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CN118159654A - 抑制素亚基βE（INHBE）调节剂组合物及其使用方法 - Google Patents

抑制素亚基βE（INHBE）调节剂组合物及其使用方法 Download PDF

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CN118159654A
CN118159654A CN202280071692.1A CN202280071692A CN118159654A CN 118159654 A CN118159654 A CN 118159654A CN 202280071692 A CN202280071692 A CN 202280071692A CN 118159654 A CN118159654 A CN 118159654A
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inhbe
ome
length
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CN202280071692.1A
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A·M·迪顿
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Abstract

本发明涉及调节(例如，抑制)抑制素亚基βE(INHBE)的表达和/或活性的调节剂，例如，双链RNA(dsRNA)剂、反义多核苷酸剂、抗体、实现ADAR编辑的指导RNA或实现CRISP编辑的指导RNA。本发明还涉及使用此类调节剂来抑制INHBE的表达和/或活性的方法及预防和治疗受试者中的INHBE相关病症(例如代谢障碍，例如代谢综合征)的方法。

Description

抑制素亚基βE(INHBE)调节剂组合物及其使用方法
相关申请
本申请要求于2021年9月20日提交的美国临时申请No.63/246,084的优先权利益，其全部内容通过引用并入本文。
本申请涉及2021年7月21日提交的美国临时申请No.63/223,995、2021年11月11日提交的美国临时申请No.63/278,126、2021年12月2日提交的美国临时申请No.63/285,143、2021年12月9日提交的美国临时申请No.63/287,578、2022年3月21日提交的美国临时申请No.63/321,799、2022年3月25日提交的美国临时申请No.63/323,543和2022年7月20日提交的PCT申请No.PCT/US2022/037658。前述申请中的每一个的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
随着世界大部分地区成功征服许多传染病，非传染性疾病，特别是代谢障碍，已经成为现代世界的主要健康危害。高热-低纤维快餐消耗的增加和由于机械化运输和久坐生活方式导致的身体活动的减少已经引起代谢障碍的扩散，如代谢综合征、2型糖尿病、高血压、心血管疾病、中风和其他残疾。实际上，近年来，患有代谢障碍(如代谢综合征)的受试者的发病率增加，这些受试者具有许多健康状况使他们处于心脏病、糖尿病、中风和其他疾病的更高风险中。
目前对脂质代谢障碍的治疗包括生活方式改变、节食、运动和用药剂治疗，如降脂剂，例如他汀类药物，及其他药物。然而，这些疗法和治疗通常受到依从性的限制，并不总是有效，导致副作用，并导致药物-药物相互作用。因此，本领域需要用于患有代谢障碍的受试者的替代治疗。
抑制素亚基βE(INHBE)是转化生长因子β(TGF-β)家族的成员。主要在肝脏中表达的INHBE是一种肝脏因子，其已显示与人的胰岛素抵抗和体重指数正相关。定量实时PCR分析还显示了来自胰岛素抵抗人类受试者的肝脏样品中INHBE基因表达增加。此外，在本领域公认的代谢障碍(即2型糖尿病)的动物模型，db/db小鼠模型的肝脏中显示Inhbe基因表达增加。证明了db/db小鼠中Inhbe表达的抑制遏制体重增加，这可归因于脂肪而不是瘦体重减少。
如上所述，对于代谢障碍的有效治疗存在未满足的需求，所述代谢障碍如代谢综合征和相关疾病，例如糖尿病、高血压和心血管疾病，如可以选择性且有效地调节(即抑制)INHBE表达和/或活性的药剂。
发明内容
本发明尤其提供了调节(即抑制)抑制素亚基βE(INHBE)的表达和/或活性的调节剂，其用于治疗INHBE相关病症，例如代谢障碍，例如代谢综合征。
在一个方面中，本发明提供了抑制素亚基βE(INHBE)的调节剂。该调节剂可以是靶向INHBE的寡核苷酸，如双链核糖核酸(dsRNA)或反义多核苷酸剂；特异性结合INHBE的抗体或其抗原结合片段，如单克隆抗INHBE抗体或其抗原结合片段；小分子；实现ADAR编辑的指导RNA，如包括结合ADAR酶的茎环结构的指导RNA；或实现CRISPR编辑的指导RNA。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂包含4至50个连续核苷酸，其中连续核苷酸中的至少一个是修饰的核苷酸，并且其中所述反义多核苷酸剂的核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1、2、4、6、8或10任一个的核苷酸序列的等同区域80％互补。
在一个实施方式中，等同区域是表4中提供的SEQ ID NO:1的靶区域中的任一个。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂包含与表3中列出的任一个核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少8个连续核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的基本上所有核苷酸是修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的所有核苷酸是修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为10至40个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为10至30个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为18至30个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为10至24个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为18至24个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为14至20个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为14个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂的长度为20个核苷酸。
在一个实施方式中，修饰的核苷酸包含选自2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分的修饰糖部分。
在一个实施方式中，双环糖部分具有在糖环的2'氧和4'碳原子之间形成桥的(-CH2-)n基团，其中n是1或2，并且其中R是H、CH3或CH3OCH3。
在一个实施方式中，修饰的核苷酸是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，修饰的核苷酸包含修饰的核苷间键。
在一个实施方式中，修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
在一个实施方式中，调节剂包含在每一侧侧接至少一个具有修饰的糖部分的核苷酸的多个2'-脱氧核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂是包含位于5'和3'翼区段之间由连接的2'-脱氧核苷酸组成的间隙区段(gap segment)的间隔寡聚体(gapmer)。
在一个实施方式中，修饰的糖部分选自2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分。
在一个实施方式中，5'翼区段的长度为1到6个核苷酸。
在一个实施方式中，3'翼区段的长度为1到6个核苷酸。
在一个实施方式中，间隙区段的长度为5至14个核苷酸。
在一个实施方式中，5'翼区段的长度为2个核苷酸。
在一个实施方式中，3'翼区段的长度为2个核苷酸。
在一个实施方式中，5'翼区段的长度为3个核苷酸。
在一个实施方式中，3'翼区段的长度为3个核苷酸。
在一个实施方式中，5'翼区段的长度为4个核苷酸。
在一个实施方式中，3'翼区段的长度为4个核苷酸。
在一个实施方式中，5'翼区段的长度为5个核苷酸。
在一个实施方式中，3'翼区段的长度为5个核苷酸。
在一个实施方式中，间隙区段的长度为10个核苷酸。
在一个实施方式中，反义多核苷酸剂包含由连接的脱氧核苷酸组成的间隙区段；由连接的核苷酸组成的5’翼区段；由连接的核苷酸组成的3'-翼区段；其中间隙区段位于5’翼区段与3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷酸包含修饰的糖。
在一个实施方式中，间隙区段的长度为十个2'-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为五个核苷酸。
在一个实施方式中，间隙区段的长度为十个2'-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为四个核苷酸。
在一个实施方式中，间隙区段的长度为十个2'-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为三个核苷酸。
在一个实施方式中，间隙区段的长度为十个2'-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为两个核苷酸。
在一个实施方式中，修饰的糖部分选自2'-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2'-甲氧基修饰的糖部分、2'-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分。
在一个实施方式中，所有核苷酸包含修饰的核苷间键。
在一个实施方式中，调节剂还包含配体。
在一个实施方式中，调节剂在3'-末端与配体缀合。
在一个实施方式中，配体是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
在一个实施方式中，配体是
本发明还提供了含有本发明的任一调节剂的细胞和包含本发明的任一调节剂的药物组合物。
本发明的药物组合物可以包括在非缓冲溶液(例如盐水或水)中的调节剂，或者本发明的药物组合物可以包括在缓冲溶液(例如包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合的缓冲溶液；或磷酸盐缓冲盐水(PBS))中的调节剂。在一些实施方式中，药物组合物包含调节剂和脂质制剂，例如，脂质制剂包含LNP或脂质制剂包含MC3。
在一个方面中，本发明提供了抑制细胞中抑制素亚基βE(INHBE)的表达和/或活性的方法。该方法包括使细胞与本发明的任一调节剂或本发明的任一药物组合物接触，从而抑制细胞中INHBE基因的表达和/或活性。
在一个实施方式中，细胞在受试者内，例如人类受试者，例如患有代谢障碍(如糖尿病)或心血管疾病(如高血压)的受试者。
在某些实施方式中，INHBE表达和/或活性被抑制至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一个实施方式中，抑制INHBE的表达和/或活性使受试者血清中的INHBE蛋白水平降低至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。
在一个方面中，本发明提供了治疗患有将受益于抑制素亚基βE(INHBE)表达和/或活性降低的病症的受试者的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的任一调节剂或本发明的任一药物组合物，从而治疗患有将受益于INHBE表达降低的病症的受试者。
在另一个方面中，本发明提供了预防患有将受益于抑制素亚基βE(INHBE)表达和/或活性降低的病症的受试者中的至少一种症状的方法。该方法包括向受试者施用预防有效量的本发明的任一调节剂或本发明的任一药物组合物，从而预防患有将受益于INHBE表达降低的病症的受试者中的至少一种症状。
在一个实施方式中，施用治疗或预防有效量降低了受试者中针对体重指数调整的腰臀比。
在某些实施方式中，所述病症是代谢障碍，例如代谢综合征、碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病、脂质代谢障碍，例如高脂血症、高血压、心血管疾病、体重失调。
在一些实施方式中，INHBE相关病症是代谢综合征。
在一些实施方式中，INHBE相关病症是心血管疾病。
在一些实施方式中，INHBE相关病症是高血压。
在某些实施方式中，向受试者施用调节剂导致受试者中INHBE蛋白积累减少。
在进一步的方面中，本发明还提供了抑制受试者的INHBE的表达和/或活性的方法。该方法包括向受试者施用治疗有效量的本文提供的任一调节剂，从而抑制受试者的INHBE的表达和/或活性。
在一个实施方式中，受试者是人。
在一个实施方式中，调节剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于受试者。
在一个实施方式中，调节剂皮下施用于受试者。
在一个实施方式中，本发明的方法包括进一步测定来自受试者的样品中的INHBE水平。
在一个实施方式中，受试者样品中的INHBE水平是血液或血清或肝组织样品中的INHBE蛋白水平。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括向受试者施用另外的治疗剂。
在某些实施方式中，另外的治疗剂选自胰岛素、胰高血糖素样肽1激动剂、磺酰脲、司格列奈(seglitinide)、双胍、噻唑烷二酮、α-葡糖苷酶抑制剂、SGLT2抑制剂、DPP-4抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、他汀类和前述任何药剂的组合。
本发明还提供了试剂盒，其包含本发明的任一调节剂或本发明的任一药物组合物，以及任选地使用说明书。在一个实施方式中，本发明提供了用于进行抑制细胞中的INHBE的表达和/或活性的方法的试剂盒，该方法是通过使细胞与有效抑制细胞中的INHBE表达和/或活性的量的本发明的调节剂接触。该试剂盒包含调节剂和使用说明书，以及任选地，用于将调节剂施用于受试者的装置。
具体实施方式
本发明提供了包含抑制素亚基βE(INHBE)基因的调节剂(即抑制剂)的组合物，其用于治疗抑制素亚基βE(INHBE)相关病症，例如代谢障碍(例如代谢综合征)、碳水化合物障碍(例如II型糖尿病)、前驱糖尿病、脂质代谢障碍(例如高脂血症)、高血压、心血管疾病、体重失调。
以下详述公开了如何制备和使用含有调节剂的组合物以抑制INHBE的表达和/或活性，以及用于治疗将受益于INHBE的表达和/或活性的抑制和/或降低的受试者(例如易患或诊断患有INHBE相关病症的受试者)的组合物、用途和方法。
I.定义
为了可以更容易理解本发明，首先定义某些术语。此外，应当注意，每当列举参数的值或值的范围时，旨在所列举的值中间的值和范围也意图成为本发明的部分。
冠词“一(a)”和“一个(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件，例如多个元件。
术语“包括”在本文中用于表示短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。
除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在本文中用于表示术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用。例如，“有义链或反义链”理解为“有义链或者反义链或者有义链和反义链”
术语“约”在本文中用于表示在本领域中的典型公差范围内。例如，“约”可以理解为平均值的约2个标准偏差。在某些实施方式中，“约”意指±10％。在某些实施方式中，“约”意指±5％。在一系列数字或范围之前存在“约”时，应理解“约”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
在数字或一系列数字之前的术语“至少”、“不小于”或“或更多”被理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可以包括的所有后续数字或整数，如从上下文中清楚的。例如，核酸分子中核苷酸的数目必须是整数。例如，“21个核苷酸核酸分子的至少19个核苷酸”是指具有所示性质的19、20或21个核苷酸。当“至少”存在于一系列数字或范围之前时，应理解“至少”可以修饰该系列或范围中的每个数字。
如本文所用，“不超过”或“或更少”被理解为与短语相邻的值以及逻辑上较低值或整数，如从上下文符合逻辑地，至零。例如，具有“不超过2个核苷酸”的突出端的双链体具有2、1或0个核苷酸的突出端。在一系列数字或范围之前存在“不超过”时，应当理解，“不超过”可以修饰该系列或范围中的每个数字。如本文所用，范围包括上限和下限。
如本文所用，检测方法可包括确定存在的分析物的量低于该方法的检测水平。
在指定的靶位点与有义链或反义链的核苷酸序列之间存在冲突的情况下，指定的序列优先。
在序列与其在转录物或其他序列上的指定位点之间存在冲突的情况下，本说明书中所述的核苷酸序列优先。
如本文所用，“调节剂”是降低或提高INHBE的表达和/或活性的分子。
如本文所用，与术语“INHBE”可互换使用的“抑制素亚基βE”是指属于转化生长因子β(TGF-β)家族的生长因子。INHBE mRNA主要在肝脏中表达(Fang J.等，Biochemical&Biophysical Res.Comm.1997；231(3):655-61)，并且INHBE参与肝细胞生长和分化的调节(Chabicovsky M.等，Endocrinology.2003；144(8)：3497-504)。INHBE也称为抑制素βE链、激活素βE、抑制素βE亚基、抑制素βE和MGC4638。
人INHBE mRNA转录物的序列可见于例如GenBank登录号GI:1877089956(NM_031479.5；SEQ ID NO:1；反向互补序列，SEQ ID NO:2)。小鼠INHBE mRNA的序列可见于例如GenBank登录号GI:1061899809(NM_008382.3；SEQ ID NO:3；反向互补序列，SEQ ID NO:4)。大鼠INHBe mRNA的序列可见于例如GenBank登录号GI:148747589(NM_031815.2；SEQ IDNO:5；反向互补序列，SEQ ID NO:6)。恒河猴INHBE mRNA的预测序列可见于例如GenBank登录号GI:1622845604(XM_001115958.3；SEQ ID NO:7；反向互补序列，SEQ ID NO:8)。
INHBE mRNA序列的其他实例可通过公众可得的数据库容易地获得，例如GenBank、UniProt、OMIM和Macaca基因组计划网站。
关于INHBE的进一步信息可以在例如www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝INHBE找到。
上述GenBank登录号和基因数据库号中的每一个的全部内容如本申请提交日通过引用并入本文。
如本文所用，术语INHBE还指INHBE基因的变异，包括SNP数据库中提供的变体。已经鉴定了INHBE基因内的许多序列变异，并且可以在例如NCBI dbSNP和UniProt处找到(参见，例如，www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝INHBE，其全部内容如在本申请提交日通过引用并入本文。
如本文所用，“靶序列”是指在INHBE基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的连续部分，包括作为初级转录产物的RNA加工产物的mRNA。
在一个实施方式中，序列的靶部分至少足够长以用作在INHBE基因转录期间形成的mRNA分子的核苷酸序列的该部分处或附近的iRNA指导的切割的底物。在另一个实施方式中，靶序列是与本发明的反义多核苷酸剂特异性杂交的核酸分子。
靶序列的长度可以为约19-36个核苷酸，例如长度为约19-30个核苷酸。例如，靶序列的长度可以是约19-30个核苷酸，19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸。在某些实施方式中，靶序列的长度为19-23个核苷酸，任选地长度21-23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的部分。
如本文所用，术语“包含序列的链”是指包含通过使用标准核苷酸命名法提及的序列描述的核苷酸链的寡核苷酸。
“G”、“C”、“A”、“T”和“U”各自通常分别代表含有鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解，术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指修饰的核苷酸，如下文进一步详述的，或代理替代部分(参见例如表1)。本领域技术人员熟知，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以被其他部分替代，而基本上不改变包含带有这种替代部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对性质。例如但不限于，包含肌苷作为其碱基的核苷酸可以与含有腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，含有尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明所述的寡核苷酸的核苷酸序列中被含有例如肌苷的核苷酸替代。在另一个实例中，寡核苷酸中任何位置的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别被鸟嘌呤和尿嘧啶替代，以与靶mRNA形成G-U Wobble碱基配对。含有此类替代部分的序列适用于本发明所述的组合物和方法。
如本文可互换使用的术语“iRNA”、“RNAi剂”、“iRNA剂”、“RNA干扰剂”是指含有RNA的试剂，如本文中该术语所定义的，并且其通过RNA诱导的沉默复合物(RISC)途径介导RNA转录物的靶向切割。iRNA通过称为RNA干扰(RNAi)的过程指导mRNA的序列特异性降解。iRNA调节(例如抑制)细胞(例如受试者如哺乳动物受试者内的肝细胞)中INHBE基因的表达。
在一个实施方式中，本发明的RNAi剂包括与靶RNA序列(例如INHBE靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割的单链RNA。不希望受理论束缚，据认为引入细胞中的长双链RNA被称为Dicer的III型核酸内切酶分解成siRNA(Sharp等，(2001)Genes Dev.15:485)。Dicer，一种核糖核酸酶-III样酶，将dsRNA加工成19-23个碱基对的短干扰RNA，其具有特征性的两碱基3'突出端(Bernstein等，(2001)Nature 409：363)。然后将siRNA并入RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，其中一个或多个解旋酶将siRNA双链体解旋，使互补的反义链能够指导靶标识别(Nykanen等，(2001)Cell 107：309)。在与适当的靶mRNA结合后，RISC内的一种或多种核酸内切酶切割靶标以诱导沉默(Elbashir等，(2001)Genes Dev.15:188)。因此，在一个方面中，本发明涉及在细胞内产生的单链RNA(siRNA)，其促进RISC复合物的形成以实现靶基因(即INHBE基因)的沉默。因此，术语“siRNA”在本文中也用于指如上所述的iRNA。
在某些实施方式中，RNAi剂可以是单链siRNA(ssRNAi)，其被引入细胞或生物体中以抑制靶mRNA。单链RNAi剂与RISC核酸内切酶Argonaute 2结合，然后其切割靶mRNA。单链siRNA通常是15-30个核苷酸并且是化学修饰的。单链siRNA的设计和测试描述于美国专利No.8,101,348和Lima等，(2012)Cell 150：883-894中，其各自的全部内容通过引用并入本文。本文所述的任何反义核苷酸序列可以用作如本文所述的单链siRNA或通过Lima等，(2012)Cell 150：883-894中描述的方法进行化学修饰。
在某些实施方式中，用于本发明的组合物、用途和方法中的“iRNA”是双链RNA，并且在本文中称为“双链RNA剂”、“双链RNA(dsRNA)分子”、“dsRNA剂”或“dsRNA”。术语“dsRNA”是指核糖核酸分子的复合物，其具有包含两条反平行且基本上互补的核酸链的双链体结构，相对于靶RNA(即INHBE基因)称为具有“有义”和“反义”取向。在本发明的一些实施方式中，双链RNA(dsRNA)通过本文称为RNA干扰或RNAi的转录后基因沉默机制触发靶RNA(例如mRNA)的降解。
通常，本发明的寡核苷酸，例如dsRNA分子的每条链，的大多数核苷酸是核糖核苷酸，但是如本文详细描述的，每条链或两条链还可以包括一个或多个非核糖核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或修饰的核苷酸。此外，如本说明书中所用，“iRNA”或“反义多核苷酸剂”可包括具有化学修饰的核糖核苷酸；iRNA或反义多核苷酸剂可以包括在多个核苷酸处的实质性修饰。如本文所用，术语“修饰的核苷酸”是指独立地具有修饰的糖部分、修饰的核苷酸间键或修饰的核碱基或其任何组合的核苷酸。因此，术语修饰的核苷酸涵盖例如对核苷间键、糖部分或核碱基的官能团或原子的取代、添加或去除。适用于本发明试剂的修饰包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求书的目的，“iRNA”或“RNAi剂”或“反义多核苷酸剂”涵盖如在siRNA型分子中使用的任何此类修饰。
在本公开的某些实施方式中，如果存在于RNAi剂或反义多核苷酸剂内，则可以认为包含脱氧核苷酸构成修饰的核苷酸。
RNAi剂的双链体区域可以具有允许通过RISC途径特异性降解所需靶RNA的任何长度，并且长度可以在约19至36个碱基对的范围内，例如，长度约19-30个碱基对，例如，长度约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35或36个碱基对，如，长度约19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-26、19-25、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。在某些实施方式中，双链体区的长度为19-21个碱基对，例如长度为21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的部分。
形成RNAi分子的双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者它们可以是单独的RNA分子。在两条链是一个较大分子的部分，且因此通过一条链的3’-端和各自另一条链的5’-端之间的不间断的核苷酸链连接形成双链体结构的情况下，连接的RNA链被称为“发夹环”。发夹环可包含至少一个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、23个或更多个未配对核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是10个或更少的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是8个或更少的未配对核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是4-10个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，发夹环可以是4-8个核苷酸。
在dsRNA的两条基本上互补的链由单独的RNA分子构成的情况下，这些分子不需要但可以共价连接。在两条链通过不同于一条链的3’-端和相应另一条链的5’-端之间的不间断核苷酸链的方式共价连接形成双链体结构的情况中，连接结构称为“接头”。RNA链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是dsRNA的最短链中的核苷酸数目减去双链体中存在的任何突出端。除了双链体结构之外，RNAi可以包含一个或多个核苷酸突出端。在RNAi剂的一个实施方式中，至少一条链包含至少1个核苷酸的3'突出端。在另一个实施方式中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、14或15个核苷酸的3'突出端。在其他实施方式中，RNAi剂的至少一条链包含至少1个核苷酸的5'突出端。在某些实施方式中，至少一条链包含至少2个核苷酸，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸的5'突出端。在再其他实施方式中，RNAi剂的一条链的3'和5'端均包含至少1个核苷酸的突出端。
在某些实施方式中，本发明的iRNA剂是dsRNA，其每条链包含19-23个核苷酸，其与靶RNA序列(例如INHBE基因)相互作用以指导靶RNA的切割。
在一些实施方式中，本发明的iRNA是24-30个核苷酸的dsRNA，其与靶RNA序列(例如INHBE靶mRNA序列)相互作用以指导靶RNA的切割。
如本文所用，术语“核苷酸突出端”是指从双链iRNA的双链体结构突出的至少一个未配对核苷酸。例如，在dsRNA的一条链的3'端延伸超出另一条链的5'端时，或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsRNA可包含至少一个核苷酸的突出端；或者，突出端可包含至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个核苷酸或更多个核苷酸。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端。
在一个实施方式中，dsRNA的反义链在3'端或5'端具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在一个实施方式中，dsRNA的有义链在3'端或5'端具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在另一个实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
在某些实施方式中，dsRNA的反义链在3'端或5'端具有1-10个核苷酸，例如0-3、1-3、2-4、2-5、4-10、5-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在一个实施方式中，dsRNA的有义链在3'端或5'端具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在另一个实施方式中，突出端中的一个或多个核苷酸被核苷硫代磷酸酯替代。
在某些实施方式中，dsRNA的反义链在3'端或5'端具有1-10个核苷酸，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的突出端。在某些实施方式中，有义链或反义链或两者上的突出端可以包括长于10个核苷酸的延伸长度，例如长度为1-30个核苷酸、2-30个核苷酸、10-30个核苷酸、10-25个核苷酸、10-20个核苷酸或10-15个核苷酸。在某些实施方式中，延伸的突出端在双链体的有义链上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体的有义链的3'端上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体的有义链的5'端上。在某些实施方式中，延伸的突出端在双链体的反义链上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体的反义链的3'端上。在某些实施方式中，延伸的突出端存在于双链体的反义链的5'端上。在某些实施方式中，延伸的突出端的一个或多个核苷酸可以是用核苷硫代磷酸酯替代。在某些实施方式中，突出端包括自身互补部分，使得突出端能够形成在生理条件下稳定的发夹结构。
“钝”或“平端”意指在双链RNA剂的该末端没有未配对的核苷酸，即没有核苷酸突出端。“平端的”双链RNA剂在其整个长度上是双链的，即在分子的任一端没有核苷酸突出端。本发明的RNAi剂包括在一端没有核苷酸突出端的RNAi剂(即，具有一个突出端和一个平端的试剂)或在任一端没有核苷酸突出端的RNAi剂。最常见的是，这种分子在其整个长度上是双链的。
术语“反义链”或“引导链”是指iRNA(例如dsRNA)的链，其包括与靶序列(例如INHBE mRNA)基本上互补的区域。
如本文所用，术语“互补区域”是指dsRNA剂的反义链上的区域或反义多核苷酸剂的区域，其与本文所定义的序列(例如靶序列，例如INHBE核苷酸序列)基本上互补。在互补区与靶序列不完全互补的情况下，错配可以在分子的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配在末端区域中，例如在iRNA的5'-或3'-端的5、4或3个核苷酸内。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂或反义多核苷酸剂包括反义链中的核苷酸错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂或反义多核苷酸剂的反义链包括与靶mRNA的不超过4个错配，例如，反义链包括与靶mRNA的4、3、2、1或0个错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂反义链包括与有义链的不超过4个错配，例如，反义链包括与有义链的4、3、2、1或0个错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂在有义链中包括核苷酸错配。在一些实施方式中，本发明的双链RNA剂的有义链包括与反义链的不超过4个错配，例如，有义链包括与反义链的4、3、2、1或0个错配。在一些实施方式中，核苷酸错配例如在iRNA的3'-端的5、4、3个核苷酸内。在另一个实施方式中，核苷酸错配例如在iRNA剂的3'末端核苷酸中。在一些实施方式中，错配不在种子区中。
因此，如本文所述的RNAi剂或反义多核苷酸剂可含有与靶序列的一个或多个错配。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂或反义多核苷酸剂含有不超过3个错配(即，3、2、1或0个错配)。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂或反义多核苷酸剂含有不超过2个错配。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂或反义多核苷酸剂含有不超过1个错配。在一个实施方式中，如本文所述的RNAi剂或反义多核苷酸剂含有0个错配。在某些实施方式中，如果RNAi剂或反义多核苷酸剂的反义链含有与靶序列的错配，则错配可以任选地限制在互补区的5'-或3'-端的最后5个核苷酸内。例如，在这样的实施方式中，对于23个核苷酸的RNAi剂，与INHBE基因的区域互补的链通常在中心13个核苷酸内不含任何错配。本文所述的方法或本领域已知的方法可用于确定含有与靶序列的错配的RNAi剂或反义多核苷酸剂是否有效抑制INHBE基因的表达。考虑具有错配的RNAi剂或反义多核苷酸剂在抑制INHBE基因表达中的功效是重要的，特别是如果已知INHBE基因中的特定互补区在群体内具有多态性序列变异。
如本文所用的术语“有义链”或“乘客链”是指包括与反义链的区域基本上互补的区域的iRNA链，如该术语在本文中定义的。
如本文所用，“基本上所有的核苷酸是修饰的”是大部分但不是完全是修饰的，并且可以包括不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
如本文所用，术语“切割区域”是指紧邻切割位点的区域。切割位点是靶标上发生切割的位点。在一些实施方式中，切割区域包含在切割位点的任一端和紧邻切割位点的三个碱基。在一些实施方式中，切割区域包含在切割位点的任一端和紧邻切割位点的两个碱基。在一些实施方式中，切割位点特异性地出现在由反义链的核苷酸10和11结合的位点处，并且切割区域包含核苷酸11、12和13。
如本文所用，并且除非另有说明，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，是指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在某些条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链体结构的能力，如本领域技术人员理解的。这样的条件可以是例如严格条件，其中严格条件可以包括：400mM NaCl、40mMPIPES pH6.4、1mM EDTA、50℃或70℃持续12-16小时，然后洗涤(参见例如MolecularCloning:A Laboratory Manual，Sambrook等(1989)Cold Spring Harbor LaboratoryPress)。可以应用其他条件，如生物体内可能遇到的生理相关条件。本领域技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用确定最适合于测试两个序列的互补性的一组条件。
如本文所述的互补序列包括在一个或两个核苷酸序列的整个长度上包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸的碱基配对。此类序列在本文中可被称为相对于彼此“完全互补”。然而，在本文中第一序列相对于第二序列被称为“基本上互补”的情况中，两个序列可以是完全互补的，或者它们可以在杂交至多30个碱基对的双链体时形成一个或多个，但通常不超过5、4、3或2个错配的碱基对，同时保留在与其最终应用最相关的条件下杂交的能力，例如在体外或体内抑制基因表达。然而，在两个寡核苷酸被设计成在杂交时形成一个或多个单链突出端时，此类突出端不应被视为关于互补性确定的错配。例如，出于本文所述的目的，包含长度为21个核苷酸的一个寡核苷酸和长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸的dsRNA，其中较长的寡核苷酸包含与较短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列，仍然可以被称为“完全互补”。
如本文所用，“互补”序列还可以包括非Watson-Crick碱基对或由非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，或完全由其形成，只要满足关于其杂交能力的上述要求即可。此类非Watson-Crick碱基对包括但不限于G:U Wobble或Hoogsteen碱基配对。
本文中的术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可以关于dsRNA的有义链和反义链之间，或两个寡核苷酸或多核苷酸(例如双链RNA剂的反义链和靶序列)之间的碱基匹配来使用，如从其使用的上下文中所理解的。
如本文所用，“与信使RNA(mRNA)的至少一部分基本上互补”的多核苷酸是指与感兴趣的mRNA(例如编码INHBE基因的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果序列与编码INHBE基因的mRNA的非中断部分基本上互补，则多核苷酸与INHBE mRNA的至少一部分互补。
因此，在一些实施方式中，本文公开的反义多核苷酸与靶INHBE序列完全互补。在其他实施方式中，本文公开的反义多核苷酸与靶INHBE序列基本上互补，并且包含在其整个长度上与SEQ ID NO:1、3、5、7或9任一个的核苷酸序列或SEQ ID NO:1、3、5、7或9任一个的片段的等同区域至少80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％互补。
在其他实施方式中，本文公开的反义多核苷酸与靶INHBE序列基本上互补，并且包含在其整个长度上与表2-5任一中的任一个有义链核苷酸序列或表2-5任一中的任一个有义链核苷酸序列的片段至少约80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一个实施方式中，本公开的RNAi剂包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链，所述反义多核苷酸又与靶INHBE序列相同，并且其中有义链多核苷酸包含在其整个长度上与SEQ ID NO:2、4、6、8或10的核苷酸序列或SEQ ID NO:2、4、6、8或10任一个的片段的等同区域至少约80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
在一些实施方式中，本发明的iRNA包括与反义多核苷酸基本上互补的有义链，该反义多核苷酸又与靶INHBE序列互补，并且其中有义链多核苷酸包含在其整个长度上与表2-3任一中的任一反义链核苷酸序列，或表2-3任一中的任一反义链核苷酸序列的片段至少约80％互补的连续核苷酸序列，如约85％、约90％、约91％、约91％互补。约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％互补。
通常，“iRNA”包括具有化学修饰的核糖核苷酸。此类修饰可包括本文公开的或本领域已知的所有类型的修饰。出于本说明书和权利要求书的目的，“iRNA”涵盖如dsRNA分子中所用的任何此类修饰。
在本公开的某些实施方式中，如果存在于RNAi剂内，包含脱氧核苷酸可被认为构成修饰的核苷酸。
如本文可互换使用的术语“多核苷酸剂”、“反义多核苷酸剂”、“反义化合物”和“试剂”是指包含单链寡核苷酸的试剂，所述单链寡核苷酸含有如本文所定义的术语RNA并且靶向编码INHBE的核酸分子(例如，编码INHBE的mRNA，如在例如SEQ ID NO:1、3、5、7或9的任一中提供的)。反义多核苷酸剂通过氢键键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合)与靶核酸分子特异性结合，并干扰靶核酸的正常功能(例如，通过反义作用机制)。本发明的多核苷酸剂对靶核酸功能的这种干扰或调节被称为“反义抑制”。
