CN118064435B - 一种花生种子特异性基因启动子0b3tgp及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP及其应用，涉及植物基因工程技术领域。所述启动子0B3TGP选自SEQ ID NO.01、与SEQ ID NO.01反向互补的序列、SEQ ID NO.02、与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02进行杂交的DNA或者RNA序列、与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02序列有至少95％一致的序列、与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02任一互补的DNA或者RNA序列；可以利用或者操作启动子0B3TGP在花生种子组织细胞内驱动目标基因进行表达，从而实现在特定花生种子组织细胞内表达目标基因的目的。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP及其应用。
背景技术
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游，这些DNA序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。
随着医药技术和基因工程技术的快速发展，为了满足药物生产等生物合成领域的低成本和高效率，将植物、动物或微生物细胞作为反应器，进行转基因和基因转化以高效生产异源蛋白，常用于药用蛋白、抗原和疫苗等产品的生产及高营养价值、高有效成分含量或具备其他优良性状的新品种作物的培育。
经过基因工程育种的农作物能具备多种常规育种模式难以获得或稳定的优良性状，或将本身的各种性状表达进行强化，从而获得具备优秀的抗病虫害、抗倒伏、抗除草剂、高营养价值、高有效成分含量或具备其他优良性状的农作物新品种，在农业生产应用中具有显著的降本增效的能力，应用前途广泛。但也存在着某些外源成分可能诱发人体免疫反应或破坏原有营养成分等潜在问题，需要在基因编辑中进行规避。
其中，转基因植物作为口服疫苗合成反应器最大的优势在于可以利用植物细胞壁形成天然的生物胶囊以避免在口服后蛋白结构被消化系统破坏，只需要简单的摄食就可以让有效成分进入到肠道，在肠道黏膜的刺激下激发特异性免疫反应让人体获得免疫能力，这样的疫苗大大改变了传统疫苗的生产方式、接种模式和经济成本，有重要的社会意义和广阔的发展前景。另外，如人胰岛素、血红蛋白、免疫球蛋白、脑啡肽等重要的蛋白质、多肽药物也已经在植物细胞反应器的生产应用中实现了产业化和商品化。
目前转基因植物细胞反应器生产外源基因表达产物中最突出的问题在于基因表达量不足，这是应用植物生产药用蛋白的最大障碍。这个问题一方面可以利用愈伤组织等干细胞新陈代谢速率高、不断分裂的特点，将其作为反应器以弥补这一缺点，另一方面，也需要在单个细胞内提高此类外源基因的表达水平，想要提高目标基因的表达水平可以从分子生物学层面入手，例如借助强启动子、特异性启动子或前导序列，让目标的外源基因得以有更高的转录、翻译活性，以提高目标产物产量，或是控制其在种子组织、特定外界环境条件下的高表达量，便于生产实践中能在特定条件下收取种子进行目标产物提取以取代整株提取，将大大降低生产成本。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP及其应用，利用特异性基因启动子0B3TGP在花生种子组织细胞内驱动目标基因进行表达，从而实现在特定花生种子组织细胞内表达目标基因的目的，培育出高价值的作物新品种。
为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP，所述花生种子特异性基因启动子0B3TGP能在花生种子组织细胞内驱动目标基因在种子组织细胞内特异性高表达，且所述特异性基因启动子0B3TGP的DNA核苷酸序列选自下列序列中任意一组：
(1)如SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列：
TTTTTATATATTTATGTCGGATTGTAGTATAATAGTGATTTGAGATATTTTAAGTGAGAGAGTGTTGTTGGCATATATAATAGTGAAAAATTCCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGAGAGATTGAGAGTAGCGAAG；
(2)与SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列反向互补的序列，即可以与原序列形成完整碱基互补配对形成双链结构，而方向相反的单链序列，如SEQ ID NO.02：
CTTCGCTACTCTCAATCTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCG GAATTTTTCACTATTATATATGCCAACAACACTCTCTCACTTAAAAT ATCTCAAATCACTATTATACTACAATCCGACATAAATATATAAAAA；
