CN106496313B

CN106496313B - 抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN106496313B
Application number: CN201610966649.8A
Authority: CN
Inventors: 何绍贞; 刘庆昌; 翟红; 李燕; 李仁崑
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-11-03
Filing date: 2016-11-03
Publication date: 2019-06-04
Anticipated expiration: 2036-11-03
Also published as: CN106496313A

Abstract

本发明公开了抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用。本发明提供的抗病相关蛋白IbSWEET10为1)或2)或3)：1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性相关的蛋白质。实验证明，在甘薯中过表达IbSWEET10基因可增强甘薯对蔓割病的抗性。因此，抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因在调控植物抗病性中具有重要的理论意义和实用价值。

Description

抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用。

背景技术

甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)是一种重要的粮食、饲料以及工业原料用作物，并且在当今世界上作为一种新型能源植物，其地位显得尤为重要。我国是世界上最大的甘薯生产国，年种植面积338.7万hm²，占世界总种植面积的42.2％，年产量占世界总产量的67.94％。我国目前正处于飞速发展的时期，对能源的需求持续增加，人们对甘薯的需求也日益增多，因此选育高产、优质、多抗及专用型新品种成为我国甘薯育种的主要目标。甘薯是世界第七大粮食作物，但甘薯病虫害在世界范围内普遍存在，严重威胁着各国甘薯生产，造成甘薯产量、品质及贮藏性大幅度下降，世界各个甘薯生产国家一直比较重视甘薯的主要病虫害的防治。

甘薯蔓割病，又称甘薯枯萎病、甘薯蔓枯病、甘薯萎蔫病或甘薯茎腐病，是典型的镰刀菌导管病，是我国南方薯区的重要病害之一，且危害极大。甘薯蔓割病由甘薯蔓割病菌引起。甘薯蔓割病菌可在土壤中存活多年。甘薯蔓割病菌的致病机理为：通过秧苗基部或根部的伤口，或，由带菌种薯通过导管侵入秧苗，在导管组织内繁殖，致使患病植株发生全株性枯萎、死亡，表现出地上部叶片自下而上变黄脱落，茎维管束变褐色，最后茎部开裂，整株枯死。

甘薯是无性繁殖作物，具有种间、种内杂交不亲和的特性，该特性严重限制了甘薯育种中的资源利用和亲本自由组配。长期育种实践表明，常规杂交育种方法难以选育出优质、高产、抗蔓割病的甘薯新品种。因此，采用基因工程技术培育抗蔓割病的甘薯新品种是一种可行途径。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何增强植物对甘薯蔓割病的抗性。

为解决上述问题，本发明首先提供了一种抗病相关蛋白。

本发明所提供的抗病相关蛋白，名称为蛋白质IbSWEET10，来源于甘薯(Ipomoeabatatas(L.)Lam.)，为如下1)或2)或3)：

1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；

2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物抗病性相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由306个氨基酸残基组成。

为了使1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述3)中的蛋白质IbSWEET10，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述3)中的蛋白质IbSWEET10可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述3)中的蛋白质IbSWEET10的编码基因可通过将序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述编码蛋白质IbSWEET10的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA分子；

(a3)与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质IbSWEET10的DNA分子；

(a4)在严格条件下与(a1)或(a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质IbSWEET10的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列1由1250个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码蛋白质IbSWEET10的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质IbSWEET10的核苷酸序列80％或者更高同一性的核苷酸，只要编码蛋白质IbSWEET10且与植物抗病性相关，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

含有编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本发明的保护范围。

所述表达盒可为表达盒A；所述表达盒A包括启动子、编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子和终止子。所述启动子可为CaMV35S启动子、NOS启动子或OCS启动子。所述终止子可为NOS终止子或OCS polyA终止子。

所述表达盒A的序列可为序列表中序列3所示。所述表达盒A中：序列表中序列3自5′末端起第1至835位为CaMV35S启动子，第848至1768位为编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子，第1785至2037位为NOS终止子。