待干扰的靶核酸分子的功能可以包括如，例如RNA转位至蛋白质翻译位点、从RNA翻译蛋白质、RNA剪接以产生一种或多种mRNA种类，以及可以参与RNA或由RNA促进的催化活性的功能。
在一些实施方式中，反义抑制是指与不存在反义多核苷酸剂的情况下的靶核酸水平或靶蛋白水平相比，在存在与靶核酸互补的反义多核苷酸试剂的情况下“抑制”细胞(例如受试者如哺乳动物受试者内的细胞)中靶核酸水平或靶蛋白水平的“表达”。例如，本发明的反义多核苷酸剂可以通过与mRNA的碱基配对并物理地阻碍翻译机制以化学计量的方式抑制翻译，参见Dias,N.等人(2002)Mol Cancer Ther 1:34 7-355。
术语“抗体”在本文中以其最宽泛的含义使用，并且包括包含一个或多个特异性结合抗原或表位的抗原结合结构域的某些类型的免疫球蛋白分子。如本文所用的术语“抗体”是指至少包含单结构域抗体(sdAb)的互补决定区(CDR)1、CDR2和CDR3的分子，其中分子能够结合抗原。术语“抗体”还指至少包含重链的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链的CDR1、CDR2和CDR3的分子，其中所述分子能够结合抗原。术语“抗体”还包括能够结合抗原的片段，例如Fv、单链Fv(scFv)、Fab、Fab'和(Fab')2。术语抗体还包括嵌合抗体、人源化抗体和各种物种(如小鼠、人、食蟹猴、美洲驼、骆驼等)的抗体。该术语还包括多价抗体，如二价或四价抗体。多价抗体包括例如包含多个抗原结合(含CDR)结构域的单多肽链，以及各自含有一个或多个抗原结合结构域的两条或更多条多肽链，此类两条或更多条多肽链例如通过能够形成二硫键或任何其他共价或非共价相互作用的铰链区彼此结合。
如本文所用的术语“重链可变区”是指包含重链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方式中，重链可变区还包含FR1的至少一部分和/或FR4的至少一部分。在一些实施方式中，重链CDR1对应于Kabat残基26至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；和重链CDR3对应于Kabat残基95至102。参见例如Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，Md.)；以及图1。在一些实施方式中，重链CDR1对应于Kabat残基31至35；重链CDR2对应于Kabat残基50至65；和重链CDR3对应于Kabat残基95至102。参见同上。
如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域CHI、CH2和CH3的区域。非限制性示例重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性示例重链恒定区还包括ε和μ。每个重链恒定区对应于抗体同种型。例如，包含γ恒定区的抗体是IgG抗体，包含δ恒定区的抗体是IgD抗体，并且包含α恒定区的抗体是IgA抗体。此外，包含μ恒定区的抗体是IgM抗体，并且包含ε恒定区的抗体是IgE抗体。某些同种型可以进一步细分为亚类。例如，IgG抗体包括但不限于IgGl(包含γ1恒定区)、IgG2(包含γ2恒定区)、IgG3(包含γ3恒定区)和IgG4(包含γ4恒定区)抗体；IgA抗体包括但不限于IgA1(包含α1恒定区)和IgA2(包含α2恒定区)抗体；且IgM抗体包括但不限于IgMl和IgM2。
如本文所用的术语“重链”(缩写为HC)是指包含至少重链可变区的多肽，其具有或不具有前导序列。在一些实施方式中，重链包含重链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长重链”是指包含重链可变区和重链恒定区的多肽，具有或不具有前导序列。
如本文所用的术语“轻链可变区”是指包含轻链CDR1、框架(FR)2、CDR2、FR3和CDR3的区域。在一些实施方式中，轻链可变区还包含FR1和/或FR4。在一些实施方式中，轻链CDR1对应于Kabat残基24至34；轻链CDR2对应于Kabat残基50至56；并且轻链CDR3对应于Kabat残基89至97。参见例如Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(1987和1991，NIH，Bethesda，Md.)。
如本文所用的术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域CL的区域。非限制性示例轻链恒定区包括λ和κ。
如本文所用的术语“轻链”(缩写LC)是指包含至少轻链可变区的多肽，其具有或不具有前导序列。在一些实施方式中，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区的多肽，具有或不具有前导序列。
如本文所用，“分离的抗体”意指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合INHBE的分离的抗体基本上不含特异性结合INHBE以外的抗原的抗体)。然而，特异性结合INHBE的分离的抗体可以与其他抗原(如来自其他物种的INHBE分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞材料和/或化学物质。
如本文所用的“嵌合抗体”是指包含来自第一物种(如小鼠、大鼠、食蟹猴等)的至少一个可变区和来自第二物种(如人、食蟹猴等)的至少一个恒定区的抗体。在一些实施方式中，嵌合抗体包含至少一个小鼠可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体包含至少一个食蟹猴可变区和至少一个人恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体包含至少一个大鼠可变区和至少一个小鼠恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体的所有可变区来自第一物种，并且嵌合抗体的所有恒定区来自第二物种。
如本文所用的“人源化抗体”是指其中非人可变区的框架区中的至少一个氨基酸被来自人可变区的相应氨基酸替换的抗体。在一些实施方式中，人源化抗体包含至少一个人恒定区或其片段。在一些实施方式中，人源化抗体是sdAb、Fab、scFv、(Fab’)2等。人源化抗体可以选自任何类别的免疫球蛋白，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。人源化抗体可以包含来自多于一个类别或同种型的序列，并且可以使用本领域熟知的技术选择特定的恒定结构域以优化所需的效应子功能。
如本文所用的“人抗体”是指在人中产生的抗体，在包含人免疫球蛋白基因的非人动物(如)中产生的抗体，以及使用体外方法(如噬菌体展示)选择的抗体，其中抗体库基于人免疫球蛋白序列。
本文可互换使用的术语“特异性结合INHBE的抗体或其抗原结合片段”或“抗INHBE抗体或其抗原结合片段”是指与INHBE(例如人INHBE)特异性结合的抗体或其抗原结合片段。“结合”目的抗原(即INHBE)的抗体是能够以足够的亲和力结合该抗原的抗体，使得该抗体可用于靶向表达该抗原的细胞。在某些实施方式中，抗体特异性地结合人INHBE。除非另有说明，术语“抗INHBE抗体”意指与野生型INHBE、INHBE的变体或异形体结合的抗体。
在一个实施方式中，如本文所用，短语“与INHBE特异性结合”或“与INHBE的特异性结合”是指抗INHBE抗体以约2,000nM或更低、约1,000nM或更低、约500nM或更低、约200nM或更低、约100nM或更低、约75nM或更低、约25nM或更低、约21nM或更低、约12nM或更低、约11nM或更低、约10nM或更低、约9nM或更低、约8nM或更低、约7nM或更低、约6nM或更低、约5nM或更低、约4nM或更低、约3nM或更低、约2nM或更低、约1nM或更低、约0.5nM或更低、约0.3nM或更低、约0.1nM或更低、约0.01nM或更低或约0.001nM或更低的解离常数(KD)与INHBE相互作用的能力。在另一个实施方式中，如本文所用，短语“与INHBE特异性结合”或“与INHBE的特异性结合”是指抗INHBE抗体以约1pM(0.001nM)至2,000nM、约500pM(0.5nM)至1,000nM、约500pM(0.5nM)至500nM、约1nM至200nM、约1nM至100nM、约1nM至50nM、约1nM至20nM或约1nM至5nM的解离常数(KD)与INHBE相互作用的能力。在一个实施方式中，KD通过表面等离子体共振或通过本领域已知的任何其他方法测定。
术语“Kabat编号”、“Kabat定义”和“Kabat标记”在本文中可互换使用。本领域公认的这些术语是指对与抗体或其抗原结合部分的重链和轻链可变区中的其他氨基酸残基更可变(即高变)的氨基酸残基进行编号的系统(Kabat等(1971)Ann.NY Acad，Sci.190:382-391和Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH Publication No.91-3242)。对于重链可变区，高变区的范围对于CDR1为氨基酸位置31至35，对于CDR2为氨基酸位置50至65，并且对于CDR3为氨基酸位置95至102。对于轻链可变区，高变区范围对于CDR1为氨基酸位置24至34，对于CDR2为氨基酸位置50至56，并且对于CDR3为氨基酸位置89至97。
如本文所用，术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链(HC)和轻链(LC)的每个可变区中存在三个CDR，其对于每个可变区命名为CDR1、CDR2和CDR3(或具体地HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。如本文所用的术语“CDR组”是指存在于能够结合抗原的单个可变区中的三个CDR的组。根据不同的系统，这些CDR的确切边界被不同地定义。Kabat(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.)；(1987)和(1991))描述的系统不仅提供了应用于抗体的任何可变区的明确的残基编号系统，而且提供了限定三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia&Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和Chothia等，Nature 342:877-883(1989))发现Kabat CDR内的某些亚部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些亚部分被命名为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指称轻链和重链区。这些区域可以称为Chothia CDR，其具有与Kabat CDR重叠的边界。Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))已经描述了限定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界。其他CDR边界定义可能不严格遵循上述系统之一，但仍然与Kabat CDR重叠，尽管根据特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可能被缩短或延长。本文使用的方法可以利用根据这些系统中任一个定义的CDR，尽管优选的实施方式使用Kabat或Chothia定义的CDR。
如本文所用，术语“框架”或“框架序列”是指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的确切定义可以通过不同的系统确定，所以框架序列的含义进行相应不同的解释。六个CDR(轻链的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3以及重链的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)还将轻链和重链上的框架区在每条链上分成四个亚区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，并且CDR3位于FR3和FR4之间。在不将特定亚区指定为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，如另外地所提及的框架区代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合FR。如本文所用，FR表示四个亚区中的一个，并且FR表示构成框架区的四个亚区中的两个或更多个。
人源化抗体的框架区和CDR区不需要与亲本序列精确对应，例如，供体抗体CDR或共有框架区可以通过至少一个氨基酸残基的置换、插入和/或缺失进行诱变，使得该位点处的CDR或框架残基不对应于供体抗体或共有框架。然而，在优选的实施方式中，此类突变将不是广泛的。通常，至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、最优选至少95％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的那些残基。如本文所用，术语“共有框架”是指共有免疫球蛋白序列中的框架区。如本文所用，术语“共有免疫球蛋白序列”是指由相关免疫球蛋白序列家族中最频繁出现的氨基酸(或核苷酸)形成的序列(参见例如Winnaker，From Genesto Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，德国1987))。在免疫球蛋白家族中，共有序列中的每个位置被家族中该位置处最频繁出现的氨基酸占据。如果两个氨基酸以同等频率出现，则共有序列中可以包括任一个。
术语“表位”是指被抗体或抗体片段结合的抗原区域。在某些实施方式中，表位决定簇包括分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施方式中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。在某些实施方式中，当在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，抗体被称为特异性结合抗原。
如本文所用，术语“表面等离子体共振”是指允许通过检测生物传感基质内蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性相互作用的光学现象，例如使用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，Sweden和Piscataway，NJ)。对于进一步的描述，参见U.等(1993)Ann.Biol.Clin.51:19-26；U.等(1991)Biotechniques11：620-627；Johnsson，B.等(1995)J.Mol.Recognit 8:12 5-131；和Johnson，B.等(1991)Anal.Biochem.198:268-277。
如本文所用，术语“kon”或“ka”意指抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
如本文所用，术语“koff”或“ka”意指抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。
如本文所用，术语“KD”意指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。KD通过ka/kd计算。在一个实施方式中，本发明的抗体的KD为约2,000nM或更小、约1,000nM或更小、约500nM或更小、约200nM或更小、约100nM或更小、约75nM或更小、约25nM或更小、约21nM或更小、约12nM或更小、约11nM或更小、约10nM或更小、约9nM或更小、约8nM或更小、约7nM或更小、约6nM或更小、约5nM或更小、约4nM或更小。约3nM或更小、约2nM或更小、约1nM或更小、约0.5nM或更小、约0.3nM或更小、约0.1nM或更小、约0.01nM或更小或者约0.001nM或更小。
如本文所用，短语“使细胞与调节剂(如反义多核苷酸剂)接触”包括通过任何可能的方式接触细胞。使细胞与调节剂接触包括使细胞在体外与调节剂接触或使细胞在体内与调节剂接触。接触可以直接或间接进行。因此，例如，可以通过执行该方法的个体使调节剂与细胞物理接触，或者可选地，可以使调节剂处于允许或导致其随后与细胞接触的情况。
在体外接触细胞可以例如通过将细胞与调节剂一起孵育来进行。在体内接触细胞可以例如通过将调节剂注射到细胞所在的组织中或附近，或通过将调节剂注射到另一区域(例如血流或皮下空间)中，使得调节剂随后将到达待接触的细胞所在的组织来进行。例如，调节剂(例如iRNA)可以含有配体(例如GalNAc)或与配体偶联，所述配体将iRNA引导至目的位点，例如肝脏。体外和体内接触方法的组合也是可能的。例如，细胞也可以在体外与调节剂接触，随后移植到受试者中。
在某些实施方式中，使细胞与调节剂接触包括通过促进或实现摄取或吸收到细胞中来将调节剂“引入”或“递送到细胞中”。iRNA的吸收或摄取可以通过无辅助的扩散或主动细胞过程，或通过辅助试剂或装置发生。将调节剂引入细胞中可以是体外或体内的。例如，对于体内引入，可以将调节剂注射到组织部位或全身施用。体外引入细胞中包括本领域已知的方法，如电穿孔和脂质转染。进一步的方法在下文中描述或者是本领域已知的。
术语“脂质纳米颗粒”或“LNP”是包含脂质层的囊泡，该脂质层包封药物活性分子，如核酸分子，例如iRNA或iRNA从其转录的质粒。LNP描述于例如美国专利No.6,858,225、6,815,432、8,158,601和8,058,069中，其全部内容通过引用并入本文。
如本文所用，“受试者”是内源性或异源性地表达靶基因的动物，如哺乳动物，包括灵长类动物(如人、非人灵长类动物，例如猴和黑猩猩)、非灵长类动物(如牛、猪、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠或小鼠)或鸟。在一个实施方式中，受试者是人，如正在治疗或评估受益于INHBE表达和/或活性降低的疾病或病症的人；处于受益于INHBE表达和/或活性降低的疾病或病症风险中的人；患有受益于INHBE表达和/或活性降低的疾病或病症的人；或待治疗受益于如本文所述的INHBE表达和/或活性降低的疾病或病症的人。在一些实施方式中，受试者是人类女性。在其他实施方式中，受试者是人类男性。在一个实施方式中，受试者是成年受试者。在另一个实施方式中，受试者是儿科受试者。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“处理(treatment)”是指有益的或期望的结果，如减少受试者中INHBE相关病症的至少一种体征或症状。治疗还包括减少与不想要的INHBE表达和/或活性相关的一种或多种体征或症状；减少不想要的INHBE激活或稳定的程度；改善或减轻不想要的INHBE激活或稳定。“治疗”还可以意指与不存在治疗的情况下的预期存活相比延长存活。
在受试者的INHBE水平或疾病标志物或症状的上下文中，术语“较低”是指这种水平的统计学显著降低。降低可以是例如至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多。在某些实施方式中，降低是至少20％。在某些实施方式中，降低是疾病标志物(例如蛋白质或基因表达水平)的至少50％。在受试者中的INHBE水平的上下文中，“较低”是降低至在没有这种病症的个体的正常范围内接受的水平。在某些实施方式中，“较低”是患有疾病的受试者的标志物或症状的水平与在个体的正常范围内可接受的水平之间的差异的降低。术语“较低”也可以与疾病或病症的症状正常化相关联地使用，即将患有INHBE相关病症的受试者中的水平之间的差异朝向未患INHBE相关病症的正常受试者中的水平降低或降低至未患INHBE相关病症的正常受试者中的水平。如本文所用，如果疾病与症状的升高的值相关，则“正常”被认为是正常值的上限。如果疾病与症状值降低相关，则“正常”被认为是正常值的下限。
如本文所用，“预防(prevention)”或“防止(preventing)”用于提及疾病、障碍或病症可以通过降低INHBE的表达和/或活性来治疗或改善时，是指受试者将发展与这种疾病、病症或病况相关的症状(例如INHBE相关病症，例如代谢障碍，例如糖尿病的症状)的可能性降低。不发生疾病、障碍或病症，或与这种疾病、障碍或病症相关的症状的发生减少(例如，在该疾病或病症的临床上可接受的量表上至少约10％)，或表现出延迟的症状(例如，数天、数周、数月或数年)被认为是有效的预防。
如本文所用，术语“抑制素βE亚基相关病症”或“INHBE相关病症”是由INHBE基因表达或INHBE蛋白产生和/或活性引起或与其相关的疾病或病症，术语“INHBE相关病症”包括受益于INHBE基因表达、复制或蛋白活性降低的疾病、障碍或病症。在一些实施方式中，INHBE相关病症是代谢障碍，例如代谢综合征。
如本文所用，“代谢障碍”是指破坏正常代谢(在细胞水平上将食物转化为能量的过程)的任何疾病或病症。代谢疾病影响细胞进行涉及蛋白质(氨基酸)、碳水化合物(糖和淀粉)或脂质(脂肪酸)的加工或转运的关键生化反应的能力。代谢疾病的非限制性实例包括碳水化合物的障碍，例如糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、半乳糖血症、遗传性果糖不耐受、果糖1,6-二磷酸酶缺乏、糖原贮积障碍、先天性糖基化障碍、胰岛素抵抗、胰岛素不足、高胰岛素血症、葡萄糖耐量受损(IGT)、糖原代谢异常；氨基酸代谢障碍，例如枫糖尿病(MSUD)或高胱氨酸尿症；有机酸代谢障碍，例如甲基丙二酸尿症、3-甲基戊烯二酸尿症-Barth综合征、戊二酸尿症或2-羟基戊二酸尿症-D和L型；脂肪酸β-氧化障碍，例如中链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(MCAD)、长链3-羟基酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(LCHAD)、极长链酰基辅酶A脱氢酶缺乏症(VLCAD)；脂质代谢障碍，例如GM1神经节苷脂贮积症、Tay-Sachs病、Sandhoff病、Fabry病、Gaucher病、Niemann-Pick病、Krabbe病、粘脂贮积症或粘多糖贮积症；线粒体障碍，例如线粒体心肌病；Leigh病；线粒体脑病、乳酸酸中毒和中风样发作(MELAS)；肌阵挛性癫痫伴破碎红纤维(MERRF)；神经病、共济失调和视网膜色素变性(NARP)；Barth综合征；过氧化物酶体病症，例如Zellweger综合征(脑肝肾综合征)、X连锁肾上腺脑白质营养不良或Refsum病。
在一个实施方式中，代谢障碍是代谢综合征。如本文所用，术语“代谢综合征”是包括反映营养过剩、久坐的生活方式、遗传因素、年龄增长和导致的过度肥胖的组成部分的聚集的病症。代谢综合征包括腹部肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常和血压升高的聚集，并且与其他合并症相关，包括血栓前状态、促炎性状态、非酒精性脂肪肝病和生殖障碍。代谢综合征的发病率不仅在美国和城市化世界的其余部分，而且在发展中国家增加到流行性程度。代谢综合征与心血管疾病风险大至倍增和2型糖尿病发病风险的5倍增加有关。
腹部肥胖(例如，大腰围(高腰臀比))、高血压、胰岛素抵抗和血脂异常是代谢综合征及其单个组成部分(例如，中心性肥胖、空腹血糖(FBG)/前驱糖尿病/糖尿病、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和高血压)的核心。
在一个实施方式中，代谢障碍是碳水化合物障碍。在一个实施方式中，碳水化合物障碍是糖尿病。
如本文所用，术语“糖尿病”是指一组代谢障碍，其特征在于由胰岛素分泌或作用或两者的缺陷引起的高血糖(葡萄糖)水平。有两种最常见的糖尿病类型，即1型糖尿病和2型糖尿病，这两者都是由身体不能调节胰岛素引起的。胰岛素是由胰腺响应于血液中血糖(葡萄糖)水平升高而释放的激素。
如本文所用，术语“I型糖尿病”是指胰腺产生的胰岛素太少而不能适当地调节血糖水平时发生的慢性疾病。I型糖尿病也是称为胰岛素依赖性糖尿病、IDDM和青少年发作糖尿病。患有I型糖尿病(胰岛素依赖性糖尿病)的人产生很少或根本不产生胰岛素。尽管约6％的美国人口患有某种形式的糖尿病，但所有糖尿病患者中仅约10％患有I型病症。大多数患有I型糖尿病的人在30岁之前发生这种病症。1型糖尿病代表胰腺β细胞的进行性自身免疫破坏的结果，伴有随后的胰岛素缺乏。胰腺的90％以上的胰岛素产生细胞(β细胞)被永久破坏。所导致的胰岛素缺乏是严重的，并且为了存活，I型糖尿病的人必须定期注射胰岛素。
在II型糖尿病(也称为非胰岛素依赖性糖尿病，NDDM)中，胰腺继续制造胰岛素，有时甚至高于正常水平。然而，身体对其作用产生抗性，导致相对胰岛素缺乏。II型糖尿病可能发生在儿童和青少年中，但通常在30岁后开始并且随着年龄逐渐变得更常见：约15％的70岁以上的人患有II型糖尿病。肥胖是II型糖尿病的风险因素，并且80％至90％的患有这种病症的人是肥胖的。
在一些实施方式中，糖尿病包括前驱糖尿病。“前驱糖尿病”是指一种或多种早期糖尿病病症，包括葡萄糖利用受损、空腹葡萄糖水平异常或受损、葡萄糖耐量受损、胰岛素敏感性受损和胰岛素抵抗。前驱糖尿病是2型糖尿病、心血管疾病和死亡的发展的主要风险因素。许多焦点已经被给予开发通过有效地治疗前驱糖尿病来预防2型糖尿病发生的治疗干预。
糖尿病可以通过给予葡萄糖耐量测试来诊断。临床上，糖尿病通常分为几个基本类别。这些类别的主要实例包括自身免疫性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病(1型NDDM)、胰岛素依赖性糖尿病(2型IDDM)、非自身免疫性糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病(2型NIDDM)和年轻人的成熟发作糖尿病(MODY)。另一个类别，通常称为继发性的，是指由一些可识别的病症引起的糖尿病，其引起或允许糖尿病综合征发展。继发性类别的实例包括由胰腺疾病引起的糖尿病、激素异常、药物或化学诱导的糖尿病、由胰岛素受体异常引起的糖尿病、与遗传综合征相关的糖尿病和其他原因的糖尿病(参见例如Harrison's(1996)第14版，NewYork，McGraw-Hill)。
在一个实施方式中，代谢障碍是脂质代谢障碍。如本文所用，“脂质代谢障碍”或“脂质代谢的障碍”是指与脂质代谢紊乱相关或由脂质代谢紊乱引起的任何病症。该术语还包括可导致高脂血症的任何障碍、疾病或病症，或以血液中任何或所有脂质和/或脂蛋白的水平异常升高为特征的病症。该术语是指遗传性障碍，如家族性高甘油三酯血症、1型家族性部分脂肪营养不良(FPLD1)或诱导性或获得性障碍，如由于疾病、障碍或病症(例如，肾衰竭)、节食或摄入某些药物而诱导或获得的障碍(例如，作为用于治疗例如AIDS或HIV的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)的结果)。
脂质代谢障碍的其他实例包括但不限于动脉粥样硬化、血脂异常、高甘油三酯血症(包括药物诱导的高甘油三酯血症、利尿剂诱导的高甘油三酯血症、酒精诱导的高甘油三酯血症、β-肾上腺素能阻断剂诱导的高甘油三酯血症、雌激素诱导的高甘油三酯血症、糖皮质激素诱导的高甘油三酯血症、类视黄醇诱导的高甘油三酯血症、西咪替丁诱导的高甘油三酯血症和家族性高甘油三酯血症)、与高甘油三酯血症相关的急性胰腺炎、乳糜微粒综合征、家族性乳糜微粒血症、Apo-E缺乏或抗性、LPL缺乏或低活性、高脂血症(包括家族性混合型高脂血症)、高胆固醇血症、与高胆固醇血症相关的痛风、黄瘤病(皮下胆固醇沉积)、高脂血症伴异质性LPL缺乏、高脂蛋白血症伴LDL和异质性LPL缺乏、脂肪肝疾病或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。
心血管疾病也被认为是如本文所定义的“代谢障碍”。这些疾病可包括冠状动脉疾病(也称为缺血性心脏病)、高血压、与冠状动脉疾病相关的炎症、再狭窄、外周血管疾病和中风。
如本文所定义，与体重相关的障碍也被认为是“代谢障碍”。此类障碍可包括肥胖、低代谢状态、甲状腺功能减退、尿毒症以及与体重增加(包括快速体重增加)、体重减轻、体重减轻的维持或体重减轻后体重恢复的风险相关的其他病症。
血糖障碍进一步被认为是如本文所定义的“代谢障碍”。此类障碍可包括糖尿病、高血压和与胰岛素抵抗相关的多囊卵巢综合征。代谢障碍的其他示例性病症还可包括肾移植、肾病综合征、Cushing’s综合征、肢端肥大症、系统性红斑狼疮、球蛋白血症、脂肪代谢障碍、I型糖原病和Addison’s病。
在一个实施方式中，INHBE相关病症是原发性高血压。“原发性高血压”是环境或遗传原因的结果(例如，没有明显的潜在医学原因的结果)。
在一个实施方式中，INHBE相关病症是继发性高血压。“继发性高血压”具有可识别的基础障碍，其可以是多种病因的，包括肾、血管和内分泌原因，例如肾实质疾病(例如多囊肾、肾小球或间质疾病)、肾血管疾病(例如肾动脉狭窄、纤维肌肉发育不良)、内分泌病症(例如肾上腺皮质类固醇或盐皮质激素过量、嗜铬细胞瘤、甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退、生长激素过量、甲状旁腺功能亢进)、主动脉缩窄或口服避孕药使用。
在一个实施方式中，INHBE相关病症是顽固性高血压。“顽固性高血压”是尽管同时使用三种不同种类的抗高血压药，其中一种是噻嗪利尿剂，但保持高于目标(例如，高于130mm Hg收缩压或高于90mm Hg收缩压)的血压。用四种或更多种药物控制血压的受试者也被认为患有顽固性高血压。
与代谢障碍相关的其他疾病或病症对于本领域技术人员来说是显而易见的并且在本公开的范围内。
如本文所用，“治疗有效量”旨在包括施用于患有INHBE相关病症的受试者时，足以实现疾病治疗(例如，通过减少、改善或维持现有疾病或疾病的一种或多种症状)的调节剂的量。“治疗有效量”可以根据调节剂、如何施用药剂、疾病及其严重程度和病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)以及待治疗受试者的其他个体特征而变化。
如本文所用，“预防有效量”旨在包括施用于患有INHBE相关病症的受试者时足以预防或改善疾病或疾病的一种或多种症状的调节剂的量。改善疾病包括减缓疾病的进程或降低后期发展的疾病的严重程度。“预防有效量”可以根据调节剂、如何施用调节剂、疾病风险程度以及待治疗患者的病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前或伴随治疗的类型(如果有的话)和其他个体特征而变化。
“治疗有效量”或“预防有效量”还包括以适用于任何治疗的合理效益/风险比产生一些所需效果的调节剂的量。本发明方法中使用的调节剂可以以足够的量施用以产生适用于这种治疗的合理的效益/风险比。
短语“药学上可接受的”在本文中用于指在合理的医学判断范围内适合用于与人受试者和动物受试者的组织接触而没有过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物或剂型。
如本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或硬脂酸)或溶剂包封材料，其涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一个器官或身体部分。每种载体在与制剂的其他成分相容并且对待治疗的受试者无害的意义上必须是“可接受的”。此类载体是本领域已知的。药学上可接受的载体包括用于通过注射施用的载体。
如本文所用，术语“样品”包括从受试者分离的类似流体、细胞或组织的集合，以及存在于受试者内的流体、细胞或组织。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊液、眼液、淋巴液、尿液、唾液等。组织样品可包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以源自特定器官、器官的部分或那些器官内的流体或细胞。在某些实施方式中，样品可以源自肝脏(例如，整个肝脏或肝脏的某些区段或肝脏中的某些类型的细胞，如，例如肝细胞)。在一些实施方式中，“源自受试者的样品”是指从受试者获得的尿液。“源自受试者的样品”可以指来自受试者的血液或血液来源的血清或血浆。
II.本发明的调节剂
本发明提供了用于调节INHBE的表达和/或活性的INHBE的调节剂(即抑制剂)和包含此类调节剂的组合物。在一些实施方式中，本发明的调节剂和组合物用于治疗易于发生INHBE相关病症的受试者，例如哺乳动物，如人，所述INHBE相关病症例如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病、脂质代谢障碍，例如高脂血症、高血压、心血管疾病、体重障碍。
在一个方面中，本发明提供了抑制素亚基βE(INHBE)的调节剂。调节剂可以是靶向INHBE的寡核苷酸，如双链核糖核酸(dsRNA)或反义多核苷酸剂；特异性结合INHBE的抗体或其抗原结合片段，如单克隆抗INHBE抗体或其抗原结合片段；小分子；实现ADAR编辑的指导RNA，如包括结合ADAR酶的茎环结构的指导RNA；或实现CRISPR编辑的指导RNA。
在一个实施方式中，本发明的调节剂是靶向INHBE基因的RNAi，例如双链核糖核酸(dsRNA)剂。
在一个实施方式中，本发明的调节剂是靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂。
在一个实施方式中，本发明的调节剂是特异性结合INHBE的抗体或其抗原结合片段，例如人、人源化或嵌合抗INHBE抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，INHBE的调节剂是小分子。
在一些实施方式中，INHBE的调节剂是适体。在一些实施方式中，适体是寡核苷酸适体。在一些实施方式中，适体是肽适体。
在一些实施方式中，INHBE的调节剂是实现双链RNA特异性腺苷脱氨酶(ADAR)编辑的指导RNA，如包括结合ADAR酶的茎环结构的指导RNA。
在一些实施方式中，INHBE的调节剂是实现CRIPR编辑的指导RNA。
A.本发明的靶向INHBE的寡核苷酸
i.本发明的iRNA
在一个实施方式中，靶向INHBE的本发明的寡核苷酸调节剂是RNAi。
因此，本发明提供了实现RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的抑制素亚基βE(INHBE)基因的RNA转录物的切割的iRNA组合物。该基因可以在细胞内，例如受试者(如人)内的细胞。这些iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解相应基因(INHBE)的mRNA。
本发明的iRNA已经被设计成靶向人抑制素亚基βE(INHBE)基因，包括在其他哺乳动物物种的INHBE直向同源物中保守的基因部分。不希望受理论限制，据信前述特性和这些iRNA中的特定靶位点或特定修饰的组合或亚组合赋予本发明的iRNA改善的功效、稳定性、效力、耐久性和安全性。
因此，本发明提供了使用实现RNA诱导沉默复合物介导的INHBE基因的RNA转录物的切割的iRNA组合物治疗和预防抑制素亚基βE(INHBE)相关病症的方法，例如代谢障碍(例如代谢综合征)、碳水化合物障碍(例如II型糖尿病)、前驱糖尿病、脂质代谢障碍(例如高脂血症)、高血压、心血管疾病、体重失调。
本发明的iRNA包括具有长度达约30个核苷酸或更少的区域的RNA链(反义链)，例如长度为19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸，该区域与INHBE基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。
在某些实施方式中，本发明的双链RNAi剂的一条或两条链的长度为至多66个核苷酸，例如长度为36-66、26-36、25-36、31-60、22-43、27-53个核苷酸，其中至少19个连续核苷酸的区域与INHBE基因的mRNA转录物的至少一部分基本上互补。在一些实施方式中，具有较长长度的反义链的此类iRNA试剂可以例如包括长度为20-60个核苷酸的第二RNA链(有义链)，其中有义链和反义链形成18-30个连续核苷酸的双链体。
本发明的iRNA的使用使得能够在哺乳动物中靶向降解相应基因(INHBE基因)的mRNA。使用体外测定，本发明人已经证明了靶向INHBE基因的iRNA可以有效介导RNAi，导致INHBE基因表达的显著抑制。因此，包括这些iRNA的方法和组合物可用于治疗患有INHBE相关病症的受试者，例如代谢障碍，例如，代谢综合征、糖代谢障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病、脂质代谢障碍，例如高脂血症、高血压、心血管疾病、体重失调。
因此，本发明提供了使用实现RNA诱导沉默复合物(RISC)介导的INHBE基因的RNA转录物的切割的iRNA组合物治疗患有受益于抑制或降低INHBE基因表达的病症的受试者的方法和组合疗法，例如抑制素亚基βE(INHBE)相关疾病，如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病，脂质代谢障碍，例如高脂血症、高血压、心血管疾病、体重失调。
本发明还提供了用于预防患有受益于抑制或降低INHBE基因表达的病症的受试者中的至少一种症状的方法，例如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病，脂质代谢障碍，例如高脂血症、高血压、心血管疾病、体重失调。
在一个方面中，本发明提供了抑制INHBE基因表达的iRNA。在某些实施方式中，iRNA包括双链核糖核酸(dsRNA)分子，其用于抑制细胞中INHBE基因的表达，例如为易发生INHBE相关病症的受试者(例如哺乳动物，例如人)内的细胞，INHBE相关病症例如为代谢障碍(例如代谢综合征)、碳水化合物障碍(例如II型糖尿病、前驱糖尿病)、脂质代谢障碍(例如高脂血症)、高血压、心血管疾病、体重失调。该dsRNAi剂包括具有与在INHBE基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补的互补区的反义链。互补区的长度为约19-30个核苷酸(例如，长度约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20或19个核苷酸)。
与表达INHBE基因的细胞接触时，iRNA抑制INHBE基因(例如人、灵长类动物、非灵长类动物或大鼠INHBE基因)的表达至少约50％，如通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法(如通过免疫荧光分析，使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术)测定的。在某些实施方式中，通过本文实施例中提供的qPCR方法用例如10nM浓度的siRNA在其中提供的适当生物体细胞系中测定表达的抑制。在某些实施方式中，体内表达的抑制通过表达人基因的啮齿动物(例如表达人靶基因的小鼠或AAV感染的小鼠)中人基因的敲低来确定，例如当作为单剂量(例如在RNA表达的最低点以3mg/kg)施用时。
dsRNA包括两条RNA链，其在使用dsRNA的条件下互补并杂交以形成双链体结构。dsRNA的一条链(反义链)包括与靶序列基本上互补并且通常完全互补的互补区。靶序列可以衍生自INHBE基因表达期间形成的mRNA的序列。另一条链(有义链)包括与反义链互补的区域，使得在合适的条件下组合时，两条链杂交并形成双链体结构。如本文别处所述的和本领域已知的，dsRNA的互补序列也可以作为单核酸分子的自身互补区域包含，与在单独的寡核苷酸上相反。
通常，双链体结构的长度为15至30个碱基对，例如15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对。在某些实施方式中，双链体结构的长度为18至25个碱基对，例如，18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-25、21-24、21-23、21-22、22-25、22-24、22-23、23-25、23-24或24-25个碱基对，例如19-21个碱基对。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的一部分。
类似地，与靶序列的互补区的长度为15至30个核苷酸，例如15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24,20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个核苷酸，例如长度为19-23个核苷酸或长度为21-23个核苷酸。上述范围和长度中间的范围和长度也被认为是本公开的部分。
在一些实施方式中，双链体结构的长度为19至30个碱基对。类似地，与靶序列互补的区域的长度为19至30个核苷酸。
在一些实施方式中，dsRNA的长度为约19至约23个核苷酸，或长度为约25至约30个核苷酸。通常，dsRNA足够长以用作Dicer酶的底物。例如，本领域众所周知，长度大于约21-23个核苷酸的dsRNA可以用作Dicer的底物。如普通技术人员将认识到的，被靶向用于切割的RNA的区域最通常是较大RNA分子(常常是mRNA分子)的部分。在相关的情况下，mRNA靶标的“部分”是mRNA靶标的连续序列，其具有足够的长度以允许其成为RNAi指导的切割(即，通过RISC途径切割)的底物。
本领域技术人员还将认识到，双链体区域是dsRNA的主要功能部分，例如约19至约30个碱基对，例如约19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23或21-22个碱基对的双链体区域。因此，在一个实施方式中，就其被加工成靶向用于切割的所需RNA的例如15-30个碱基对的功能性双链体而言，具有大于30个碱基对的双链体区域的RNA分子或RNA复合物分子是dsRNA。因此，普通技术人员将认识到，在一个实施方式中，miRNA是dsRNA。在另一个实施方案中，dsRNA不是天然存在的miRNA。在另一个实施方式中，可用于靶向INHBE基因表达的iRNA剂不是通过较大dsRNA的切割在靶细胞中产生的。
如本文所述的dsRNA可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如1-4、2-4、1-3、2-3、1、2、3或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA相对于其平端对应物可具有优异的抑制特性。核苷酸突出端可包含核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。突出端可以在有义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的核苷酸可以存在于dsRNA的反义链或有义链的5'端、3'端或两端。
