CN114525300A - 多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系 - Google Patents

Abstract

本发明提供多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系，该多核苷酸包含或由如下序列组成：1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；或2)SEQ ID NO：1所示序列的互补序列、简并序列或同源序列；或3)在严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列；4)所述序列1)‑3)中任一序列的cDNA序列或CDS序列；当该核苷酸的表达和/或活性被抑制，或者该核苷酸所表达的蛋白活性降低或失去活性时，含有该核苷酸的植物自交或与其他植物杂交即可产生单倍体后代。

Description

多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系

技术领域

本发明涉及生物育种领域，特别涉及多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系。

背景技术

马铃薯是世界上最重要的块茎作物，与其他主要作物不同，四倍体遗传和无性系繁殖的复杂性极大地阻碍了栽培马铃薯的遗传改良。为了获得具有足够的杂种优势和一致性的杂交种，具有高基因组纯合度的纯自交系至关重要。

自交衰退，是由于自交或近亲繁殖而出现的生活力下降、适应性减弱或经济性状退化的现象。原因是自交使群体内纯合体比率增加,显性度降低。马铃薯为了得到纯合自交系必须经历近交或者自交，但是其经过长期的无性繁殖积累了大量的有害突变，并且很难通过重组清除这些有害突变。自交衰退也是限制马铃薯培育优良种系的结构障碍之一。通过诱导植株产生单倍体，加倍获得纯合株系，已然成为快速获得自交系的方法之一。近年来在玉米、拟南芥和番茄等物种中已经实现通过诱导系诱导产生单倍体植株。

自交不亲和性和近交系的衰退使得开发纯自交系具有挑战性。马铃薯杂交育种仍处于早期阶段，迫切需要开发一种获得纯自交系的有效方法。与利用多代自交或回交的传统育种方法相比，双倍的单倍体生产可以使单交系的单倍体基因组在单代内固定。单倍体配子体可通过体外组织培养、体内诱导系杂交和种内杂交或CENH3着丝粒组蛋白诱导发育为双单倍体孢子体。在这些方法中，单倍体诱导(HI)触发是最有效的方法，但PLA1/MTL/NLD和DMP等HI基因仅在个别物种中证实可行，且由于物种间遗传背景的差异，导致这些物种之间诱导效率(HIR)的差异显著。目前，尚无证据证明这些HI基因在各个物种间均可通用，特别是在难以转化的基因型中。

目前，部分四倍体马铃薯可以被诱导成单倍体(二倍体水平)。然而，二倍体马铃薯是否能被诱导成单倍体(一倍体水平)尚未见报道。

发明内容

鉴于此，本申请提供了一种多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系。该核苷酸与马铃薯形成单倍体有关。当该核苷酸的表达和/或活性被抑制，或者该核苷酸所表达的蛋白活性受到影响时，例如活性降低或失去活性，含有该核苷酸的植物自交或与其他植物杂交即可产生单倍体后代。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

本发明一方面提供一种多核苷酸在马铃薯单倍体诱导中的应用，该多核苷酸为如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，即StDMP基因序列；

2)SEQ ID NO：1所示序列的互补序列、简并序列或同源序列，其中所述同源序列为与SEQ ID No.1所示的核苷酸具有75％或以上、76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上同一性的多核苷酸；

3)在严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列；

4)所述序列1)-3)中任一序列的cDNA序列或CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述CDS序列如SEQ ID NO：3所示。

本发明另一方面提供一种蛋白质在马铃薯单倍体诱导中的应用，该蛋白质为如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：2所示的蛋白质，即所述StDMP基因序列所表达的氨基酸序列；

2)SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

3)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

4)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中所述75％以上的同源性为76％或以上、77％或以上、78％或以上、79％或以上、80％或以上、81％或以上、82％或以上、83％或以上、84％或以上、85％或以上、86％或以上、87％或以上、88％或以上、89％或以上、90％或以上、91％或以上、92％或以上、93％或以上、94％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上、99％或以上、99.1或以上、99.2或以上、99.3％或以上、99.4％或以上、99.5％或以上、99.6％或以上、99.7％或以上、99.8％或以上、或99.9％或以上。

本发明另一方面提供一种马铃薯单倍体诱导系，该单倍体诱导系通过基因的插入、取代和/或缺失的突变方式使上述多核苷酸或蛋白质的表达和/或活性降低。

作为优选，突变方式为CRISPR/Cas9、TELLEN技术、T-DNA插入、EMS诱变、ZFN技术中的一种。

在本发明的一个具体实施方式中，所述突变方式为CRISPR/Cas9技术。

在本发明的一个具体实施方式中，所述StDMP基因被敲除。

本发明中的一个具体实施方式中，马铃薯单倍体诱导系基因组中的StDMP基因的表达和/或活性降低。

在本发明的一个具体实施方式中，所述StDMP基因不表达。

在本发明的一个具体实施方式中，相较于发现StDMP基因时，其表达量降低。

在本发明的一个具体实施方式中，所述StDMP基因的活性降低。

在本发明的一个具体实施方式中，所述StDMP基因所表达的蛋白活性降低。

在本发明的一个具体实施方式中，所述StDMP基因所表达的蛋白丧失了该蛋白原有的生物学活性，从而使所述单倍体诱导系自交或与其杂交的后代中基因组减半形成单倍体。

在本发明的一个具体实施方式中，所述单倍体诱导系作为父本。

本发明还应当包括利用RNAi干扰、过表达或者启动子编辑等其他现有技术手段而使得StDMP基因的表达和/或活性降低，甚至丧失。

本发明另一方面提供了一种单倍体诱导系的制备方法，其包括如下步骤：将含有StDMP基因的生物材料中的StDMP基因的表达和/或活性降低，优选地，所述StDMP基因不表达，或所述StDMP基因所表达的蛋白无活性。