(3)能够与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02序列进行杂交的核酸DNA或RNA序列；
(4)与(1)或(2)中所述序列有至少95％序列一致性的序列；
(5)与(1)或(2)任一所述序列互补的DNA或者RNA序列。
优选的，所述启动子0B3TGP通过PCR扩增技术获得。
优选的，所述PCR扩增过程中根据如SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列配置如下两种引物进行扩增：
(1)SEQ ID NO.03：GTAATCATCACACTACATTGTCTCA；
(2)SEQ ID NO.04：CTTCGCAATTTGGCTAAGTAAACAT。
所述特异性基因启动子0B3TGP应用于花生种子基因编辑或转基因操作培育新品种。
优选的，所述应用方式为利用或者操作基因启动子0B3TGP在花生种子组织细胞内驱动目标基因进行表达，从而在分子生物学层面利用种子细胞作为反应器合成相关蛋白。
优选的，所述应用的具体过程为对花生种子进行转基因操作，利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子0B3TGP—目标基因—NOS终止子的DNA双链，利用该植物表达载体转化目标植物完成遗传转化。
本发明提供一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP及其应用，与现有技术相比优点在于：
本发明提供一种新的花生种子特异性基因启动子0B3TGP，可以利用或者操作花生种子特异性基因启动子0B3TGP在花生种子组织细胞内驱动目标基因进行表达，从而实现在特定花生种子组织细胞内表达目标基因的目的，在农业生产的分子生物学层面育种中可以利用这样的方式将花生种子组织细胞作为反应器，进行转基因和基因转化以高效生产异源蛋白或加强表达自身蛋白及生产脂肪酸等各种营养物质，常用于药用蛋白、抗原和疫苗等产品的生产或培育具有高营养价值、高产量等优良性状的品种。
附图说明
图1为本发明实施例1中花生种子特异性基因启动子0B3TGP的PCR扩增电泳图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
花生种子特异性基因启动子0B3TGP的PCR扩增操作：
1、选择SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列为花生种子特异性基因启动子0B3TGP序列；
2、根据上述序列配置两种引物：
SEQ ID NO.03：GTAATCATCACACTACATTGTCTCA；
SEQ ID NO.04：CTTCGCAATTTGGCTAAGTAAACAT。
3、配制基于Phusion DNA聚合酶(Phusion DNAPolymerase)的DNA扩增体系：配置方法为混合下列，此处配比以体系总量为50μL为例：
(1)dd H2O 30.5μL
(2)10×Buffer缓冲液5μL
(3)dNTP(10mmol/L)1μL
(4)SEQ ID NO.03(10μmol/L)5μL
(5)SEQ ID NO.04(10μmol/L)5μL
(6)MgCl2(50mmol/L)0.5μL
(7)花生基因组DNA 2μL
(8)Phusion DNA聚合酶1μL；
4、运行PCR扩增程序：将上述扩增体系放入PCR热循环仪器中，进行下列热循环步骤：
(1)98℃，5min
(2)98℃，30sec
(3)55℃，30sec
(4)72℃，3min
(5)重复步骤(2)-(4)，循环20次
(6)72℃，保温20min；
电泳跑胶，回收长度为0.22kb的DNA片段
利用pEASY-Blunt进行平端连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，完成测序。
实施例2：
利用上述实施例1获得的花生种子特异性基因启动子0B3TGP用于农作物基因组整合操作：
利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP的组织特异性，操作花生种子特异性基因启动子0B3TGP在花生种子组织细胞内驱动GFP荧光蛋白基因进行表达，从而实现在花生种子组织细胞内表达GFP荧光蛋白基因的目的：
1、利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子0B3TGP——GFP荧光蛋白基因——NOS终止子的DNA双链，利用该植物表达载体转化目标植物完成遗传转化；