dsRNA可以通过本领域已知的标准方法合成。本发明的双链RNAi化合物可以使用两步法制备。首先，单独制备双链RNA分子的单个链。然后，使组成链退火。siRNA化合物的单个链可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。有机合成提供了可以容易地制备包含非天然或修饰的核苷酸的寡核苷酸链的优点。类似地，本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。
在一个方面中，本发明的dsRNA包括至少两个核苷酸序列，有义序列和反义序列。有义链选自表2-3任一中提供的序列组，有义链的相应反义链选自表2-3任一中的序列组。在这一方面，两个序列中的一个与两个序列中的另一个互补，其中一个序列与在INHBE基因表达中产生的mRNA的序列基本上互补。因此，在这个方面中，dsRNA包括两个寡核苷酸，其中一个寡核苷酸在表2-3任一中被描述为有义链，并且第二寡核苷酸在表2-3任一中被描述为有义链的相应反义链。
在某些实施方式中，dsRNA的基本上互补的序列包含在单独的寡核苷酸上。在其他实施方式中，dsRNA的基本上互补的序列包含在单个寡核苷酸上。
应当理解，尽管例如表3中的序列未被描述为修饰的或缀合的序列，但是本发明的iRNA(例如，本发明的dsRNA)的RNA可以包含表2-3任一中列出的任一序列，其是未修饰的、未缀合的，或与其中所述不同地修饰或缀合的。换句话说，本发明涵盖表2-3的dsRNA，其是未修饰的、未缀合的、修饰的或缀合的，如本文所述。
本领域技术人员熟知，具有约20至23个碱基对(例如21个碱基对)的双链体结构的dsRNA被声称在诱导RNA干扰中特别有效(Elbashir等，EMBO 2001，20：6877-6888)。然而，另外发现更短或更长的RNA双链体结构也可以是有效的(Chu和Rana(2007)RNA 14：1714-1719；Kim等(2005)Nat Biotech 23：222-226)。在上述实施方式中，由于表2-3任一中提供的寡核苷酸序列的性质，本文所述的dsRNA可包括至少一条长度最小为21个核苷酸的链。可以合理地预期，与上述dsRNA相比，具有表2-3任一中的任一序列减去一端或两端上的仅几个核苷酸的较短双链体可以类似地有效。因此，具有衍生自表2-3任一中的任一序列的至少19、20或更多个连续核苷酸的序列，并且其抑制INHBE基因表达的能力与包含完整序列的dsRNA的差异不超过约5、10、15、20、25或30％抑制的dsRNA被认为在本发明的范围内。
此外，表2-3中提供的RNA鉴定了易受RISC介导的切割的INHBE转录物中的位点。因此，本发明的特征还在于靶向这些位点之一内的iRNA。如本文所用，如果iRNA在RNA转录物的特定位点内的任何位置促进转录物的切割，则称该iRNA靶向该特定位点内。这种iRNA通常包括来自表2-3任一中提供的任一序列的至少约19个连续核苷酸，其与取自与INHBE基因中的所选序列连续的区域的其他核苷酸序列偶联。
ii.本发明的反义多核苷酸剂
在一个实施方式中，本发明的调节剂是反义多核苷酸剂。
因此，本发明提供了靶向INHBE基因并抑制INHBE基因表达的多核苷酸剂，例如反义多核苷酸剂，和包含此类试剂的组合物。在一个实施方式中，多核苷酸剂(例如，反义多核苷酸剂)抑制细胞中的INHBE基因表达，如患有INHBE相关疾病(例如，肢端肥大症、巨人症或癌症)的受试者(例如，哺乳动物，如人)内的细胞。
本发明的多核苷酸剂，例如反义多核苷酸剂，包括互补区，其与在INHBE基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补。互补区的长度可以是约50个核苷酸或更少(例如，长度为22-12、20-14、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸或更少)。与表达INHBE基因的细胞接触时，反义多核苷酸剂抑制INHBE基因(例如人、灵长类动物、非灵长类动物或鸟INHBE基因)的表达至少20％，如通过例如PCR或基于分支DNA(bDNA)的方法，或通过基于蛋白质的方法(如通过免疫荧光分析、使用例如蛋白质印迹或流式细胞术技术)测定的。在优选的实施方式中，使用细胞系递送方法在10nM浓度下测定表达的抑制。
反义多核苷酸剂与靶序列之间的互补区可以是基本上互补的(例如，在反义多核苷酸剂与靶核酸之间存在足够程度的互补性，使得它们特异性杂交并诱导所需效果)，但通常与靶序列完全互补。靶序列可以衍生自在INHBE基因表达期间形成的mRNA的序列。
因此，在一个方面中，本发明的反义多核苷酸剂与靶核酸分子(例如编码INHBE的mRNA)特异性杂交，并且包含对应于SEQ ID NO:1、3、5、7或9任一个的核苷酸序列或SEQ IDNO:1、3、5、7或9任一个的片段的反向互补序列的连续核苷酸序列。
在一些实施方式中，本发明的反义多核苷酸剂可以与靶序列基本上互补。例如，与靶序列基本上互补的反义多核苷酸剂可以包括与靶序列杂交时包含不超过5个错配(例如，不超过1、不超过2、不超过3、不超过4或不超过5个错配)的连续核苷酸序列，例如与编码哺乳动物INHBE mRNA的核酸的相应区域杂交。在一些实施方式中，与靶序列(例如编码哺乳动物INHBE mRNA的核酸的相应区域)杂交时，连续核苷酸序列包含不超过单个错配。
在一些实施方式中，与靶序列基本上互补的本发明的反义多核苷酸剂包含在其整个长度上与SEQ ID NO:1、3、5、7或9任一个的核苷酸序列或SEQ ID NO:1、3、5、7或9任一个的片段的等同区域至少80％互补的连续核苷酸序列，例如至少85％、90％、95％或100％互补。
在一些实施方式中，反义多核苷酸剂包含在其整个长度上与SEQ ID NO:1、3、5、7或9任一个的核苷酸序列(或SEQ ID NO:1-5任一个的片段)的等同区域完全互补的连续核苷酸序列。例如，反义多核苷酸剂的核苷酸序列在其整个长度上与GenBank登录号NM_031479.5(SEQ ID NO:1)的核苷酸1-20的等同区域完全互补(参见例如表4或5)。
反义多核苷酸剂可以包含长度为约4至50个核苷酸或落入该范围内的任何子范围的连续核苷酸序列，例如，长度为约8-49、8-48、8-47、8-46、8-45、8-44、8-43、8-42、8-41、8-40、8-39、8-38、8-37、8-36、8-35、8-34、8-33、8-32、8-31、8-30、8-29、8-28、8-27、8-26、8-25、8-24、8-23、8-22、8-21、8-20、8-19、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、10-49、10-48、10-47、10-46、10-45、10-44、10-43、10-42、10-41、10-40、10-39、10-38、10-37、10-36、10-35、10-34、10-33、10-32、10-31、10-30、10-29、10-28、10-27、10-26、10-25、10-24、10-23、10-22、10-21、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-49、11-48、11-47、11-46、11-45、11-44、11-43、11-42、11-41、11-40、11-39、11-38、11-37、11-36、11-35、11-34、11-33、11-32、11-31、11-30、11-29、11-28、11-27、11-26、11-25、11-24、11-23、11-22、11-21、11-20、11-19、11-18、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-49、12-48、12-47、12-46、12-45、12-44、12-43、12-42、12-41、12-40、12-39、12-38、12-37、12-36、12-35、12-34、12-33、12-32、12-31、12-30、12-29、12-28、12-27、12-26、12-25、12-24、12-23、12-22、12-21、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-49、13-48、13-47、13-46、13-45、13-44、13-43、13-42、13-41、13-40、13-39、13-38、13-37、13-36、13-35、13-34、13-33、13-32、13-31、13-30、13-29、13-28、13-27、13-26、13-25、13-24、13-23、13-22、13-21、13-20、13-19、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-49、14-48、14-47、14-46、14-45、14-44、14-43、14-42、14-41、14-40、14-39、14-38、14-37、14-36、14-35、14-34、14-33、14-32、14-31、14-30、14-29、14-28、14-27、14-26、14-25、14-24、14-23、14-22、14-21、14-20、14-19、14-18、14-17、14-16、14-15、15-49、15-48、15-47、15-46、15-45、15-44、15-43、15-42、15-41、15-40、15-39、15-38、15-37、15-36、15-35、15-34、15-33、15-32、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、15-16、16-49、16-48、16-47、16-46、16-45、16-44、16-43、16-42、16-41、16-40、16-39、16-38、16-37、16-36、16-35、16-34、16-33、16-32、16-31、16-30、16-29、16-28、16-27、16-26、16-25、16-24、16-23、16-22、16-21、16-20、16-19、16-18、16-17、17-49、17-48、17-47、17-46、17-45、17-44、17-43、17-42、17-41、17-40、17-39、17-38、17-37、17-36、17-35、17-34、17-33、17-32、17-31、17-30、17-29、17-28、17-27、17-26、17-25、17-24、17-23、17-22、17-21、17-20、17-19、17-18、18-49、18-48、18-47、18-46、18-45、18-44、18-43、18-42、18-41、18-40、18-39、18-38、18-37、18-36、18-35、18-34、18-33、18-32、18-31、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-49、19-48、19-47、19-46、19-45、19-44、19-43、19-42、19-41、19-40、19-39、19-38、19-37、19-36、19-35、19-34、19-33、19-32、19-31、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-49、20-48、20-47、20-46、20-45、20-44、20-43、20-42、20-41、20-40、20-39、20-38、20-37、20-36、20-35、20-34、20-33、20-32、20-31、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24、20-23、20-22、20-21、21-49、21-48、21-47、21-46、21-45、21-44、21-43、21-42、21-41、21-40、21-39、21-38、21-37、21-36、21-35、21-34、21-33、21-32、21-31、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、21-22、22-49、22-48、22-47、22-46、22-45、22-44、22-43、22-42、22-41、22-40、22-39、22-38、22-37、22-36、22-35、22-34、22-33、22-32、22-31、22-30、22-29、22-28、22-27、22-26、22-25、22-24、22-23、23-49、23-48、23-47、23-46、23-45、23-44、23-43、23-42、23-41、23-40、23-39、23-38、23-37、23-36、23-35、23-34、23-33、23-32、23-31、23-30、23-29、23-28、23-27、23-26、23-25、23-24、24-49、24-48、24-47、24-46、24-45、24-44、24-43、24-42、24-41、24-40、24-39、24-38、24-37、24-36、24-35、24-34、24-33、24-32、24-31、24-30、24-29、24-28、24-27、24-26、24-25、25-49、25-48、25-47、25-46、25-45、25-44、25-43、25-42、25-41、25-40、25-39、25-38、25-37、25-36、25-35、25-34、25-33、25-32、25-31、25-30、25-29、25-28、25-27、25-26、26-49、26-48、26-47、26-46、26-45、26-44、26-43、26-42、26-41、26-40、26-39、26-38、26-37、26-36、26-35、26-34、26-33、26-32、26-31、26-30、26-29、26-28、26-27、27-49、27-48、27-47、27-46、27-45、27-44、27-43、27-42、27-41、27-40、27-39、27-38、27-37、27-36、27-35、27-34、27-33、27-32、27-31、27-30、27-29、27-28、28-49、28-48、28-47、28-46、28-45、28-44、28-43、28-42、28-41、28-40、28-39、28-38、28-37、28-36、28-35、28-34、28-33、28-32、28-31、28-30、28-29、29-49、29-48、29-47、29-46、29-45、29-44、29-43、29-42、29-41、29-40、29-39、29-38、29-37、29-36、29-35、29-34、29-33、29-32、29-31、29-30、30-49、30-48、30-47、30-46、30-45、30-44、30-43、30-42、30-41、30-40、30-39、30-38、30-37、30-36、30-35、30-34、30-33、30-32或30-31个核苷酸，例如长度为4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。
在一些实施方式中，反义多核苷酸剂可以包含不超过22个核苷酸的连续核苷酸序列，例如不超过21个核苷酸、20个核苷酸、19个核苷酸、不超过18个核苷酸、17个核苷酸、16个核苷酸、不超过15个核苷酸或14个核苷酸中的任一个。在其他实施方式中，本发明的反义多核苷酸剂的长度为20个核苷酸。在其他实施方式中，本发明的反义多核苷酸剂的长度为14个核苷酸。在某些实施方式中，多核苷酸的长度为至少12个核苷酸。
在一个方面中，本发明的反义多核苷酸剂包括选自表4或表5中提供的序列的序列。应当理解，尽管表5中的序列被描述为修饰或缀合的序列，但是本发明的反义多核苷酸剂还可以包含表5中列出的任一序列，其是未修饰的、未缀合的或与其中所述不同地修饰或缀合的。
由于表4或5中提供的核苷酸序列的性质，本发明的反义多核苷酸剂可以包括表3或5的序列之一在一端或两端仅减去几个核苷酸，并且与上述反义多核苷酸剂相比仍然保持类似的有效性。因此，预期具有衍生自表4或5的序列之一的至少4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个连续核苷酸的序列的反义多核苷酸剂，并且其抑制INHBE基因表达的能力与包含完全序列的反义多核苷酸剂相差不超过5、10、15、20、25或30％在本发明的范围内。此外，表4和5中提供的反义多核苷酸剂鉴定了INHBE转录物中易受反义抑制影响的区域(例如，相对于表4中的核苷酸序列的起始和末端位置所涵盖的区域)。因此，本发明进一步涉及靶向这些位点之一内的反义多核苷酸剂。
如本文所用，如果反义多核苷酸剂促进对RNA转录物的特定位点处的靶标的反义抑制，则该反义多核苷酸剂称为靶向该位点内。这种反义多核苷酸剂通常将包括来自表4或5中提供的序列之一的至少14个连续核苷酸，其与取自与INHBE基因中的所选序列连续的区域的附加核苷酸序列偶联。
虽然靶序列的长度通常为4-50个核苷酸，但是在该范围内的特定序列用于指导任何给定靶RNA的反义抑制的适用性存在广泛的变化。本文所示出的各种软件包和指南为鉴定任何给定基因靶标的最佳靶序列提供了指导，但是也可以采用经验方法，其中给定大小(作为非限制性实例，20个核苷酸)的“窗口”或“掩模”字面上或象征性地(包括例如计算机模拟)置于靶RNA序列上以鉴定可以用作靶序列的大小范围内的序列。通过将序列“窗口”在初始靶序列位置的上游或下游逐渐移动一个核苷酸，可以鉴定下一个潜在的靶序列，直到针对所选择的任何给定靶大小鉴定出可能序列的完整集合。该过程与鉴定序列的系统合成和测试(使用如本文所述或如本领域已知的测定)相结合以鉴定表现最佳的那些序列，可以鉴定用反义多核苷酸剂靶向时介导对靶基因表达的最佳抑制的那些RNA序列。因此，虽然例如在表4或5中鉴定的序列代表有效的靶序列，但预期反义抑制效率的进一步优化可以通过在给定序列的上游或下游逐渐“窗口步移”一个核苷酸来实现，以鉴定具有相同或更好抑制特征的序列。
此外，预期对于例如表4或5中鉴定的任何序列，可以通过系统地添加或去除核苷酸以产生更长或更短的序列并测试通过从该点沿靶RNA向上或向下步移较长或较短大小的窗口产生的那些序列来实现进一步优化。再次，将产生新的候选靶标的该方法与在本领域已知或如本文所述的抑制测定中基于那些靶序列测试反义多核苷酸剂的有效性相结合，可以导致抑制效率的进一步改善。更进一步，可以通过例如引入如本文所述或如本领域已知的修饰的核苷酸，添加或改变长度，或本领域已知或本文讨论的其他修饰来调整此类优化的序列，以进一步优化作为表达抑制剂的分子(例如，增加血清稳定性或循环半衰期，增加热稳定性，增强跨膜递送，靶向特定位置或细胞类型，增加与沉默途径酶的相互作用，增加从内体的释放)。
iii.本发明的修饰的寡核苷酸
在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)是未修饰的，并且不包含例如本领域已知的和本文所述的化学修饰或缀合。在其他实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA或反义多核苷酸剂)经化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。在本发明的某些实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)的基本上所有核苷酸都是修饰的。在本发明的其他实施方式中，寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)的所有核苷酸，或寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)的基本上所有核苷酸都是修饰的，即，寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)的链中存在不超过5、4、3、2或1个未修饰的核苷酸。
本发明中涉及的核酸可以通过本领域熟知的方法合成或修饰，如在“CurrentProtocols in Nucleic Acid Chemistry”，Beaucage，S.L.等(编辑)，John Wiley&Sons，Inc.，New York，NY，USA中描述的那些，将其按引用并入。修饰包括例如末端修饰，例如5′-端修饰修饰(磷酸化、缀合、反向连接)或3′-端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向连接等)；碱基修饰，例如用稳定碱基、去稳定碱基或与扩展伴体库碱基配对的碱基替换，去除碱基(无碱基核苷酸)或缀合碱基；糖修饰(例如在2′-位或4′-位)或糖的替换；或主链修饰，包括磷酸二酯键的修饰或替换。可用于本文所述的实施方式中的寡核苷酸化合物的具体实例包括但不限于含有修饰的主链或不含天然核苷间键的寡核苷酸，例如RNA。具有修饰主链的寡核苷酸，例如RNA，尤其包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸(例如RNA)也可以被认为是寡核苷酸。在一些实施方式中，修饰的寡核苷酸在其核苷间主链中具有磷原子。
修饰的寡核苷酸主链包括例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、次膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰基氨基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯和具有正常3'-5'连接的硼烷磷酸酯、这些的2'-5'-连接的类似物以及具有相反极性的那些，其中相邻的核苷单元对以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。还包括各种盐、混合盐和游离酸形式。在本发明的一些实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)呈游离酸形式。在本发明的其他实施方式中，寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)呈盐形式。在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)呈钠盐形式。在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA试或反义多核苷酸剂)呈钠盐形式时，钠离子作为试剂中存在的基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子存在于试剂中。其中基本上所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键具有钠抗衡离子的寡核苷酸包括不超过5、4、3、2或1个不含钠抗衡离子的磷酸二酯和/或硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)呈钠盐形式时，钠离子作为试剂中存在的所有磷酸二酯和/或硫代磷酸酯基团的抗衡离子存在于寡核苷酸中。
教导上述含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE39464，其各自的全部内容通过引用并入本文。
不包括磷原子的修饰的寡核苷酸(例如RNA)主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键，或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有吗啉代键(部分由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含烯烃的主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它组分。
教导制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，其各自的全部内容通过引用并入本文。
考虑将合适的RNA模拟物用于本文提供的寡核苷酸，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂，其中核苷酸单元的糖和核苷间键(即主链)都被新基团替代。保持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。显示具有优异杂交特性的RNA模拟物的一种这样的寡聚化合物被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，RNA的糖主链被含酰胺的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链替代。核碱基被保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082；5,714,331；和5,719,262，其各自的全部内容通过引用并入本文。适用于本发明的寡核苷酸(例如iRNA)的其他PNA化合物描述于例如Nielsen等，Science，1991，254，1497-1500中。
本发明涉及的一些实施方式包括具有硫代磷酸酯主链的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷酸，且特别是上述参考的美国专利No.5,489,677的-CH2-NH-CH2-、-CH2-N(CH3)-O-CH2-[称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI主链]、-CH2-O-N(CH3)-CH2-、-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和-N(CH3)-CH2-CH2-，以及上述参考的美国专利No.5,602,240的酰胺主链。在一些实施方式中，本文涉及的RNA具有以上参考的美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。天然磷酸二酯主链可以表示为O-P(O)(OH)-OCH2-。
修饰的寡核苷酸还可以含有一个或多个取代的糖部分。本文所涉及的寡核苷酸，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂，可以在2’-位置包括以下之一：OH；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性的合适修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2)nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在其他实施方式中，dsRNA在2’位包括以下之一：C1至C10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的甲硅烷基、RNA切割基团、报告基团、嵌入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团，以及具有类似性质的其他取代基。在一些实施方式中，修饰包括2'-甲氧基乙氧基(2'-O-CH2CH2OCH3，也称为2’-O-(2-甲氧基乙基)或2’-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta，1995，78:486-504)，即烷氧基-烷氧基基团。另一种示例性修饰是2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2’-DMAOE，如下文实施例中所述的，以及2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称为2'-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH2-O-CH2-N(CH3)2。更多示例性修饰包括：5'-Me-2'-F核苷酸、5'-Me-2'-OMe核苷酸、5'-Me-2'-脱氧核苷酸(这三个家族中的R和S异构体)；2′-烷氧基烷基；和2'-NMA(N-甲基乙酰胺)。
其它修饰包括2’-甲氧基(2’-OCH3)、2’-氨基丙氧基(2’-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可以在iRNA的RNA上的其他位置进行类似的修饰，特别是3'末端核苷酸上或2'-5'连接的dsRNA中的糖的3'位和5'末端核苷酸的5'位。寡核苷酸，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂，也可以具有代替呋喃戊糖的糖模拟物，如环丁基部分。教导此类修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中某些与本申请共同拥有。上述每一个的全部内容通过引用并入本文。
寡核苷酸，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂，还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文所用，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成和天然核碱基，如脱氧胸苷(dT)、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。其他核碱基包括在美国专利No.3,687,808中公开的那些，在Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine，Herdewijn,P编辑，Wiley-VCH，2008中公开的那些；在The Concise Encyclopedia Of Polymer ScienceAnd Engineering，第858-859页，Kroschwitz,J.L编辑，John Wiley&Sons,1990中公开的那些，Englisch等，Angewandte Chemie，国际版本，1991，30，613中公开的那些，和Sanghvi,YS.，第15章，dsRNA Research and Applications，第289-302页，Crooke,S.T.和Lebleu,B.编辑，CRC Press，1993中公开的那些。这些核碱基中的某些特别地可用于增加本发明涉及的寡聚化合物的结合亲和力。这些包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，dsRNA Research and Applications，CRC Press，Boca Raton，1993，第276-278页)，并且是示例性碱基取代，甚至更特别地与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。
教导制备某些上述修饰的核碱基以及其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不限于上述美国专利No.3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121、5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本公开的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)还可以被修饰为包括一个或多个双环糖部分。“双环糖”是被通过桥接两个碳(无论是相邻的还是不相邻的)形成的环修饰的呋喃糖基环。“双环核苷”(“BNA”)是具有糖部分的核苷，其包含通过桥接糖环的相邻或不相邻的两个碳从而形成双环系统而形成的环。在某些实施方式中，桥任选地经由2'-无环氧原子连接糖环的4'-碳和2'-碳。因此，在一些实施方式中，本发明的试剂可包括一种或多种锁核酸(LNA)。锁核酸是具有修饰的核糖部分的核苷酸，其中核糖部分包含连接2'和4'碳的额外桥。换句话说，LNA是包含双环糖部分的核苷酸，其包含4'-CH2-O-2'桥。该结构有效地将核糖“锁定”在3'-内结构构象中。向siRNA添加锁核酸已显示增加siRNA在血清中的稳定性，并减少脱靶效应(Elmen，J.等，(2005)Nucleic AcidsResearch 33(1):439-447；Mook,OR.等(2007)Mol Canc Ther6(3):833-843；Grunweller，A.等(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193)。用于本发明的多核苷酸中的双环核苷的实例包括但不限于包含在4'和2'核糖基环原子之间的桥的核苷。在某些实施方式中，本发明的反义多核苷酸剂包括一种或多种包含4'-2'桥的双环核苷。
锁核苷可以由以下结构(省略立体化学)表示，
其中B是核碱基或修饰的核碱基，并且L是将核糖环的2'-碳与4'-碳接合的连接基团。这样的4′至2′桥连双环核苷的实例包括但不限于4′-(CH2)-O-2′(LNA)；4′-(CH2)-S-2′；4′-(CH2)2-O-2′(ENA)；4′-CH(CH3)-O-2′(也称为“受限的乙基”或“cEt”)和4′-CH(CH2OCH3)-O-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No.7,399,845)；4′-C(CH3)(CH3)-O-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No.8,278,283)；4′-CH2-N(OCH3)-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No.8,278,425)；4′-CH2-O-N(CH3)-2′(参见，例如，美国专利公开No.2004/0171570)；4′-CH2-N(R)-O-2′，其中R是H、C1-C12烷基或氮保护基团(参见，例如，美国专利No.7,427,672)；4′-CH2-C(H)(CH3)-2′(参见，例如，Chattopadhyaya等，J.Org.Chem.，2009，74，118-134)；和4′-CH2-C(＝CH2)-2′(及其类似物；参见，例如，美国专利No.8,278,426)。将前述每篇的完整内容按引用并入本文中。
教导锁核酸核苷酸的制备的其他代表性美国专利和美国专利公开包括但不限于以下：美国专利No.6,268,490；6,525,191；6,670,461；6,770,748；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,034,133；7,084,125；7,399,845；7,427,672；7,569,686；7,741,457；8,022,193；8,030,467；8,278,425；8,278,426；8,278,283；US2008/0039618；和US2009/0012281，其各自的全部内容通过引用并入本文。
可以制备任何前述双环核苷，其具有一种或多种立体化学糖构型，包括例如α-L-呋喃核糖和β-D-呋喃核糖(参见WO 99/14226)。
还可以修饰寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)的核苷酸以包括一个或多个受限的乙基核苷酸。如本文所用，“受限的乙基核苷酸”或“cET”是包含双环糖部分的锁核酸，其包含4’-CH(CH3)-O-2’桥(即，前述结构中的L)。在一个实施方式中，受限的乙基核苷酸呈S构象，在本文中称为“S-cET”。
本发明的寡核苷酸，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂，还可以包括一种或多种“构象受限的核苷酸”(“CRN”)。CRN是具有连接核糖的C2'和C4'碳或核糖的C3和-C5'碳的接头的核苷酸类似物。CRN将核糖环锁定为稳定构象并增加与mRNA的杂交亲和力。接头具有足够的长度以将氧置于稳定性和亲和力的最佳位置，导致较少的核糖环褶皱。
教导制备某些上述CRN的代表性公开出版物包括但不限于美国专利公开No.2013/0190383；和PCT公开WO 2013/036868，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸(例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)包含一种或多种为UNA(解锁核酸)核苷酸的单体。UNA是解锁的无环核酸，其中糖的任何键已被去除，从而形成解锁的“糖”残基。在一个实例中，UNA还包括C1’-C4'之间的键已被除去的单体(即C1'和C4'碳之间的共价碳-氧-碳键)。在另一个实例中，已经除去糖的C2'-C3'键(即C2'和C3'碳之间的共价碳碳键)(参见Nuc.Acids Symp.Series，52，133-134(2008)和Fluiter等，Mol.Biosyst.，2009，10，1039，其通过引用并入本文)。
教导制备UNA的代表性美国公开出版物包括但不限于美国专利No.8,314,227；和美国专利公开No.2013/0096289；2013/0011922；和2011/0313020，其各自的全部内容通过引用并入本文。
对寡核苷酸(例如RNA)分子的末端的潜在稳定修饰可以包括N-(乙酰氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇(Hyp-C6-NHAc)、N-(己酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-C6)、N-(乙酰基-4-羟基脯氨醇)(Hyp-NHAc)、胸苷-2'-O-脱氧胸苷(醚)、N-(氨基己酰基)-4-羟基脯氨醇)(Hyp-C6-氨基)、2-二十二烷酰基-尿苷-3’-磷酸、反向碱基dT(idT)等。这种修饰的公开可以在PCT公开No.WO 2011/005861中找到。
本发明的例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂的核苷酸的其他修饰包括5′磷酸酯或5′磷酸酯模拟物，例如iRNA的反义链上的5′末端磷酸酯或磷酸酯模拟物。合适的磷酸盐模拟物公开于例如美国专利公开No.2012/0157511中，其全部内容通过引用并入本文。
iv.包含本发明的基序的修饰iRNA
在本发明的某些方面，本发明的双链RNA剂包括具有化学修饰的试剂，如例如WO2013/075035中所公开的，其各自的全部内容通过引用并入本文。如本文和WO2013/075035中所示的，可以将一个或多个三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序引入dsRNAi剂的有义链或反义链中，特别是在切割位点处或附近。在一些实施方式中，dsRNAi剂的有义链和反义链可以另外被完全修饰。这些基序的引入中断了有义链或反义链的修饰模式(如果存在的话)。dsRNAi剂可以任选地与GalNAc衍生配体缀合，例如在有义链上。
更具体地，当双链RNA剂的有义链和反义链被完全修饰以在dsRNAi剂的至少一条链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上具有三个相同修饰的一个或多个基序时，观察到dsRNAi剂的基因沉默活性。
因此，本发明提供了能够在体内抑制靶基因(即INHBE基因)表达的双链RNA剂。RNAi剂包含有义链和反义链。RNAi剂的每条链可以是例如17-30个核苷酸长、25-30个核苷酸长、27-30个核苷酸长、19-25个核苷酸长、19-23个核苷酸长、19-21个核苷酸长、21-25个核苷酸长或21-23个核苷酸长。
有义链和反义链通常形成双链体双链RNA(“dsRNA”)，在本文中也称为“dsRNAi剂”。dsRNAi剂的双链体区域可以是，例如，双链体区域可以是长度为27-30个核苷酸对、长度为19-25个核苷酸对、长度为19-23个核苷酸对、长度为19-21个核苷酸对、长度为21-25个核苷酸对或长度为21-23个核苷酸对。在另一个实例中，双链体区域的长度选自19、20、21、22、23、24、25、26和27个核苷酸。
在某些实施方式中，dsRNAi剂可以在一条或两条链的3′-端、5′-末或两端含有一个或多个突出端区域或帽基团。突出端的长度可独立地为1-6个核苷酸，例如长度为2-6个核苷酸、长度为1-5个核苷酸、长度为2-5个核苷酸、长度为1-4个核苷酸、长度为2-4个核苷酸、长度为1-3个核苷酸、长度为2-3个核苷酸或长度为1-2个核苷酸。在某些实施方式中，突出端区域可以包括如上提供的延伸的突出端区域。突出端可以是一条链比另一条链更长的结果，或者是相同长度的两条链交错的结果。突出端可以与靶mRNA形成错配，或者它可以与被靶向的基因序列互补，或者可以是另一序列。第一链和第二链也可以例如通过另外的碱基连接以形成发夹，或通过其他非碱基接头连接。
在某些实施方式中，dsRNAi剂的突出端区域中的核苷酸可以各自独立地是修饰的或未修饰的核苷酸，包括但不限于2'-糖修饰的，如2'-F、2'-O-甲基、胸苷(T)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞苷(m5CEO)及其任何组合。
例如，TT可以是任一链上任一端的突出端序列。突出端可以与靶mRNA形成错配，或者它可以与被靶向的基因序列互补，或者可以是另一序列。
dsRNAi剂的有义链、反义链或两条链处的5'-或3'-突出端可以被磷酸化。在一些实施方式中，突出端区域含有在两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯的两个核苷酸，其中两个核苷酸可以相同或不同。在一些实施方式中，突出端存在于有义链、反义链或两条链的3'端。在一些实施方式中，该3'-突出端存在于反义链中。在一些实施方式中，该3'-突出端存在于有义链中。
dsRNAi剂可以仅含有单突出端，其可以增强RNAi的干扰活性，而不影响其整体稳定性。例如，单链突出端可以位于有义链的3'-端，或可选地，位于反义链的3'-端。RNAi还可以具有位于反义链的5'端(即，有义链的3'端)的平端，反之亦然。通常，dsRNAi剂的反义链在3'端具有核苷酸突出端，并且5'末端是平端。虽然不希望受理论束缚，但反义链的5’-端处的不对称平端和反义链的3’-端突出端有利于引导链加载到RISC过程中。
在某些实施方式中，dsRNAi剂是长度为19个核苷酸的双平端，其中有义链含有至少一个在5’-端的位置7、8、9处的三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个在5'端的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上三个2'-O-甲基修饰的基序。
在其他实施方式中，dsRNAi剂是长度为20个核苷酸的双平端，其中有义链含有至少一个在5’-端的位置8、9和10处的三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个在5'端的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上三个2'-O-甲基修饰的基序。
还在其他实施方式中，dsRNAi剂是长度为21个核苷酸的双平端，其中有义链含有至少一个在5’-端的位置9、10和11处的三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序。反义链含有至少一个在5'端的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上三个2'-O-甲基修饰的基序。