所述重组载体可为将编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子(即序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子)通过含有编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子的表达盒插入出发质粒得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒pCB-IbSWEET10。重组质粒pCB-IbSWEET10的构建过程如下：(A)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pCAMBIA3301得到载体骨架，用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pBI121，回收约3032bp的片段，将所述载体骨架和所述片段连接，得到重组质粒pCBGUS；(B)用序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA分子替换重组质粒pCBGUS的限制性内切酶XbaI和SacI识别序列间的片段(重组质粒pCBGUS被限制性核酸内切酶XbaI和SacI切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)得到的重组质粒pCB-IbSWEET10，重组质粒pCB-IbSWEET10表达序列表中序列2所示的蛋白质IbSWEET10。所述重组质粒pCBGUS与重组质粒pCB-IbSWEET10的差别仅在于将重组质粒pCBGUS的限制性核酸内切酶XbaI和SacI识别序列间的DNA片段(重组质粒pCBGUS被限制性核酸内切酶XbaI和SacI切成一个大片段和一个小片段，该DNA为该小片段)替换为序列表中序列1自5′末端起第122至1042位所示的DNA分子。

所述重组微生物可通过将所述重组载体导入出发微生物得到。

所述出发微生物可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌EHA105。

所述重组微生物具体可为EHA105/pCB-IbSWEET10。EHA105/pCB-IbSWEET10是将重组质粒pCB-IbSWEET10转化根癌农杆菌EHA105得到的重组农杆菌。

所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。所述转基因植物理解为不仅包含将所述IbSWEET10基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

下述b1)或b2)也属于本发明的保护范围；

b1)所述蛋白质IbSWEET10，或，编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子，或，含有编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在调控植物抗病性中的应用；

b2)所述蛋白质IbSWEET10，或，编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子，或，含有编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系，在培育抗病性改变的转基因植物中的应用。

所述b1)中，所述调控植物抗病性可为增强植物抗病性。

所述b2)中，所述抗病性改变可为抗病性增强。

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括将编码所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性增强。

上述培育转基因植物的方法中，所述编码蛋白质IbSWEET10的核酸分子可为如下(a1)或(a2)或(a3)或(a4)所示的DNA分子：

(a1)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

(a2)核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子；

为解决上述技术问题，本发明还提供了一种植物育种方法。

本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质IbSWEET10的含量或活性，从而增强植物的抗病性。

上述任一所述抗病性可为抗蔓割病。

上述任一所述抗病性可为抗甘薯蔓割病菌引起的病害。

上述任一所述植物可为如下c1)至c5)中的任一种：

c1)双子叶植物；

c2)单子叶植物；

c3)薯蓣科植物；

c4)甘薯；

c5)甘薯品种栗子香。

实验证明，利用本发明提供的抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因能增强植物对蔓割病的抗性：与甘薯品种栗子香野生型幼苗相比，甘薯转基因株系L96幼苗、甘薯转基因株系L99幼苗和甘薯转基因株系L130幼苗的蔓割病病级降低和褐化比例显著降低；而甘薯品种栗子香野生型幼苗和甘薯转空载体阳性幼苗的蔓割病病级和褐化比例均无显著差异。因此，抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因在调控植物抗病性中具有重要的理论意义和实用价值。

附图说明

图1为甘薯拟转基因植株的PCR扩增结果。

图2为甘薯转基因株系的鉴定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

ND98(记载于如下文献中：He et al.，Plant Cell Tissue and Organ Culture，2009，96:69-74.ND98在该文献中的名称为LM1)为一甘薯品系，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

栗子香(王玉萍等，中国农业科学，2003，36(9)：1000-1005)为一甘薯品种，公众可从中国农业大学甘薯遗传育种研究室获得，以重复本实验。

克隆载体pMD19-T为宝生物工程(大连)公司产品，产品目录号为6013。载体pCAMBIA3301为Cambia公司产品。载体pBI121为Clontech公司产品。植物总RNA提取试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司产品，目录号为DP432。PrimeScript^TM 1st Strand cDNASynthesis Kit为宝生物工程(大连)有限公司的产品，产品目录号为6110A。