2、于MB培养基内分别对阜花54花生愈伤组织进行组织培养及后续诱导分化，获得原始种阜花54品种花生和利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP——GFP荧光蛋白基因——NOS终止子质粒序列插入了GFP荧光蛋白基因的转基因品种阜花54(遗传转化阳性品种)品种花生经组织培养后获得的完整植株各20株，在正常温室条件下种植120d至植株成熟并结果，分别收集两种植株所结种子并单独分离出子叶及胚部分，两种花生种子分别在紫外光照射条件下观察其荧光的有无及强度，根据观察可知原始种阜花54品种花生检测的组织中花生未出现荧光现象，阜花54(遗传转化阳性品种)品种花生组织中有92％的组织出现荧光现象。
即花生种子特异性基因启动子0B3TGP可以使GFP荧光蛋白基因在花生种子组织细胞内强化表达。
2、验证花生种子特异性基因启动子0B3TGP在用于基因编辑时对GFP荧光蛋白基因的强化表达的效果仅对花生种子组织细胞有特异性：
对上述种植后得到的原始种阜花54品种花生和利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP——GFP荧光蛋白基因——NOS终止子质粒序列插入了GFP荧光蛋白基因的转基因品种阜花54(遗传转化阳性品种)品种花生完整植株的其余部分，即根、茎、叶、果壳部分的蛋白提取液与种子部分的蛋白提取液在紫外光照射条件下观察其荧光的有无及强度，考察其GFP荧光蛋白基因强化表达的情况，通过检测可知原始种阜花54品种花生在根、茎、叶、果壳部分的组织均无荧光现象，阜花54(遗传转化阳性品种)品种花生的根、茎、叶、果壳部分均无荧光现象，可得知，在原始种阜花54品种花生和利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP——GFP荧光蛋白基因——NOS终止子质粒序列插入了GFP荧光蛋白基因的转基因品种阜花54(遗传转化阳性品种)品种花生两种植株的除种子之外的剩余植株细胞内，GFP荧光蛋白基因的表达并未受到明显增强。
实施例3：
花生种子特异性基因启动子0B3TGP用于农作物基因编辑：
伤寒沙门氏菌属于沙门氏菌属，革兰染色阴性，呈短粗杆状，体周满布鞭毛，运动活泼，在含有胆汁的培养基中生长较好，因胆汁中的类脂及色氨酸可作为伤寒沙门氏菌的营养成分。伤寒沙门氏菌的菌体(O)抗原、鞭毛(H)抗原和表面(Vi)抗原能使人体产生相应的抗体。由于O及H抗原的抗原性较强，故可用于血清凝集试验(肥达反应，Widalreaction)，以测定血清中的O及H抗体的效价来辅助临床诊断。菌体裂解时可释放强烈的内毒素，是伤寒沙门氏菌致病的主要因素。利用沙门菌的invA基因和鞭毛素基因用PCR方法扩增进行分子杂交，可以检出3～300活菌细胞，达到敏感和特异的效果。
构建伤寒沙门氏菌疫苗时，可用伤寒沙门氏菌Ty21a抗原作为抗原物质进入体内以诱发免疫反应，促使动物体受到伤寒沙门氏菌侵染时能快速产生针对性免疫应答以快速消灭病原体。
选择植物基因组整合的方法，通过花生种子特异性基因启动子0B3TGP提高其表达量及加大转基因食物食用量的方法克服表达量偏低的问题：
1、利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子0B3TGP——伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因——NOS终止子的DNA双链，利用该植物表达载体转化目标植物完成遗传转化。
2、于MB培养基内分别对鲁花11花生愈伤组织进行组织培养及后续诱导分化，获得原始种鲁花11品种花生和利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP——伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因——NOS终止子质粒序列插入了伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因的转基因品种鲁花11(遗传转化阳性品种)品种花生经组织培养后获得的完整植株各20株，在正常温室条件下种植120d至植株成熟并结果，分别收集两种植株所结种子并单独分离出种子部分，两种花生种子对50只实验用白鼠进行15g/只用量的喂食，每周单独投食4次，饲养2周，即共投喂8次，末次免疫3d后采集眶后静脉血和唾液，以白鼠血清和黏膜(以口腔黏膜为例)表面伤寒沙门氏菌O9抗体水平为指标考察其伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因强化表达从而生产抗原疫苗的情况，具体结果如下表所示：
由上表可知，花生种子特异性基因启动子0B3TGP可以使伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因在花生种子组织细胞内强化表达从而生产抗原疫苗。
另外，为了验证花生种子特异性基因启动子0B3TGP在用于基因编辑时对伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因的强化表达从而生产抗原疫苗的效果仅对花生种子组织细胞有特异性，对上述实验中得到的植株进行下列实验检验：