本发明另一方面提供上述单倍体诱导系在马铃薯单倍体育种或杂交育种中的应用。

本发明另一方面提供一种基因敲除盒，其为敲除上述多核苷酸的敲除盒。

本发明另一方面提供一种敲除载体，其为敲除上述多核苷酸的敲除载体。

本发明另一方面提供一种重组微生物，其为敲除上述多核苷酸的重组载体。

本发明另一方面提供一种转基因植物细胞系，其为敲除上述多核苷酸的转基因植物细胞系。

本发明另一方面提供一种马铃薯植物，其为如下植物之一：

1)上述转基因植物细胞系生长形成的植物；

2)所述1)中的植物自交所形成的后代，以及所述后代生长形成的植物；

3)所述1)中的植物与其它品种杂交所形成的后代，以及所述后代生长形成的植物。

本发明还提供了一种马铃薯单倍体植物的制备方法，包括如下步骤：

1)以上述敲除StDMP基因的转基因植物为父本，将其自交或与其它品种杂交，得到种子；

2)所述种子经1～5mg/mL赤霉素处理24～72小时后，消毒，播种在1/2MS培养基中，得到种苗；

3)对种苗进行单倍体鉴别，得到单倍体植物。

在本发明具体实施例中，赤霉素处理的浓度为2mg/mL，时间为48小时。

在本发明中，单倍体鉴别的方法包括荧光标记鉴别技术、分子标记鉴别技术、成熟植株表型鉴别技术、流式细胞检测叶片鉴别技术中的一种或几种。

本发明还提供了一种马铃薯纯合二倍体植物的制备方法，包括如下步骤：利用上述筛选方法获得单倍体植物，取单倍体植物的顶端嫩芽，采用0.35％～0.55％秋水仙素进行染色体加倍处理至少2天，得到纯合二倍体植物。

在本发明具体实施例中，秋水仙素处理的浓度为0.4％～0.5％，时间为至少3天。

示例性的，本发明至少具有以下优势之一：

一方面，本发明所提供的多核苷酸与马铃薯形成单倍体有关。当该核苷酸的表达和/或活性被抑制，或者该核苷酸所表达的蛋白活性降低或失去活性时，含有该核苷酸的植物自交或与其他植物杂交即可产生单倍体后代。因此，含有该多核苷酸的植物可以用于马铃薯的杂交育种或单倍体育种。

另一方面，由于马铃薯本身存在大量的有害突变位点，在形成单倍体的过程中这些位点从隐性转为显性导致植株发育不良甚至致死，经过荧光初筛后的弱(无)荧光种子的发芽率只有6％。本发明利用赤霉素处理48h后播在1/2MS培养基中，将它的发芽率从6％提升至40％，显著提高了马铃薯单倍体的制备效率，为二倍体马铃薯植物的单倍体制备提供了切实有效的方法，具有实际应用和操作价值。

此外，本发明提供的马铃薯纯合二倍体的制备方法，整个诱导获得单倍体的时间大概半年左右，从单倍体加倍到二倍体只需要一个月左右的时间，相比较通过五六年的自交回交获得纯合的株系，本发明提供的方法节省了大量的时间、人力和物力。诱导产生的单倍体和加倍后的二倍体，也会成为马铃薯基础研究重要材料。

无论是实际生产还是基础研究，本发明均具有重要作用和应用价值。

附图说明

图1示马铃薯StDMP基因双等位突变株系基因型；突变株系的两套染色体和野生型相比均发生缺失突变，为功能缺失型突变体；

图2示马铃薯单倍体种子荧光筛选结果；二倍体种子中胚和胚乳中均有红色荧光，单倍体种子胚中无荧光、胚乳中有弱荧光；比例尺＝1mm；

图3示马铃薯单倍体植株分子标记鉴定结果；I为转基因马铃薯植株亲本材料，II为杂交马铃薯B材料(PG6359，国际马铃薯中心原始编号CIP705468)，III为StDMP基因双等位突变株系，IV和V为StDMP基因双等位突变株系和马铃薯B材料杂交后诱导产生的单倍体，VI和VII为StDMP基因双等位突变株系和马铃薯B材料杂交后的二倍体；单倍体材料只可以扩增出母本马铃薯B材料的基因型；

图4示马铃薯单倍体植株表型鉴定结果；与二倍体植株相比，单倍体植株具有植株矮小，叶片较窄，株型紧凑等特征；比例尺＝1cm；

图5示马铃薯单倍体植株流式细胞仪鉴定结果；将二倍体细胞核信号峰位设为50，由于细胞内可能存在正在复制的细胞，所以二倍体细胞核信号峰位会出现在50和100附近，单倍体细胞核信号峰位则会在25和50附近出现。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

说明：本申请中StDMP基因是Soltu.DM.05G005100.1基因的简称。

StDMP或StDMP表示基因或蛋白可根据上下文确定。

实施例1利用CRISPR/Cas9系统敲除StDMP基因

利用CRISPR/Cas9系统敲除马铃薯中的StDMP基因，获得StDMP基因敲除的马铃薯突变体。具体步骤如下：

步骤1、sgRNA序列的选择

在StDMP基因上设计靶位点序列，长度为20bp。

靶位点位于序列1(基因组序列)的第4-23位，位于序列3(CDS序列)的第4-23位，靶位点1序列为GAGCAAACTAGTGAAGGAAT(序列4)。

靶位点设计sgRNA序列为：

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(序列5)

该sgRNA的编码DNA分子为：

GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC(序列6)。

步骤2、CRISPR/Cas9载体的构建

原始载体包含sgRNA序列，进一步将步骤1中的靶位点1序列插入载体，得到CRISPR/Cas9载体。

步骤3、转基因植株的获得

将步骤2获得的CRISPR/Cas9载体通过热激转化转至农杆菌感受态细胞EHA105(农杆菌EHA105感受态细胞购自上海唯第生物技术有限公司，公众可通过购买获得)，得到重组菌EHA105/CRISPR/Cas9。

再将重组菌EHA105/CRISPR/Cas9采用农杆菌侵染马铃薯的转化方法(重组农杆菌进行28℃扩繁，扩繁后的菌液用于马铃薯侵染)，经过卡那抗性筛选后获得T₀代转基因马铃薯植株。

实施例2 StDMP基因发生突变的转基因植株鉴定

采集实施例1中步骤3获得的T₀代转基因马铃薯植株叶片，并提取基因组DNA作为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，得到不同株系的PCR扩增产物。

StDMP突变序列检测引物的序列如下：

StDMP-test-F:AGAAGATTCAAAACATTTGTAAGTGCATTT(序列7)

StDMP-test-R:ACAACTGTCACGATTTATGGTGAAA(序列8)