甘薯蔓割病菌和PDA培养基均记载于如下文献中：户勋，余萍，方一泓，李薇.甘薯蔓割病菌对甘薯的诱导抗性和PR蛋白的性质测定.2007年11月，福建师范大学学报(自然科学版)。

实施例1、IbSWEET10基因的获得

IbSWEET10基因的获得的步骤如下：

1、模板的获得

用植物总RNA提取试剂盒提取ND98幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录出第一链cDNA。

2、从采用抑制差减杂交技术构建的差减cDNA文库中获得了EST序列。EST序列的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

3、根据EST序列的核苷酸序列，设计并合成引物3GSP1和3GSP2。

4、完成步骤3后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤3合成的3GSP1和3GSP2为引物，利用RACE方法扩增获得约1100bp的3’-RACE片段，将3’-RACE片段和克隆载体pMD19-T连接，得到重组质粒2。将重组质粒2进行测序，获得3’-RACE片段的核苷酸序列。根据3’-RACE片段的核苷酸序列，设计并合成引物5GSP1和5GSP2。

5、完成步骤4后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤4合成的5GSP1和5GSP2为引物，利用RACE方法扩增获得约200bp的5’-RACE片段，将5’-RACE片段和克隆载体pMD19-T连接，得到重组质粒3。将重组质粒3进行测序，获得5’-RACE片段的核苷酸序列。

6、完成步骤5后，利用DNAMAN 6.0软件拼接候选的IbSWEET10基因。依据拼接候选的IbSWEET10基因序列进一步设计并合成IbSWEET10基因ORF的引物O-F和O-R。

7、完成步骤6后，以步骤1获得的cDNA为模板，以步骤6合成的O-F和O-R为引物，PCR扩增获得约921bp的PCR扩增产物并测序。

上述引物3GSP1、3GSP2、5GSP1、5GSP2、O-F和O-R的核苷酸序列信息详见表2。

结果表明，步骤7获得的PCR扩增产物的核苷酸序列如序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示，将该序列所示的基因命名为IbSWEET10基因，其编码的蛋白命名为IbSWEET10蛋白或蛋白质IbSWEET10，氨基酸序列如序列表中序列2所示。

表2.引物序列信息

引物名称	序列信息5'-3'
		3GSP1	5'-ATGGCTCTCACTGGTCATCAATT-3'
3GSP2	5'-TCATCTCATTCATCGTCTTCCTTTC-3'
		5GSP1	5'-GTAGAATGTTGGCAGTGGAGAAAG-3'
5GSP2	5'-AAAGCAAAAGCCAATTGATGACC-3'
		O-F	5'-ATGGCTCTCACTGGTCATCAA-3'
O-R	5'-TTAAGCTCCCACAGCCTGAA-3'

实施例2、IbSWEET10蛋白在增强甘薯的蔓割病抗性中的应用

一、重组质粒的构建

1、人工合成序列表中序列1所示的双链DNA分子。以该双链DNA分子为模板，以OS-F-XbaI：GCTCTAGAATGGCTCTCACTGGTCATCAA(下划线为限制性内切酶XbaI的识别序列)和OS-R-SacI：CGAGCTCTTAAGCTCCCACAGCCTGAA(下划线为限制性内切酶SacI的识别序列)为引物进行PCR扩增，得到N端含有限制性内切酶XbaI和C端含有限制性内切酶SacI的双链DNA分子。

2、将步骤1中得到的N端含有限制性内切酶XbaI和C端含有限制性内切酶SacI的双链DNA分子连接至克隆载体pMD19-T，得到重组质粒pMD19-IbSWEET10。

3、完成步骤2后，用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切重组质粒pMD19-IbSWEET10，回收约1.0kb的片段1。

4、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pCAMBIA3301，回收约11256bp的载体骨架1。

5、用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切载体pBI121，回收包含约3032bp的片段2。

6、将片段2与载体骨架1连接，得到重组质粒pCBGUS。

7、用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切重组质粒pCBGUS，回收约12000bp的载体骨架2。