在某些实施方式中，dsRNAi剂包含21个核苷酸的有义链和23个核苷酸的反义链，其中有义链含有至少一个在5’-端的位置9、10和11处的三个连续核苷酸上三个2’-F修饰的基序；反义链含有至少一个在5’-端的位置11、12和13处的三个连续核苷酸上三个2’-O-甲基修饰的基序，其中RNAi剂的一端是平端，而另一端包含2核苷酸的突出端。在一个实施方式中，该2核苷酸的突出端在反义链的3'端。
当2核苷酸的突出端位于反义链的3'端时，在末端三个核苷酸之间可以存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是紧接突出端核苷酸的配对核苷酸。在一个实施方式中，RNAi剂另外在有义链的5'-端和反义链的5'-端两者处的末端三个核苷酸之间具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。在某些实施方式中，dsRNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸(包括作为基序的部分的核苷酸)是修饰的核苷酸。在某些实施方式中，每个残基独立地被2’-O-甲基或3’-氟修饰，例如在交替基序中。任选地，dsRNAi剂进一步包含配体(如GalNAc3)。
在某些实施方式中，dsRNAi剂包含有义链和反义链，其中有义链的长度为25-30个核苷酸残基，其中从5’末端核苷酸(位置1)开始，第一链的位置1至23包含至少8个核糖核苷酸；反义链的长度为36-66个核苷酸残基，并且从3'末端核苷酸开始，在与有义链的位置1-23配对以形成双链体的位置中包含至少8个核糖核苷酸；其中至少反义链的3'末端核苷酸与有义链不配对，并且至多6个连续的3'末端核苷酸与有义链不配对，从而形成1-6个核苷酸的3'单链突出端；其中反义链的5'末端包含与有义链不配对的10-30个连续核苷酸，从而形成10-30个核苷酸的单链5'突出端；其中当有义链和反义链对齐以获得最大互补性时，至少有义链5'末端和3'末端核苷酸与反义链的核苷酸碱基配对，从而在有义链和反义链之间形成基本上双链体的区域；并且反义链沿着反义链长度的至少19个核糖核苷酸与靶RNA充分互补，以在将双链核酸引入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达；并且其中有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上三个2'-F修饰的基序，其中至少一个基序出现在切割位点处或附近。反义链含有至少一个在切割位点处或附近的三个连续核苷酸上三个2'-O-甲基修饰的基序。
在某些实施方式中，dsRNAi剂包含有义链和反义链，其中dsRNAi剂包含长度为至少25个且至多29个核苷酸的第一链和长度为至多30个核苷酸的第二链，该第二链具有至少一个在5’-端的位置11、12、13的三个连续核苷酸上三个2'-O-甲基修饰的基序；其中第一链的3’-端和第二链的5’-端形成平端，并且第二链在其3’-端比第一链长1-4个核苷酸，其中双链体区域长度为至少25个核苷酸，并且第二链沿着第二链长度的至少19个核苷酸与靶mRNA充分互补，以在将RNAi剂引入哺乳动物细胞中时降低靶基因表达，并且其中dsRNAi剂的Dicer切割产生包含第二链的3’-端的siRNA，从而降低哺乳动物中靶基因的表达。任选地，dsRNAi剂进一步包含配体。
在某些实施方式中，dsRNAi剂的有义链含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中基序之一出现在有义链中的切割位点处。
在某些实施方式中，dsRNAi剂的反义链也可以含有至少一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中基序之一出现在反义链中的切割位点处或附近。
对于具有长度为19-23个核苷酸的双链体区域的dsRNAi剂，反义链的切割位点典型地在5′-端的10、11和12位置附近。因此，三个相同修饰的基序可以出现在9、10、11位置；10、11、12位置；11、12、13位置；12、13、14位置；或反义链的13、14、15位置，从自反义链的5'-端的第一核苷酸开始计数，或自反义链的5'-端的双链体区域内的第一配对核苷酸开始计数。反义链中的切割位点也可以根据dsRNAi剂从5’-端的双链体区域长度而改变。
dsRNAi剂的有义链可以含有至少一个在链的切割位点处的三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序；并且反义链可以具有至少一个在链的切割位点处或附近的三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。当有义链和反义链形成dsRNA双链体时，有义链和反义链可以对齐以使得有义链上三个核苷酸的一个基序和反义链上三个核苷酸的一个基序具有至少一个核苷酸重叠，即有义链中的基序的三个核苷酸中的至少一个与反义链中的基序的三个核苷酸中的至少一个碱基配对。或者，至少两个核苷酸可以重叠，或者所有三个核苷酸可以重叠。
在一些实施方式中，dsRNAi剂的有义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序。第一基序可以出现在链的切割位点处或附近，并且其他基序可以是翼修饰。本文中的术语“翼修饰”是指在链的另一部分处出现的基序，其与相同链的切割位点处或附近的基序分开。翼修饰与第一基序相邻或被至少一个或多个核苷酸分开。当基序彼此紧邻时，则基序的化学性彼此不同，并且当基序被一个或多个核苷酸分开时，化学性可以相同或不同。可以存在两个或更多个翼修饰。例如，当存在两个翼修饰时，每个翼修饰可以发生在相对于第一基序的一端，所述第一基序在切割位点处或附近或者在前导基序的任一侧。
与有义链一样，dsRNAi剂的反义链可以含有多于一个在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序，其中基序中的至少一个出现在链的切割位点处或附近。反义链还可以在比对中含有一个或多个翼修饰，其类似于可能存在于有义链上的翼修饰。
在一些实施方式中，dsRNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包括链的3'-端、5'-端或两端处的前一个或两个末端核苷酸。
在其他实施方式中，dsRNAi剂的有义链或反义链上的翼修饰通常不包括在链的3'-端、5'-端或两端处的双链体区域内的前一个或两个配对核苷酸。
当dsRNAi剂的有义链和反义链各自含有至少一个翼修饰时，翼修饰可以落在双链体区域的同一端上，并且具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
dsRNAi剂的有义链和反义链各自含有至少两个翼修饰时，有义链和反义链可以对齐以使得各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的一端上，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；各自来自一条链的两个修饰落在双链体区域的另一端，具有一个、两个或三个核苷酸的重叠；一条链的两个修饰落在前导基序的每一侧，在双链体区域中具有一个、两个或三个核苷酸的重叠。
在一些实施方式中，可以修饰dsRNAi剂的有义链和反义链中的每个核苷酸，包括作为基序的部分的核苷酸。每个核苷酸可以用相同或不同的修饰进行修饰，所述修饰可以包括一个或两个非连接磷酸氧或一个或多个连接磷酸氧的一个或多个改变；核糖的成分的改变，例如核糖上的2'-羟基的改变；用“脱磷酸”接头大规模替换磷酸酯部分；天然存在的碱基的修饰或替换；以及核糖-磷酸酯主链的替换或修饰。
由于核酸是亚基的聚合物，因此许多修饰发生在核酸内重复的位置，例如碱基或磷酸酯部分的修饰或磷酸酯部分的非连接O。在一些情况下，修饰将发生在核酸中的所有所述位置处，但在许多情况下不发生。举例来说，修饰可以仅发生在3'-或5'末端位置，可以仅发生在末端区域，例如，在末端核苷酸上的位置或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中。修饰可以发生在双链区域、单链区域或两者中。修饰可以仅发生在RNA的双链区域中，或者可以仅发生在RNA的单链区域中。例如，非连接O位置处的硫代磷酸酯修饰可以仅发生在一个或两个末端，可以仅发生在末端区域中，例如，在末端核苷酸上的位置处或在链的最后2、3、4、5或10个核苷酸中，或者可以发生在双链和单链区域中，特别是在末端。一个或多个5'-端可以是磷酸化的。
例如，有可能增强稳定性，在突出端中包括特定碱基，或者在单链突出端中包括修饰的核苷酸或核苷酸代理物，例如在5'-或3'-突出端中，或在两者中。例如，可能需要在突出端中包含嘌呤核苷酸。在一些实施方式中，3'-或5'-突出端中的所有或一些碱基可以例如用本文所述的修饰进行修饰。修饰可包括例如在核糖的2'位置处使用本领域已知的修饰，例如使用脱氧核糖核苷酸、2'-脱氧-2'-氟(2'-F)或2'-O-甲基修饰的，而不是核碱基的核糖，以及磷酸酯基团中的修饰，例如硫代磷酸酯修饰进行修饰。突出端不需要与靶序列同源。
在一些实施方式中，有义链和反义链的每个残基独立地用LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-脱氧、2'-羟基或2'-氟进行修饰。链可含有多于一种修饰。在一个实施方式中，有义链和反义链的每个残基独立地用2'-O-甲基或2'-氟进行修饰。
有义链和反义链上通常存在至少两种不同的修饰。这两种修饰可以是2’-O-甲基或2’-氟修饰，或其它修饰。
在某些实施方式中，Na或Nb包含交替模式的修饰。如本文所用的术语“交替基序”是指具有一个或多个修饰的基序，每个修饰发生在一条链的交替核苷酸上。交替核苷酸可以指每隔一个核苷酸一个或每三个核苷酸一个，或类似的模式。例如，如果A、B和C各自表示核苷酸的一种类型的修饰，则交替基序可以是“ABABABABABAB…”、“AABBAABBAABB…”、“AABAABAAB…”、“AAABAABAAAB…”、“AAABAABAAAB…”、“AAABBBAAABBB…”或“ABCABCABCABC…”等。
交替基序中包含的修饰类型可以相同或不同。例如，如果A、B、C、D各自表示核苷酸上的一种类型的修饰，则交替模式，即每隔一个核苷酸上的修饰，可以是相同的，但是有义链或反义链中的每一条可以选自交替基序内的几种修饰可能性，例如“ABABAB…”、“ACACAC…”、“BDBDBD…”或“CDCDCD…”等。
在一些实施方式中，本发明的dsRNAi剂包含有义链上的交替基序的修饰模式相对于反义链上的交替基序的修饰模式被偏移。偏移可以使得有义链的核苷酸的修饰基团对应于反义链的不同修饰的核苷酸基团，反之亦然。例如，当有义链与dsRNA双链体中的反义链配对时，有义链中的交替基序可以从链的5'至3'以“ABABAB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区域内从链的5'至3'以“BABABA”开始。作为另一个实例，有义链中的交替基序可以从链的5'至3'以“AABBAABB”开始，并且反义链中的交替基序可以在双链体区域内从链的5'至3'以“BBAABBAA”开始，使得在有义链和反义链之间存在修饰模式的完全或部分偏移。
在一些实施方式中，dsRNAi剂包含最初有义链上的2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序的模式相对于最初反义链上的2’-O-甲基修饰和2’-F修饰的交替基序的模式具有偏移，即有义链上的2’-O-甲基修饰的核苷酸与反义链上的2’-F修饰的核苷酸碱基配对，反之亦然。有义链的1位可以以2'-F修饰开始，反义链的1位可以以2'-O-甲基修饰开始。
在三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个或多个基序引入有义链或反义链中断了有义链或反义链中存在的初始修饰模式。通过向有义链或反义链引入一个或多个三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序导致的有义链或反义链的修饰模式的这种中断可以增强针对靶基因的基因沉默活性。
在一些实施方式中，当三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序引入到任何链时，与基序相邻的核苷酸的修饰是与基序的修饰不同的修饰。例如，含有基序的序列部分是“…NaYYYNb…”，其中“Y”表示在三个连续核苷酸上三个相同修饰的基序的修饰，并且“Na”和“Nb”表示对与基序“YYY”相邻的核苷酸的修饰，其不同于Y的修饰，并且其中Na和Nb可以是相同或不同的修饰。或者，当存在翼修饰时，Na和Nb可以存在或不存在。
iRNA可以进一步包含至少一个硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰可以发生在有义链、反义链或两条链在链的任何位置上的任何核苷酸上。例如，核苷酸间键修饰可以发生在有义链或反义链上的每个核苷酸上；每个核苷酸间键修饰可以在有义链或反义链上以交替模式发生；或者有义链或反义链可以含有交替模式的两种核苷酸间键修饰。有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以与反义链相同或不同，并且有义链上的核苷酸间键修饰的交替模式可以相对于反义链上的核苷酸间键修饰的交替模式具有偏移。在一个实施方式中，双链RNAi剂包含6-8个硫代磷酸酯核苷酸间键。在一些实施方式中，反义链包含在5’-端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键和在3’-端处的两个硫代磷酸酯核苷酸间键，并且有义链包含在5’-端或3’-端处的至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一些实施方式中，dsRNAi剂在突出端区域中包含硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰。例如，突出端区域可以含有两个核苷酸，在这两个核苷酸之间具有硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键。还可以进行核苷酸间键修饰以将突出端核苷酸与双链体区域内的末端配对核苷酸连接。例如，至少2、3、4或所有突出端核苷酸可以通过硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键连接，并且任选地，可以存在另外的硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键，其将突出端核苷酸与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸连接。例如，在末端三个核苷酸之间可以存在至少两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。这三个末端核苷酸可以位于反义链的3'端、有义链的3'端、反义链的5'端或反义链的5'端。
在一些实施方式中，2-核苷酸的突出端位于反义链的3'端，并且在末端三个核苷酸之间存在两个硫代磷酸酯核苷酸间键，其中三个核苷酸中的两个是突出端核苷酸，并且第三个核苷酸是与突出端核苷酸相邻的配对核苷酸。任选地，dsRNAi剂可以另外在有义链的5'-端和反义链的5'-端两者处的末端三个核苷酸之间具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一个实施方式中，dsRNAi剂在双链体内包含与靶标的错配，或其组合。错配可以发生在突出端区域或双链体区域中。碱基对可以基于其促进解离或解链的倾向来排序(例如，基于特定配对的缔合或解离的自由能，最简单的方法是在单个配对的基础上检查配对，尽管也可以使用下一相邻或类似分析)。在促进解离方面：A:U优于G:C；G:U优于G:C；并且I:C优于G:C(I＝肌苷)。错配，例如非规范或除规范之外的配对(如本文其他地方所述)优于规范(A:T，A:U，G:C)配对；并且包括通用碱基的配对优于规范配对。
在某些实施方式中，dsRNAi剂包含双链体区域内从反义链的5'-端起的前1、2、3、4或5个碱基对中的至少一个，其独立地选自：A:U、G:U、I:C和错配对，例如非规范或除规范之外的配对或包括通用碱基的配对，以促进反义链在双链体的5'-端处的解离。
在某些实施方式中，双链区区域内反义链5’-端的的1位的核苷酸选自A、dA、dU、U和dT。或者，双链区域内反义链的5'-端的前1、2或3个碱基对中的至少一个是AU碱基对。例如，双链区域内反义链的5'-端的第一碱基对是AU碱基对。
在其他实施方式中，有义链3'-端的核苷酸是脱氧胸苷(dT)，或者反义链3'-端的核苷酸是脱氧胸苷(dT)。例如，存在脱氧胸苷核苷酸的短序列，例如，在有义链、反义链或两条链的3'-端的两个dT核苷酸。
在某些实施方式中，有义链序列可以由式(I)表示：
5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'(I)
其中：
i和j各自独立地为0或1；
p和q各自独立地为0-6；
每个Na独立地代表包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np和nq独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb和Y不具有相同的修饰；和
XXX、YYY和ZZZ各自独立地表示在三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。在一个实施方式中，YYY均为2'-F修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，Na或Nb包含交替模式的修饰。
在一些实施方式中，YYY基序出现在有义链的切割位点处或附近。例如，当dsRNAi剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区域时，YYY基序可以出现在有义链的切割位点处或其附近(例如，可以出现在位置6、7、8；7、8、9；8、9、10；9、10、11；10、11、12；或11、12、13处)，计数从5’-端的第一核苷酸开始；或任选地，计数从双链体区域内的5’-端第一配对核苷酸开始。
在一个实施方式中，i为1且j为0，或i为0且j为1，或i和j均为1。因此，有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Ib)；
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3'(Ic)；或
5'np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3'(Id)。
当有义链由式(Ib)表示时，Nb表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Ic)时，Nb表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当有义链表示为式(Id)时，每个Nb独立地表示包含0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一个实施方式中，Nb为0、1、2、3、4、5或6。每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
X、Y和Z中的每一个可以彼此相同或不同。
在其他实施方式中，i是0且j是0，并且有义链可以由下式表示：
5'np-Na-YYY-Na-nq 3' (Ia)。
当有义链由式(Ia)表示时，每个Na可以独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
在一个实施方式中，RNAi的反义链序列可以由式(II)表示：
5'nq’-Na′-(Z’Z′Z′)k-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-(X′X′X′)l-N′a-np′3' (II)
其中：
k和l各自独立地为0或1；
p′和q′各自独立地为0-6；
每个Na′独立地表示包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb′独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
每个np′和nq′独立地表示突出端核苷酸；
其中Nb′和Y’不具有相同的修饰；和
X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。
在一些实施方式中，Na′或Nb′包含交替模式的修饰。
Y'Y'Y'基序出现在反义链的切割位点处或附近。例如，当dsRNAi剂具有长度为17-23个核苷酸的双链体区域时，Y'Y'Y'基序可以出现在反义链的位置9、10、11；10、11、12；11、12、13；12、13、14；或13、14、15处，其中计数从5'-端的第一核苷酸开始；或任选地，计数从双链体区域内5’-端的第一配对核苷酸开始。在一个实施方式中，Y'Y'Y'基序出现在位置11、12、13处。
在某些实施方式中，Y'Y'Y'基序均为2'-OMe修饰的核苷酸。
在某些实施方式中，k为1且l为0，或k为0且l为1，或k和l两者均为1。
因此，反义链可以由下式表示：
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Na′-np’3' (IIb)；
5'nq’-Na′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-np’3' (IIc)；或
5'nq’-Na′-Z′Z′Z′-Nb′-Y′Y′Y′-Nb′-X′X′X′-Na′-np’3' (IId)。
当反义链由式(IIb)表示时，Nb′表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na′独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链由式(IIc)表示时，Nb′表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na′独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当反义链表示为式(IId)时，每个Nb′独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na′独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。在一个实施方式中，Nb是0、1、2、3、4、5或6。
在其他实施方式中，k是0并且l是0，并且反义链可以由下式表示：
5'np’-Na’-Y’Y’Y’-Na’-nq’3' (Ia)。
当反义链表示为式(IIa)时，每个Na′独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。X'、Y'和Z'中的每一个可以彼此相同或不同。
有义链和反义链的每个核苷酸可以独立地用LNA、CRN、UNA、cEt、HNA、CeNA、2'-甲氧基乙基、2'-O-甲基、2'-O-烯丙基、2'-C-烯丙基、2'-羟基或2'-氟进行修饰。例如，有义链和反义链的每个核苷酸独立地用2'-O-甲基或2'-氟进行修饰。特别地，每个X、Y、Z、X'、Y'和Z'可以表示2'-O-甲基修饰或2'-氟修饰。
在一些实施方式中，当双链体区域为21nt时，dsRNAi剂的有义链可以含有出现在链的9、10和11位置的YYY基序，计数从5’-端的第一核苷酸开始，或任选地，计数从双链体区域内5’-端的第一配对核苷酸开始；并且Y表示2'-F修饰。有义链可以另外含有XXX基序或ZZZ基序作为双链体区域的相对端处的翼修饰；并且XXX和ZZZ各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
在一些实施方式中，反义链可以含有出现在链的位置11、12、13的Y'Y'Y'基序，计数从5'端的第一核苷酸开始，或任选地，计数从双链体内5'端的第一配对核苷酸开始；并且Y'表示2'-O-甲基修饰。反义链可以另外含有X'X'X'基序或Z'Z'Z'基序作为双链体区域的相对端处的翼修饰；并且X’X’X’和Z’Z’Z’各自独立地表示2’-OMe修饰或2’-F修饰。
由上式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)中的任一个表示的有义链分别与由式(IIa)、(IIb)、(IIc)和(IId)中的任一个表示的反义链形成双链体。
因此，用于本发明的方法中的dsRNAi剂可以包含有义链和反义链，每条链具有14至30个核苷酸，iRNA双链体由式(III)表示：
有义：5'np-Na-(X X X)i-Nb-Y Y Y-Nb-(Z Z Z)j-Na-nq 3'
反义：3'np’-Na’-(X’X′X′)k-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-(Z′Z′Z′)l-Na’-nq’5'
(III)
其中：
i、j、k和l各自独立地为0或1；
p、p'、q和q'各自独立地为0-6；
每个Na和Na’独立地代表包含0-25个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列，每个序列包含至少两个不同修饰的核苷酸；
每个Nb和Nb’独立地表示包含0-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列；
其中每个np’、np、nq’和nq，其各自可以存在或可以不存在，独立地表示突出端核苷酸；和
XXX、YYY、ZZZ、X'X'X'、Y'Y'Y'和Z'Z'Z'各自独立地表示在三个连续核苷酸上三个相同修饰的一个基序。
在一个实施方式中，i是0且j是0；或i为1且j为0；或i为0且j为1；或者i和j都是0；或者i和j都是1。在另一个实施方式中，k是0且l是0；或k为1且l为0；k为0且l为1；或k和l均为0；或k和l均为1。
形成iRNA双链体的有义链和反义链的示例性组合包括下式：
5'np-Na-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Na’nq’5'
(IIIa)
5'np-Na-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np’-Na’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na’nq’5'
(IIIb)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Na-nq 3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Na’-nq’5'
(IIIc)
5'np-Na-X X X-Nb-Y Y Y-Nb-Z Z Z-Na-nq 3'
3'np’-Na’-X′X′X′-Nb’-Y′Y′Y′-Nb’-Z′Z′Z′-Na-nq’5'
(IIId)
当dsRNAi剂由式(IIIa)表示时，每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi剂由式(IIIb)表示时，每个Nb独立地表示包含1-10、1-7、1-5或1-4个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi剂由式(IIIc)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2、或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。
当dsRNAi剂由式(IIId)表示时，每个Nb、Nb’独立地表示包含0-10、0-7、0-10、0-7、0-5、0-4、0-2或0个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。每个Na、Na’独立地表示包含2-20、2-15或2-10个修饰的核苷酸的寡核苷酸序列。Na、Na’、Nb和Nb’中的每一个独立地包含交替模式的修饰。
式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中X、Y和Z的每一个可以彼此相同或不同。
当dsRNAi剂由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示时，Y核苷酸中的至少一个可以与Y'核苷酸中的一个形成碱基对。或者，Y核苷酸中至少两个与相应的Y'核苷酸形成碱基对；或所有三个Y核苷酸与相应的Y'核苷酸形成碱基对。
当dsRNAi剂由式(IIIb)或(IIId)表示时，Z核苷酸中的至少一个可以与Z’核苷酸中的一个形成碱基对。或者，Z核苷酸中的至少两个与相应的Z'核苷酸形成碱基对；或所有三个Z核苷酸与相应的Z'核苷酸形成碱基对。
当dsRNAi剂由式(IIIc)或(IIId)表示时，X个核苷酸中的至少一个可以与X'个核苷酸中的一个形成碱基对。或者，X核苷酸中的至少两个与相应的X'核苷酸形成碱基对；或所有三个X核苷酸与相应的X'核苷酸形成碱基对。
在某些实施方式中，Y核苷酸上的修饰不同于Y'核苷酸上的修饰，Z核苷酸上的修饰不同于Z'核苷酸上的修饰，或X核苷酸上的修饰不同于X'核苷酸上的修饰。
在某些实施方式中，当dsRNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2'-氟修饰。在其他实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰和np’>0且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接。还在其他实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接，并且有义链与通过二价或三价分支接头(如下所述)附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。在其他实施方式中，当RNAi剂由式(IIId)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价分支接头附接的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在一些实施方式中，当dsRNAi剂由式(IIIa)表示时，Na修饰是2’-O-甲基或2’-氟修饰，np’>0且至少一个np’通过硫代磷酸酯键与相邻的核苷酸连接，有义链包含至少一个硫代磷酸酯键，并且有义链与通过二价或三价分支接头附连的一个或多个GalNAc衍生物缀合。
在一些实施方式中，dsRNAi剂是含有至少两个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或者每个双链体可以在两个不同的靶位点处靶向相同的基因。
在一些实施方式中，dsRNAi剂是含有三个、四个、五个、六个或更多个由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)表示的双链体的多聚体，其中双链体通过接头连接。接头可以是可切割的或不可切割的。任选地，多聚体还包含配体。每个双链体可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或者每个双链体可以在两个不同的靶位点处靶向相同的基因。
在一个实施方式中，由式(III)、(IIIa)、(IIIb)、(IIIc)和(IIId)中的至少一种表示的两种dsRNAi剂在5’-端及一个或两个3’-端处彼此连接，并且任选地与配体缀合。每个试剂可以靶向相同的基因或两个不同的基因；或者每个试剂可以在两个不同的靶位点处靶向相同的基因。
在某些实施方式中，本发明的RNAi剂可以含有少量含有2'-氟修饰的核苷酸，例如10个或更少的具有2'-氟修饰的核苷酸。例如，RNAi剂可以含有10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或0个具有2’-氟修饰的核苷酸。在一个具体实施方式中，本发明的RNAi剂含有10个具有2’-氟修饰的核苷酸，例如，在有义链中具有2’-氟修饰的4个核苷酸和在反义链中具有2’-氟修饰的6个核苷酸。在另一个具体实施方式中，本发明的RNAi剂含有6个具有2’-氟修饰的核苷酸，例如，在有义链中具有2’-氟修饰的4个核苷酸和在反义链中具有2’-氟修饰的2个核苷酸。
在其他实施方式中，本发明的RNAi剂可以含有超低数量的含2'-氟修饰的核苷酸，例如2个或更少的含2'-氟修饰的核苷酸。例如，RNAi剂可以含有2、1或0个具有2′-氟修饰的核苷酸。在一个具体实施方式中，RNAi剂可以含有2个具有2’-氟修饰的核苷酸，例如，在有义链中0个具有2-氟修饰的核苷酸和在反义链中2个具有2’-氟修饰的核苷酸。
各种公开描述了可用于本发明方法中的多聚体iRNA。这样的公开包括WO2007/091269、美国专利No.7,858,769、WO2010/141511、WO2007/117686、WO2009/014887和WO2011/031520，其各自的全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方式中，本公开的组合物和方法包括如本文所述的RNAi剂的乙烯基膦酸酯(VP)修饰。在示例性实施方式中，本公开的5’乙烯基膦酸酯修饰的核苷酸具有以下结构：
其中X是O或S；
R是氢、羟基、氟或C1-20烷氧基(例如甲氧基或正十六烷氧基)；
R5是＝C(H)-P(O)(OH)2并且C5’碳和R5’之间的双键处于E或Z取向(例如，E取向)；和
B是核碱基或修饰的核碱基，任选地其中B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
本公开的乙烯基膦酸酯可以连接至本公开的dsRNA的反义链或有义链。在某些实施方式中，本公开的乙烯基膦酸酯连接至dsRNA的反义链，任选地dsRNA的反义链的5’-端处。
本公开的组合物和方法也考虑了乙烯基膦酸酯修饰。示例性的乙烯基膦酸酯结构包括前述结构，其中R5′是＝C(H)-OP(O)(OH)2，并且C5′碳和R5′之间的双键处于E或Z取向(例如，E取向)。
如下文更详细描述的，含有一个或多个碳水化合物部分与iRNA的缀合的iRNA可以优化iRNA的一种或多种性质。在许多情况下，碳水化合物部分附接至iRNA的修饰亚基。例如，iRNA的一个或多个核糖核苷酸亚基的核糖可以被另一部分(例如，与碳水化合物配体附接的非碳水化合物(如环状)载体)替代。其中亚基的核糖已被如此替代的核糖核苷酸亚基在本文中称为核糖置换修饰亚基(RRMS)。环状载体可以是碳环系统，即所有环原子都是碳原子，或杂环系统，即一个或多个环原子可以是杂原子，例如氮、氧、硫。环状载体可以是单环环系，或者可以含有两个或更多个环，例如稠合环。环状载体可以是完全饱和的环体系，或者其可以含有一个或多个双键。
配体可以通过载体附接到多核苷酸。载体包括(i)至少一个“主链连接点”，如两个“主链连接点”和(ii)至少一个“系链连接点”。如本文所用的“主链连接点”是指官能团，例如羟基，或者通常是可用于并适合于将载体并入核糖核酸主链(例如磷酸酯或修饰的磷酸酯，例如含硫主链)中的键。在一些实施方式中，“系链连接点”(TAP)是指环状载体的组成环原子，例如碳原子或杂原子(不同于提供主链连接点的原子)，其连接所选部分。该部分可以是例如碳水化合物，例如单糖、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖。任选地，所选部分通过中间系链连接到环状载体。因此，环状载体通常包括官能团，例如氨基，或通常提供适合于将另一种化学实体(例如配体)并入或栓系到组成环的键。
iRNA可以通过载体与配体缀合，其中载体可以是环状基团或非环状基团。在一个实施方式中，环状基团选自吡咯烷基、吡唑啉基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、哌啶基、哌嗪基、[1，3]二氧戊环、噁唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、噻唑烷基、异噻唑烷基、喹喔啉基、哒嗪酮基、四氢呋喃基和十氢化萘。在一个实施方式中，非环状基团是丝氨醇主链或二乙醇胺主链。
a.热去稳定修饰
在某些实施方式中，可以通过在该反义链的种子区域中掺入热去稳定修饰来针对RNA干扰优化dsRNA分子。如本文所用，“种子区域”意指参考链的5′-端的位置2-9。例如，可以在反义链的种子区域中掺入热去稳定修饰以减少或抑制脱靶基因沉默。
术语“热去稳定修饰”包括获得总体解链温度(Tm)比不具有此类修饰的dsRNA的Tm低的dsRNA。例如，热去稳定修饰可以将dsRNA的Tm降低1-4℃，例如一、二、三或四摄氏度。并且，术语“热去稳定核苷酸”是指含有一个或多个热去稳定修饰的核苷酸。
已经发现了具有在反义链的从5'端计数的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个双链体的热去稳定修饰的反义链的dsRNA具有降低的脱靶基因沉默活性。因此，在一些实施方式中，反义链在反义链的5’区的前9个核苷酸位置内包含双链体的至少一个(例如一个、两个、三个、四个、五个或更多个)热去稳定修饰。在一些实施方式中，双链体的一个或多个热去稳定修饰位于反义链的5'-端的位置2-9，如位置4-8。在一些进一步的实施方式中，双链体的热去稳定修饰位于反义链的5'-端的位置6、7或8处。在还有一些进一步的实施方式中，双链体的热去稳定修饰位于反义链的5’-端的位置7处。在一些实施例中，双链体的热去稳定修饰位于从反义链的5'-端的位置2、3、4、5或9处。
iRNA剂包含有义链和反义链，每条链具有14至40个核苷酸。RNAi剂可由式(L)表示：
在式(L)中，B1、B2、B3、B1’、B2’、B3’和B4’各自独立地为含有选自2’-O-烷基、2’-取代的烷氧基、2’-取代的烷基、2’-卤素、ENA和BNA/LNA的修饰的核苷酸。在一个实施方式中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自含有2'-OMe修饰。在一个实施方式中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'各自含有2'-OMe或2'-F修饰。在一个实施方式中，B1、B2、B3、B1'、B2'、B3'和B4'中的至少一个含有2'-O-N-甲基乙酰胺基(2'-O-NMA，2'O-CH2C(O)N(Me)H)修饰。
C1是位于与反义链的种子区域相对的位点处(即，在反义链的5'-端的位置2-8处)的热去稳定核苷酸。例如，C1位于与反义链的5'-端的位置2-8处的核苷酸配对的有义链的位置处。在一个实例中，C1位于位于有义链的5'-端的位置15处。C1核苷酸带有热去稳定修饰，其可以包括脱碱基修饰；与双链体中相对核苷酸的错配；以及糖修饰，如2'-脱氧修饰或无环核苷酸，例如解锁核酸(UNA)或甘油核酸(GNA)。在一个实施方式中，C1具有选自下组的热去稳定修饰：i)与反义链中的相对核苷酸的错配；ii)选自以下的无碱基修饰：
和iii)选自以下的糖修饰：
其中B是修饰或未修饰的核碱基，R1和R2独立地是H、卤素、OR3或烷基；且R3是H、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖。在一个实施方式中，C1中的热去稳定修饰是选自G:G、G:A、G:U、G:T、A:A、A:C、C:C、C:U、C:T、U:U、T:T和U:T的错配；并且任选地，错配对中的至少一个核碱基是2'-脱氧核碱基。在一个实例中，C1中的热去稳定修饰是GNA或
T1′、T2′、T2′和T3′各自独立地表示包含修饰的核苷酸，所述修饰为核苷酸提供的空间体积小于或等于2′-OMe修饰的空间体积。空间体积是指修饰的空间效应的总和。用于确定核苷酸修饰的空间效应的方法是本领域技术人员已知的。修饰可以在核苷酸的核糖的2'位置，或是对非核糖核苷酸、无环核苷酸或核苷酸主链的修饰，其与核糖的2'位置相似或等同，并为核苷酸提供的空间体积小于或等于2'-OMe修饰的空间体积。例如，T1、T1'、T2'和T3'各自独立地选自DNA、RNA、LNA、2'-F和2'-F-5'-甲基。在一个实施方式中，T1是DNA。在一个实施方式中，T1'是DNA、RNA或LNA。在一个实施方式中，T2'是DNA或RNA。在一个实施方式中，T3'是DNA或RNA。
n1、n3和q1的长度独立地为4至15个核苷酸。
n5、q3和q7的长度独立地是1-6个核苷酸。
n4、q2和q6的长度独立地是1-3个核苷酸；或者，n4为0。
q5的长度独立地是0-10个核苷酸。
n2和q4的长度独立地为0-3个核苷酸。
或者，n4的长度为0-3个核苷酸。
在一个实施方式中，n4可以是0。在一个实例中，n4是0，并且q2和q6是1。在另一个实例中，n4是0，并且q2和q6是1，在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰以及在反义链的位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，n4、q2和q6各自为1。
在一个实施方式中，n2、n4、q2、q4和q6各自为1。
在一个实施方式中，有义链的长度为19-22个核苷酸且n4为1时，C1在有义链的5'-端的位置14-17。在一个实施方式中，C1在有义链的5'-端的位置15。
在一个实施方式中，T3'从反义链的5'端的位置2开始。在一个实例中，T3'在从反义链的5'端的位置2处，并且q6等于1。
在一个实施方式中，T1'从反义链的5’-端的位置14开始。在一个实例中，T1'在从反义链的5’-端的位置14处，并且q2等于1。
在一个示例性实施方式中，T3'从反义链的5'端的位置2开始，并且T1'从反义链的5'端的位置14开始。在一个实例中，T3'从反义链的5'端的位置2开始并且q6等于1，并且T1'从反义链的5'端的位置14开始并且q2等于1。
在一个实施方式中，T1'和T3'被长度为11个核苷酸分隔开(即，不计算T1'和T3'核苷酸)。
在一个实施方式中，T1'位于反义链的5’-端的位置14处。在一个实例中，T1'在反义链的5’-端的位置14处，并且q2等于1，并且修饰在2’位置处或在非核糖、无环或主链中提供比2’-OMe核糖更小的空间体积的位置处。
在一个实施方式中，T3'在反义链的5'端的位置2处。在一个实例中，T3'在反义链的5'端的位置2处，并且q6等于1，并且修饰在2'位置处或在非核糖、无环或主链中提供小于或等于2'-OMe核糖的空间体积的位置处。
在一个实施方式中，T1在有义链的切割位点处。在一个实例中，当有义链的长度为19-22个核苷酸且n2为1时，T1位于有义链的5’-端的位置11处。在一个示例性实施方式中，当有义链的长度为19-22个核苷酸且n2为1时，T1位于有义链的5’-端的位置11处的有义链的切割位点处。
在一个实施方式中，T2'从反义链的5'端的位置6开始。在一个实例中，T2'在反义链的5'端的位置6-10处，并且q4是1。