对上述种植后得到的原始种鲁花11品种花生和利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP——伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因——NOS终止子质粒序列插入了伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因的转基因品种鲁花11(遗传转化阳性品种)品种花生完整植株的其余部分，即根、茎、叶、果壳部分用Westernblot检测Ty21a的表达，得知除种子部分外其他组织内未检测到与Ty21a亚单位蛋白分子量相符,且具有抗原性的蛋白。经对比后得到该启动子对于伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因在两种植株内，在除了种子以外的部分表达的促进并无明显区别。
即，在原始种鲁花11品种花生和利用花生种子特异性基因启动子0B3TGP——伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因——NOS终止子质粒序列插入了伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因的转基因品种鲁花11(遗传转化阳性品种)品种花生两种植株的除种子之外的剩余植株细胞内，伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因的表达并未受到明显增强。
综合上述实验可得，插入了花生种子特异性基因启动子0B3TGP——伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因——NOS终止子质粒序列的鲁花11种花生幼苗相比未经处理的同种花生种子组织细胞在相同的生长条件下伤寒沙门氏菌Ty21a抗原含量有明显提升，而植株剩余部分中伤寒沙门氏菌Ty21a抗原含量并未发现明显变化，故花生种子特异性基因启动子0B3TGP在用于基因编辑时对伤寒沙门氏菌Ty21a抗原基因在种子组织细胞中的表达有明显的组织特异性和表达强化效果。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (6)
1.一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP，其特征在于，所述花生种子特异性基因启动子0B3TGP能在花生种子组织细胞内驱动目标基因在种子组织细胞内特异性高表达，且所述特异性基因启动子0B3TGP的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示：
TTTTTATATATTTATGTCGGATTGTAGTATAATAGTGATTTGAGATATTTTAAGTGAGAGAGTGTTGTTGGCATATATAATAGTGAAAAATTCCGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGGAGAGATTGAGAGTAGCGAAG。
2.根据权利要求1所述的一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP，其特征在于：所述启动子0B3TGP通过PCR扩增技术获得。
3.根据权利要求1所述的一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP，其特征在于：所述PCR扩增过程中根据如SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列配置如下两种引物进行扩增：
（1）SEQ ID NO.03：GTAATCATCACACTACATTGTCTCA；
（2）SEQ ID NO.04：CTTCGCAATTTGGCTAAGTAAACAT。
4.一种如权利要求1-3任一所述的花生种子特异性基因启动子0B3TGP的应用，其特征在于：所述特异性基因启动子0B3TGP应用于花生种子基因编辑或转基因操作培育新品种。
5.根据权利要求4所述的一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP的应用，其特征在于：所述应用方式为利用或者操作基因启动子0B3TGP在花生种子组织细胞内驱动目标基因进行表达，从而在分子生物学层面利用种子细胞作为反应器合成相关蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种花生种子特异性基因启动子0B3TGP的应用，其特征在于：所述应用的具体过程为对花生种子进行转基因操作，利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子0B3TGP—目标基因—NOS终止子的DNA双链，利用该植物表达载体转化目标植物完成遗传转化。
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