副产物。
本实施例针对TCB形式的抗体的条件总结：
·抗体的固定水平＝6900RU
·抗体浓度＝100nM
·分析物流量＝20μl/min
·缔合时间＝480秒
·解离时间＝1200秒
·温度＝37℃
·缓冲液组成＝HBS-P+
根据本发明使用CrossMab形式抗体的方法
这是根据本发明的方法的进一步的实施例。在本实施例中，根据本发明的方法对与两种不同CD抗原特异性结合的双特异性抗体举例说明。这仅仅是为了对本发明进行举例说明，并且不应解释为限制。本发明的真实范畴在所附权利要求书中阐述。
本实施例中使用的双特异性抗体是Y形全长抗体，其包含一个与第一CD抗原特异性结合的结合位点、以及一个与不同的第二CD抗原特异性结合的结合位点。双特异性抗体采用所谓的CrossMab形式(参见上文)。
由于双特异性抗体包含两条不同的重链，因此重链的CH3结构域已根据杵臼异二聚化方法进行了修饰(参见Merchant等人，同上)。与第一CD抗原结合的重链包含杵突变，而另一个重链包含臼突变。
对于该示例性抗体，在根据本发明的方法中待检测的抗体相关亲合结合副产物是包含均与第一CD抗原结合的两条重链的同二聚体。经正确组装的双特异性抗体仅包含针对每种CD抗原的一个结合位点。
必须检测与第一CD抗原的二价结合物，因为与第一CD抗原的二价结合可能产生不利的副作用，即毒副作用，例如，通过不依赖靶标的T细胞激活。因此，需要对这些抗体相关的同二聚体亲合结合副产物进行监测和(精确)定量，因为这些副产物可能会因T细胞的靶标独立激活而带来潜在的安全风险。
根据本发明的方法，与经正确组装的抗体相比，已经固定在SPR芯片的表面上的待检测副产物所针对的抗原包含增加数量的结合位点，即两个而不是一个。在本实施例中，第一CD抗原的固定是直接固定至芯片表面。
第一CD抗原的固定进行至超过2000RU。但发现不应超过4000RU。
将包含经正确组装的抗体的样品施加到具有固定的第一CD抗原的表面。所述经正确组装的抗体与固定的CD抗原特异性结合，从而与芯片表面结合。这会生成SPR信号。为了从芯片表面溶解抗体，将不包含双特异性抗体或与第一CD抗原结合的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减，并将其作为参考值。
与第一CD抗原结合价增加的不同可能副产物也已施加于如上所述的芯片(参见图5)。可以看出，所有与抗体相关的亲合结合副产物(包括表面上在溶液中实际上自发地与同二聚体缔合的(K)杵单体(经SEC确认)和(KK)杵-杵同二聚体(共价和非共价形式表现相似)和包含不同聚集体的溶液)由于与经正确组装的双特异性抗体相比更稳定的亲合结合而被保留在表面上。
可以看出，经分离的亲合结合副产物不会以可检测的解离速率解离(参见图6)，而经正确组装的双特异性抗体(bsmAb)则会解离。
可以使用长解离阶段来强调并更清楚地利用单价抗体形式和亲合结合抗体形式之间复合物稳定性的差异。由此，经正确组装的异二聚体亲和结合双特异性抗体(单价第一和第二CD抗原结合)从芯片表面溶解。相反地，与第一CD抗原具有二价和多价亲合结合相互作用的所有物种都被保留。SPR读数、即“残余结合”可以在长解离阶段后确定，例如解离开始后约1200秒后。
固定的第一CD抗原芯片表面已经如前所述制备。将包含一个经分离的杵重链(单体副产物)以及同二聚体副产物的样品施加到该表面。所有抗体与固定的第一CD抗原(特异性)结合，从而与芯片表面结合(参见图6和7)。根据分析数据推测单体杵副产物原位二聚化并形成同二聚体副产物。
结合的同二聚体亲合结合副产物的复合物与经正确组装的异二聚体亲和结合抗体的复合体相比具有更高的复合体稳定性，因此在该同二聚体亲合结合副产物的上样阶段期间发生积累。
为了从芯片表面溶解经正确组装的抗体以及同二聚体亲合结合副产物，已经将不包含所述抗体或与第一CD抗原结合的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减。可以看出，对于同二聚体亲合结合副产物，可以确定明显的残余结合(参见图6和图7)。
在该方法的第二部分中，已经如前所述制备了固定的第一CD抗原芯片表面。将仅包含经正确组装的抗体的样品以及掺有1％(w/w)的不同抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的样品施加至具有固定的第一CD抗原的该表面。所有抗原都与固定的第一CD抗原结合并由此与芯片表面结合。