8、将片段1和载体骨架2连接，得到重组质粒pCB-IbSWEET10。

根据测序结果，对重组质粒pCB-IbSWEET10进行结构描述如下：将重组质粒pCBGUS的限制性内切酶XbaI和SacI识别序列间的小片段替换为序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子。重组质粒pCB-IbSWEET10表达序列表中序列2所示的IbSWEET10蛋白。

重组质粒pCB-IbSWEET10具有一个表达盒A，表达盒A的核苷酸序列如序列表中序列3所示，其中序列表中序列3自5’末端起第1至835位为CaMV35S启动子，第848至1768位为IbSWEET10蛋白的编码基因，第1785至2037位为NOS终止子。

二、重组农杆菌的获得和甘薯转基因植株的再生

1、将重组质粒pCB-IbSWEET10转化根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌甲，将重组农杆菌甲命名为EHA105/pCB-IbSWEET10。

2、剥取长约0.5mm的栗子香的茎尖分生组织，置于胚性愈伤组织诱导固体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS固体培养基)上，27±1℃培养8周，得到胚性愈伤组织，然后将胚性愈伤组织置于胚性愈伤组织诱导液体培养基(含2.0mg/L 2，4-D和3.0％蔗糖的MS液体培养基)中，水平摇床上振荡光暗交替培养3d(具体条件为：100r/min；27℃；光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)，得到直径为0.7-1.3mm的胚性细胞团。

3、完成步骤2后，采用农杆菌介导的方法将EHA105/pCB-IbSWEET10转化胚性细胞团，然后置于共培养基(含30mg/L AS、2.0mg/L 2，4-D的MS固体培养基)上，28℃暗培养3d。

4、完成步骤3后，将胚性细胞团用含900mg/L头孢噻肟钠(cefotaxime sodium，CS)和2.0mg/L 2，4-D的MS液体培养基洗涤2次，然后置于选择培养基(含2.0mg/L 2，4-D、100mg/L CS和0.5mg/L草铵膦(phosphinothricin，PPT)的固体MS培养基)上，27±1℃暗培养10-12周(每2周需更换一次选择培养基)。

5、完成步骤4后，将胚性细胞团置于体细胞胚诱导培养基(含有1.0mg/L ABA、100mg/L CS和0.5mg/L PPT的MS固体培养基)上，27±1℃光暗交替培养(光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)2-4周，得到抗性愈伤组织。

6、完成步骤5后，将抗性愈伤组织置于MS固体培养基上，27±1℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为3000lx)4-8周，即获得150株甘薯拟转基因植株，依次命名L1-L150。

7、分别提取步骤6获得的甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，并以该基因组DNA为模板，以T35-F：5'-TTGATGTGATATCTCCACTGACG-3'和TS-R：5'-GGTAGAGACCGATCTGGAGGA-3'为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；如果PCR扩增产物中含有约700bp的条带，则相应的甘薯拟转基因植株即为甘薯转基因阳性植株。用等体积水代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阴性对照。用甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为对照。用重组质粒pCB-IbSWEET10代替甘薯拟转基因植株的幼嫩叶片的基因组DNA，进行PCR扩增，作为阳性对照。

部分实验结果见图1(M为DNA分子Marker，W为阴性对照，P为阳性对照，WT为甘薯品种栗子香野生型植株的幼嫩叶片的基因组DNA，L4、L5、L6、L10、L14、L56、L63、L96、L99、L121和L130均为甘薯拟转基因植株)。结果表明，L4、L5、L6、L10、L14、L56、L63、L96、L99、L121和L130均为甘薯转基因阳性植株。

采用无性繁殖的方法扩繁鉴定得到的甘薯转基因阳性植株，由一株转基因幼苗扩繁得到的植株作为一个株系。将L96、L99和L130的株系命名为甘薯转基因株系L96、甘薯转基因株系L99和甘薯转基因株系L130。