将不同株系的PCR扩增产物进行Sanger测序，根据测序结果与野生型的StDMP基因进行比对。根据以下原则分别对StDMP基因型进行鉴定。

自靶位点序列起具有双峰特征的序列，则该株系的基因型为杂合基因型(2条同源染色体中的1条染色体上的StDMP基因突变，且另1条染色体上的StDMP基因未突变)，该株系为T₀代转基因马铃薯杂合突变型株系；

自靶位点序列起具有双峰特征的序列，且2条同源染色体中StDMP基因均发生突变，则该株系为T₀代转基因马铃薯双等位突变株系。

自靶位点序列起具有特异单峰特征的序列，若与野生型马铃薯的StDMP基因序列相同，则该株系的基因型为野生型，即StDMP基因序列没有发生突变；若与野生型马铃薯的StDMP基因的序列不同，则该株系的基因型为纯合基因型(2条同源染色体上的StDMP基因均发生突变)，该株系为T₀代转基因马铃薯纯合突变型株系。

本案例鉴定到T₀代StDMP基因双等位突变株系(如图1所示)，用于下述单倍体诱导能力分析实验。

实施例3 StDMP基因敲除的马铃薯突变体在诱导产生单倍体中的应用

将实施例2中所获得T₀代StDMP基因双等位突变株系分别与马铃薯B材料(PG6359，国际马铃薯中心原始编号CIP705468)进行杂交获得后代，通过如下方法对后代中的单倍体进行鉴别。

步骤1、荧光标记鉴别

CRISPR/Cas9载体上携带启动子OLEO1驱动TagRFP(Entacmaea quadricolor)的表达元件。由于启动子OLEO1在成熟的种子胚中特异表达，可通过荧光灯对TagRFP的荧光信号进行观察。因此，用携带该表达元件的突变体作为父本，与其它不携带荧光的母本材料杂交，所得到的种子中，二倍体种子的胚由于具有父本的基因组而表现出红色荧光，而单倍体种子的胚由于来源于母本而表现为无荧光(图2)。

步骤2、单倍体种子萌发

将上述步骤1鉴定出来的弱(无)荧光种子，经过2mg/mL赤霉素浸泡处理48h后，8％的次氯酸钠消毒后铺在1/2MS培养基中。

由于单倍体诱导系在诱导单倍体的过程中，与卵细胞结合的精子的基因组会全部消失，与中央细胞融合的精子的基因组会保留，所以单倍体的种子萌发后根中并无荧光，而只在胚乳中有荧光。

一周后，种子开始陆续萌发，发芽率达40％，筛选出根无荧光，胚乳有荧光的植株，即为单倍体植株。

步骤3、分子标记鉴别

将上述步骤2鉴定出的根无荧光、胚乳有荧光的植株，提取其基因组DNA，采用母本材料和转基因突变株系间多态性引物A+B进行PCR扩增，并将扩增产物进行琼脂糖带型检测。

在本实施例中，使用的引物序列为A：CGTGGGAAGAACGTCGTG；B：CATGAGTCATATGGGGTGGA，若待测单株的扩增产物的大小为117bp，表现为1条带，认为该单株条带为母本带型，不存在父本材料的带型，则该单株是母本单倍体。若待测单株的扩增产物的大小为117bp和175bp，表现为2条带，认为该单株条带为母本和转基因突变株系杂合带型，则该单株是正常杂交的后代，是二倍体。

如图3所示，I为转基因马铃薯植株亲本材料，II为杂交马铃薯B材料(母本)，III为StDMP基因双等位突变株系(父本)，IV和V为StDMP基因双等位突变株系和马铃薯B材料杂交后诱导产生的单倍体，其只可以扩增出母本马铃薯B材料的基因型，扩增产物的大小为117bp，表现为1条带。VI和VII为StDMP基因双等位突变株系和马铃薯B材料杂交后的二倍体，扩增产物的大小为117bp和175bp，表现为2条带。

步骤4、成熟植株表型鉴别

将上述步骤1鉴定出的弱(无)荧光的种子进一步种植，观察后代单株表型，单倍体具有植株矮小，叶片较窄，株型紧凑等特征，二倍体则表现为植株高大，叶片宽大(图4)。

步骤5、流式细胞检测叶片鉴别

将上述步骤中获得的表现为单倍体性状植株进行流式细胞检测，具体方法如下：提取待测植株幼嫩叶片的细胞核，以二倍体马铃薯叶片作为对照；再用流式细胞仪器检测信号，首先检测二倍体细胞核信号，并将二倍体细胞核信号峰位设为50，由于细胞内可能存在正在复制的细胞，所以二倍体细胞核信号峰位会出现在50和100附近。二倍体细胞的遗传物质是单倍体细胞的两倍，因此，单倍体细胞核信号峰位会在25和50附近出现。若待测植株细胞核信号峰出现在25和50附近，则认为该待测植株为单倍体植株。若待测植株的信号峰出现在50和100附近，则认为其与二倍体细胞核信号强度富集位置相同，该待测植株为二倍体(图5)。

统计上述鉴定结果可以看出，马铃薯StDMP基因突变后与其他材料杂交，在后代中可获得母本单倍体。

步骤6、通过秋水仙素加倍获得纯合二倍体

将获得的马铃薯单倍体，取顶端的嫩芽，移栽至秋水仙素(0.3％、0.4％、0.5％和0.6％)的MS培养中，三天后转移至正常MS培养基中。经过一段时间的培养发现在0.6％的秋水仙素浓度培养基培养过的顶芽出现死亡，其他浓度的发育正常。经过倍性的检测发现在0.3％和0.5％的秋水仙素浓度下没有发生加倍，在0.4％的秋水仙素浓度下发生加倍，加倍效率达5％。随后尝试将顶芽一直放在0.4％和0.5％的秋水仙素MS培养基中培养，发现顶芽可以正常发育。并且在0.4％浓度的秋水仙素培养基中7个顶芽有2株发生了加倍，加倍效率28.6％；0.5％浓度的秋水仙素培养基中4个顶芽有1个发生了加倍，加倍率25％，其余顶芽均未加倍。这些检测出的二倍体植株为纯合的二倍体马铃薯。