在一个示例性实施方式中，当有义链的长度为19-22个核苷酸且n2为1时，T1位于有义链的切割位点处，例如在有义链的5’-端的位置11处；T1'位于反义链的5’-端的位置14处，并且q2等于1，并且T1'的修饰位于核糖的2’位置处或在非核糖、无环或主链中提供比2’-OMe核糖更小的空间体积的位置处；T2'在反义链的5'端的位置6-10处，并且q4是1；并且T3’位于反义链的5’-端的位置2处，并且q6等于1，并且T3'的修饰是在2'位置处或在非核糖、无环或主链中提供小于或等于2'-OMe核糖的空间体积的位置处。
在一个实施方式中，T2'在反义链的5'端的位置8开始。在一个实例中，T2'在反义链的5'端的位置8开始，并且q4是2。
在一个实施方式中，T2'在反义链的5'端的位置9开始。在一个实例中，T2'在反义链的5'端的位置9处，并且q4是1。
在一个实施方式中，B1'是2'-OMe或2'-F，q1是9，T1'是2'-F，q2是1，B2'是2'-OMe或2'-F，q3是4，T2'是2'-F，q4是1，B3'是2'-OMe或2'-F，q5是6，T3'是2'-F，q6是1，B4'是2'-OMe，且q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，n4是0，B3是2′-OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2′-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2′是2′-OMe或2′-F，q3是4，T2′是2′-F，q4是1，B3′是2′-OMe或2′-F，q5是6，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，且q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是6，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是7，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是6，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是7，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是1，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是6，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，B1是2′-OMe或2′-F，n1是8，T1是2′-F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2′-OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2′-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2′是2′-OMe或2′-F，q3是5，T2′是2′-F，q4是1，B3′是2′-OMe或2′-F，q5是5，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，且q7是1；任选地在反义链的3'端具有至少2个另外的TT。
在一个实施方式中，B1是2′-OMe或2′-F，n1是8，T1是2′-F，n2是3，B2是2′-OMe，n3是7，n4是0，B3是2′-OMe，n5是3，B1′是2′-OMe或2′-F，q1是9，T1'是2′-F，q2是1，B2′是2′-OMe或2′-F，q3是5，T2′是2′-F，q4是1，B3′是2′-OMe或2′-F，q5是5，T3′是2′-F，q6是1，B4′是2′-OMe，且q7是1；任选地在反义链的3'端具有至少2个另外的TT；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1'是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2'是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3'是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3'是2’-F，q6是1，B4'是2’-OMe，和q7是1。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1'是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2'是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3'是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3'是2’-F，q6是1，B4'是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从5’-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23(从5’-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5内(从有义链的5'-端计数)具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰并且在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。
RNAi剂可以在有义链或反义链的5'-端包含含磷基团。5'-端含磷基团可以是5'-端磷酸酯(5'-P)、5'-端硫代磷酸酯(5'-PS)、5'-端二硫代磷酸酯(S'-PS2)、5'-端乙烯基膦酸酯(5'-VP)、5'-末端甲基膦酸酯(MePhos)或5'-脱氧-5'-C-丙二酰当5'-端含磷基团是5'-端乙烯基膦酸酯(5'-VP)时，5'-VP可以是5'-E-VP异构体(即反式-乙烯基膦酸酯，)、5’-Z-VP异构体(即顺式-乙烯基膦酸酯，)，或其混合物。
在一个实施方式中，RNAi剂在有义链的5'-端包含含磷基团。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链的5'-端包含含磷基团。
在一个实施方式中，RNAi剂包含5'-P。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-P。
在一个实施方式中，RNAi剂包含5'-PS。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-PS。
在一个实施方式中，RNAi剂包含5'-VP。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-VP。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-E-VP。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-Z-VP。
在一个实施方式中，RNAi剂包含5'-PS2。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-PS2。
在一个实施方式中，RNAi剂包含5'-PS2。在一个实施方式中，RNAi剂在反义链中包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。dsRNA剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。dsRNAi RNA剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-P。
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在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酸单酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP。5'-VP可以是5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P和靶向配体。在一个实施方式中，5'-P在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS和靶向配体。在一个实施方式中，5'-PS在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP(例如5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)和靶向配体。
在一个实施方式中，5’-VP在反义链的5’-端，并且靶向配体在有义链的3’-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2和靶向配体。在一个实施方式中，5′-PS2在反义链的5′-端，并且靶向配体在有义链的3′-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施方式中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P和靶向配体。在一个实施方式中，5'-P在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS和靶向配体。在一个实施方式中，5'-PS在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP(例如5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)和靶向配体。在一个实施方式中，5’-VP在反义链的5’-端，并且靶向配体在有义链的3’-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2和靶向配体。在一个实施方式中，5′-PS2在反义链的5′-端，并且靶向配体在有义链的3′-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-OMe，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施方式中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P和靶向配体。在一个实施方式中，5'-P在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS和靶向配体。在一个实施方式中，5'-PS在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP(例如5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)和靶向配体。在一个实施方式中，5’-VP在反义链的5’-端，并且靶向配体在有义链的3’-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2和靶向配体。在一个实施方式中，5′-PS2在反义链的5′-端，并且靶向配体在有义链的3′-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，T2’是2’-F，q4是2，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是5，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施方式中，5'-脱氧-5'-C-丙二酰在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-P和靶向配体。在一个实施方式中，5'-P在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS和靶向配体。在一个实施方式中，5'-PS在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-VP(例如5'-E-VP、5'-Z-VP或其组合)和靶向配体。在一个实施方式中，5’-VP在反义链的5’-端，并且靶向配体在有义链的3’-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-PS2和靶向配体。在一个实施方式中，5′-PS2在反义链的5′-端，并且靶向配体在有义链的3′-端。
在一个实施方式中，B1是2’-OMe或2’-F，n1是8，T1是2’-F，n2是3，B2是2’-OMe，n3是7，n4是0，B3是2’-OMe，n5是3，B1’是2’-OMe或2’-F，q1是9，T1'是2’-F，q2是1，B2’是2’-OMe或2’-F，q3是4，q4是0，B3’是2’-OMe或2’-F，q5是7，T3’是2’-F，q6是1，B4’是2’-F，和q7是1；在有义链的位置1-5(从有义链的5'-端计数)内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰，并且在反义链的位置1和2具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰和在位置18-23内具有两个硫代磷酸酯核苷酸间键修饰(从反义链的5'-端计数)。RNAi剂还包含5'-脱氧-5'-C-丙二酰和靶向配体。在一个实施方式中，5'-脱氧-5'-C-丙二酸单酰在反义链的5'-端，并且靶向配体在有义链的3'-端。
在一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1、3、5、7、9-11、13、17、19和21的2'-F修饰，以及在位置2、4、6、8、12、14-16、18和20的2'-OMe修饰(从5'端计数)；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、9、11-13、15、17、19、21和23的2'-OMe修饰，以及在位置2、4、6-8、10、14、16、18、20和22的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中dsRNA剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1、3、5、7、9-11、13、17、19和21的2'-F修饰，以及在位置2、4、6、8、12、14、16、18和20的2'-OMe修饰(从5'端计数)；和
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、9、11-13、15、17、19和21-23的2'-OMe修饰，以及在位置2、4、6、8、10、14、16、18和20的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1-6、8、10和12-21的2'-OMe修饰，在位置7和9的2'-F修饰以及位置11的脱氧-核苷酸(例如，dT)(从5'端计数)；和
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、7、9、11、13、15、17和19-23的2'-OMe修饰，以及在位置2、4-6、8、10、12、14、16和18的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1-6、8、10、12、14和16-21的2'-OMe修饰，以及在位置7、9、11、13和15的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、5、7、9、11、13、15、17、19和21-23的2'-OMe修饰，以及在位置2-4、6、8、10、12、14、16、18和20的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1-9和12-21的2'-OMe修饰，以及在位置10和11的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5、9、11-13、15、17、19和21-23的2'-OMe修饰，以及在位置2、4、6、8、10、14、16、18和20的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1、3、5、7、9-11和13的2'-F修饰，以及在位置2、4、6、8、12和14-21的2'-OMe修饰；和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3、5-7、9、11-13、15、17-19和21-23的2'-OMe修饰，以及在位置2、4、8、10、14、16和20的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1、2、4、6、8、12、14、15、17和19-21的2'-OMe修饰，以及在位置3、5、7、9-11、13、16和18的2'-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)25个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、4、6、7、9、11-13、15、17和19-23的2'-OMe修饰，在位置2、3、5、8、10、14、16和18的2'-F修饰，以及在位置24和25的脱氧核苷酸(例如dT)(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有四核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1-6、8和12-21的2'-OMe修饰，以及在位置7和9-11的2'-F修饰；和
(iv)核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3-5、7、8、10-13、15和17-23的2'-OMe修饰，以及在位置2、6、9、14和16的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3'-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5'-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)附接至3'-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1-6、8和12-21的2'-OMe修饰，以及在位置7和9-11的2'-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)23个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3-5、7、10-13、15和17-23的2'-OMe修饰，以及在位置2、6、8、9、14和16的2'-F修饰(从5'端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置21和22之间以及核苷酸位置22和23之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3′-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5′-端具有平末端。
在另一个特定实施方式中，本发明的RNAi剂包含：
(a)有义链，其具有：
(i)19个核苷酸的长度；
(ii)附接至3′-端的ASGPR配体，其中所述ASGPR配体包含通过三价分支接头附接的三个GalNAc衍生物；和
(iii)在位置1-4、6和10-19的2′-OMe修饰，以及在位置5和7-9的2′-F修饰；和
(iv)在核苷酸位置1和2之间以及核苷酸位置2和3之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；和
(b)反义链，其具有：
(i)21个核苷酸的长度；
(ii)在位置1、3-5、7、10-13、15和17-21的2′-OMe修饰，以及在位置2、6、8、9、14和16的2′-F修饰(从5′端计数)；和
(iii)在核苷酸位置1和2之间、核苷酸位置2和3之间、核苷酸位置19和20之间以及核苷酸位置20和21之间(从5’端计数)的硫代磷酸酯核苷酸间键；
其中RNAi剂在反义链的3′-端具有两核苷酸的突出端，并且在反义链的5′-端具有平末端。
在某些实施方式中，用于本发明方法中的iRNA是选自表4-5任一中列出的试剂的试剂。这些试剂可以进一步包含配体。
v.包含基序的反义多核苷酸剂
在本发明的某些实施方式中，本发明的反义多核苷酸剂的连续核苷酸中的至少一个可以是修饰的核苷酸。在一个实施方式中，修饰的核苷酸包含一个或多个修饰的糖。在其他实施方式中，修饰的核苷酸包含一个或多个修饰的核碱基。在又其他实施方式中，修饰的核苷酸包含一个或多个修饰的核苷间键。在一些实施方式中，修饰(糖修饰、核碱基修饰或键修饰)限定模式或基序。在一个实施方式中，糖部分、核苷间键和核碱基的修饰模式各自彼此独立。
具有以模式或基序排列的修饰的寡核苷酸的反义多核苷酸剂可以例如赋予试剂诸如增强的抑制活性、增加的对靶核酸的结合亲和力或对体内核酸酶降解的抗性的性质。例如，此类试剂可含有至少一个修饰的区域，以便赋予增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取、增加的对靶核酸的结合亲和力或增加的抑制活性。此类试剂的第二区域可以任选地用作细胞内切核酸酶RNA酶H的底物，其切割RNA：DNA双链体的RNA链。
具有以模式或基序排列的修饰的寡核苷酸的示例性反义多核苷酸剂是间隔寡聚体。在“间隔寡聚体”中，具有支持RNaseH切割的多个连接的核苷酸的内部区域或“间隙”位于两个外部侧翼区之间或具有多个连接的核苷酸的“翼”之间，该连接的核苷酸在化学上不同于内部区域的连接的核苷酸。间隙区段通常用作核酸内切酶切割的底物，而翼区段包含修饰的核苷酸。
间隔寡聚体基序的三个区域(5'-翼、间隙和3'-翼)形成连续的核苷酸序列，并且可以描述为“X-Y-Z”，其中“X”表示5-翼的长度，“Y”表示间隙的长度，并且“Z”表示3'-翼的长度。在一个实施方式中，描述为“X-Y-Z”的间隔寡聚体具有使得间隙区段紧邻5’翼区段和3’翼区段中的每一个定位的的构型。因此，5'翼区段与间隙区段之间或间隙区段与3'翼区段之间不存在中间核苷酸。本文所述的任何反义化合物可具有间隔寡聚体基序。在一些实施方式中，X和Z是相同的，在其他实施方式中，它们是不同的。
在某些实施方式中，间隔寡聚体的区域通过区域中修饰的核苷酸的类型来区分。在一些实施方式中，可用于区分间隔寡聚体的区域的修饰的核苷酸的类型包括β-D-核糖核苷酸、β-D-脱氧核糖核苷酸、2'-修饰的核苷酸(例如，2'-修饰的核苷酸，例如，2'-MOE和2'-O-CH3)和双环糖修饰的核苷酸(例如，具有4'-(CH2)n-O-2'桥的那些，其中n＝1或n＝2)。
在一个实施方式中，每个翼的至少一些修饰的核苷酸可以不同于间隙的至少一些修饰的核苷酸。例如，最靠近间隙的每个翼的至少一些修饰的核苷酸(5'-翼的最3'-核苷酸和3-翼的最5-'核苷酸)不同于相邻间隙核苷酸的修饰的核苷酸，从而限定了翼和间隙之间的边界。在某些实施方式中，间隙内的修饰核苷酸彼此相同。在某些实施方式中，间隙包括一个或多个修饰的核苷酸，其不同于间隙的一个或多个其他核苷酸的修饰的核苷酸。
间隔寡聚体的5'-翼(X)的长度可以是1至6个核苷酸的长度，例如2至6、2至5、3至6、3至5、1至5、1至4、1至3、2至4个核苷酸的长度，例如1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度。
间隔寡聚体的3'-翼(Z)的长度可以是1至6个核苷酸的长度，例如2至6、2至5、3至6、3至5、1至5、1至4、1至3、2至4个核苷酸的长度，例如1、2、3、4、5或6个核苷酸的长度。
间隔寡聚体的间隙(Y)的长度可以是5至14个核苷酸，例如长度5至13、5至12、5至11、5至10、5至9、5至8、5至7、5至6、6至14、6至13、6至12、6至11、6至10、6至9、6至8、6至7、7至14、7至13、7至12、7至11、7至10、7至9、7至8、8至14、8至13、8至12、8至11、8至10、8至9、9至14、9至13、9至12、9至11、9至10，10至14、10至13、10至12、10至11、11至14、11至13、11至12、12至14、12至13或13至14个核苷酸，例如长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个核苷酸。
在本发明的一些实施方式中，X由2、3、4、5或6个核苷酸组成，Y由7、8、9、10、11或12个核苷酸组成，并且Z由2、3、4、5或6个核苷酸组成。这样的间隔寡聚体包括(X-Y-Z)2-7-2、2-7-3、2-7-4、2-7-5、2-7-6、3-7-2、3-7-3、3-7-4、3-7-5、3-7-6、4-7-3、4-7-4、4-7-5、4-7-6、5-7-3、5-7-4、5-7-5、5-7-6、6-7-3、6-7-4、6-7-5、6-7-6、3-7-3、3-7-4、3-7-5、3-7-6、4-7-3、4-7-4、4-7-5、4-7-6、5-7-3、5-7-4、5-7-5、5-7-6、6-7-3、6-7-4、6-7-5、6-7-6、2-8-2、2-8-3、2-8-4、2-8-5、2-8-6、3-8-2、3-8-3、3-8-4、3-8-5、3-8-6、4-8-3、4-8-4、4-8-5、4-8-6、5-8-3、5-8-4、5-8-5、5-8-6、6-8-3、6-8-4、6-8-5、6-8-6、2-9-2、2-9-3、2-9-4、2-9-5、2-9-6、3-9-2、3-9-3、3-9-4、3-9-5、3-9-6、4-9-3、4-9-4、4-9-5、4-9-6、5-9-3、5-9-4、5-9-5、5-9-6、6-9-3、6-9-4、6-9-5、6-9-6、2-10-2、2-10-3、2-10-4、2-10-5、2-10-6、3-10-2、3-10-3、3-10-4、3-10-5、3-10-6、4-10-3、4-10-4、4-10-5、4-10-6、5-10-3、5-10-4、5-10-5、5-10-6、6-10-3、6-10-4、6-10-5、6-10-6、2-11-2、2-11-3、2-11-4、2-11-5、2-11-6、3-11-2、3-11-3、3-11-4、3-11-5、3-11-6、4-11-3、4-11-4、4-11-5、4-11-6、5-11-3、5-11-4、5-11-5、5-11-6、6-11-3、6-11-4、6-11-5、6-11-6、2-12-2、2-12-3、2-12-4、2-12-5、2-12-6、3-12-2、3-12-3、3-12-4、3-12-5、3-12-6、4-12-3、4-12-4、4-12-5、4-12-6、5-12-3、5-12-4、5-12-5、5-12-6、6-12-3、6-12-4、6-12-5或6-12-6。
在本发明的一些实施方式中，靶向INHBE的反义多核苷酸剂包括5-10-5间隔寡聚体基序。在本发明的其他实施方式中，靶向INHBE的反义多核苷酸剂包括4-10-4间隔寡聚体基序。在本发明的另一个实施方式中，靶向INHBE的反义多核苷酸剂包括3-10-3间隔寡聚体基序。在本发明的其他实施方式中，靶向INHBE的反义多核苷酸剂包括2-10-2间隔寡聚体基序。
间隔寡聚体的5’翼或3’翼可以独立地包含1-6个修饰的核苷酸，例如1、2、3、4、5或6个修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包括至少一个修饰的核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少两个修饰的核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少三个修饰的核苷酸。在又另一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少四个修饰的核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少五个修饰的核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是修饰的核苷酸。
在一些实施方式中，间隔寡聚体的3′-翼包括至少一个修饰的核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少两个修饰的核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少三个修饰的核苷酸。在又另一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少四个修饰的核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少五个修饰的核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼的每个核苷酸是修饰的核苷酸。
在某些实施方式中，间隔寡聚体的区域通过核苷酸的糖部分的类型来区分。在一个实施方式中，每个不同区域的核苷酸包含均一的糖部分。在其他实施方式中，每个不同区域的核苷酸包含不同的糖部分。在某些实施方式中，两个翼的糖核苷酸修饰基序彼此相同。在某些实施方式中，5’-翼的糖核苷酸修饰基序不同于3’-翼的糖核苷酸修饰基序。
间隔寡聚体的5′-翼可包括1-6个修饰的核苷酸，例如1、2、3、4、5或6个修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的至少一个修饰的核苷酸是双环核苷酸，例如受限的乙基核苷酸或LNA。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包括2、3、4或5个双环核苷酸。在一些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是双环核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少1、2、3、4或5个受限的乙基核苷酸。在一些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是受限的乙基核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少一个LNA核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包括2、3、4或5个LNA核苷酸。在其他实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是LNA核苷酸。
在某些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的至少一个修饰的核苷酸是非双环修饰的核苷酸，例如2'-取代的核苷酸。“2′-取代的核苷酸”是在2′-位包含除H或OH以外的修饰的核苷酸，如2′-OMe核苷酸或2′-MOE核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5′-翼包含2、3、4或5个2′-取代的核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是2'-取代的核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少一个2'-OMe核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5′-翼包含至少2、3、4或5个2′-OMe核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5′-翼的每个核苷酸包含2′-OMe核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少一个2'-MOE核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5′-翼包含至少2、3、4或5个2′-MOE核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的5′-翼的每个核苷酸包含2′-MOE核苷酸。
在某些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少一个2'-脱氧核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是2'-脱氧核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼包含至少一个核糖核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸是核糖核苷酸。
间隔寡聚体的3′翼可包括1-6个修饰的核苷酸，例如1、2、3、4、5或6个修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼的至少一个修饰的核苷酸是双环核苷酸，例如受限的乙基核苷酸或LNA。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼包含2、3、4或5个双环核苷酸。在一些实施方式中，间隔寡聚体的3′翼的每个核苷酸是双环核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少一个受限的乙基核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼包含2、3、4或5个受限的乙基核苷酸。在一些实施方式中，间隔寡聚体的3′翼的每个核苷酸是受限的乙基核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少一个LNA核苷酸。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼包括2、3、4或5个LNA核苷酸。在其他实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼的每个核苷酸是LNA核苷酸。
在某些实施方式中，间隔寡聚体的3′翼的至少一个修饰的核苷酸是非双环修饰的核苷酸，例如2′-取代的核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3′-翼包含2、3、4或5个2′-取代的核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼的每个核苷酸是2'-取代的核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼包含至少一个2′-OMe核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼包含至少2、3、4或5个2′-OMe核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼的每个核苷酸包含2′-OMe核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少一个2'-MOE核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼包含至少2、3、4或5个2′-MOE核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的3′翼的每个核苷酸包含2′-MOE核苷酸。
在某些实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少一个2'-脱氧核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼的每个核苷酸是2'-脱氧核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼包含至少一个核糖核苷酸。在某些实施方式中，间隔寡聚体的3′翼的每个核苷酸是核糖核苷酸。
间隔寡聚体的间隙可以包含5-14个修饰的核苷酸，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个修饰的核苷酸。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙包含至少一个5-甲基胞嘧啶。在一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个5-甲基胞嘧啶。在一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙的所有核苷酸都是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙包含至少一个2’-脱氧核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个2’-脱氧核苷酸。在一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙的所有核苷酸都是2'-脱氧核苷酸。
间隔寡聚体可以包括一个或多个修饰的核苷酸间键。在一些实施方式中，间隔寡聚体包括一个或多个磷酸二酯核苷酸间键。在其他实施方式中，间隔寡聚体包括一个或多个硫代磷酸酯核苷酸间键。
在一个实施方式中，间隔寡聚体的5'-翼的每个核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键连接。在另一个实施方式中，间隔寡聚体的3'-翼的每个核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键连接。在又另一个实施方式中，间隔寡聚体的间隙区段的每个核苷酸经由硫代磷酸酯核苷酸间键连接。在一个实施方式中，间隔寡聚体中的所有核苷酸通过硫代磷酸酯核苷酸间键连接。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含五个核苷酸的5'-翼区段和包含5个核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间。
在另一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含四个核苷酸的5-’翼区段和包含四个核苷酸的3’翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间。
在另一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含三个核苷酸的5'-翼区段和包含三个核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间。
在另一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含两个核苷酸的5'-翼区段和包含两个核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间。
在一个实施方式中，侧接10个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段的5-翼的每个核苷酸包含修饰的核苷酸。在另一个实施方式中，侧接10个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段的3-翼的每个核苷酸包含修饰的核苷酸。在一个实施方式中，每个修饰的5′-翼核苷酸和每个修饰的3′-翼核苷酸包含2′-糖修饰。在一个实施方式中，2'-糖修饰是2'-OMe修饰。在另一个实施方式中，2'-糖修饰是2'-MOE修饰。在一个实施方式中，修饰的5’翼核苷酸中的每一个和修饰的3’翼核苷酸中的每一个包含双环核苷酸。在一个实施方式中，双环核苷酸是受限的乙基核苷酸。在另一个实施方式中，双环核苷酸是LNA核苷酸。在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂中的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸试剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含含有2'-OMe修饰的五个核苷酸的5'-翼区段和包含含有2'-OMe修饰的五个核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中所述试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一个实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方式中，试剂还包含配体。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含五个含有2'-MOE修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含五个含有2'-MOE修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一个实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。在一些实施方式中，试剂还包含配体。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含五个受限的乙基核苷酸的5'-翼区段和包含五个受限的乙基核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含五个LNA核苷酸的5'-翼区段和包含五个LNA核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含四个含有2'-OMe修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含四个含有2'-OMe修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含四个含有2'-MOE修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含四个含有2'-MOE修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含四个受限的乙基核苷酸的5'-翼区段和包含四个受限的乙基核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含四个LNA核苷酸的5'-翼区段和包含四个LNA核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含三个含有2'-OMe修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含三个含有2'-OMe修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含三个含有2'-MOE修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含三个含有2'-MOE修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含三个受限的乙基核苷酸的5'-翼区段和包含三个受限的乙基核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含三个LNA核苷酸的5'-翼区段和包含三个LNA核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含两个含有2'-OMe修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含两个含有2'-OMe修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含两个含有2'-MOE修饰的核苷酸的5'-翼区段和包含两个含有2'-MOE修饰的核苷酸的3'-翼区段并且位于所述5'-翼区段和所述3'-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2'-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含两个受限的乙基核苷酸的5′-翼区段和包含两个受限的乙基核苷酸的3′-翼区段并且位于所述5′-翼区段和所述3′-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