四、对照根癌农杆菌的获得和甘薯转空载体植株的再生

用重组质粒pCBGUS代替重组质粒pCB-IbSWEET10，其它同步骤三，得到重组农杆菌乙(命名为EHA105/pCBGUS)和甘薯转空载体阳性植株。

四、蔓割病抗性鉴定

1、甘薯转基因株系的鉴定

用植物总RNA提取试剂盒提取甘薯植株(甘薯品种栗子香野生型植株(WT)、甘薯转空载体阳性植株(OCK)、甘薯转基因株系L96的植株、甘薯转基因株系L99的植株和甘薯转基因株系L130的植株)的幼嫩叶片的总RNA，将该总RNA用PrimeScript^TM 1stStrand cDNASynthesis Kit反转录出第一链cDNA，然后以该cDNA为模板，实时定量检测甘薯植株中IbSWEET10基因的相对表达量(以Ibactin基因作为内参基因)。检测IbSWEET10基因的引物为5’-TTTCTGTTCAAAAGTCCGATGC-3’和5’-CATTCCACGCTCTTGGTGC-3’。检测Ibactin基因的引物为5’-AGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTAGCAC-3’和5’-TGGAAAATTAGAAGCACTTCCTGTGAAC-3’。

将甘薯品种栗子香野生型植株中IbSWEET10基因的相对表达量作为1，其它甘薯植株中IbSWEET10基因的相对表达量见图2(WT为甘薯品种栗子香野生型植株，OCK为甘薯转空载体阳性植株，L96为甘薯转基因株系L96的植株，L99为甘薯转基因株系L99的植株，L130为甘薯转基因株系L130的植株)。结果表明，甘薯转基因株系L96的植株、甘薯转基因株系L99的植株和甘薯转基因株系L130的植株中IbSWEET10基因的相对表达量分别为甘薯品种栗子香野生型植株中IbSWEET10基因的相对表达量的2.99倍、2.53倍和3.48倍。甘薯品种栗子香野生型植株和甘薯转空载体阳性植株中IbSWEET10基因的相对表达量无显著差异。

2、蔓割病抗性鉴定

实验重复三次，每个株系每次种植10株。具体操作步骤如下：

a、将甘薯蔓割病菌接种于PDA培养基，28℃光暗交替培养(光暗交替培养的周期为：光照时间为13h，黑暗时间11h；光照强度为500lx)3d，然后28℃暗培养7d，得到菌丝。

b、完成步骤a后，将所述菌丝转移至三角瓶，加入100mL无菌蒸馏水，100r/min振荡30min，然后用双层无菌纱布过滤，用血球计数板在显微镜下计数，得到浓度为1.0×10⁷个/mL的孢子悬浮液。

c、将长势基本一致的甘薯幼苗(甘薯品种栗子香野生型幼苗(WT)、甘薯转空载体阳性幼苗、甘薯转基因株系L96的幼苗，甘薯转基因株系L99的幼苗或甘薯转基因株系L130的幼苗)剪口，对齐后置于孢子悬浮液中30min，然后插入无菌沙壤土中正常培养。

完成步骤c 9天后，记录甘薯幼苗的蔓割病发病程度和褐化比例(褐化比例＝褐化茎杆长度/茎杆全长×100％)，并按照文献((方树民等.甘薯品种对蔓割病抗性的研究.植物保护学报，1988，15(3)：185-190.)中的蔓割病病级划分标准进行病级调查。蔓割病病级划分标准具体见表3。

表3

部分实验结果见表4。结果表明，与甘薯品种栗子香野生型幼苗相比，甘薯转基因株系L96幼苗、甘薯转基因株系L99幼苗和甘薯转基因株系L130幼苗的蔓割病病级和褐化比例均显著降低；而甘薯品种栗子香野生型幼苗和甘薯转空载体阳性幼苗的蔓割病病级和褐化比例均无显著差异。可见，在甘薯中过表达IbSWEET10基因可增强甘薯对蔓割病的抗性。

表4

<110> 抗病相关蛋白IbSWEET10及其编码基因与应用

<120> 中国农业大学

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1250

<212> DNA

<213> 甘薯Ipomoea batatas（L.）Lam.