上述实施例中的序列1-序列3如下：

序列1：

ATGGAGCAAACTAGTGAAGGAATTGGAATAAAAATGTACAGTACATCGAAACGCGTCGATAATTCATCTTCTATGTATCCTACTAATTTACCACAAGATGATACAATCCCAGAATTATCTCAACCTGCATTACCAATTGGTGGGAAAAAAAGAAGAGCAATGGCAAATGGTGTACAAAAAACACTTTCAAAAACTTCATTACTTGTTAATTTTCTACCAACAGGCACACTTTTAACATTTGAAATGTTACTTCCATCAGTATTTGGTAAAGGAGATTGTTCACCAATTACTACATTTATGATTTTAACATTACTTGGACTTTGTACTTTGTCATGTTTTTTCTTCCATTTTACCGATAGTTTTCGAGGTCCTGATGGCAAAGTTTACTATGGTTTTGTTACACCAAGAGGTTTGAAAGTTTTCAAGACTGGACTTGGTGTTGATGTGCCAAAAGATGAAAGGTAATTTTTTATGTTGGTAATCGCCCTTAGCCACGAACACTATTTTCTATAAAAAAGAGAAAAATAGAGATTTGTGATAGGAATATTTTTGACTAAAGAGTTTCATACATATATGATTGTGACAAAAGATGAAAGGTAACTTTTAGGGATGGTTTTTGTAATATTTGTGTGTGTGAGAGACGTACATCGCCCTTGGCTATGAACACTATTTTTCTATGAGAAAAGAGAAAAATATTAATTTGTGATGGAATGAATATTTTTTACTAGAGAGTTTTCATTTATGTAAATTTTATGATTGTGACAAAAGATAGAAAGGTAACTTTTTAGTGATGATTTTTTCAATGTTTATGTGTGTGAGATGTAAATTCGCCCTTGGCTATGAACACTATTTTCTATGAGAAAAGAGAAAATATACAGATTTGTGATGGAATATTTTTGACTAAAGATTTTCATCCACATAATTATAAAAAATTTATGATTGTGACAAAAGGTTTTCCGTCACAAAAATTGTGTGTTTTTTTTAAAAATATAGTTATTTGCTTAAAGTCATTGTTTCACCATAAAAGATGACAGTTTTTAGATAAATTATCAATTTCACCCCTCAAAATCATTGTTTCACCATAAATCGTGACAGTTGTATAGCAAAATCTTCAATATTGTGGACGAAATTTGCAATGCTTTCTTTATTACTAATATTGTGTTTTTTCCCCCTTAATTTAGTGTGTTGACATCATTACCTTTTTGTTGGTTGGTTGTACTAGGTACATTGTGGGATTGACAGATTTTGTACATGCAATGATGTCTGTTTTGGTGTTTGTGGCAATTGCATTTTCTGATCATAGAGTGACACTTTGTCTATTTCCTGGACATGCTAAAGAACTTGATGAAATTATGAGGAGTTTTCCATTAATGGTTGGAGTTATTTGTAGTGGACTTTTTCTTGTTTTTCCTAATTCTAGATATGGTGTTGGATGTATGTCTGCTTAGCTATTTTTATTTTATTCTACACTAGACTACATTTCTTTTCTAGTTTTATACTGTTTCATATATATTGTAATTTAAGTTGGTCGATATTTATTTAAAATTATCTATATGATATATTGTTTTCTTTTCTTTTTCAAATTTATATTTCAAAATTTAAATATATTGGTATTTTGCTAGCTGTTCTAAATATGTCCCATATCCCTCCTATTTATTGCACAAAAATAACAGCTATAACTAAATATTTATATTGCTTGGACTTTTTAAATATATCACGTGGAGTATTTCAAATTTTCAATAATACCCCCTCTATTCCAAATGTAATTGTCCTTTTCAAGAGTCGTGAATTTTCCTAATTTTCAAAACTAAATTTAATTAGATAAGATAACTATGTACAAGTTACAACCTCTGCCACACACATCAATAAATCTATCACTTCAACCAGATAAGGTAACTACTTAAAATTTGTACATCCAAATCTCTACACATTTCAAAATTGCCACTATCCAGCTGTAATCTTCTTTGTATCGTTCCAATTAAGTACGTACTTAATCATATGGCTATGTTAGTCCCAAAAATTATGTTGAATTCTGGTCATGAAATGCCTCTAATAGGCATGGGAACAGCACCAACGGCACCAACATTACCACCAATTGACCAATTAGTCTCCATTTTTATCGATGCTATCGAAGCTGGTTATCGACACTTTGACACCGCTGCGGCCTATGGCTCCGAGGAAGCACTAGGTCGAGCCGTGGCTGACGCGATACAACGCGGACTCATAGAGAGCCGTGAAGATGTTTTTATTACATCTAAGTTATGGTGCACCGAAACACATCATGACCTTGTTCTTCCTGCTCTCAAAAGATCTCTCGCGTAAGTTTGCTCATACTATTGATTTTAAATTCGAATAAAATAAAAAGTTGTGATAGATTAACATCTTATACATGTTTCTACGGGGTGGGGGTTTGGTTCAACCCCTACCATGTAGTAATATATATATATAAGCAAAAAATTCACTTTAATTAGAGGGACATGGATCTTGTCTATAATCTACAAAAATATTGTCATTGGCTCATAGCAATTTATATGTGGTAATATTCCCAACTTCATTTATGTGATTGTATTTCCTTTTAAGTCCATTCTAGATAGAATGACTATTTTCTAATTTTGATAATAATATAATTTTGACTTTCTCCTTTTTTCCATAATGACATATTTGTATAATCACACAAATATTATACAATATATTTAATATCACATATTTCAAAAATTTTATCGTCATATAAATGTTATGATACGTTTAAGATTACGAATTTTATAAGTCTTGATTTCTTTTTAAAACTTTGCATCTGATCAAAATACACTACATAAATTGAAATTACTATATAATTATTGTTGTTATTGGTACAAACACAATACATGCATCAAATTATTATACTTCATATATTTTGTCATCAATTTCATATATTAATCATGAATGTAAAGATATCTCATCCTCTTTCAGATTTCACATAATGTGGAACTATCCTTGTTGTTGTAATCATGAATGTCATAAAATGTTTTGTAGGAGATTAGGGATGGATTACTTGGACTTGTACCATATACATTGGCCAGTGAGGATGAAGAATGGTAGTGACCAAGGTATAAAGTTGGTAAATGAGGATGTAATTCCATTTGACATGAAAGGAACATGGGAAGCTATGGAAGAATGTCACAAATTAGGTTTGGCCAAATCTATTGGTGTATGCAACTTTAGTTGCACAAAACTCTCTCAACTCCTAACTCATGCTACCATTCCTCCTGCTGTAAATCAGGTAAATATAACATACTATACCCTTAGCGATATTTAATTGGGAACGAAATTTAAGAAATTTAAAGCTATAGATATTTATGGCTATAAATCATTTCGTTAATAATAACATGAATTAATTTAAAATTTAGTTTATGATCAAGAAATGATAACATTCTTTTTGTATAGACTAGAGAGGAAAGTACGACATTCTAGTATAGAATCTTTAAATCTTTTGAAATAAGATTTACTTATTTAAAAATTACATAAAAAATATATTATAAAATGCAATAATTGACAGGTGGAAATGCATGTAGCATGGAGACAAGAGAAGATGTTAGCATTTTGTAAAGAGAAAGGAATACATGTAAGTGCATGGTCTCCTCTTGGAGCAAATGGAATACCTTTTTGGGGCAATCATGCTGTTATGCAAAACTCTGTTCTAAAAGACATTGCCTTTCATAGACAAAAGAGCATTCCACAGGTACCAATAAATAATTAAATTATTCACTCAGTGTTCACACTAAATTATATTAGTATATTAACGTTTAATATATCAATAACTTTTTAAATTTGCTCTCAAATTCTATTTTGACACTTGAAGTAAGACTTGTTTCAATTGAACATCTGAACTCATGATAAATTTTTTTTTATTAGTAATCATTAGACACTTTCAGTTCAAATTTTGAAGAAAAAAGATATCTACTAGATAGTTAAGTTAACTCCATAAAATATGACATCTCCTTTAAGTATGCGATTAGCCTCAATTGAGGTTTTACGACTTATTAAGGCAAATACATTTAATCAGAGGAGGTAGCATGTTTTAAGTGTGACGTTTGAGAACACACGCTAAAAGTTTTTCAAAATTTGAACCGTAAGTCTCTAATAAAACGCTTTACTATGTGTTTTAAGTGATTAGAATAAATATTAGTTCGAACATCCAAATAAAATTGCTCACAAGGATAGTAATTGTTTGATATTTGTAGGTGGCATTGAGATGGGTATATGAGCAAGGTGTTAGTGTATTAGTGAAGAGTTTTAACAAAGATAGAATGAAAGAGAATCTTCAAATTTTGGATTGGGAATTAAGCAATGAAGAAAATGCTAAGATTCAAGAGATTCCTCAATGCAGGGGATTCAAAGGTGAACTTTTTGTTCATCCAGATGGACCATACAAATCCCCAGATGAATTCTGGGATGGTGAACTATAA