经正确组装的异二聚体抗体和同二聚体亲合结合副产物的重量差异太小，无法导致SPR信号中可检测到的差异。
同样，使用其他生化方法(如SEC、CE-SDS或HIC)也无法检测到差异，因为这些方法中用于区分的分子特性是相同的。仅通过根据本发明的方法，可以实现由于不同的动力学结合特性而产生的差异。由于这种差异存在于所有异二聚体抗体形式中，因此根据本发明的方法可以至少应用于此类用于确定抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的任何形式。
同二聚体副产物由于其二价且与固定的第一CD抗原亲合结合而积聚在芯片表面上。它取代了经正确组装但仅具有亲和结合的双特异性抗体(仅与固定的第一CD抗原单价，因此仅具有亲和结合)。与经正确组装的异二聚亲和结合双特异性抗体的复合物相比，结合的抗体相关的同二聚亲和结合副产物的复合物具有更高的复合物稳定性。从而可以积累副产物。
为了从芯片表面溶解经正确组装的异二聚体亲和结合双特异性抗体以及抗体相关的同二聚体亲合结合副产物，将不包含所述抗体或与第一CD抗原结合的任何其他化合物的缓冲水溶液施加至芯片。记录SPR(结合)信号的衰减，并将其作为信号值。
在溶解开始后的规定时间点，可以确定信号值与参考值之间的差异。这种差异是所谓的残余结合。
这种效果如图8所示，其中已经将1％(w/w)的亲合结合副产物(将1nM副产物添加到100nM的经正确组装的抗体中)添加到经分离的正确组装的抗体(LS)。
残余结合差异取决于样品中同二聚体副产物的量。
将所有不同的抗体相关的二价和多价第一CD抗原亲合结合副产物一起定量，即作为总和。
如果没有经分离的异二聚体亲和结合双特异性抗体，则可以通过“标准添加校准”进行定量。使用确定的同二聚体分子(同二聚体亲合结合副产物)作为副产物标准品。计算后，“高活性二价第一CD抗原结合物总和的％值”作为“同二聚体标准的％值当量”给出。
在溶解开始后的规定时间点，确定信号值与参考值之间的差异。这种差异称为残余结合。
残余结合差异取决于样品中同二聚体亲合结合副产物的量。
通过将已知量的同二聚体亲合结合副产物掺入经分离的正确组装的异二聚体亲和结合抗体样品中，制备了不同的标准品并生成了校准曲线。校准曲线在同二聚体副产物含量至少为2％(w/w)时呈线性(R2值0.9997)(参见图9)。
因此，所测定的残余结合可以与样品中同二聚体亲合结合副产物的量相关。
通过应用根据本发明的方法，现在可以定量样品中少量的同二聚体亲合结合副产物。
本实施例针对CrossMab形式的抗体使用的条件：
·抗原的固定水平＝2000RU-4000RU
·抗体浓度＝100nM
·分析物流速＝20μl/min
·缔合时间＝480秒。
·解离时间＝1200秒。
·温度＝25℃
·缓冲液组成＝HBS-P+
用于根据本发明的方法的通用性说明：
-抗原固定量为至少约2000RU，在一个优选实施方案中在2000RU至8000RU的范围内
-上样时间在180秒至480秒的范围内，在一个优选实施方案中为约360秒。
-样品中经正确组装的抗体的浓度在50nM至200nM的范围内，在一个优选实施方案中约为100nM
-流量在10μL/min至30μL/min的范围内，在一个优选实施方案中在约20μL/min至约30μL/min的范围内
-残余结合可以在溶解开始后的任何时间确定，在一个优选的实施方案中，残余结合在至少400秒后、至少480秒后或至少1200秒后确定
-经正确组装的抗体与同二聚体副产物之间没有解离速率差异，因为残余结合取决于副产物的亲合力
-参与结合可以通过流量和时间进行调整
本发明的具体实施方案
1.一种用于使用表面等离子体共振确定样品中双特异性抗体的亲合结合副产物的方法，该样品包含经正确组装的双特异性抗体和该双特异性抗体的一种或多种亲合结合副产物，
其中，经正确组装的双特异性抗体包含一个或多个针对第一抗原的结合位点以及一个或多个针对第二抗原的结合位点，
其中，双特异性抗体的亲合结合副产物包含两个或更多个与第一抗原的结合位点并且与经正确组装的双特异性抗体相比包含更多的与第一抗原的结合位点，
该方法包括以下步骤：
i)将包含经正确组装的双特异性抗体的上样溶液施加于其上已经以至少1000RU固定该第一抗原的SPR表面，以产生SPR信号，随后将不包含与第一抗原结合的化合物的溶解溶液施加于SPR芯片并记录SPR信号的衰减，
ii)将怀疑包含双特异性抗体的亲合结合副产物的样品溶液施加于其上已经以至少1000RU固定第一抗原的SPR表面，以产生SPR信号，随后将不包含与第一抗原结合的化合物的溶解溶液施加于SPR芯片并记录SPR信号的衰减，