在一个实施方式中，靶向INHBE基因的反义多核苷酸剂包含十个2′-脱氧核糖核苷酸的间隙区段，所述间隙区段紧邻包含两个LNA核苷酸的5′-翼区段和包含两个LNA核苷酸的3′-翼区段并且位于所述5′-翼区段和所述3′-翼区段之间，其中试剂的每个核苷酸间键是硫代磷酸酯键。在一些实施方式中，试剂的每个胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
适用于本发明的药剂、组合物和方法的进一步间隔寡聚体设计公开于例如美国专利No.7,687,617和8,580,756；美国专利公开No.20060128646、20090209748、20140128586、20140128591、20100210712和20080015162A1；和国际公开No.WO 2013/159108，其各自的全部内容通过引用并入本文。
vi.与配体缀合的调节剂
本发明的调节剂(例如，寡核苷酸，例如dsRNA剂、反义多核苷酸剂、实现ADAR编辑的指导RNA或实现CRISPR编辑的指导RNA)的另一种修饰涉及将调节剂化学连接至一种或多种配体、部分或缀合物，其增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取(例如，摄取至细胞中)。此类部分包括但不限于脂质部分，如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acid.Sci.USA，1989，86：6553-6556)。在其他实施方式中，配体是胆酸(Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1994，4：1053-1060)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660：306-309；Manoharan等，Biorg.Med.Chem.Let.，1993，3：2765-2770)、硫代胆甾醇(Oberhauser等，Nucl.AcidsRes.，1992，20：533-538)、例如十二烷二醇或十一烷基残基的脂族链(Saison-Behmoaras等，EMBO J，1991，10：111；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259：327；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75：49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1，2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-膦酸三乙铵(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36：3651-3654；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18：3777-3783)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14：969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，TetrahedronLett.，1995，36：3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264：229-237)或十八烷基胺或己基氨基-羰基氧基胆固醇部分(Grooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277：923-937)。
在某些实施方式中，配体改变其掺入其中的寡核苷酸的分布、靶向或寿命。在一些实施方式中，配体提供增强的对所选靶标(例如分子、细胞或细胞类型、区室(例如细胞或器官区室)、组织、器官或身体区域)的亲和力，例如与不存在这种配体的物质相比。在一些实施方式中，配体不参与双链体化核酸中的双链体配对。
配体可以包括天然存在的物质，如蛋白质(例如，人血清白蛋白(HSA)、低密度脂蛋白(LDL)或球蛋白)；碳水化合物(例如葡聚糖、支链淀粉、几丁质、壳聚糖、菊粉、环糊精、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，如合成聚合物，例如合成聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括作为聚赖氨酸(PLL)、聚L-天冬氨酸、聚L-谷氨酸、苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(L-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酸酐共聚物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)、聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、N-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚膦嗪的聚氨基酸。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(PLL)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-聚胺、拟肽聚胺、树枝状聚合物聚胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐或α螺旋肽。
配体还可以包括靶向基团，例如细胞或组织靶向剂，例如凝集素、糖蛋白、脂质或蛋白质，例如抗体，其与特定细胞类型(如肾细胞)结合。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白A、粘蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、二膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆汁酸、叶酸、维生素B12、维生素A、生物素或RGD肽或RGD肽模拟物。在某些实施方式中，配体是多价半乳糖，例如N-乙酰基-半乳糖胺。
配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素C)、卟啉(TPPC4、德克萨卟啉、沙卟啉)、多环芳香烃(例如吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如EDTA)、亲脂性分子，例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1,3-双-O(十六烷基)甘油、香叶基氧基己基、十六烷基甘油、冰片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基或吩噁嗪)和肽缀合物(例如，触足肽、Tat肽)；烷基化剂、磷酸盐、氨基、巯基、PRG(例如，PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射性标记的标志物、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如阿司匹林、维生素E、叶酸)、合成核糖核酸酶(例如咪唑、双咪唑、组胺、咪唑簇、吖啶-咪唑缀合物、四氮杂大环的Eu3+络合物)、二硝基苯基、HRP或AP。
配体可以是蛋白质，例如糖蛋白，或肽，例如对共配体具有特异性亲和力的分子，或抗体，例如结合特定细胞类型(如肝细胞)的抗体。配体还可以包括激素和激素受体。它们还可以包括非肽物质，如脂质、凝集素、碳水化合物、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、N-乙酰基-半乳糖胺、N-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38 MAP激酶的激活剂或NF-κB的激活剂。
配体可以是可以例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝或中间丝来增加调节剂(例如寡核苷酸，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂)摄取到细胞中的物质，例如药物。药物可以是例如紫杉醇、长春新碱、长春碱、细胞松弛素、诺考达唑、japlakinolide、latrunculin A、鬼笔环肽、swinholide A、茚满辛或myoservin。
在一些实施方式中，连接至如本文所述的寡核苷酸的配体充当药代动力学调节剂(PK调节剂)。PK调节剂包括亲脂体、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白质结合剂、PEG、维生素等。示例性的PK调节剂包括但不限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素。还已知包含多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸与血清蛋白结合，因此在主链中包含多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸也适合于本发明作为配体(例如作为PK调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适体也适合用作本文所述实施方式中的PK调节配体。
本发明的配体缀合的寡核苷酸可以通过使用带有侧接的反应性官能团的寡核苷酸来合成，如衍生自连接分子在寡核苷酸上的连接的侧接的反应性官能团(如下所述)。该反应性寡核苷酸可以直接与市售配体、作为合成的带有多种保护基团中的任一种的配体或具有与其连接的连接部分的配体反应。
本发明的缀合物中使用的寡核苷酸可以通过众所周知的固相合成技术方便且常规地制备。用于这种合成的设备由几个零售商出售，包括例如Applied(Foster City，Calif.)。可以另外地或可选地采用本领域已知的用于这种合成的任何其他方法。还已知使用类似的技术来制备其他寡核苷酸，如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。
在本发明的配体缀合的寡核苷酸和带有序列特异性连接的核苷的配体-分子中，寡核苷酸和寡核苷可以在合适的DNA合成仪上组装，其使用标准核苷酸或核苷前体，或已经带有连接部分的核苷酸或核苷缀合物前体，已经带有配体分子的配体-核苷酸或核苷-缀合物前体，或带有非核苷配体的结构块。
当使用已经带有连接部分的核苷酸-缀合物前体时，通常完成序列特异性连接的核苷的合成，然后配体分子与连接部分反应以形成配体缀合的寡核苷酸。在一些实施方式中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成仪使用衍生自配体-核苷缀合物的亚磷酰胺以及可商购获得的和常规用于寡核苷酸合成的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺来合成。
A.脂质缀合物
在某些实施方式中，配体或缀合物是脂质或基于脂质的分子。在一个实施方式中，这种脂质或基于脂质的分子结合血清蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)。HSA结合配体允许缀合物分布至靶组织，例如身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合HSA的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加缀合物对降解的抗性，(b)增加靶向或转运到靶细胞或细胞膜中，或(c)可以用于调节与血清蛋白(例如HSA)的结合。
基于脂质的配体可用于抑制，例如控制缀合物与靶组织的结合。例如，与HSA更强结合的脂质或基于脂质的配体将不太可能被靶向肾，且因此不太可能从体内清除。与HSA不太强烈结合的脂质或基于脂质的配体可用于将缀合物靶向肾脏。
在某些实施方式中，基于脂质的配体结合HSA。在一个实施方式中，它以足够的亲和力结合HSA，使得缀合物分布到非肾组织。然而，优选的是亲和力不太强，以至于不能逆转HSA-配体结合。
在其它实施方式中，基于脂质的配体弱结合HSA或完全不结合。在一个实施方式中，缀合物分布至肾脏。也可以使用靶向肾细胞的其他部分代替基于脂质的配体或在基于脂质的配体之外使用靶向肾细胞的其他部分。
在另一方面，配体是被靶细胞(例如增殖细胞)摄取的部分，例如维生素。这些对于治疗特征在于不合需要的细胞增殖的病症特别有用，例如恶性或非恶性类型的细胞增殖，例如癌细胞。示例性维生素包括维生素A、E和K。其它示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或其它由靶细胞(如肝细胞)摄取的维生素或营养物。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
B.细胞渗透剂
在另一方面，配体是细胞渗透剂，如螺旋细胞渗透剂。在一个实施方式中，试剂是两亲性的。示例性试剂是肽，例如tat或触足肽。如果试剂是肽，可以对其进行修饰，包括肽模拟物、反向异构体、非肽或假肽键，以及使用D-氨基酸。在一个实施方式中，螺旋剂是α-螺旋剂，其具有亲脂相和疏脂相。
配体可以是肽或肽模拟物。肽模拟物(在本文中也称为寡肽模拟物)是能够折叠成类似于天然肽的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与iRNA剂的连接可以影响iRNA的药代动力学分布，如通过增强细胞识别和吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50个氨基酸长，例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。
肽或肽模拟物可以是例如细胞渗透肽、阳离子肽、两亲性肽或疏水性肽(例如，主要由Tyr、Trp或Phe组成)。肽部分可以是树枝状聚合物肽、受限肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜易位序列(MTS)。示例性疏水性含MTS肽是具有氨基酸序列AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID NO：14)的RFGF。含有疏水性MTS的RFGF类似物，例如氨基酸序列AALLPVLLAAP(SEQ ID NO：15)，也可以是靶向部分。肽部分可以是“递送”肽，其可以携带大的极性分子，包括跨细胞膜的肽、寡核苷酸和蛋白质。例如，已经发现来自HIV Tat蛋白(GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：16))和来自果蝇触足蛋白的序列(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ IDNO：17))能够起递送肽的作用。肽或肽模拟物可以由DNA的随机序列编码，如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(OBOC)组合文库中鉴定的肽(Lam等，Nature，354：82-84，1991)。出于细胞靶向目的经由掺入的单体单元栓系至dsRNA剂的肽或肽模拟物的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)-肽或RGD模拟物。肽部分的长度范围可以为约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，例如以增加稳定性或直接构象性质。可以利用下面描述的任何结构修饰。
用于本发明的组合物和方法的RGD肽可以是线性或环状的，并且可以被修饰，例如糖基化或甲基化，以促进靶向特定组织。含RGD的肽和肽模拟物可包括D-氨基酸，以及合成的RGD模拟物。除了RGD之外，还可以使用靶向整联蛋白配体的其他部分，例如PECAM-1或VEGF。
“细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞，如细菌或真菌细胞，或哺乳动物细胞，如人细胞。微生物细胞渗透肽可以是例如α-螺旋线性肽(例如LL-37或Ceropin P1)、含有二硫键的肽(例如α-防御素、β-防御素或牛抗菌肽)或仅含有一个或两个主导氨基酸的肽(例如PR-39或indolicidin)。细胞渗透肽还可以包括核定位信号(NLS)。例如，细胞渗透肽可以是两分两亲性肽，如MPG，其衍生自HIV-1 gp41的融合肽结构域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等，Nucl.Acids Res.31：2717-2724，2003)。
C碳水化合物缀合物
在本发明的组合物和方法的一些实施方式中，寡核苷酸(例如dsRNA试或反义多核苷酸剂)进一步包含碳水化合物。如本文所述，碳水化合物缀合的寡核苷酸对于核酸的体内递送以及适合于体内治疗用途的组合物是有利的。如本文所用，“碳水化合物”是指其本身是由一个或多个具有至少6个碳原子的单糖单元(其可以是直链、支链或环状)及与每个碳原子键合氧、氮或硫原子组成的碳水化合物的化合物；或具有作为其一部分的由一个或多个各自具有至少六个碳原子的单糖单元(其可以是直链、支链或环状的)构成的碳水化合物部分的化合物，其中氧、氮或硫原子键合到每个碳原子。代表性碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖和含有约4、5、6、7、8或9个单糖单元的寡糖)和多糖，如淀粉、糖原、纤维素和多糖胶。具体的单糖包括C5和以上(例如，C5、C6、C7或C8)糖；二糖和三糖包括具有两个或三个单糖单元(例如C5、C6、C7或C8)的糖。
在某些实施方式中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。
在某些实施方式中，单糖是N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。包含一种或多种N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)衍生物的GalNAc缀合物描述于例如US 8,106,022中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方式中，GalNAc缀合物充当将iRNA靶向特定细胞的配体。在一些实施方式中，GalNAc缀合物将iRNA靶向肝脏细胞，例如通过充当肝脏细胞(例如肝细胞)的脱唾液酸糖蛋白受体的配体。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物包含一种或多种GalNAc衍生物。GalNAc衍生物可以经由接头(例如二价或三价分支接头)连接。在一些实施方式中，GalNAc缀合物与有义链的3'端缀合。在一些实施方式中，GalNAc缀合物经由接头(例如，如本文所描述的接头)与寡核苷酸剂缀合(例如，与有义链的3'端缀合)。在一些实施方式中，GalNAc缀合物与有义链的5'端缀合。在一些实施方式中，GalNAc缀合物经由接头(例如，如本文所描述的接头)与iRNA剂缀合(例如，与有义链的5'端缀合)。
在本发明的某些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由单价接头与本发明的寡核苷酸连接。在一些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由二价接头与本发明的寡核苷酸连接。还在本发明的其他实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由三价接头与本发明的寡核苷酸连接。在本发明的其他实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由四价接头与本发明的寡核苷酸连接。
在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含一个与寡核苷酸连接的GalNAc或GalNAc衍生物。在某些实施方式中，本发明的寡核苷酸包含多个(例如2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，其各自独立地通过多个单价接头连接寡核苷酸的多个核苷酸。
在一些实施方式中，例如，当本发明的iRNA剂的两条链是通过一条链的3'-端与相应另一条链的5'-端之间形成包含多个未配对核苷酸的发夹环的不间断核苷酸链连接的一个较大分子的部分时，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含经由单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。
在一些实施方式中，例如，当本发明的iRNA剂的两条链是通过一条链的3'-端与相应另一条链的5'-端之间形成包含多个未配对核苷酸的发夹环的不间断核苷酸链连接的一个较大分子的部分时，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含经由单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。发夹环也可以由双链体的一条链中的延伸突出端形成。
在一个实施方式中，用于本发明的组合物和方法中的碳水化合物缀合物选自：
其中Y是O或S且n为3-6(式XXIV)；
其中Y是O或S且n为3-6(式XXV)；
其中X是O或S(式XXVII)；
在另一个实施方式中，用于本发明的组合物和方法的碳水化合物缀合物是单糖。在一个实施方式中，单糖是N-乙酰半乳糖胺，例如
在一些实施方式中，寡核苷酸以下示意所示的经由接头连接至碳水化合物缀合物。
在一些实施方式中，寡核苷酸与如表1中所定义并如下所示的L96缀合：
用于本文所述实施方式的另一种代表性碳水化合物缀合物包括但不限于，
(式XXXVI)，当X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在一些实施方式中，合适的配体是WO 2019/055633中公开的配体，其全部内容通过引用并入本文。在一个实施方式中，配体包含以下结构：
在本发明的某些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由单价接头与本发明的寡核苷酸连接。在一些实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由二价接头与本发明的寡核苷酸连接。还在本发明的其他实施方式中，GalNAc或GalNAc衍生物经由三价接头与本发明的寡核苷酸连接。
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包含一个或多个与寡核苷酸连接的GalNAc或GalNAc衍生物。GalNAc可以在有义链或反义链上经由接头与任何核苷酸连接。GalNAc可以连接于有义链的5'-端、有义链的3'-端、反义链的5'-端或反义链的3'-端。在一个实施方式中，GalNAc例如经由三价接头连接于有义链的3'端。
在其他实施方式中，本发明的寡核苷酸包含多个(例如2、3、4、5或6个)GalNAc或GalNAc衍生物，其各自独立地通过多个接头(例如单价接头)连接至寡核苷酸的多个核苷酸。
在一些实施方式中，例如，当本发明的iRNA剂的两条链是通过一条链的3'-端与相应另一条链的5'-端之间形成包含多个未配对核苷酸的发夹环的不间断核苷酸链连接的一个较大分子的部分时，发夹环内的每个未配对核苷酸可以独立地包含经由单价接头连接的GalNAc或GalNAc衍生物。
在一些实施方式中，碳水化合物缀合物还包含一种或多种如上所述的另外的配体，如但不限于PK调节剂或细胞渗透肽。
适用于本发明的另外的碳水化合物缀合物和接头包括PCT公开号WO 2014/179620和WO 2014/179627中描述的那些，其各自的全部内容通过引用并入本文。
D.接头
在一些实施方式中，本文所述的缀合物或配体可以用各种接头连接寡核苷酸，所述接头可以是可切割的或不可切割的。
术语“接头”或“连接基团”意指连接化合物的两个部分，例如共价连接化合物的两个部分的有机部分。接头通常包含直接键或原子如氧或硫，单元如NR8、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH或原子链，如但不限于取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环基烷基、杂环基烯基、杂环基炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环基烷基、烷基杂环基烯基、烷基杂环基炔基、烯基杂烷基烷基、烯基杂环基烯基、烯基杂环基炔基、炔基杂环基烷基、炔基杂环基烯基、炔基杂环基炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(R8)、C(O)、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基或者取代或未取代的杂环中断或封端；其中R8是氢、酰基、脂族基或取代的脂族基。在一个实施方式中，接头为约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18、7-17、8-17、6-16、7-17或8-16个原子。
可切割的连接基团是在细胞外足够稳定的连接基团，但其在进入靶细胞时被切割以释放由接头保持在一起的两个部分。在示例性实施方式中，可切割连接基团在靶细胞中或在第一参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下比在受试者的血液中或在第二参考条件(其可以例如被选择为模拟或代表在血液或血清中发现的条件)下快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多倍，或快至少100倍切割。
可切割的连接基团对切割剂(例如pH、氧化还原电位或降解分子的存在)敏感。通常，切割剂在细胞内比在血清或血液中更普遍或以更高的水平或活性存在。此类降解剂的实例包括：针对特定底物选择性的或不具有底物特异性的氧化还原剂，包括例如存在于细胞中的氧化或还原酶或还原剂，如硫醇，其可以通过还原降解氧化还原可切割的连接基团；酯酶；可以产生酸性环境的内体或试剂，例如导致pH 5或更低的那些；可以通过充当广义酸来水解或降解酸可切割的连接基团的酶、肽酶(其可以是底物特异性的)和磷酸酶。
可切割的连接基团，如二硫键，可能对pH敏感。人血清的pH为7.4，而平均细胞内pH略低，范围为约7.1-7.3。内体具有在5.5-6.0范围内的更酸性的pH，并且溶酶体具有在约5.0的甚至更酸性的pH。一些接头具有可切割的连接基团，其在选定的pH下切割，从而在细胞内从配体释放阳离子脂质，或释放到细胞的所需区室中。
接头可以包括可被特定酶切割的可切割连接基团。并入接头中的可切割连接基团的类型可取决于待靶向的细胞。例如，肝靶向配体可以通过包含酯基的接头与阳离子脂质连接。肝细胞富含酯酶，因此接头在肝细胞中比在不富含酯酶的细胞类型中更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。
当靶向富含肽酶的细胞类型(如肝细胞和滑膜细胞)时，可以使用含肽键的接头。
通常，可以通过测试降解剂(或条件)切割候选连接基团的能力来评估候选可切割连接基团的适合性。还期望测试候选可切割连接基团在血液中或与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定第一条件和第二条件之间对切割的相对敏感性，其中第一条件被选择为指示靶细胞中的切割，而第二条件被选择为指示其他组织或生物流体(例如血液或血清)中的切割。评估可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养物中或在整个动物中进行。在无细胞或培养条件下进行初步评估并通过在整个动物中的进一步评估进行确认可能是有用的。在某些实施方式中，与血液或血清(或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞中(或在所选择的模拟细胞内条件的体外条件下)切割快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100倍。
i.氧化还原可切割连接基团
在某些实施方式中，可切割连接基团是在还原或氧化时切割的氧化还原可切割连接基团。可还原切割的连接基团的实例是二硫化物连接基团(-S-S-)。为了确定候选的可切割连接基团是否是合适的“可还原切割连接基团”，或例如是否适合与特定寡核苷酸和特定靶向剂一起使用，可以寻求本文所述的方法。例如，可以使用本领域已知的试剂通过与二硫苏糖醇(DTT)或其他还原剂一起孵育来评估候选物，其模拟将在细胞(例如靶细胞)中观察到的切割速率。还可以在选择模拟血液或血清条件的条件下评估候选物。在一个实施方式中，候选化合物在血液中切割至多约10％。在其他实施方式中，与血液(或在选择用于模拟细胞外条件的体外条件下)相比，有用的候选化合物在细胞(或在选择用于模拟细胞内条件的体外条件下)中降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。候选化合物的切割速率可以使用标准酶动力学测定在选择为模拟细胞内介质的条件下测定，并与选择用于模拟细胞外介质的条件进行比较。
ii.基于磷酸酯的可切割连接基团
在其他实施方式中，可切割接头包含基于磷酸酯的可切割连接基团。基于磷酸酯的可切割连接基团被降解或水解磷酸酯基团的试剂切割。切割细胞中的磷酸基团的试剂的实例是酶，如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基团的实例是-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-，其中Rk在每次出现可以独立地是C1-C20烷基、C1-C20卤代烷基、C6-C10芳基或C7-C12芳烷基。示例性实施方式包括-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-和-O-P(S)(H)-S-。在某些实施方式中，基于磷酸酯的连接基团是-O-P(O)(OH)-O-。可以使用与上述方法类似的方法评估这些候选物。
iii.酸可切割连接基团
在其他实施方式中，可切割接头包含酸可切割连接基团。酸可切割连接基团是在酸性条件下切割的连接基团。在某些实施方式中，酸可切割连接基团在pH为约6.5或更低(例如，约6.0、5.5、5.0或更低)的酸性环境中切割，或通过可充当广义酸的试剂(如酶)切割。在细胞中，特定的低pH细胞器，如内体和溶酶体，可以为酸可切割连接基团提供切割环境。酸可切割连接基团的实例包括但不限于腙、酯和氨基酸的酯。酸可切割基团可具有通式-C＝NN-、C(O)O或-OC(O)。示例性实施方式是与酯的氧连接的碳(烷氧基)是芳基、取代的烷基或叔烷基，如二甲基戊基或叔丁基。可以使用与上述那些类似的方法评估这些候选物。
iv.基于酯的连接基团
在其他实施方式中，可切割接头包含基于酯的可切割连接基团。基于酯的可切割连接基团被细胞中的酶(如酯酶和酰胺酶)切割。基于酯的可切割连接基团的实例包括但不限于亚烷基、亚烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基团具有通式-C(O)O-或-OC(O)-。可以使用与上述那些类似的方法评估这些候选物。
v.基于肽的切割基团
还在其他实施方式中，可切割的接头包含基于肽的可切割连接基团。基于肽的可切割连接基团被细胞中的酶(如肽酶和蛋白酶)切割。基于肽的可切割连接基团是在氨基酸之间形成以产生寡肽(例如，二肽、三肽等)和多肽的肽键。基于肽的可切割基团不包括酰胺基团(-C(O)NH-)。酰胺基团可以在任何亚烷基、亚烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成以产生肽和蛋白质的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团通常限于在氨基酸之间形成而产生肽和蛋白质的肽键(即酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基团具有通式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-，其中RA和RB是两个相邻氨基酸的R基团。可以使用与上述那些类似的方法评估这些候选物。
在一些实施方式中，本发明的iRNA通过接头与碳水化合物缀合。本发明的组合物和方法的具有接头的iRNA碳水化合物缀合物的非限制性实例包括但不限于，
X或Y中的一个是寡核苷酸时，另一个是氢。
在本发明的组合物和方法的某些实施方式中，配体是通过二价或三价分支接头连接的一种或多种“GalNAc”(N-乙酰半乳糖胺)衍生物。
在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸与选自式(XLV)-(XLVI)中任一个所示的结构的二价或三价分链接头缀合：
其中：
q2A、q2B、q3A、q3B、q4A、q4B、q5A、q5B和q5C每次出现时独立地表示0-20，并且其中重复单元可以相同或不同；
P2A、P2B、P3A、P3B、P4A、P4B、P5A、P5B、P5C、T2A、T2B、T3A、T3B、T4A、T4B、T4A、T5B、T5C每次出现时各自独立地为不存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH或CH2O；
Q2A、Q2B、Q3A、Q3B、Q4A、Q4B、Q5A、Q5B、Q5C每次出现时独立地为不存在、亚烷基、取代的亚烷基，其中一个或多个亚甲基可以被O、S、S(O)、SO2、N(RN)、C(R’)＝C(R”)、C≡C或C(O)中的一个或多个中断或封端。
R2A、R2B、R3A、R3B、R4A、R4B、R5A、R5B、R5C每次出现时各自独立地为不存在、NH、O、S、CH2、C(O)O、C(O)NH、NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CO、CH＝N-O、 或杂环基；
L2A、L2B、L3A、L3B、L4A、L4B、L5A、L5B和L5C代表配体；即每次出现时各自独立地为单糖(例如GalNAc)、二糖、三糖、四糖、寡糖或多糖；和Ra是H或氨基酸侧链。三价缀合GalNAc衍生物特别可用于与RNAi剂一起使用以抑制靶基因的表达，如式(XLIX)的那些：
式XLIX
其中L5A、L5B和L5C代表单糖，如GalNAc衍生物。
合适的缀合GalNAc衍生物的二价和三价分支接头基团的实例包括但不限于以上如式II、VII、XI、X和XIII所述的结构。
教导制备寡核苷酸缀合物的代表性美国专利包括但不限于美国专利No.4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241，5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；和8,106,022，其各自的全部内容通过引用并入本文。
给定化合物中所有位置不必均一地修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在寡核苷酸内的单个核苷处并入多于一种上述修饰。本发明还包括作为嵌合化合物的寡核苷酸化合物。
例如，在本发明的上下文中，“嵌合”iRNA化合物或“嵌合体”是iRNA化合物，如dsRNAi剂，其含有两个或更多个化学上不同的区域，各自由至少一个单体单元组成，即在dsRNA化合物的情况下的核苷酸。这些iRNA通常含有至少一个区域，其中RNA被修饰以赋予iRNA增加的对核酸酶降解的抗性、增加的细胞摄取或增加的对靶核酸的结合亲和力。iRNA的另外区域可以用作能够切割RNA:DNA或RNA:RNA杂合体的酶的底物。举例来说，RNase H是切割RNA:DNA双链体的RNA链的细胞内切核酸酶。因此，RNase H的激活导致RNA靶的切割，从而极大地增强iRNA抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsRNA相比，使用嵌合dsRNA时常常可以用较短的iRNA获得相当的结果。RNA靶的切割可以通过凝胶电泳常规检测，并且如果需要，可以通过本领域已知的相关核酸杂交技术检测。
在某些情况下，寡核苷酸可以通过非配体基团修饰。许多非配体分子已经与寡核苷酸缀合以增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类缀合的程序可在科学文献中获得。此类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(Kubo，T.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.，2007，365(1):54-61；Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86:6553)、胆酸(Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994，4:1053)、硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660:306；Manoharan等，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3:2765)、硫代胆固醇(Oberhauser等，Nucl.Acids Res.，1992，20:533)、脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等，EMBO J.，1991，10:111；Kabanov等，FEBS Lett.，1990，259:327；Svinarchuk等，Biochimie，1993，75:49)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸三乙铵(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651；Shea等，Nucl.Acids Res.，1990，18:3777)、聚胺或聚乙二醇链(Manoharan等，Nucleosides&Nucleotides，1995，14:969)，或金刚烷乙酸(Manoharan等，Tetrahedron Lett.，1995，36:3651)、棕榈基部分(Mishra等，Biochim.Biophys.Acta，1995，1264:229)，或十八烷基胺或己基氨基-羰基-氧胆固醇部分(Crooke等，J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277:923)。以上已经列出了教导制备此类寡核苷酸缀合物的代表性美国专利。典型的缀合方案包括合成在序列的一个或多个位置带有氨基接头的寡核苷酸。然后使用合适的偶联剂或活化剂使氨基与待缀合的分子反应。缀合反应可以在寡核苷酸仍然与固体支持物结合的情况下或在寡核苷酸切割后在溶液相中进行。通过HPLC纯化RNA缀合物通常提供纯缀合物。
B.本发明的抗体或其抗原结合片段
在一些实施方式中，本发明的调节剂是特异性结合INHBE的抗体或其抗原结合片段，例如单克隆抗INHBE抗体或其抗原结合片段。
可以通过本领域已知的各种测定法鉴定、筛选(例如，使用噬菌体展示)或表征抗体调节剂的物理/化学性质和/或生物活性(参见，例如，Antibodies：A LaboratoryManual，第二版，Greenfield编辑，2014)。抗体对其抗原的结合特异性可以通过本领域已知的方法测试，如ELISA、蛋白质印迹或表面等离子体共振。
在一些实施方式中，抗INHBE抗体或其抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。人源化抗体可用作治疗分子，因为人源化抗体可减少或消除对非人抗体的人免疫反应(如人抗小鼠抗体反应)，这可导致对抗体治疗剂的免疫反应，并降低治疗剂的有效性。
在一些实施方式中，抗INHBE抗体或其抗原结合片段是嵌合抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗INHBE抗体或其抗原结合片段包含至少一个非人可变区和至少一个人恒定区。在一些这样的实施方式中，抗-INHBE抗体的所有可变区是非人可变区，并且抗-INHBE抗体的所有恒定区是人恒定区。在一些实施方式中，嵌合抗体的一个或多个可变区是小鼠可变区。嵌合抗体的人恒定区不需要与其替代的非人恒定区(如果有的话)为相同的同种型。嵌合抗体在例如美国专利No.4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-55(1984)中讨论。