序列2：

Met Glu Gln Thr Ser Glu Gly Ile Gly Ile Lys Met Tyr Ser Thr Ser LysArg Val Asp Asn Ser Ser Ser Met Tyr Pro Thr Asn Leu Pro Gln Asp Asp Thr IlePro Glu Leu Ser Gln Pro Ala Leu Pro Ile Gly Gly Lys Lys Arg Arg Ala Met AlaAsn Gly Val Gln Lys Thr Leu Ser Lys Thr Ser Leu Leu Val Asn Phe Leu Pro ThrGly Thr Leu Leu Thr Phe Glu Met Leu Leu Pro Ser Val Phe Gly Lys Gly Asp CysSer Pro Ile Thr Thr Phe Met Ile Leu Thr Leu Leu Gly Leu Cys Thr Leu Ser CysPhe Phe Phe His Phe Thr Asp Ser Phe Arg Gly Pro Asp Gly Lys Val Tyr Tyr GlyPhe Val Thr Pro Arg Gly Leu Lys Val Phe Lys Thr Gly Leu Gly Val Asp Val ProLys Asp Glu Arg Tyr Ile Val Gly Leu Thr Asp Phe Val His Ala Met Met Ser ValLeu Val Phe Val Ala Ile Ala Phe Ser Asp His Arg Val Thr Leu Cys Leu Phe ProGly His Ala Lys Glu Leu Asp Glu Ile Met Arg Ser Phe Pro Leu Met Val Gly ValIle Cys Ser Gly Leu Phe Leu Val Phe Pro Asn Ser Arg Tyr Gly Val Gly Cys MetGly Thr Ala Pro Thr Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ile Asp Gln Leu Val Ser Ile PheIle Asp Ala Ile Glu Ala Gly Tyr Arg His Phe Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Gly SerGlu Glu Ala Leu Gly Arg Ala Val Ala Asp Ala Ile Gln Arg Gly Leu Ile Glu SerArg Glu Asp Val Phe Ile Thr Ser Lys Leu Trp Cys Thr Glu Thr His His Asp LeuVal Leu Pro Ala Leu Lys Arg Ser Leu Ala Arg Leu Gly Met Asp Tyr Leu Asp LeuTyr His Ile His Trp Pro Val Arg Met Lys Asn Gly Ser Asp Gln Gly Ile Lys LeuVal Asn Glu Asp Val Ile Pro Phe Asp Met Lys Gly Thr Trp Glu Ala Met Glu GluCys His Lys Leu Gly Leu Ala Lys Ser Ile Gly Val Cys Asn Phe Ser Cys Thr LysLeu Ser Gln Leu Leu Thr His Ala Thr Ile Pro Pro Ala Val Asn Gln Val Glu MetHis Val Ala Trp Arg Gln Glu Lys Met Leu Ala Phe Cys Lys Glu Lys Gly Ile HisVal Ser Ala Trp Ser Pro Leu Gly Ala Asn Gly Ile Pro Phe Trp Gly Asn His AlaVal Met Gln Asn Ser Val Leu Lys Asp Ile Ala Phe His Arg Gln Lys Ser Ile ProGln Val Ala Leu Arg Trp Val Tyr Glu Gln Gly Val Ser Val Leu Val Lys Ser PheAsn Lys Asp Arg Met Lys Glu Asn Leu Gln Ile Leu Asp Trp Glu Leu Ser Asn GluGlu Asn Ala Lys Ile Gln Glu Ile Pro Gln Cys Arg Gly Phe Lys Gly Glu Leu PheVal His Pro Asp Gly Pro Tyr Lys Ser Pro Asp Glu Phe Trp Asp Gly Glu Leu