<400> 1

gaaaattccg gagagtaaag atcctaagca gttttatatc tctctaaaca cagtagatat 60

atatacacac acacatatat atagagagag atttcttaca gttaactaag agaacaacac 120

tatggctctc actggtcatc aattggcttt tgcttttggt gttcttggaa acatcatctc 180

attcatcgtc ttcctttctc cactgccaac attctaccag atgtacaaga agaaatcaac 240

ggaaggatat caatcaatcc cctatgtggt tgcactgttc agtgcaatgc tttggatata 300

ctatgcattc gtgaaggcca acgactccac tcttctcatt actatcaact cctttggtat 360

ctttattgag accatttacg ttgtcttttt cctctgctac tcaaccaaga aaaccaggat 420

ccaaactttg aagtttcttg gtctgttcgt ggcggggggc ttcggtgcaa ttcttcttgt 480

cactcagttt ctgttcaaaa gtccgatgcg actccacgtg gttggatgga tcgccctcgt 540

gttctcggtg tgtgtgtttg ttgcgccatt gttcatagtg agacaagtga tccgcaccaa 600

gagcgtggaa tgcatgccag tactcctctc ggtcttcctc accgtaaatg ctgtcatgtg 660

gttcttctac ggcttgttct taaaagacat gaacattgct cttccaaatg ttctgggctt 720

catcttcggg atcctccaga tcggtctcta cctgaagtac aaagacgcga agaaagacgc 780

agtgaaggag caaaagcttc cagaagtgac aacactgcca aaaccagtca taatcttgga 840

agacaataac gacactaacg acaacaacaa caacaagcgc agcagcaagc ttcctgaact 900

caccgaggaa caaatcatcg acatcgtcaa actcggaacc ctcgtgtgct ccgagaaaat 960

ccagaagagc gccgccgccg ccgcttcacc gttcgacaag aacgccgcca ctgctcctaa 1020

gcttcaggct gtgggagctt aattcaatac aagattatcc attgatacag catatgcatg 1080

cgctatatat ataaatatat atatgtatgt ggtgaatttt gctttgggtg gtttaattta 1140

gtttttgcta tggcattact ttactttgta aacgtacgct aattggaatt tggtataatt 1200

aatgtttaat gcatgaaggt taatctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1250

<210> 2

<211> 306

<212> PRT

<213> 甘薯Ipomoea batatas（L.）Lam.