iii)如果在步骤ii)中确定的SPR信号的衰减比在步骤i)中确定的SPR信号的衰减慢，则确定双特异性抗体的亲合结合副产物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中以至少2000RU固定第一抗原。
3.根据实施方案1至2中任一项所述的方法，其中以至少2000RU且至多8000RU固定第一抗原。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中上样溶液和/或样品的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少300秒。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中上样溶液和/或样品的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少400秒。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中溶解溶液的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少600秒。
7.根据实施方案1至6中任一项所述的方法，其中溶解溶液的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少1200秒。
8.根据实施方案1至5中任一项所述的方法，其中上样溶液和样品的施加在相同的条件下进行。
9.根据实施方案1至3和6至8中任一项所述的方法，其中在步骤i)和ii)中溶解溶液的施加在相同的条件下进行。
10.根据实施方案4至9中任一项所述的方法，其中流量为15μL/min至35μL/min。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中步骤iii)中的确定是用在开始施加溶解溶液之后至少400秒的时间点确定的SPR信号进行的，并且其中使在步骤i)和ii)中开始施加溶解溶液时用上样溶液获得的SPR信号相同。
12.根据实施方案1至6和8至11中任一项所述的方法，其中步骤iii)中的确定是用在开始施加溶解溶液之后至少1200秒的时间点确定的SPR信号进行的，并且其中使在步骤i)和ii)中开始施加溶解溶液时用上样溶液获得的SPR信号相同。
13.根据实施方案1至12中任一项所述的方法，其中抗体为
i)CrossMab形式的双特异性抗体，或
ii)TCB-形式的双特异性抗体，或
iii)2+1形式的双特异性抗体。
14.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中方法用于确定抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的存在情况。
15.根据实施方案1至13中任一项所述的方法，其中方法用于定量抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的存在情况。
图表和实施例
提供以下实施例和附图以帮助理解本发明，本发明的真正范围在所附权利要求书中阐明。应当理解，在不脱离本发明的精神的情况下，可对所阐述的程序进行修改。
附图说明
图1将预先包被在芯片上的单链DNA与其链霉亲和素的补体链杂交后、通过生物素标签将人转铁蛋白受体间接固定在链霉亲和素修饰的CAP芯片表面的测定设置的示意图。
图2从芯片表面使用不含所述抗体的缓冲水溶液溶解经分离的正确组装的抗体(下曲线；红色)以及含20％的亲合结合副产物的样品(上曲线；绿色)期间的SPR信号的衰减。上信号值与下信号值之间的差值是残余结合。
图3用根据本发明的方法建立的用于确定2+1形式的双特异性抗体的亲合结合副产物的校准曲线。
图4用根据本发明的方法建立的用于确定TCB-形式的双特异性抗体的亲合结合副产物的校准曲线。上曲线：将亲合结合副产物掺入经分离的抗体中；下曲线：已经包含亲合结合副产物的参考材料中掺入的亲合结合副产物。
图5经分离的不同可能的副产物与第一CD抗原结合价增加的SPR传感器图。
图6 SPR传感图显示残余结合取决于亲合结合副产物的量。
图7用不含所述抗体的缓冲水溶液溶解经正确组装的抗体以及芯片表面的同二聚体亲合结合副产物-记录了SPR(结合)信号的衰减–表明对于同二聚体亲合结合副产物能够确定明显的残余结合。