序列3：

ATGGAGCAAACTAGTGAAGGAATTGGAATAAAAATGTACAGTACATCGAAACGCGTCGATAATTCATCTTCTATGTATCCTACTAATTTACCACAAGATGATACAATCCCAGAATTATCTCAACCTGCATTACCAATTGGTGGGAAAAAAAGAAGAGCAATGGCAAATGGTGTACAAAAAACACTTTCAAAAACTTCATTACTTGTTAATTTTCTACCAACAGGCACACTTTTAACATTTGAAATGTTACTTCCATCAGTATTTGGTAAAGGAGATTGTTCACCAATTACTACATTTATGATTTTAACATTACTTGGACTTTGTACTTTGTCATGTTTTTTCTTCCATTTTACCGATAGTTTTCGAGGTCCTGATGGCAAAGTTTACTATGGTTTTGTTACACCAAGAGGTTTGAAAGTTTTCAAGACTGGACTTGGTGTTGATGTGCCAAAAGATGAAAGGTACATTGTGGGATTGACAGATTTTGTACATGCAATGATGTCTGTTTTGGTGTTTGTGGCAATTGCATTTTCTGATCATAGAGTGACACTTTGTCTATTTCCTGGACATGCTAAAGAACTTGATGAAATTATGAGGAGTTTTCCATTAATGGTTGGAGTTATTTGTAGTGGACTTTTTCTTGTTTTTCCTAATTCTAGATATGGTGTTGGATGCATGGGAACAGCACCAACGGCACCAACATTACCACCAATTGACCAATTAGTCTCCATTTTTATCGATGCTATCGAAGCTGGTTATCGACACTTTGACACCGCTGCGGCCTATGGCTCCGAGGAAGCACTAGGTCGAGCCGTGGCTGACGCGATACAACGCGGACTCATAGAGAGCCGTGAAGATGTTTTTATTACATCTAAGTTATGGTGCACCGAAACACATCATGACCTTGTTCTTCCTGCTCTCAAAAGATCTCTCGCGAGATTAGGGATGGATTACTTGGACTTGTACCATATACATTGGCCAGTGAGGATGAAGAATGGTAGTGACCAAGGTATAAAGTTGGTAAATGAGGATGTAATTCCATTTGACATGAAAGGAACATGGGAAGCTATGGAAGAATGTCACAAATTAGGTTTGGCCAAATCTATTGGTGTATGCAACTTTAGTTGCACAAAACTCTCTCAACTCCTAACTCATGCTACCATTCCTCCTGCTGTAAATCAGGTGGAAATGCATGTAGCATGGAGACAAGAGAAGATGTTAGCATTTTGTAAAGAGAAAGGAATACATGTAAGTGCATGGTCTCCTCTTGGAGCAAATGGAATACCTTTTTGGGGCAATCATGCTGTTATGCAAAACTCTGTTCTAAAAGACATTGCCTTTCATAGACAAAAGAGCATTCCACAGGTGGCATTGAGATGGGTATATGAGCAAGGTGTTAGTGTATTAGTGAAGAGTTTTAACAAAGATAGAATGAAAGAGAATCTTCAAATTTTGGATTGGGAATTAAGCAATGAAGAAAATGCTAAGATTCAAGAGATTCCTCAATGCAGGGGATTCAAAGGTGAACTTTTTGTTCATCCAGATGGACCATACAAATCCCCAGATGAATTCTGGGATGGTGAACTATAA

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院深圳农业基因组研究所

中国农业大学

中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 多核苷酸和蛋白质的应用及其单倍体诱导系

<130> 21-13620CN

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagcaaa ctagtgaagg aattggaata aaaatgtaca gtacatcgaa acgcgtcgat 60