在一些实施方式中，抗INHBE抗体或其抗原结合片段是人抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，抗体调节剂，例如抗INHBE抗体或其抗原结合片段，是单克隆抗INHBE抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方式中，抗体调节剂，例如抗IMHBE抗体或其抗原结合片段，是多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或相同抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，可以使用本领域可用的常规技术适应于本发明抗体的抗原结合片段的情况。
本发明的抗体调节剂可以使用本领域已知的任何方法产生。例如，可以使用重组DNA方法产生抗体及其抗原结合片段。编码重链和轻链的表达载体通过标准技术转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式旨在涵盖通常用于将外源DNA引入原核或真核宿主细胞中的广泛多样的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞中的多核苷酸或载体可以整合到宿主细胞的基因组中，或者可以在染色体外维持。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人细胞。在一些实施方式中，真菌细胞是例如酵母属的那些，特别是酿酒酵母物种的那些。术语“原核”包括可以用DNA或RNA分子转化或转染以表达抗体或相应的免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，如，例如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌和枯草芽孢杆菌。术语“真核”包括酵母、高等植物、昆虫和脊椎动物细胞，例如哺乳动物细胞，如NSO和CHO细胞。取决于重组生产程序中使用的宿主，由多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的或可以是非糖基化的。抗体或相应的免疫球蛋白链还可以包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。尽管可以在原核或真核宿主细胞中表达抗体，但优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达抗体，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠的和免疫活性的抗体。
在一些实施方式中，一旦将载体并入合适的宿主中，就可以将宿主维持在适于高水平表达核苷酸序列的条件下，并且根据需要，可以随后收集和纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、其抗原结合片段或其他免疫球蛋白形式；参见，Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis，Academic Press，N.Y.，(1979)。因此，将多核苷酸或载体引入细胞中，其随之产生抗体或其抗原结合片段。此外，包含上述宿主细胞的转基因动物，优选哺乳动物，可用于大规模生产抗体或其抗体片段。
转化的宿主细胞可以在发酵罐中生长，并使用任何合适的技术培养以实现最佳细胞生长。一旦表达，完整抗体、其二聚体、单个轻链和重链、其他免疫球蛋白形式或其抗原结合片段可以根据本领域的标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、凝胶电泳等；参见Scopes，“Protein Purification”，Springer Verlag，N.Y.(1982)。然后可以从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分中分离抗体或其抗原结合片段。例如微生物表达的抗体或其抗原结合片段的分离和纯化可以通过任何常规手段进行，例如制备型色谱分离和免疫分离，如涉及使用针对例如抗体恒定区的单克隆或多克隆抗体的那些。
本发明的方面涉及杂交瘤，其提供无限期延长的单克隆抗体来源。作为直接从杂交瘤培养物获得免疫球蛋白的替代方案，永生化杂交瘤细胞可用作重排重链和轻链基因座的来源，用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适当的mRNA逆转录以产生cDNA。在一些实施方式中，重链恒定区可以交换为不同同种型的重链恒定区或完全消除。可变区可以连接以编码单链Fv区。可以连接多个Fv区以赋予对多于一个靶标的结合能力，或者可以采用嵌合重链和轻链组合。任何合适的方法可用于克隆抗体可变区和产生重组抗体及其抗原结合部分。
在一些实施方式中，获得编码重链和/或轻链可变区的适当核酸并将其插入可转染到标准重组宿主细胞中的表达载体中。可以使用多种这样的宿主细胞。在一些实施方式中，哺乳动物宿主细胞可有利于有效加工和生产。可用于此目的的典型哺乳动物细胞系包括CHO细胞、293细胞或NSO细胞。抗体或其抗原结合片段的产生可以通过在适于宿主细胞生长和编码序列的表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行。可以通过从培养物分离来回收抗体或其抗原结合片段。表达系统可以被设计为包括信号肽，使得所得抗体分泌到培养基中；然而，细胞内生产也是可能的。
本发明还包括至少编码本文所述抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。在一些实施方式中，由多核苷酸编码的可变区包含由任何一种上述杂交瘤产生的抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
编码抗体或其抗原结合片段的多核苷酸可以是例如DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或者重组产生的嵌合核酸分子，其包含单独或组合的任何那些多核苷酸。在一些实施方式中，多核苷酸是载体的部分。此类载体可包含其他基因，如允许在合适的宿主细胞中和在合适的条件下选择载体的标记基因。
在一些实施方式中，多核苷酸可操作地连接允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列。多核苷酸的表达包括将多核苷酸转录成可翻译的mRNA。确保在真核细胞(优选哺乳动物细胞)中表达的调控元件是本领域技术人员熟知的。它们可以包括促进转录起始的调控序列和任选地poly-A信号，其促进转录终止和转录物稳定。另外的调控元件可包括转录以及翻译增强子，和/或天然相关或异源启动子区。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调控元件包括例如大肠杆菌中的PL、Lac、Tp或Tac启动子，并且允许在真核宿主细胞中表达的调控元件的实例是酵母中的AOX1或GAL1启动子或在哺乳动物和其他动物细胞中的CMV-启动子、SV40-启动子、RSV-启动子(劳斯肉瘤病毒)、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。
除了负责转录起始的元件之外，此类调控元件还可以包括多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于所采用的表达系统，可以将能够将多肽引导至细胞区室或将其分泌到培养基中的前导序列添加到多核苷酸的编码序列中，并且已经在先前进行了描述。前导序列在适当的阶段与翻译、起始和终止序列组装，并且优选地，前导序列能够指导翻译的蛋白质或其部分分泌到例如细胞外培养基中。任选地，可以使用编码融合蛋白的异源多核苷酸序列，所述融合蛋白包括赋予所需特征(例如，表达的重组产物的稳定化或简化的纯化)的C-末端或N-末端识别肽。
在一些实施方式中，至少编码轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码两条免疫球蛋白链或仅一条免疫球蛋白链的可变结构域。同样地，多核苷酸可以在相同启动子的控制下或可以单独地控制用于表达。此外，一些方面涉及载体，特别是基因工程中常规使用的质粒、粘粒、病毒和噬菌体，其包含编码抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸；任选地与编码抗体的另一免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸组合。
在一些实施方式中，表达控制序列作为能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统提供，但也可以使用用于原核宿主的控制序列。衍生自病毒(如逆转录病毒、痘苗病毒、腺相关病毒、疱疹病毒或牛乳头瘤病毒)的表达载体可用于将多核苷酸或载体递送到靶向的细胞群体中(例如，以工程化细胞来表达抗体或其抗原结合片段)。可以使用多种合适的方法来构建重组病毒载体。在一些实施方式中，可以将多核苷酸和载体重构到脂质体中用于递送至靶细胞。可以通过合适的方法将含有多核苷酸(例如免疫球蛋白链的重链和/或轻链可变结构域编码序列和表达控制序列)的载体转移到宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。
单克隆抗体及其抗原结合片段也可以通过根据已知方法产生杂交瘤(参见，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature，256:495-499)来产生。以这种方式形成的杂交瘤随后使用标准方法筛选，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和表面等离子体共振(例如，OCTET或BIACORE)分析，以鉴定产生特异性结合特定抗原(例如，INHBE，例如野生型INHBE或突变INHBE)的抗体或其抗原结合部分的一种或多种杂交瘤。任何形式的特定抗原可以用作免疫原，例如重组抗原、天然存在的形式、其任何变体或片段以及其抗原肽(例如，本文描述的作为线性表位或在支架内作为构象表位的任何表位)。制备抗体及其抗原结合部分的一种示例性方法包括筛选表达抗体或其片段(例如scFv)的蛋白质表达文库，例如噬菌体或核糖体展示文库。噬菌体展示描述于例如Ladner等，美国专利No.5,223,409；Smith(1985)Science228:1315-1317；Clakson等，(1991)Nature，352:624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.，222:581-597；WO92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；和WO 90/02809。
除了使用展示文库之外，指定抗原(例如INHBE)可用于免疫非人动物，例如啮齿动物，例如小鼠、仓鼠或大鼠。在一个实施方式中，非人动物是小鼠。
在另一个实施方式中，从非人动物获得单克隆抗体，然后使用合适的重组DNA技术进行修饰，例如嵌合。已经描述了用于制备嵌合抗体的多种方法。参见例如，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851，1985；Takeda等，Nature 314:452，1985，Cabilly等，美国专利No.4,816,567；Boss等，美国专利No.4,816,397。
对于另外的抗体产生技术，参见Antibodies：A Laboratory Manual，Harlow等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory，1988。本发明不一定限于抗体的任何特定来源、生产方法或其他特殊特征。
在转基因小鼠中产生人抗体的方法也是本领域已知的。在本发明的上下文中可以使用任何这样的已知方法来制备特异性结合人INHBE的人抗体。
在一些实施方式中，分离具有人可变区和小鼠恒定区的高亲和力嵌合抗体。对抗体进行表征和针对所需特征，包括亲和力、选择性、表位等进行选择。用所需的人恒定区替换小鼠恒定区以产生本发明的完全人抗体，例如野生型或修饰的IgGl或IgG4。虽然所选择的恒定区可以根据具体用途而变化，但高亲和力抗原结合和靶特异性特征存在于可变区中。
C.本发明的实现ADAR编辑的指导RNA
本发明还提供了实现INHBE基因的ADAR编辑的指导RNA。本文公开的任何核苷酸(如表2-5中的核苷酸)可用于设计实现ADAR编辑的指导RNA。用于设计和制备此类指导RNA的方法描述于例如WO2016097212A1、WO2017220751A1、US20210261955A1和WO2018041973A1中，其全部内容通过引用并入本文。
D.本发明的实现CRISPR编辑的指导RNA
本发明还提供了实现INHBE基因的CRISPR编辑的指导RNA。本文公开的任何核苷酸(例如表2-5中的核苷酸)可用于设计实现CRISPR编辑的指导RNA。用于设计和制备此类指导RNA的方法描述于例如US20200248180和US20190316121中，其全部内容通过引用并入本文。
IV.本发明的调节剂的递送
可以以许多不同的方式实现将本发明的调节剂递送至细胞，例如受试者体内的细胞，如人受试者(例如，有需要的受试者，如易患或被诊断患有INHBE相关病症的受试者，例如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病，脂质代谢障碍，例如高脂血症，高血压，心血管疾病，体重失调)。例如，可以通过在体外或体内使细胞与本发明的调节剂接触来进行递送。体内递送也可以通过向受试者施用包含调节剂的组合物来直接进行。或者，体内递送可以通过施用一种或多种编码并指导调节剂表达的载体来间接进行。下面进一步讨论这些替代方案。
关于本发明的寡核苷酸调节剂，例如dsRNA剂或反义多核苷酸剂，通常，(在体外或体内)递送核酸分子的任何方法可以适用于本发明的iRNA(参见例如，Akhtar S.和JulianRL.(1992)Trends Cell.Biol.2(5)：139-144和WO94/02595，将其全部按引用并入本文)。对于体内递送，为了递送iRNA分子而考虑的因素包括例如所递送分子的生物稳定性、非特异性效应的预防和所递送分子在靶组织中的积累。RNA干扰也显示出通过直接注射成功地局部递送至CNS(Dorn，G.等(2004)Nucleic Acids 32：e49；Tan，PH.等(2005)Gene Ther.12：59-66；Makimura，H.等(2002)BMC Neurosci.3：18；Shishkina，GT.等(2004)Neuroscience129：521-528；Thakker，ER.等(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101：17270-17275；Akaneya，Y.等(2005)J.Neurophysiol.93：594-602)。RNA或药物载体的修饰也可以允许iRNA靶向靶组织，并避免不希望的脱靶效应。iRNA分子可以通过与亲脂性基团(如胆固醇)化学缀合来修饰，以增强细胞摄取并防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分缀合的针对ApoB的iRNA全身注射到小鼠中，并导致肝脏和空肠中的ApoB mRNA敲低(Soutschek，J.等(2004)Nature 432：173-178)。
在替代实施方式中，可以使用药物递送系统(如纳米颗粒、树枝状聚合物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统)来递送调节剂。例如，带正电荷的阳离子递送系统促进iRNA分子(带负电荷)的结合，并且还增强带负电荷的细胞膜处的相互作用以允许细胞有效摄取iRNA。阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物可以与iRNA结合，或被诱导以形成包裹iRNA的囊泡或胶束(参见例如，Kim SH等(2008)Journal of Controlled Release 129(2)：107-116)。当全身施用时，囊泡或胶束的形成进一步防止iRNA的降解。制备和施用阳离子-iRNA复合物的方法完全在本领域技术人员的能力范围内(参见例如，Sorensen，DR等(2003)J.Mol.Biol 327：761-766；Verma，UN等(2003)Clin.Cancer Res.9：1291-1300；Arnold，AS等(2007)J.Hypertens.25：197-205，其通过引用整体并入本文)。可用于全身递送iRNA的药物递送系统的一些非限制性实例包括DOTAP(Sorensen，D.，等(2003)，同上；Verma，UN等(2003)，同上)，“固体核酸脂质颗粒”(Zimmermann，TS等(2006)Nature 441：111-114)，心磷脂(Chien，PY等(2005)Cancer Gene Ther.12：321-328；Pal，A等(2005)Int J.Oncol.26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(Bonnet ME等(2008)Pharm.Res.，印刷前8月16日；Aigner，A.(2006)J.Biomed.Biotechnol.71659)、Arg-Gly-Asp(RGD)肽(Liu，S.(2006)Mol.Pharm，3：482-487)和聚酰胺基胺(Tomalia，DA等(2007)Biochem.Soc.Trans.35：61-67；Yoo，H.等(1999)Pharm.Res.16：1799-1804)。在一些实施方式中，iRNA与环糊精形成复合物用于全身施用。施用方法以及iRNA和环糊精的药物组合物可以在美国专利No.7,427,605中找到，以引用的方式将其整体并入本文。本公开的某些方面涉及降低细胞中INHBE的表达和/或活性的方法，其包括使所述细胞与本公开的调节剂接触。在一个实施方式中，细胞是肝脏细胞，任选肝细胞。在一个实施方式中，细胞是肝外细胞。
A.本发明的载体编码的寡核苷酸
靶向INHBE基因的寡核苷酸可以从插入DNA或RNA载体中的转录单元表达(参见例如Couture，A等，TIG.(1996)，12：5-10；Skillern，A等，国际PCT公开No.WO 00/22113，Conrad，国际PCT公开No.WO 00/22114和Conrad，美国专利No.6,054,299)。表达可以是瞬时的(大约数小时至数周)或持续的(数周至数月或更长)，这取决于所使用的特定构建体和靶组织或细胞类型。这些转基因可以作为线性构建体、环状质粒或病毒载体引入，其可以是整合或非整合载体。还可以构建转基因以允许其作为染色体外质粒遗传(Gassmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92：1292)。
可以与本文所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等，(c)腺相关病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)SV 40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小核糖核酸病毒载体；(i)痘病毒载体，例如正痘病毒，例如痘苗病毒载体，或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或禽痘病毒载体；和(j)辅助细胞依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以是有利的。不同的载体将整合或不整合到细胞的基因组中。如果需要，构建体可以包括用于转染的病毒序列。或者，可以将构建体整合到能够游离型复制的载体中，例如EPV和EBV载体。用于重组表达iRNA的构建体通常需要调控元件，例如启动子、增强子等，以确保iRNA在靶细胞中的表达。对于载体和构建体考虑的其他方面是本领域已知的。
V.本发明的药物组合物
本发明还包括含有本发明调节剂的药物组合物和制剂。在一个实施方式中，本文提供了含有如本文所述的调节剂和药学上可接受的载体的药物组合物。含有调节剂的药物组合物可用于预防或治疗INHBE相关病症，例如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物病症，例如II型糖尿病、前驱糖尿病，脂质代谢障碍，例如高脂血症，高血压，心血管疾病，体重失调。
基于递送模式配制此类药物组合物。一个实例是配制用于通过肠胃外递送(例如通过皮下(SC)、肌内(IM)或静脉内(IV)递送)全身施用的组合物。本发明的药物组合物可以以足以抑制INHBE基因表达的剂量施用。
在一些实施方式中，本发明的药物组合物是无菌的。在另一个实施方式中，本发明的药物组合物是无热原的。
本发明的药物组合物可以以足以抑制INHBE的表达和/或活性的剂量施用。通常，本发明调节剂的合适剂量在约0.001至约200.0mg/kg接受者体重/天的范围内，通常在约1至50mg/kg体重/天的范围内。通常，本发明调节剂的合适剂量在约0.1mg/kg至约5.0mg/kg的范围内，如约0.3mg/kg和约3.0mg/kg。重复剂量方案可以包括定期施用治疗量的调节剂，如每月，每3-6个月一次，或每年一次。在某些实施方式中，调节剂约每月一次至约每六个月一次施用。
在初始治疗方案后，可以以较低频率施用治疗。治疗的持续时间可以基于疾病的严重程度来确定。
在其他实施方式中，单剂量的药物组合物可以是持久的，使得剂量以不超过1、2、3或4个月的间隔施用。在本发明的一些实施方式中，大约每月一次施用单剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施方式中，每季度(即，约每三个月)施用单剂量的本发明的药物组合物。在本发明的其他实施方式中，单剂量的本发明的药物组合物每年施用两次(即，约每六个月一次)。
本领域技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于受试者中存在的突变、先前的治疗、受试者的一般健康状况或年龄以及存在的其他疾病。此外，用预防或治疗有效量(视情况而定)的组合物治疗受试者可包括单次治疗或一系列治疗。
本公开的药物组合物可以以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部(包括眼、阴道、直肠、鼻内、透皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌内注射或输注；真皮下，例如通过植入装置；或颅内，例如通过实质内、鞘内或脑室内施用。
调节剂可以以靶向特定组织(例如肝脏)的方式递送。
用于局部施用的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体、水性、粉末或油性基质、增稠剂等可能是必需的或期望的。涂覆的避孕套、手套等也是有用的。合适的局部制剂包括其中本公开中涉及的调节剂与局部递送剂，如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。合适的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)、阴性(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。本公开中涉及的调节剂可以包封在脂质体内或可以与其形成复合物，特别是与阳离子脂质体形成复合物。或者，调节剂可以与脂质复合，特别是与阳离子脂质复合。合适的脂肪酸和酯包括但不限于花生四烯酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油酸甘油酯、二月桂酸甘油酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-20烷基酯(例如肉豆蔻酸异丙酯IPM)、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部制剂详细描述于US 6,747,014中，其通过引用并入本文。
在一个实施方式中，本发明的调节剂在药物组合物中通过局部施用途径施用于细胞。
在一个实施方式中，药物组合物可包括与局部递送剂混合的调节剂。局部递送剂可以是多个微观囊泡。微观囊泡可以是脂质体。在一些实施方式中，脂质体是阳离子脂质体。
在另一个实施方式中，调节剂与局部渗透增强剂混合。在一个实施方式中，局部渗透增强剂是脂肪酸。脂肪酸可以是花生四烯酸、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱或C1-10烷基酯、甘油单酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方式中，局部渗透增强剂是胆汁盐。胆汁盐可以是胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸、熊脱氧胆酸、牛磺-24,25-二氢夫西地酸钠、甘氨二氢夫西地酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚或其药学上可接受的盐。
在另一个实施方式中，渗透增强剂是螯合剂。螯合剂可以是EDTA、柠檬酸、水杨酸盐、胶原蛋白的N-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9、β-二酮的N-氨基酰基衍生物或其混合物。
在另一个实施方式中，渗透增强剂是表面活性剂，例如离子或非离子表面活性剂。表面活性剂可以是月桂基硫酸钠、聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚、全氟化学乳液或其混合物。
在另一个实施方式中，渗透增强剂可选自不饱和环脲、1-烷基-烷酮、1-烯基氮杂环-烷酮、类固醇抗炎剂及其混合物。在另一个实施方式中，渗透增强剂可以是二醇、吡咯、氮酮或萜烯。
在一个方面中，本发明涉及在可注射剂型中包括调节剂的药物组合物。在一个实施方式中，药物组合物的可注射剂型包括无菌水溶液或分散体和无菌粉末。在一些实施方式中，无菌溶液可包括稀释剂，如水；盐水溶液；固定油、聚乙二醇、甘油或丙二醇。
本发明的调节剂可以掺入药物组合物中。此类组合物通常包括一种或多种调节剂和药学上可接受的载体。如本文所用，词语“药学上可接受的载体”旨在包括与对细胞(例如肝细胞)的药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。补充活性化合物也可以掺入组合物中。
本发明的药物组合物包括但不限于溶液、乳液和含脂质体的制剂。这些组合物可以由多种组分产生，所述组分包括但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。制剂包括靶向肝脏的那些。
可以方便地以单位剂型存在的本发明的药物制剂可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。此类技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过使活性成分与液体载体均匀且紧密地结合来制备制剂。
A.另外的制剂
i.乳液
本发明的组合物可以制备和配制成乳液。乳液通常是一种液体以直径通常超过0.1μm的液滴形式分散在另一种液体中的非均相体系(参见例如Ansel′s PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Idson，PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199；Rosoff，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，第245页；Block inPharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第2卷，第335页；Higuchi等，Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，1985，p.301)。乳液通常是两相体系，其包含彼此紧密混合和分散的两个不混溶的液体相。通常，乳液可以是油包水(w/o)或水包油(o/w)种类。当水相被细分并作为微小液滴分散到本体油相中时，所得组合物被称为油包水(w/o)乳液。或者，当油相被细分并作为微小液滴分散到本体水相中时，所得组合物被称为水包油(o/w)乳液。除了分散相和活性药物之外，乳液还可以含有另外的组分，所述活性药物可以作为在水相、油相中的溶液或本身作为单独的相存在。药物赋形剂，如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂也可以根据需要存在于乳液中。药物乳液也可以是由多于两相组成的多重乳液，例如在油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳液的情况下。这样的复杂制剂通常提供简单二元乳液所不具有的某些优点。其中o/w乳液的单个油滴包封小的水滴的多重乳液构成w/o/w乳液。同样地，包封在稳定于油性连续相中的水的小球中的油滴的系统提供o/w/o乳液。
乳液特征在于很少或没有热力学稳定性。通常，乳液的分散相或不连续相很好地分散到外相或连续相中，并通过乳化剂或制剂的粘度的方式保持这种形式。稳定乳液的其他方式需要使用可以掺入乳液的任一相中的乳化剂。乳化剂可以广泛地分为四个类别：合成表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和细分的固体(参见例如Ansel′sPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Idson，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。
合成表面活性剂，也称为表面活性剂，已发现在乳液制剂中广泛适用，并且已在文献中综述(参见例如Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Rieger，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.285；Idson，PharmaceuticalDosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，1988，第1卷，p.199)。表面活性剂通常是两亲性的，并且包含亲水性和疏水性部分。表面活性剂的亲水性与疏水性特性的比率被称为亲水/亲脂平衡(HLB)，并且是在制剂制备中分类和选择表面活性剂的有价值的工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质分为不同的种类：非离子、阴离子、阳离子和两性(参见例如Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms andDrug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，LippincottWilliams&Wilkins(第8版)，New York，NY Rieger，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.285)。
广泛多样的非乳化材料也包括在乳液制剂中并有助于乳液的性质。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(Block，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger and Banker(编辑)，1988，MarcelDekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.335；Idson，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。
乳液制剂经由皮肤、口服和肠胃外途径的应用及其制备方法已在文献中综述(参见例如Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；Idson，Pharmaceutical Dosage Forms，Lieberman，Rieger和Banker(编辑)，1988，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，第1卷，p.199)。
ii.微乳液
在本发明的一个实施方式中，将调节剂的组合物配制为微乳液。微乳液可以定义为水、油和两亲物的系统，其是单一光学各向同性和热力学稳定的液体溶液(参见例如，Ansel′s Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems，Allen，LV.，Popovich NG.和Ansel HC.，2004，Lippincott Williams&Wilkins(第8版)，New York，NY；第1卷，p.245)。通常，微乳液是通过首先将油分散在表面活性剂水溶液中，并然后加入足量的第四组分(通常是中等链长的醇)以形成透明系统而制备的体系。因此，微乳液也被描述为两种不混溶的液体的热力学稳定的各向同性透明的分散体，其通过表面活性分子的界面膜稳定(Leung和Shah，见：Controlled Release of Drugs：Polymers and AggregateSystems，Rosoff，M.编辑，1989，VCH Publishers，New York，第185-215页)。
iii.微粒
本发明的调节剂可以掺入颗粒中，例如微粒。微粒可以通过喷雾干燥产生，但也可以通过其他方法产生，包括冻干、蒸发、流化床干燥、真空干燥或这些技术的组合。
iv.渗透增强剂
在一个实施方式中，本发明采用各种渗透增强剂来实现调节剂(例如核酸，特别是iRNA)向动物皮肤的有效递送。大多数药物以离子化和非离子化形式存在于溶液中。然而，通常只有脂溶性或亲脂性药物容易跨过细胞膜。已经发现，如果用渗透增强剂处理待跨过的膜，即使非亲脂性药物也可以跨过细胞膜。除了帮助非亲脂性药物跨细胞膜扩散之外，渗透增强剂还增强亲脂性药物的渗透性。
渗透增强剂可以分类为属于五大类别之一，即表面活性剂、脂肪酸、胆汁盐、螯合剂和非螯合非表面活性剂(参见例如Malmsten，M.Surfactants and Polymers in DrugDelivery，Informa Health Care，New York，NY，2002；Lee等，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems，1991，p.92)。每种上述种类的渗透增强剂及其在制备药物组合物和递送药剂中的用途是本领域熟知的。
v.赋形剂
与载体化合物相反，“药物载体”或“赋形剂”是药学上可接受的溶剂、悬浮剂或用于将一种或多种调节剂递送至动物的任何其他药理惰性媒介物。赋形剂可以是液体或固体，并且在考虑计划的施用方式的情况下进行选择，以便在与核酸和给定药物组合物的其他组分组合时提供所需的体积、稠度等。此类试剂是本领域熟知的。
vi.其他组分
本发明的组合物可以另外含有常规以本领域确认的使用量存在于药物组合物中的其它辅助组分。因此，例如，组合物可以含有另外的相容的药学活性材料，如，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或可以含有可用于物理配制本发明组合物的各种剂型的其他材料，如染料、调味剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，这些物质在加入时不应过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。可以将制剂灭菌，并且如果需要，与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂或芳香物质等，其不与制剂的核酸有害地相互作用。
水性悬浮液可含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。
在一些实施方式中，本发明涉及的药物组合物包括(a)一种或多种反义多核苷酸剂和(b)一种或多种通过非反义抑制机制起作用并且可用于治疗INHBE相关病症(例如代谢障碍)的药剂。
此类化合物的毒性和预防功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药学程序来确定，例如用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(在50％群体中预防有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且它可以表示为比率LD50/ED50。表现出高治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。本发明的本文所述的组合物的剂量通常在包括ED50(如ED80或ED90)的循环浓度范围内，具有很少或没有毒性。剂量可以在该范围内变化，这取决于所用的剂型和所用的施用途径。对于在本发明涉及的方法中使用的任何化合物，预防有效剂量最初可以从细胞培养测定中估计。剂量可以在动物模型中配制以达到化合物或适当时靶序列多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，达到降低的多肽浓度)，其包括IC50(即，达到症状的半数最大抑制的测试化合物的浓度)或如在细胞培养物中测定的更高抑制水平。这些信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。可以例如通过高效液相色谱测量血浆中的水平。
除了它们的施用之外，如上文所讨论的，本发明涉及调节剂可以与用于预防或治疗INHBE相关病症(例如代谢障碍)的其他已知药剂组合施用。在任何情况下，施用医师可以基于使用本领域已知或本文所述的标准功效测量观察到的结果来调整iRNA施用的量和时机。
VI.用于抑制INHBE表达和/或活性的方法
本发明还提供了抑制细胞中INHBE的表达和/或活性的方法。所述方法包括使细胞与有效抑制细胞中INHBE的表达和/或活性的量的调节剂(例如，双链RNA剂、反义多核苷酸剂、抗体、实现ADAR编辑的指导RNA或实现CRISPR编辑的指导RNA)接触，从而抑制细胞中INHBE的表达和/或活性。在本公开的一些实施方式中，优先抑制肝脏(例如肝细胞)中的INHBE基因的表达。
细胞与调节剂的接触可以在体外或体内进行。使细胞在体内与调节剂接触包括使受试者(例如人类受试者)内的细胞或细胞组与调节剂接触。接触细胞的体外和体内方法的组合也是可能的。如上所述，接触细胞可以是直接或间接的。此外，接触细胞可以通过靶向配体完成，包括本文所述或本领域已知的任何配体。在一些实施方式中，靶向配体是碳水化合物部分，例如GalNAc3配体，或将调节剂引导至目标位点的任何其他配体。
如本文所用，术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“阻遏”和其他类似术语互换使用，并且包括任何水平的抑制。
短语“抑制INHBE的表达和/或活性”意指抑制任何INHBE(如，例如小鼠INHBE基因、大鼠INHBE基因、猴INHBE基因或人INHBE基因)以及INHBE基因的变体或突变体的表达。因此，在遗传操作的细胞、细胞组或生物体的背景下，INHBE基因可以是野生型INHBE基因、突变体INHBE基因或转基因INHBE基因。
“抑制INHBE的表达和/或活性”包括INHBE基因的任何水平的抑制，例如至少部分抑制INHBE的表达和/或活性。可以基于与INHBE基因表达相关的任何变量(例如INHBE mRNA水平或INHBE蛋白水平)的水平或水平变化来评估INHBE的表达和/或活性。应当理解，INHBE主要在肝脏中表达。
还可以基于与INHBE基因表达相关的其他变量间接评估INHBE的表达和/或活性，例如，细胞质中抑制素亚基βE表达的水平、抑制素亚基βE的核定位或者在抑制素亚基βE转录控制下的某些靶基因或其他基因的表达。
可以通过与INHBE表达和/或活性相关的一个或多个变量的绝对或相对水平与对照水平相比的降低来评估抑制。对照水平可以是本领域使用的任何类型的对照水平，例如，给药前基线水平，或从未处理或用对照(如，例如，仅缓冲液对照或无活性剂对照)处理的类似受试者、细胞或样品确定的水平。
在本发明方法的一些实施方式中，INHBE的表达和/或活性被抑制至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或至低于测定的检测水平。在一些实施方式中，INHBE的表达和/或活性被抑制至少70％。还应理解，可能需要抑制某些组织(例如肝脏)中的INHBE表达和/或活性，而不显著抑制其他组织(例如脑)中的表达。
在某些实施方式中，体内表达和/或活性的抑制通过表达人基因的啮齿动物(例如表达人靶基因(即INHBE)的AAV感染的小鼠)中人基因的敲低来确定，例如当作为单剂量(例如3mg/kg)在RNA表达的最低点施用时。也可以确定模型动物系统中内源基因表达的敲低，例如，在RNA表达的最低点以例如3mg/kg的单剂量施用后。当人基因和模型动物基因的核酸序列足够接近以使得人iRNA提供模型动物基因的有效敲低时，此类系统是有用的。使用实施例2中提供的PCR方法测定肝脏中的RNA表达。
抑制INHBE的表达和/或活性可以通过INHBE在其中转录并且已经被处理(例如通过使一个或多个细胞与本发明的调节剂接触，或通过向存在或存在过该细胞的受试者施用本发明的调节剂)使得INHBE基因的表达被抑制的第一细胞或细胞组(这样的细胞可以存在于例如源自受试者的样品中)表达的mRNA的量的减少来表现，如与第一细胞或细胞组基本相同，但未如此处理的第二细胞或细胞组(未用调节剂处理或未用靶向目的基因的调节剂处理的对照细胞)相比的。在一些实施方式中，通过实施例2中提供的方法，在物种匹配的细胞系中使用10nM siRNA浓度评估抑制，并使用下式将处理的细胞中的mRNA水平表示为对照细胞中的mRNA水平的百分比：
在其他实施方式中，INHBE的表达和/或活性的抑制可以根据与INHBE基因表达功能相关的参数(例如来自受试者的血液或血清中的INHBE蛋白水平)的降低来评估。可以通过本领域已知的任何测定法在表达IINHBE(内源的或从表达构建体异源的)的任何细胞中测定INHBE基因沉默。
抑制INHBE蛋白的表达和/或活性可以通过由细胞或细胞组表达的或受试者样品中的INHBE蛋白水平(例如，源自受试者的血液样品中的蛋白质水平)的降低来表现。如上所述，为了评估mRNA抑制，处理的细胞或细胞组中蛋白质表达水平的抑制可以类似地表示为对照细胞或细胞组中蛋白质水平的百分比，或受试者样品(例如由其衍生的血液或血清)中蛋白质水平的变化。
可用于评估INHBE的表达和/或活性的抑制的对照细胞、细胞组或受试者样品包括尚未与本发明的调节剂接触的细胞、细胞组或受试者样品。例如，对照细胞、细胞组或受试者样品可以源自在用调节剂处理受试者之前或适当匹配的群体对照的个体受试者(例如，人或动物受试者)。
可以使用本领域已知的用于评估mRNA表达的任何方法来确定由细胞或细胞组表达的INHBE mRNA的水平。在一个实施方式中，样品中INHBE的表达水平通过检测转录的多核苷酸或其部分(例如INHBE基因的mRNA)来确定。可以使用RNA提取技术从细胞中提取RNA，包括例如使用酸性酚/胍异硫氰酸提取(RNAzol B；Biogenesis)、RNeasyTM RNA制备试剂盒或PAXgeneTM(PreanalytixTM，瑞士)。利用核糖核酸杂交的典型测定形式包括核连缀分析、RT-PCR、RNA酶保护测定、RNA印迹、原位杂交和微阵列分析。