图8用于含1％(w/w)亲合结合副产物(1nM的副产物加入100nM的经正确组装的抗体)的样品的SPR信号衰减。
图9通过将已知量的同二聚体亲合结合副产物掺入经正确组装的异二聚体亲和结合抗体样品中来用本发明的方法确定校准曲线；制备了不同的标准品并生成了校准曲线-校准曲线在至少2％(w/w)的同二聚体副产物含量下呈线性。
实施例说明
实施例1
使用根据本发明的方法确定亲合结合副产物：2+1形式/抗Aβ/TfR双特异性抗体
BIAcore CAP ship(Cytiva)与BIAcore T200仪器对接，并按照供应商提供的说明进行准备。然后进行多个测定循环。所有循环均包括根据制造商说明的杂交步骤，以将链霉亲和素结合在芯片表面上。随后注射1μM的生物素化转铁蛋白受体溶液180秒，流量为5μl/min。此后，将样品注入流动腔室180秒(缔合阶段)，流量为30μl/min，随后通过切换至缓冲液600秒来与转铁蛋白受体解离，在相同的流量下。最后，使用SA CAP套件中包含的溶液再生芯片表面。
在如上所述进行的连续循环中，一系列抗体-抗体副产物混合物(0％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、50％和100％抗体副产物)用作样品。使用BIAcore T200评估软件处理所得到的信号。在解离阶段结束进行之前，使用“结果图”功能，调整捕获水平并在10秒内对报告的信号进行线性拟合。
该测定在25℃下用HBS-EP+缓冲液作为运行缓冲液和样品缓冲液(含有0.1M的HEPES、1.5M的NaCl、0.03M的EDTA、0.5％(v/v)的表面活性剂P20，pH 7.4的缓冲水溶液)进行。
实施例2
使用根据本发明的方法确定亲合结合副产物：TCB形式
为了定量少量二价CD3结合同二聚体副产物，使用了BIAcore T200。CD3抗原通过胺偶联至>6000RU来固定于CM5芯片上(CD3抗原原液在pH 5.0的10mM的醋酸钠缓冲液中稀释至浓度为10μg/mL)。固定后，在37℃下并用HBS-P+作为运行和稀释缓冲液(含有0.1M的HEPES、1.5M的NaCl、0.5％(v/v)的表面活性剂P20、pH 7.4的缓冲水溶液)进行分析。将待分析的样品稀释至100nM抗体浓度。校准标准品制备如下：将限定量的副产物添加到100nM的样品中(例如0.25％、0.5％、1％2％的杵-杵同二聚体(KK)物种)。在CD3衍生化芯片表面上注射样品和校准标准样480秒。以20μl/min的流量解离1200秒的时间后，表面再生，然后用3M的MgCl2溶液进行再生步骤60秒。使用BiaEvaluation软件用校准功能进行浓度分析来分析数据。校准设置指定如下：流动池：FC2-1或FC4-3，报告点：1200秒时的稳定性，响应类型：相对响应，拟合函数：线性。定量是通过标准添加校准的方式完成的。同二聚体CD3的％值：KK的当量＝截距/斜率。
实施例3
使用根据本发明的方法确定亲合结合副产物：CrossMab形式
为了定量少量的第一CD抗原结合同二聚体副产物，使用了BIAcore T200。将第一CD抗原以介于2000RU与4000RU之间的水平、以10μL/min的流量固定在SA芯片上(第一CD抗原原液在HBS-P+缓冲液中稀释至浓度为5μg/mL)。固定后，在25℃下用HBS-P+作为运行和稀释缓冲液进行分析。将待分析的抗体样品稀释至100nM。同时，通过标准添加制备几个用于校准的样品：将规定量的副产物添加到100nM抗体样品中(例如0.25％、0.5％、1％和2％的杵-杵同二聚体(KK)副产物)。在含芯片表面的第一CD抗原上以20μL/min的流速注射抗体样品和校准样480秒。以20μl/min的流量解离1200秒的时间后，用“温和的Ag/Ab洗脱缓冲液pH6.6”(Thermo Cat#21013)表面再生120秒。数据分析：使用BiaEvaluation软件用校准功能进行浓度分析来分析数据。校准设置指定如下：流动池：FC2-1或FC4-3，报告点：1200秒时的稳定性，响应类型：相对响应，拟合函数：线性定量是通过标准添加校准的方式完成的。同二聚体KK第一CD抗原的％值：KK的当量＝截距/斜率。

Claims (15)

1.一种用于使用表面等离子体共振确定样品中双特异性抗体的亲合结合副产物的方法，所述样品包含经正确组装的双特异性抗体和所述双特异性抗体的一种或多种亲合结合副产物，