aattcatctt ctatgtatcc tactaattta ccacaagatg atacaatccc agaattatct 120

caacctgcat taccaattgg tgggaaaaaa agaagagcaa tggcaaatgg tgtacaaaaa 180

acactttcaa aaacttcatt acttgttaat tttctaccaa caggcacact tttaacattt 240

gaaatgttac ttccatcagt atttggtaaa ggagattgtt caccaattac tacatttatg 300

attttaacat tacttggact ttgtactttg tcatgttttt tcttccattt taccgatagt 360

tttcgaggtc ctgatggcaa agtttactat ggttttgtta caccaagagg tttgaaagtt 420

ttcaagactg gacttggtgt tgatgtgcca aaagatgaaa ggtaattttt tatgttggta 480

atcgccctta gccacgaaca ctattttcta taaaaaagag aaaaatagag atttgtgata 540

ggaatatttt tgactaaaga gtttcataca tatatgattg tgacaaaaga tgaaaggtaa 600

cttttaggga tggtttttgt aatatttgtg tgtgtgagag acgtacatcg cccttggcta 660

tgaacactat ttttctatga gaaaagagaa aaatattaat ttgtgatgga atgaatattt 720

tttactagag agttttcatt tatgtaaatt ttatgattgt gacaaaagat agaaaggtaa 780

ctttttagtg atgatttttt caatgtttat gtgtgtgaga tgtaaattcg cccttggcta 840

tgaacactat tttctatgag aaaagagaaa atatacagat ttgtgatgga atatttttga 900

ctaaagattt tcatccacat aattataaaa aatttatgat tgtgacaaaa ggttttccgt 960

cacaaaaatt gtgtgttttt tttaaaaata tagttatttg cttaaagtca ttgtttcacc 1020

ataaaagatg acagttttta gataaattat caatttcacc cctcaaaatc attgtttcac 1080

cataaatcgt gacagttgta tagcaaaatc ttcaatattg tggacgaaat ttgcaatgct 1140

ttctttatta ctaatattgt gttttttccc ccttaattta gtgtgttgac atcattacct 1200

ttttgttggt tggttgtact aggtacattg tgggattgac agattttgta catgcaatga 1260

tgtctgtttt ggtgtttgtg gcaattgcat tttctgatca tagagtgaca ctttgtctat 1320

ttcctggaca tgctaaagaa cttgatgaaa ttatgaggag ttttccatta atggttggag 1380

ttatttgtag tggacttttt cttgtttttc ctaattctag atatggtgtt ggatgtatgt 1440

ctgcttagct atttttattt tattctacac tagactacat ttcttttcta gttttatact 1500

gtttcatata tattgtaatt taagttggtc gatatttatt taaaattatc tatatgatat 1560

attgttttct tttctttttc aaatttatat ttcaaaattt aaatatattg gtattttgct 1620

agctgttcta aatatgtccc atatccctcc tatttattgc acaaaaataa cagctataac 1680

taaatattta tattgcttgg actttttaaa tatatcacgt ggagtatttc aaattttcaa 1740

taataccccc tctattccaa atgtaattgt ccttttcaag agtcgtgaat tttcctaatt 1800

ttcaaaacta aatttaatta gataagataa ctatgtacaa gttacaacct ctgccacaca 1860

catcaataaa tctatcactt caaccagata aggtaactac ttaaaatttg tacatccaaa 1920

tctctacaca tttcaaaatt gccactatcc agctgtaatc ttctttgtat cgttccaatt 1980

aagtacgtac ttaatcatat ggctatgtta gtcccaaaaa ttatgttgaa ttctggtcat 2040

gaaatgcctc taataggcat gggaacagca ccaacggcac caacattacc accaattgac 2100

caattagtct ccatttttat cgatgctatc gaagctggtt atcgacactt tgacaccgct 2160

gcggcctatg gctccgagga agcactaggt cgagccgtgg ctgacgcgat acaacgcgga 2220

ctcatagaga gccgtgaaga tgtttttatt acatctaagt tatggtgcac cgaaacacat 2280

catgaccttg ttcttcctgc tctcaaaaga tctctcgcgt aagtttgctc atactattga 2340

ttttaaattc gaataaaata aaaagttgtg atagattaac atcttataca tgtttctacg 2400

gggtgggggt ttggttcaac ccctaccatg tagtaatata tatatataag caaaaaattc 2460

actttaatta gagggacatg gatcttgtct ataatctaca aaaatattgt cattggctca 2520

tagcaattta tatgtggtaa tattcccaac ttcatttatg tgattgtatt tccttttaag 2580

tccattctag atagaatgac tattttctaa ttttgataat aatataattt tgactttctc 2640

cttttttcca taatgacata tttgtataat cacacaaata ttatacaata tatttaatat 2700

cacatatttc aaaaatttta tcgtcatata aatgttatga tacgtttaag attacgaatt 2760

ttataagtct tgatttcttt ttaaaacttt gcatctgatc aaaatacact acataaattg 2820

aaattactat ataattattg ttgttattgg tacaaacaca atacatgcat caaattatta 2880

tacttcatat attttgtcat caatttcata tattaatcat gaatgtaaag atatctcatc 2940

ctctttcaga tttcacataa tgtggaacta tccttgttgt tgtaatcatg aatgtcataa 3000

aatgttttgt aggagattag ggatggatta cttggacttg taccatatac attggccagt 3060

gaggatgaag aatggtagtg accaaggtat aaagttggta aatgaggatg taattccatt 3120

tgacatgaaa ggaacatggg aagctatgga agaatgtcac aaattaggtt tggccaaatc 3180

tattggtgta tgcaacttta gttgcacaaa actctctcaa ctcctaactc atgctaccat 3240

tcctcctgct gtaaatcagg taaatataac atactatacc cttagcgata tttaattggg 3300

aacgaaattt aagaaattta aagctataga tatttatggc tataaatcat ttcgttaata 3360

ataacatgaa ttaatttaaa atttagttta tgatcaagaa atgataacat tctttttgta 3420

tagactagag aggaaagtac gacattctag tatagaatct ttaaatcttt tgaaataaga 3480

tttacttatt taaaaattac ataaaaaata tattataaaa tgcaataatt gacaggtgga 3540

aatgcatgta gcatggagac aagagaagat gttagcattt tgtaaagaga aaggaataca 3600

tgtaagtgca tggtctcctc ttggagcaaa tggaatacct ttttggggca atcatgctgt 3660

tatgcaaaac tctgttctaa aagacattgc ctttcataga caaaagagca ttccacaggt 3720

accaataaat aattaaatta ttcactcagt gttcacacta aattatatta gtatattaac 3780

gtttaatata tcaataactt tttaaatttg ctctcaaatt ctattttgac acttgaagta 3840

agacttgttt caattgaaca tctgaactca tgataaattt ttttttatta gtaatcatta 3900

gacactttca gttcaaattt tgaagaaaaa agatatctac tagatagtta agttaactcc 3960

ataaaatatg acatctcctt taagtatgcg attagcctca attgaggttt tacgacttat 4020

taaggcaaat acatttaatc agaggaggta gcatgtttta agtgtgacgt ttgagaacac 4080

acgctaaaag tttttcaaaa tttgaaccgt aagtctctaa taaaacgctt tactatgtgt 4140

tttaagtgat tagaataaat attagttcga acatccaaat aaaattgctc acaaggatag 4200

taattgtttg atatttgtag gtggcattga gatgggtata tgagcaaggt gttagtgtat 4260

tagtgaagag ttttaacaaa gatagaatga aagagaatct tcaaattttg gattgggaat 4320

taagcaatga agaaaatgct aagattcaag agattcctca atgcagggga ttcaaaggtg 4380

aactttttgt tcatccagat ggaccataca aatccccaga tgaattctgg gatggtgaac 4440

tataa 4445

<210> 2

<211> 529

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Glu Gln Thr Ser Glu Gly Ile Gly Ile Lys Met Tyr Ser Thr Ser