<400> 2

Met Ala Leu Thr Gly His Gln Leu Ala Phe Ala Phe Gly Val Leu Gly

1 5 10 15

Asn Ile Ile Ser Phe Ile Val Phe Leu Ser Pro Leu Pro Thr Phe Tyr

20 25 30

Gln Met Tyr Lys Lys Lys Ser Thr Glu Gly Tyr Gln Ser Ile Pro Tyr

35 40 45

Val Val Ala Leu Phe Ser Ala Met Leu Trp Ile Tyr Tyr Ala Phe Val

50 55 60

Lys Ala Asn Asp Ser Thr Leu Leu Ile Thr Ile Asn Ser Phe Gly Ile

65 70 75 80

Phe Ile Glu Thr Ile Tyr Val Val Phe Phe Leu Cys Tyr Ser Thr Lys

85 90 95

Lys Thr Arg Ile Gln Thr Leu Lys Phe Leu Gly Leu Phe Val Ala Gly

100 105 110

Gly Phe Gly Ala Ile Leu Leu Val Thr Gln Phe Leu Phe Lys Ser Pro

115 120 125

Met Arg Leu His Val Val Gly Trp Ile Ala Leu Val Phe Ser Val Cys

130 135 140

Val Phe Val Ala Pro Leu Phe Ile Val Arg Gln Val Ile Arg Thr Lys

145 150 155 160

Ser Val Glu Cys Met Pro Val Leu Leu Ser Val Phe Leu Thr Val Asn

165 170 175

Ala Val Met Trp Phe Phe Tyr Gly Leu Phe Leu Lys Asp Met Asn Ile

180 185 190

Ala Leu Pro Asn Val Leu Gly Phe Ile Phe Gly Ile Leu Gln Ile Gly

195 200 205

Leu Tyr Leu Lys Tyr Lys Asp Ala Lys Lys Asp Ala Val Lys Glu Gln

210 215 220

Lys Leu Pro Glu Val Thr Thr Leu Pro Lys Pro Val Ile Ile Leu Glu

225 230 235 240

Asp Asn Asn Asp Thr Asn Asp Asn Asn Asn Asn Lys Arg Ser Ser Lys

245 250 255

Leu Pro Glu Leu Thr Glu Glu Gln Ile Ile Asp Ile Val Lys Leu Gly

260 265 270

Thr Leu Val Cys Ser Glu Lys Ile Gln Lys Ser Ala Ala Ala Ala Ala

275 280 285

Ser Pro Phe Asp Lys Asn Ala Ala Thr Ala Pro Lys Leu Gln Ala Val

290 295 300

Gly Ala

305

<210> 3

<211> 2037

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180

aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240

acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300

aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360

aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420

tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480

gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540

cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga 840

ctctagaatg gctctcactg gtcatcaatt ggcttttgct tttggtgttc ttggaaacat 900

catctcattc atcgtcttcc tttctccact gccaacattc taccagatgt acaagaagaa 960

atcaacggaa ggatatcaat caatccccta tgtggttgca ctgttcagtg caatgctttg 1020

gatatactat gcattcgtga aggccaacga ctccactctt ctcattacta tcaactcctt 1080

tggtatcttt attgagacca tttacgttgt ctttttcctc tgctactcaa ccaagaaaac 1140

caggatccaa actttgaagt ttcttggtct gttcgtggcg gggggcttcg gtgcaattct 1200

tcttgtcact cagtttctgt tcaaaagtcc gatgcgactc cacgtggttg gatggatcgc 1260

cctcgtgttc tcggtgtgtg tgtttgttgc gccattgttc atagtgagac aagtgatccg 1320

caccaagagc gtggaatgca tgccagtact cctctcggtc ttcctcaccg taaatgctgt 1380

catgtggttc ttctacggct tgttcttaaa agacatgaac attgctcttc caaatgttct 1440

gggcttcatc ttcgggatcc tccagatcgg tctctacctg aagtacaaag acgcgaagaa 1500

agacgcagtg aaggagcaaa agcttccaga agtgacaaca ctgccaaaac cagtcataat 1560

cttggaagac aataacgaca ctaacgacaa caacaacaac aagcgcagca gcaagcttcc 1620

tgaactcacc gaggaacaaa tcatcgacat cgtcaaactc ggaaccctcg tgtgctccga 1680

gaaaatccag aagagcgccg ccgccgccgc ttcaccgttc gacaagaacg ccgccactgc 1740

tcctaagctt caggctgtgg gagcttaaga gctcgaattt ccccgatcgt tcaaacattt 1800

ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 1860

ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 1920

gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 1980

tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagatc 2037

<210> 4

<211> 96

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

atggctctca ctggtcatca attggctttt gcttttggtg ttcttggaaa catcatctca 60

ttcatcgtct tcctttctcc actgccaaca ttctac 96

Claims

1.蛋白质IbSWEET10，其氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子。

3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下（a1）或（a2）所示的DNA分子：（a1）核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；

（a2）核苷酸序列是序列表中序列1自5’末端起第122至1042位所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物。

5.b1）或b2）：

b1）权利要求1所述蛋白质IbSWEET10，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，在增强植物抗病性中的应用；所述抗病性为抗蔓割病；所述植物为薯蓣科植物；

b2）权利要求1所述蛋白质，或，权利要求2或3所述核酸分子，或，含有权利要求2或3所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组微生物，在培育抗病性增强的转基因植物中的应用；所述抗病性为抗蔓割病；所述植物为薯蓣科植物。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述薯蓣科植物为甘薯。

7.一种培育转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述蛋白质IbSWEET10的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性增强；所述抗病性为抗蔓割病；所述植物为薯蓣科植物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述薯蓣科植物为甘薯。

9.如权利要求 7所述的方法，其特征在于：所述薯蓣科植物为甘薯品种栗子香。

10.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述蛋白质IbSWEET10的含量，从而增强植物的抗病性；所述抗病性为抗蔓割病；所述植物为薯蓣科植物。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述薯蓣科植物为甘薯。

12.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述薯蓣科植物为甘薯品种栗子香。