其中，所述经正确组装的双特异性抗体包含一个或多个针对第一抗原的结合位点以及一个或多个针对第二抗原的结合位点，
其中，所述双特异性抗体的所述亲合结合副产物包含两个或更多个与所述第一抗原的结合位点并且与所述经正确组装的双特异性抗体相比包含更多的与所述第一抗原的结合位点，
所述方法包括以下步骤：
i)将包含所述经正确组装的双特异性抗体的上样溶液施加于其上已经以至少1000RU固定所述第一抗原的SPR表面，以产生SPR信号，随后将不包含与所述第一抗原结合的化合物的溶解溶液施加于SPR芯片并记录所述SPR信号的衰减，
ii)将怀疑包含所述双特异性抗体的亲合结合副产物的样品溶液施加于其上已经以至少1000RU固定所述第一抗原的SPR表面，以产生SPR信号，随后将不包含与所述第一抗原结合的化合物的溶解溶液施加于SPR芯片并记录所述SPR信号的衰减，
iii)如果在步骤ii)中确定的所述SPR信号的衰减比在步骤i)中确定的所述SPR信号的衰减慢，则确定所述双特异性抗体的亲合结合副产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中以至少2000RU固定所述第一抗原。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中以至少2000RU且至多8000RU固定所述第一抗原。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述上样溶液和/或所述样品的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少300秒。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述上样溶液和/或所述样品的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少400秒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述溶解溶液的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少600秒。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述溶解溶液的施加以5μL/min至50μL/min的流量进行至少1200秒。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述上样溶液和所述样品的施加在相同的条件下进行。
9.根据权利要求1至3和6至8中任一项所述的方法，其中在步骤i)和ii)中所述溶解溶液的施加在相同的条件下进行。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的方法，其中所述流量为15μL/min至35μL/min。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中步骤iii)中的确定是用在开始施加所述溶解溶液之后至少400秒的时间点确定的所述SPR信号进行的，并且其中使在步骤i)和ii)中开始施加所述溶解溶液时用所述上样溶液获得的所述SPR信号相同。
12.根据权利要求1至6和8至11中任一项所述的方法，其中步骤iii)中的确定是用在开始施加所述溶解溶液之后至少1200秒的时间点确定的所述SPR信号进行的，并且其中使在步骤i)和ii)中开始施加所述溶解溶液时用所述上样溶液获得的所述SPR信号相同。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述抗体为
i)CrossMab形式的双特异性抗体，或
ii)TCB-形式的双特异性抗体，或
iii)2+1形式的双特异性抗体。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法用于确定抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的存在情况。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法用于定量抗体相关的同二聚体亲合结合副产物的存在情况。
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