在一些实施方式中，使用核酸探针测定INHBE的表达水平。如本文所用，术语“探针”是指能够选择性结合特定INHBE的任何分子。探针可以由本领域技术人员合成，或衍生自适当的生物制剂。探针可以被特别设计为标记的。可用作探针的分子的实例包括但不限于RNA、DNA、蛋白质、抗体和有机分子。
分离的mRNA可用于杂交或扩增测定中，包括但不限于DNA或RNA分析、聚合酶链式反应(PCR)分析和探针阵列。用于测定mRNA水平的一种方法涉及使分离的mRNA与可与INHBEmRNA杂交的核酸分子(探针)接触。在一个实施方式中，将mRNA固定在固体表面上并与探针接触，例如通过在琼脂糖凝胶上运行分离的mRNA并将mRNA从凝胶转移到膜，如硝酸纤维素。在可选实施方式中，将探针固定在固体表面上，并使mRNA与探针接触，例如在基因芯片阵列中。本领域技术人员可以容易地采用已知的mRNA检测方法用于测定INHBE mRNA水平。
用于确定样品中INHBE表达水平的替代方法涉及样品中例如mRNA的核酸扩增或逆转录酶(以制备cDNA)的过程，例如通过RT-PCR(Mullis，1987，美国专利No.4,683,202中所列的实验实施方式)、连接酶链式反应(Barany(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193)、自持的序列复制(Guatelli等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878)、转录扩增系统(Kwoh等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi等(1988)Bio/Technology 6:1197)、滚环复制(Lizardi等，美国专利No.5,854,033)或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员熟知的技术检测扩增的分子。如果这样的分子以非常低的数量存在，则这些检测方案对于检测核酸分子是特别有用的。在本发明的特定方面，INHBE的表达水平通过定量荧光RT-PCR(即，TaqManTM系统)测定。在一些实施方式中，通过实施例2中提供的方法使用例如10nM siRNA浓度在物种匹配的细胞系中测定表达水平。
可以使用膜印迹(如用于杂交分析中，如RNA、DNA、斑点印迹等)，或微孔、样品管、凝胶、珠或纤维(或包含结合的核酸的任何固体支持物)监测INHBE mRNA的表达水平。参见美国专利No.5,770,722、5,874,219、5,744,305、5,677,195和5,445,934，其通过引用并入本文。INHBE表达水平的测定还可以包括使用溶液中的核酸探针。
在一些实施方式中，使用分支DNA(bDNA)测定或实时PCR(qPCR)评估mRNA表达水平。在本文提供的实施例中描述和举例说明了这些方法的用途。在一些实施方式中，通过实施例2中提供的方法在物种匹配的细胞系中使用10nM siRNA浓度测定表达水平。
可以使用本领域已知的用于测量蛋白质水平的任何方法来确定INHBE蛋白表达的水平。此类方法包括例如电泳、毛细管电泳、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱(TLC)、超扩散色谱、流体或凝胶沉淀素反应、吸收光谱、比色测定、分光光度测定、流式细胞术、免疫扩散(单或双)、免疫电泳、蛋白质印迹、放射免疫测定(RIA)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫荧光测定、电化学发光测定等。
在一些实施方式中，通过INHBE mRNA或蛋白质水平的降低(例如，在肝活检中)来评估本发明方法的功效。
在本发明方法的一些实施方式中，将调节剂施用于受试者，使得调节剂被递送至受试者内的特定部位。可以使用来自受试者体内特定部位的流体或组织(例如肝脏或血液)的样品中INHBE mRNA或INHBE蛋白的水平或水平变化的测量来评估INHBE的表达和/或活性的抑制。
如本文所用，术语检测或测定分析物的水平应理解为意指执行确定是否存在材料(例如蛋白质、RNA)的步骤。如本文所用，检测或测定方法包括检测或测定低于所用方法的检测水平的分析物水平。
VII.本发明的预防和治疗方法
本发明还提供了使用本发明的调节剂或含有本发明调节剂的组合物来抑制INHBE的表达和/或活性的方法，从而预防或治疗INHBE相关病症，例如代谢障碍(例如代谢综合征)、碳水化合物障碍(例如II型糖尿病、前驱糖尿病)、脂质代谢障碍(例如高脂血症)、高血压、心血管疾病、体重失调。在本发明的方法中，细胞可以在体外或体内与调节剂接触，即细胞可以在受试者体内。
适于使用本发明的方法处理的细胞可以是表达INHBE基因的任何细胞，例如肝细胞。适用于本发明方法的细胞可以是哺乳动物细胞，例如灵长类动物细胞(如人细胞，包括嵌合非人动物中的人细胞，或非人灵长类动物细胞，例如猴细胞或黑猩猩细胞)，或非灵长类动物细胞。在某些实施方式中，细胞是人细胞，例如人肝细胞。在本发明的方法中，INHBE表达在细胞中被抑制至少50、55、60、65、70、75、80、85、90或95，或至低于测定检测水平的水平。
本发明的体内方法可以包括向受试者施用含有调节剂(如寡核苷酸)的组合物，例如其中寡核苷酸包括与待施用RNAi剂的哺乳动物的INHBE基因的RNA转录物的至少一部分互补的核苷酸序列。组合物可以通过本领域已知的任何方式施用，包括但不限于口服、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如，脑室内、实质内和鞘内)、静脉内、肌内、皮下、透皮、气道(气溶胶)、鼻、直肠、眼内(例如眼周、结膜、筋膜下、前房内、玻璃体内、眼球内、前或后巩膜旁、视网膜下、结膜下、眼球后或小管内注射)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气管(气溶胶)和局部(包括口腔和舌下)施用。
在某些实施方式中，组合物通过静脉内输注或注射施用。在某些实施方式中，组合物通过皮下注射施用。在某些实施方式中，组合物通过肌内注射施用。
可以基于是需要局部治疗还是全身治疗并基于待治疗的区域来选择施用模式。可以选择施用途径和部位以增强靶向。
在一个方面，本发明还提供了用于抑制哺乳动物中INHBE的表达和/或活性的方法。所述方法包括在哺乳动物的细胞中向哺乳动物施用包含调节剂(如寡核苷酸，例如靶向INHBE基因的寡核苷酸)的组合物，并将哺乳动物维持足以获得INHBE基因的mRNA转录物降解的时间，从而抑制细胞中INHBE的表达和/或活性。表达和/或活性的降低可以通过本领域已知的任何方法和通过本文例如实施例2中所述的方法例如qRT-PCR来评估。蛋白质产生的减少可以通过本领域已知的任何方法，例如ELISA来评估。在某些实施方式中，穿刺肝活检样品用作用于监测INHBE基因或蛋白质表达减少的组织材料。在其他实施方式中，血液样品用作用于监测INHBE蛋白表达和/或活性的降低的受试者样品。
本发明还提供了在有需要的受试者中治疗的方法，例如诊断为患有INHBE相关病症的受试者，如代谢障碍(例如代谢综合征)、碳水化合物障碍(例如II型糖尿病、前驱糖尿病)、脂质代谢障碍(例如高脂血症)、高血压、心血管疾病、体重失调。
本发明还提供了在有需要的受试者中预防的方法。本发明的治疗方法包括以预防有效量的靶向INHBE基因的dsRNA或包含本发明的调节剂的药物组合物向受试者(例如，将受益于INHBE表达降低的受试者)施用本发明的调节剂。
在一个方面，本发明提供了治疗患有将受益于INHBE表达和/或活性降低的病症(例如INHBE相关病症，如代谢障碍，例如糖尿病)的受试者的方法。
将受益于INHBE表达和/或活性的降低和/或抑制的受试者的治疗包括治疗性治疗(例如，受试者患有代谢障碍)和预防性治疗(例如，受试者未患代谢障碍或受试者可能处于发展代谢障碍的风险中)。
在一些实施方式中，INHBE相关病症是代谢障碍。代谢障碍的实例包括但不限于代谢综合征、碳水化合物障碍(例如II型糖尿病、前驱糖尿病)、脂质代谢障碍(例如高脂血症)、高血压、心血管疾病、体重失调。
在一些实施方式中，INHBE相关病症是代谢综合征。
在一些实施方式中，调节剂以有效抑制受试者内细胞中的INHBE表达和/或活性的量施用于受试者。可以使用上述方法评估有效抑制受试者细胞中的INHBE表达和/或活性的量，包括涉及评估INHBE mRNA、INHBE蛋白或相关变量(如腰围)的方法。
关于本发明的寡核苷酸，本发明的寡核苷酸可以作为“游离寡核苷酸”施用。游离寡核苷酸在不存在药物组合物的情况下施用。裸寡核苷酸可以在合适的缓冲溶液中。缓冲溶液可包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐或其任何组合。在一个实施方式中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。可以调节含有寡核苷酸的缓冲溶液的pH和摩尔渗透压浓度，使得其适合于施用于受试者。或者，本发明的寡核苷酸可以作为药物组合物施用，如寡核苷酸脂质体制剂。
受益于INHBE表达和/或活性的抑制的受试者是易患或被诊断患有INHBE相关病症的受试者，例如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病，脂质代谢障碍，例如高脂血症，高血压，心血管疾病，体重失调。在一个实施方式中，方法包括施用本文所述的组合物，使得INHBE的表达和/或活性降低，如每剂约1、2、3、4、5、6、1-6、1-3或3-6个月。在某些实施方式中，组合物每3-6个月施用一次。
在一个实施方式中，可用于本文所述的方法和组合物的调节剂特异性靶向靶INHBE基因的RNA(初级或加工的)。可以如本文所述制备和进行使用iRNA抑制这些基因表达的组合物和方法。
根据本发明的方法施用调节剂可以导致预防或治疗INHBE相关病症，例如代谢障碍，例如代谢综合征，碳水化合物障碍，例如II型糖尿病、前驱糖尿病，脂质代谢障碍，例如高脂血症，高血压，心血管疾病、体重失调。可以向受试者施用治疗量的调节剂，如约0.01mg/kg至约200mg/kg。
在一个实施方式中，皮下施用调节剂，即通过皮下注射。可以使用一次或多次注射将所需剂量的调节剂递送至受试者。注射可以在一段时间内重复。
可以定期重复施用。在某些实施方式中，在初始治疗方案后，可以以较低频率施用治疗。重复剂量方案可以包括定期施用治疗量的调节剂，如每月一次至每年一次。在某些实施方式中，调节剂约每月一次至约每三个月一次，或约每三个月一次至约每六个月一次施用。
本发明还提供了调节剂或其药物组合物用于与其他药物和/或其他治疗方法联合治疗受益于INHBE表达和/或活性抑制和/或降低的受试者(例如患有INHBE相关病症的受试者)的方法和用途，例如与已知的药物和/或已知的治疗方法联合，如，例如目前用于治疗这些病症的那些。
因此，在本发明的一些方面，包括施用本发明的调节剂的方法还包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
例如，在某些实施方式中，本发明的调节剂与例如可用于治疗如本文所述或本领域已知的INHBE相关病症的药剂组合施用。例如，适合于治疗受益于INHBE表达和/或活性降低的受试者(例如患有INHBE相关病症的受试者)的另外的药剂和治疗可以包括目前用于治疗INHBE相关病症症状的药剂。
可以与本发明的调节剂一起使用的另外的治疗剂的实例包括但不限于胰岛素、胰高血糖素样肽1激动剂(例如，艾塞那肽、利拉鲁肽、度拉鲁肽、索马鲁肽和普兰林肽)、磺酰脲(例如，氯磺丙脲、格列吡嗪)、司格列奈(例如，瑞格列奈、那格列地)、双胍(例如，二甲双胍)、噻唑烷二酮(例如，罗格列酮、曲格列酮)、α-葡糖苷酶抑制剂(例如，阿卡波糖和美格列醇)、SGLT2抑制剂(例如，达格列净)、DPP-4抑制剂(例如，利格列汀)或HMG-CoA还原酶抑制剂，例如，他汀类，如阿托伐他汀(Lipotor)、氟伐汀(Lescol)、洛伐他汀(Mevacor)、洛伐他汀延长释放(Altoprev)、匹伐他汀(Livalo)、普伐他汀(Pravachol)、瑞舒伐他汀(Crestor)和辛伐他汀(Zocor)。
调节剂和另外的治疗剂和/或治疗可以同时和/或以相同的组合施用，例如肠胃外施用，或者另外的治疗剂可以作为单独的组合物的部分或在单独的时间和/或通过本领域已知的或本文所述的另一种方法施用。
VIII.试剂盒
在某些方面，本公开提供了试剂盒，其包括含有本发明调节剂的药物制剂的合适容器。
此类试剂盒包括一种或多种调节剂和使用说明书，例如施用预防或治疗有效量的调节剂的说明书。调节剂可以在小瓶或预填充注射器中。试剂盒可以任选地进一步包含用于施用调节剂的手段(例如，注射装置，如预填充注射器)，或用于测量INHBE抑制的手段(例如，用于测量INHBE mRNA、INHBE蛋白和/或INHBE活性的抑制的手段)。用于测量INHBE抑制的此类手段可以包括用于从受试者获得样品(如，例如血浆样品)的手段。本发明的试剂盒可以任选地进一步包含用于确定治疗有效量或预防有效量的手段。
在某些实施方式中，药物制剂的单个组分可以在一个容器中提供，例如小瓶或预填充注射器。或者，可能需要在两个或更多个容器中分别提供药物制剂的组分，例如一个容器用于调节剂制备物，并且至少另一个用于载体化合物。试剂盒可以以多种不同的配置包装，如单个盒中的一个或多个容器。可以例如根据试剂盒提供的说明书组合不同的组分。可以根据本文所述的方法组合组分，例如，以制备和施用药物组合物。试剂盒还可以包括递送装置。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为限制。本申请通篇引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的全部内容以及非正式序列表和附图在此通过引用并入本文。
实施例
实施例1：UK Biobank中INHBE功能丧失与腰臀比的相关性研究
腹部肥胖是代谢综合征的最普遍表现(Després J.和Lemieux I.Nature 2006；444：881-887)并且被公认为是心血管疾病和超过体重指数(BMI)的代谢风险的贡献因素(Neeland IJ等，Lancet Diabetes&Endocrinology 2019；7(9)：715-725)。针对BMI调整的腰臀比(WHRadjBMI)反映了腹部肥胖并与腹部脂肪的直接成像相关。孟德尔随机化研究已经显示WHRadjBMI与2型糖尿病和冠心病以及缺血性中风、血糖性状和循环脂质的风险之间的因果关系(Emdin CA等，JAMA 2017；317(6)：626-634；Dale CE等，Circulation 2017；135(24)：2373-2388)。
使用来自UKBiobank(UKBB)的外显子组测序数据测试罕见遗传变体与针对BMI调整的腰臀比的相关性。UKBB，英国(UK)的一项大型长期生物库研究，正在研究遗传倾向和环境暴露(包括营养、生活方式、药物等)对疾病发展的相应贡献(参见例如www.ukbiobank.ac.uk)。该研究跟踪了英国约50万名年龄在40至69岁的入组志愿者。从2006年开始，首次招募超过4年，并且随后将对志愿者进行至少30年的随访。已经收集了大量的表型数据，包括人体测量，如腰围和臀围。最近，已经获得了来自研究中约450,000名参与者的外显子组测序数据(或由外显子组成的基因组部分)。
这些全外显子组序列用于鉴定罕见的预测功能丧失(pLOF)变体(即移码、终止增加、剪接供体或剪接受体变体)，其被LOFTEE称为高置信度。使用在其UKBB评估时获取的腰围、臀围和体重指数(BMI)的手动测量来计算参与者的WHR adjBMI。WHR计算为这两次测量的比率。使用这些数据以及招募时的年龄和性别，构建了建模WHR的线性模型(WHR～年龄+性别+BMI)。使用来自该模型的残差定义WHR adjBMI。
使用基于基因的折叠测试(即，负荷测试)来寻找罕见(次要等位基因频率≤1％)pLOF变体和WHRadjBMI之间的相关性。在不相关的白人群体(n＝363,973)中通过30个主成分进行负荷测试，针对年龄和遗传祖先调整。INHBE pLOF与WHRadjBMI的0.22标准偏差降低相关(表A)。测试了INHBE与另外的数量性状的相关性，并且我们检测了与出生体重、WHR(未针对BMI调整)、甘油三酯和HDL胆固醇(表A)的相关性。INHBE pLOF对于高血压、冠心病和T2D也具有较低的优势比(表B)。
UKBB外显子组测序数据中最常见的INHBE pLoF变体是620个pLOF携带者中的536个携带的剪接受体变体(rs150777893)。作为单一变体测试，rs150777893与降低的WHRadjBMI显著相关(表C)。
表A：INHBE pLOF与WHRadj BMI和其他性状的相关性
表B：INHBE pLOF与高血压、心脏病和T2D的相关性
表C：剪接受体变体rs150777893与WHRadj BMI的相关性
实施例2.iRNA合成
试剂来源
在本文未具体给出试剂的来源的情况下，这种试剂可以以用于分子生物学的质量/纯度标准从分子生物学试剂的任何供应商获得。
siRNA设计
使用定制R和Python脚本设计靶向抑制素亚基βE基因(INHBE，人：NCBI refseqIDNM_031479.5，NCBI基因ID：83729)的siRNA。人NM_031479.5 mRNA具有2460个碱基的长度。
未修饰的INHBE有义和反义链核苷酸序列的详细列表显示在表2中。修饰的INHBE有义和反义链核苷酸序列的详细列表显示在表3中。
应当理解，在整个申请中，没有十分位的双链体名称等同于具有仅指双链体的批号的十分数的双链体名称。例如，AD-959917等同于AD-959917.1。
siRNA合成
使用本领域已知的方法设计、合成和制备siRNA。
简言之，使用Mermade 192合成仪(BioAutomation)在固体支持物上用亚磷酰胺化学以1μmol规模合成siRNA序列。固体支持物是负载有定制GalNAc配体(3′-GalNAc缀合物)、通用固体支持物(AM Chemicals)或第一目的核苷酸的受控多孔玻璃辅助合成试剂和标准2-氰乙基亚磷酰胺单体(2′-脱氧-2′-氟、2′-O-甲基、RNA、DNA)获自Thermo-Fisher(Milwaukee，WI)、Hongene(中国)或Chemgenes(Wilmington，MA，USA)。另外的亚磷酰胺单体从商业供应商获得、内部制备，或使用定制合成从各种CMOS获得。在乙腈或9∶1 乙腈∶DMF中以100mM的浓度制备亚磷酰胺，并使用5-乙硫基-1H-四唑(ETT，在乙腈中0.25M)偶联，反应时间为400s。使用3-((二甲基氨基-亚甲基)氨基)-3H-1，2，4-二噻唑-3-硫酮(DDTT，获自Chemgenes(Wilmington，MA，USA))在无水乙腈/吡啶(9∶1 v/v)中的100mM溶液产生硫代磷酸酯键。氧化时间为5分钟。合成所有序列，最终除去DMT基团(“DMT-Off”)。
在固相合成完成后，在室温下在96孔板中用300μL甲胺(40％水溶液)处理固体支持的寡核糖核苷酸约2小时，以提供从固体支持物的切割和随后去除所有另外的碱不稳定保护基团。对于含有用叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)基团保护的任何天然核糖核苷酸键(2′-OH)的序列，使用TEA.3HF(三乙胺三氢氟酸盐)进行第二脱保护步骤。向甲胺水溶液中的每种寡核苷酸溶液中加入200μL二甲亚砜(DMSO)和300μL TEA.3HF，并将溶液在60℃下孵育约30min。孵育后，使板达到室温，并通过加入1mL 9∶1 乙腈∶乙醇或1∶1 乙醇∶异丙醇沉淀粗寡核苷酸。然后将板在4℃下离心45min，并借助于多通道移液管小心地倾析上清液。将寡核苷酸沉淀重悬于20mM NaOAc中，随后使用配备有自动进样器、UV检测器、电导率计和级分收集器的Agilent LC系统上的HiTrap尺寸排阻柱(5mL，GE Healthcare)脱盐。将脱盐的样品收集在96孔板中，然后通过LC-MS和UV光谱法分析以分别确认身份和定量材料的量。
在Tecan液体处理机器人上进行单链的双链体化。将有义和反义单链以等摩尔比在96孔板中在1×PBS中组合至10μM的终浓度，将板密封，在100℃下孵育10分钟，随后使其在2-3小时的时间段内缓慢返回至室温。确认每种双链体的浓度和身份，且随后用于体外筛选测定。
实施例3.体外siRNA筛选方法
细胞培养和384孔转染
将Hep3b细胞(ATCC，Manassas，VA)在37℃下在5％CO2的气氛中在补充有10％FBS(ATCC)的Eagle最低必需培养基(Gibco)中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。通过将每孔7.5μl Opti-MEM加0.1μl Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad CA.目录号13778-150)添加到384孔板中的单个孔中的2.5μl每种siRNA双链体中来进行转染。然后将混合物在室温下孵育15分钟。将40μl不含抗生素的含有约1.5×104细胞的完全生长培养基加入siRNA混合物中。在RNA纯化之前，将细胞孵育24小时。在10nM、1nM和0.1nM最终双链体浓度下进行单剂量实验。
使用DYNABEADS mRNA分离试剂盒(InvitrogenTM，部件号：610-12)分离总RNA
将细胞在每孔含有3μL珠的75μL裂解/结合缓冲液中裂解，并在静电振荡器上混合10分钟。洗涤步骤在Biotek EL406上使用磁性板支持物自动进行。将珠粒在缓冲液A中(在90μL中)洗涤一次，在缓冲液B中洗涤一次，并在缓冲液E中洗涤两次，其间具有抽吸步骤。在最终抽吸后，如下所述，向每个孔中加入完全的10μL RT混合物。
使用ABI高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，CA，Cat#4368813)合成cDNA
每孔加入1μl 10X缓冲液、0.4μl 25X dNTP、1μl随机引物、0.5μl逆转录酶、0.5μLRNA酶抑制剂和6.6μL H2O/反应的主混合物。将板密封，在静电振荡器上搅拌10分钟，然后在37℃下孵育2小时。此后，将板在80℃下搅拌8分钟。
实时PCR
在384孔板(Roche目录号04887301001)中，将两微升(μl)的cDNA加入每孔含有0.5μL人GAPDH TaqMan探针(4326317E)、0.5μL人INHBE、2μL无核酸酶的水和5μL Lightcycler480探针主混合物(Roche目录号04887301001)的主混合物中。在LightCycler480实时PCR系统(Roche)中进行实时PCR。
为了计算相对倍数变化，使用ΔΔCt方法分析数据，并将其针对用10nM AD-1955转染的细胞或模拟转染的细胞进行的测定归一化。使用4参数拟合模型使用XLFit计算IC50，并相对用AD-1955转染或模拟转染的细胞进行归一化。AD-1955的有义和反义序列是：有义：cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT和反义：UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT。
实施例4.反义多核苷酸剂合成
生物信息学
使用本领域熟知的标准合成方法设计和合成靶向抑制素亚基βE基因(INHBE，人：NCBI refseqID NM_031479.5，NCBI基因ID：83729)的一组反义多核苷酸剂。
靶向INHBE的反义分子的未修饰的核苷酸序列的详细列表显示在表4中，并且靶向INHBE的反义分子的修饰的核苷酸序列的详细列表显示在表5中。
实施例5.体外基于荧光的分支DNA(bDNA)筛选测定
概述
通过使用基于荧光的分支DNA(bDNA)测定测量INHBE转录物的水平，筛选一组32种人细胞系的INHBE表达。具有足够表达(高于背景相对发光单位(RLU)至少50倍)的细胞系(Hep3B)被鉴定为用于筛选靶标敲低的INHBE siRNA和ASO的体外模型。
材料和方法
针对人INHBE和人GapDH mRNA(用于归一化的管家基因)和对于Ahsa1设计Quantigene探针集，Ahsa1在筛选中用作阳性对照。探针组寡聚物从ThermoFisherScientific订购并由Metabion合成。INHBE、GapdDH和Ahsa1的探针集序列，没有其专有部分。
为了鉴定用于筛选的具有足够靶表达的细胞系(RLU高于背景至少约50倍)，通过Quantigene Singleplex测定测试来自32种人细胞系的裂解物的INHBE靶标表达。在每种细胞系中，以200,000个细胞/mL裂解物的浓度分析两种不同体积的裂解物。根据制造商的Quantigene Singleplex方案进行Quantigene测定。在室温下在黑暗中温育30分钟后，使用1420发光计数器(WALLAC VICTOR Light，Perkin Elmer，Rodgau-Jügesheim，德国)读取荧光。
Hep3B细胞中的体外筛选和剂量反应
将Hep3b细胞(ATCC，Manassas，VA)在37℃下在5％CO2气氛中在补充有10％FBS(ATCC)的Eagle最低必需培养基(Gibco)中生长至接近汇合，然后通过胰蛋白酶消化从板中释放。
为了转染Hep3B细胞，将细胞以15,000个细胞/孔的密度接种到96孔组织培养板(#655180，GBO，德国)中。siRNA的转染用Lipofectamine RNAiMax进行，反义寡核苷酸(ASO)用Lipofectamine 2000(均来自Invitrogen/Life Technologies，Karlsruhe，德国)根据制造商的反向转染说明书转染。在10nM和1nM下用siRNA/ASO一式四份进行体外筛选，具有靶向Ahsal、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶(作为非特异性对照和模拟转染)的siRNA。在与siRNA/ASO孵育24小时后，除去培养基，并将细胞在150μL培养基-裂解混合物(1体积裂解缓冲液，2体积细胞培养基)中裂解，然后在53℃下孵育30分钟。根据制造商的说明书用针对人INHBE的探针集进行bDNA测定。在室温下在黑暗中孵育30分钟后，使用1420发光计数器(Wallac Victor Light，Perkin Elmer，Rodgau-Jugesheim，德国)读取发光。
Ahsa1 siRNA用作INHBE靶mRNA表达的非特异性对照，并用作关于Ahsa1 mRNA水平的转染效率的阳性对照。通过与Ahsa1探针集杂交，模拟转染用作Ahsa1 mRNA水平的对照。通过将用Ahsa1 siRNA/ASO处理的细胞中的Ahsa1水平(针对GapDH归一化)与模拟处理的细胞中的Ahsa1水平相关联，计算体外剂量筛选中每个96孔板和两种剂量的转染效率。
对于每个孔，将靶mRNA水平针对相应的GapDH mRNA水平归一化。将给定siRNA/ASO的活性表示为相对于对照孔或模拟转染孔(DRC)上平均的靶mRNA浓度(针对GapDH mRNA归一化)，处理的细胞中相应靶的mRNA浓度(针对GapDH mRNA归一化)的百分比。用XLfit软件(Excel插件)使用4参数逻辑模型测定半数最大抑制浓度(IC50)，其使用公式且顶部限制为100％的值。使用公式从IC50计算IC80(80％抑制浓度)，其中F是抑制百分比和H是hill斜率。
表6显示了用指定的反义分子转染的细胞中的体外筛选结果。
表1.用于核酸序列表示的核苷酸单体的缩写。
将认识到，当存在于寡核苷酸中时，这些单体通过5′-3′-磷酸二酯键相互连接；并且应理解，当核苷酸含有2′-氟修饰时，则氟替代亲本核苷酸中该位置处的羟基(即，它是2′-脱氧-2′-氟核苷酸)。还应当理解，当置于寡核苷酸的3′-末端位置时，表中的核苷酸缩写省略了3′-磷酸(即，它们是3′-OH)。
缩写 核苷酸
A 腺苷-3’-磷酸
Ab β-L-腺苷-3`-磷酸
Abs β-L-腺苷-3`-硫代磷酸
Af 2’-氟腺苷-3’-磷酸
Afs 2’-氟腺苷-3’-硫代磷酸
As 腺苷-3’-硫代磷酸
C 胞苷-3’-磷酸
Cb β-L-胞苷-3`-磷酸
Cbs β-L-胞苷-3′-硫代磷酸
Cf 2’-氟胞苷-3’-磷酸
Cfs 2’-氟胞苷-3’-硫代磷酸
Cs 胞苷-3’-硫代磷酸
G 鸟苷-3’-磷酸
Gb β-L-鸟苷-3`-磷酸
Gbs β-L-鸟苷-3`-硫代磷酸
Gf 2’-氟鸟苷-3’-磷酸
Gfs 2’-氟鸟苷-3’-硫代磷酸
Gs 鸟苷-3’-硫代磷酸
T 5’-甲基尿苷-3’-磷酸
Tf 2’-氟-5-甲基尿苷-3’-磷酸
Tfs 2’-氟-5-甲基尿苷-3’-硫代磷酸
表6.Hep3B细胞中INHBE的单剂量ASO筛选
等同
本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验确定本文所述的具体实施方式和方法的许多等同物。这样的等同物旨在被以下权利要求的范围所涵盖。
非正式序列表
SEQ ID NO：1
>NM_031479.5智人抑制素亚基βE(INHBE)，mRNA
sEQ ID NO：2 SEQ ID NO：1的反向互补序列
SEQ ID NO：3
>NM_008382.3小鼠抑制素β-E(Inhbe)，mRNA
SEQ ID NO：4 SEQ ID NO：3的反向互补序列
SEQ ID NO：5
>NM_031815.2大鼠抑制素亚基βE(Inhbe)，mRNA
SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：5的反向互补序列
SEQ ID NO：7
>XM_001115958.3预测的：恒河猴抑制素亚基βE(INHBE)，mRNA
SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：7的反向互补序列

Claims (88)

1.一种抑制素亚基βE(INHBE)的调节剂。
2.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂是靶向INHBE的寡核苷酸。
3.如权利要求2所述的调节剂，其中靶向INHBE的所述寡核苷酸是双链核糖核酸(dsRNA)。
4.如权利要求2所述的调节剂，其中靶向INHBE的所述寡核苷酸是反义多核苷酸剂。
5.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂是特异性结合INHBE的抗体或其抗原结合片段。
6.如权利要求5所述的调节剂，其中特异性结合INHBE的所述抗体或其抗原结合片段是人单克隆抗INHBE抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂是小分子。
8.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂是实现ADAR编辑的指导RNA。
9.如权利要求8所述的调节剂，其中所述指导RNA包含结合ADAR酶的茎环结构。
10.如权利要求1所述的调节剂，其中所述调节剂是实现CRISPR编辑的指导RNA。
11.如权利要求4所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂包含4至50个连续核苷酸，其中所述连续核苷酸中的至少一个是修饰的核苷酸，并且其中所述反义多核苷酸剂的核苷酸序列在其整个长度上与SEQ ID NO:1、2、4、6、8或10任一个的核苷酸序列的等同区域80％互补。
12.如权利要求11所述的调节剂，其中所述等同区域是表4中提供的SEQ ID NO:1的靶区域中的任一个。
13.如权利要求4所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂包含与表3中列出的任一核苷酸序列相差不超过3个核苷酸的至少8个连续核苷酸。
14.如权利要求4和11-13任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的基本上所有核苷酸是修饰的核苷酸。
15.如权利要求4和11-14任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂所有核苷酸是修饰的核苷酸。
16.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为10至40个核苷酸。
17.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为10至30个核苷酸。
18.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为18至30个核苷酸。
19.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为10至24个核苷酸。
20.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为18至24个核苷酸。
21.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为14至20个核苷酸。
22.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为14个核苷酸。
23.如权利要求4和11-15任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂的长度为20个核苷酸。
24.如权利要求4和11-23任一项所述的调节剂，其中所述修饰的核苷酸包含选自2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分的修饰糖部分。
25.如权利要求24所述的调节剂，其中所述双环糖部分具有在糖环的2'氧和4'碳原子之间形成桥的(-CH2-)n基团，其中n为1或2，且其中R为H、CH3或CH3OCH3。
26.如权利要求4和11-25任一项所述的调节剂，其中所述修饰的核苷酸是5-甲基胞嘧啶。
27.如权利要求4和11-26任一项所述的调节剂，其中所述修饰的核苷酸包含修饰的核苷间键。
28.如权利要求27所述的调节剂，其中所述修饰的核苷间键是硫代磷酸酯核苷间键。
29.如权利要求4和11-28任一项所述的调节剂，其包含在每一侧侧接至少一个具有修饰的糖部分的核苷酸的多个2’-脱氧核苷酸。
30.如权利要求29所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂是包含位于5’和3’翼区段之间的由连接的2’-脱氧核苷酸组成的间隙区段的间隔寡聚体。
31.如权利要求29或30所述的调节剂，其中所述修饰的糖部分选自2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分。
32.如权利要求30或31所述的调节剂，其中所述5’-翼区段的长度为1至6个核苷酸。
33.如权利要求30-32任一项所述的调节剂，其中所述3’-翼区段的长度为1至6个核苷酸。
34.如权利要求30-33任一项所述的调节剂，其中所述间隙区段的长度为5至14个核苷酸。
35.如权利要求30-34任一项所述的调节剂，其中所述5’-翼区段的长度为2个核苷酸。
36.如权利要求30-35任一项所述的调节剂，其中所述3’-翼区段的长度为2个核苷酸。
37.如权利要求30-36任一项所述的调节剂，其中所述5’-翼区段的长度为3个核苷酸。
38.如权利要求30-37任一项所述的调节剂，其中所述3’-翼区段的长度为3个核苷酸。
39.如权利要求30-38任一项所述的调节剂，其中所述5’-翼区段的长度为4个核苷酸。
40.如权利要求30-39任一项所述的调节剂，其中所述3’-翼区段的长度为4个核苷酸。
41.如权利要求30-40任一项所述的调节剂，其中所述5’-翼区段的长度为5个核苷酸。
42.如权利要求30-41任一项所述的调节剂，其中所述3’-翼区段的长度为5个核苷酸。
43.如权利要求30-42任一项所述的调节剂，其中所述间隙区段的长度为10个核苷酸。
44.如权利要求4和11-43任一项所述的调节剂，其中所述反义多核苷酸剂包含
由连接的脱氧核苷酸组成的间隙区段；
由连接的核苷酸组成的5’翼区段；
由连接的核苷酸组成的3'-翼区段；
其中所述间隙区段位于所述5’翼区段与所述3’翼区段之间，并且其中每个翼区段的每个核苷酸包含修饰的糖。
45.如权利要求44所述的调节剂，其中所述间隙区段的长度为十个2’-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为五个核苷酸。
46.如权利要求44所述的调节剂，其中所述间隙区段的长度为十个2’-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为四个核苷酸。
47.如权利要求44所述的调节剂，其中所述间隙区段的长度为十个2’-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为三个核苷酸。
48.如权利要求44所述的调节剂，其中所述间隙区段的长度为十个2’-脱氧核苷酸，并且每个翼区段的长度为两个核苷酸。
49.如权利要求44-48任一项所述的调节剂，其中所述修饰的糖部分选自2’-O-甲氧基乙基修饰的糖部分、2’-甲氧基修饰的糖部分、2’-O-烷基修饰的糖部分和双环糖部分。
50.如权利要求44-49任一项所述的调节剂，其中所有核苷酸包含修饰的核苷间键。
51.如权利要求4和11-50任一项所述的调节剂，其中所述调节剂还包含配体。
52.如权利要求51所述的调节剂，其中所述调节剂在3’-末端与所述配体缀合。
53.如权利要求51所述的调节剂，其中所述配体是N-乙酰基半乳糖胺(GalNAc)衍生物。
54.如权利要求53所述的调节剂，其中所述配体是
55.一种用于抑制INHBE的表达和/或活性的药物组合物，其包含权利要求1至54任一项所述的调节剂。
56.如权利要求55所述的药物组合物，其中所述调节剂存在于未缓冲溶液中。
57.如权利要求56所述的药物组合物，其中所述未缓冲溶液是盐水或水。
58.如权利要求56所述的药物组合物，其中所述调节剂存在于缓冲溶液中。
59.如权利要求58所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液包含乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。
60.如权利要求58所述的药物组合物，其中所述缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)。
61.一种药物组合物，其包含权利要求1-54任一项的调节剂和脂质制剂。
62.如权利要求61所述的药物组合物，其中所述脂质制剂包含LNP。
63.如权利要求61所述的药物组合物，其中所述脂质制剂包含MC3。
64.一种抑制细胞中INHBE的表达和/或活性的方法，所述方法包括：
(a)使所述细胞与权利要求1-54任一项所述的调节剂或权利要求55-63任一项所述的药物组合物接触；和
(b)将步骤(a)中产生的细胞维持足以获得INHBE表达和/或活性的抑制的时间，从而抑制所述细胞中INHBE的表达和/或活性。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述细胞在受试者体内。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述受试者是人。
67.如权利要求64-66任一项所述的方法，其中所述INHBE表达和/或活性被抑制至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或至低于检测水平。
68.如权利要求65或66所述的方法，其中所述受试者患有INHBE相关病症。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述INHBE相关病症是代谢障碍。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述代谢障碍是代谢综合征。
71.如权利要求68所述的方法，其中所述INHBE相关病症是心血管疾病。
72.如权利要求68所述的方法，其中所述INHBE相关病症是高血压。
73.一种治疗患有将受益于抑制素亚基βE(INHBE)表达和/或活性降低的病症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的权利要求1-54任一项所述的调节剂或权利要求55-63任一项所述的药物组合物，从而治疗患有将受益于INHBE表达降低的病症的所述受试者。
74.一种预防患有将受益于抑制素亚基βE(INHBE)表达和/或活性降低的病症的受试者中的至少一种症状的方法，其包括向所述受试者施用预防有效量的权利要求1-54任一项所述的调节剂或权利要求55-63任一项所述的药物组合物，从而预防患有将受益于INHBE表达降低的病症的所述受试者中的至少一种症状。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述病症是INHBE相关病症。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述INHBE相关病症是代谢障碍。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述代谢障碍是代谢综合征。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述INHBE相关病症是心血管疾病。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述INHBE相关病症是高血压。
80.如权利要求73-79任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
81.如权利要求73-80任一项所述的方法，其中向所述受试者施用所述调节剂导致所述受试者中INHBE蛋白积累的减少。
82.如权利要求73-81任一项所述的方法，其中所述调节剂以约0.01mg/kg至约50mg/kg的剂量施用于所述受试者。
83.如权利要求73-82任一项所述的方法，其中所述调节剂皮下施用于所述受试者。
84.如权利要求73-83任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用用于治疗INHBE相关病症的另外的治疗剂。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述另外的治疗剂选自胰岛素、胰高血糖素样肽1激动剂、磺酰脲、司格列奈、双胍、噻唑烷二酮、α-葡糖苷酶抑制剂、SGLT2抑制剂、DPP-4抑制剂、HMG-CoA还原酶抑制剂、他汀和任何前述药剂的组合。
86.一种试剂盒，其包含权利要求1-54任一项所述的调节剂或权利要求55-63任一项所述的药物组合物。
87.一种小瓶，其包含权利要求1-54任一项所述的调节剂或权利要求55-63任一项所述的药物组合物。
88.一种注射器，其包含根据权利要求1-54任一项所述的调节剂或根据权利要求55-63任一项所述的药物组合物。
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