1 5 10 15

Lys Arg Val Asp Asn Ser Ser Ser Met Tyr Pro Thr Asn Leu Pro Gln

20 25 30

Asp Asp Thr Ile Pro Glu Leu Ser Gln Pro Ala Leu Pro Ile Gly Gly

35 40 45

Lys Lys Arg Arg Ala Met Ala Asn Gly Val Gln Lys Thr Leu Ser Lys

50 55 60

Thr Ser Leu Leu Val Asn Phe Leu Pro Thr Gly Thr Leu Leu Thr Phe

65 70 75 80

Glu Met Leu Leu Pro Ser Val Phe Gly Lys Gly Asp Cys Ser Pro Ile

85 90 95

Thr Thr Phe Met Ile Leu Thr Leu Leu Gly Leu Cys Thr Leu Ser Cys

100 105 110

Phe Phe Phe His Phe Thr Asp Ser Phe Arg Gly Pro Asp Gly Lys Val

115 120 125

Tyr Tyr Gly Phe Val Thr Pro Arg Gly Leu Lys Val Phe Lys Thr Gly

130 135 140

Leu Gly Val Asp Val Pro Lys Asp Glu Arg Tyr Ile Val Gly Leu Thr

145 150 155 160

Asp Phe Val His Ala Met Met Ser Val Leu Val Phe Val Ala Ile Ala

165 170 175

Phe Ser Asp His Arg Val Thr Leu Cys Leu Phe Pro Gly His Ala Lys

180 185 190

Glu Leu Asp Glu Ile Met Arg Ser Phe Pro Leu Met Val Gly Val Ile

195 200 205

Cys Ser Gly Leu Phe Leu Val Phe Pro Asn Ser Arg Tyr Gly Val Gly

210 215 220

Cys Met Gly Thr Ala Pro Thr Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ile Asp Gln

225 230 235 240

Leu Val Ser Ile Phe Ile Asp Ala Ile Glu Ala Gly Tyr Arg His Phe

245 250 255

Asp Thr Ala Ala Ala Tyr Gly Ser Glu Glu Ala Leu Gly Arg Ala Val

260 265 270

Ala Asp Ala Ile Gln Arg Gly Leu Ile Glu Ser Arg Glu Asp Val Phe

275 280 285

Ile Thr Ser Lys Leu Trp Cys Thr Glu Thr His His Asp Leu Val Leu

290 295 300

Pro Ala Leu Lys Arg Ser Leu Ala Arg Leu Gly Met Asp Tyr Leu Asp

305 310 315 320

Leu Tyr His Ile His Trp Pro Val Arg Met Lys Asn Gly Ser Asp Gln

325 330 335

Gly Ile Lys Leu Val Asn Glu Asp Val Ile Pro Phe Asp Met Lys Gly

340 345 350

Thr Trp Glu Ala Met Glu Glu Cys His Lys Leu Gly Leu Ala Lys Ser

355 360 365

Ile Gly Val Cys Asn Phe Ser Cys Thr Lys Leu Ser Gln Leu Leu Thr

370 375 380

His Ala Thr Ile Pro Pro Ala Val Asn Gln Val Glu Met His Val Ala

385 390 395 400

Trp Arg Gln Glu Lys Met Leu Ala Phe Cys Lys Glu Lys Gly Ile His

405 410 415

Val Ser Ala Trp Ser Pro Leu Gly Ala Asn Gly Ile Pro Phe Trp Gly

420 425 430

Asn His Ala Val Met Gln Asn Ser Val Leu Lys Asp Ile Ala Phe His

435 440 445

Arg Gln Lys Ser Ile Pro Gln Val Ala Leu Arg Trp Val Tyr Glu Gln

450 455 460

Gly Val Ser Val Leu Val Lys Ser Phe Asn Lys Asp Arg Met Lys Glu

465 470 475 480

Asn Leu Gln Ile Leu Asp Trp Glu Leu Ser Asn Glu Glu Asn Ala Lys

485 490 495

Ile Gln Glu Ile Pro Gln Cys Arg Gly Phe Lys Gly Glu Leu Phe Val

500 505 510

His Pro Asp Gly Pro Tyr Lys Ser Pro Asp Glu Phe Trp Asp Gly Glu

515 520 525

Leu

<210> 3

<211> 1590

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggagcaaa ctagtgaagg aattggaata aaaatgtaca gtacatcgaa acgcgtcgat 60

aattcatctt ctatgtatcc tactaattta ccacaagatg atacaatccc agaattatct 120

caacctgcat taccaattgg tgggaaaaaa agaagagcaa tggcaaatgg tgtacaaaaa 180

acactttcaa aaacttcatt acttgttaat tttctaccaa caggcacact tttaacattt 240

gaaatgttac ttccatcagt atttggtaaa ggagattgtt caccaattac tacatttatg 300

attttaacat tacttggact ttgtactttg tcatgttttt tcttccattt taccgatagt 360

tttcgaggtc ctgatggcaa agtttactat ggttttgtta caccaagagg tttgaaagtt 420

ttcaagactg gacttggtgt tgatgtgcca aaagatgaaa ggtacattgt gggattgaca 480

gattttgtac atgcaatgat gtctgttttg gtgtttgtgg caattgcatt ttctgatcat 540

agagtgacac tttgtctatt tcctggacat gctaaagaac ttgatgaaat tatgaggagt 600

tttccattaa tggttggagt tatttgtagt ggactttttc ttgtttttcc taattctaga 660

tatggtgttg gatgcatggg aacagcacca acggcaccaa cattaccacc aattgaccaa 720

ttagtctcca tttttatcga tgctatcgaa gctggttatc gacactttga caccgctgcg 780

gcctatggct ccgaggaagc actaggtcga gccgtggctg acgcgataca acgcggactc 840

atagagagcc gtgaagatgt ttttattaca tctaagttat ggtgcaccga aacacatcat 900

gaccttgttc ttcctgctct caaaagatct ctcgcgagat tagggatgga ttacttggac 960

ttgtaccata tacattggcc agtgaggatg aagaatggta gtgaccaagg tataaagttg 1020

gtaaatgagg atgtaattcc atttgacatg aaaggaacat gggaagctat ggaagaatgt 1080

cacaaattag gtttggccaa atctattggt gtatgcaact ttagttgcac aaaactctct 1140

caactcctaa ctcatgctac cattcctcct gctgtaaatc aggtggaaat gcatgtagca 1200

tggagacaag agaagatgtt agcattttgt aaagagaaag gaatacatgt aagtgcatgg 1260

tctcctcttg gagcaaatgg aatacctttt tggggcaatc atgctgttat gcaaaactct 1320

gttctaaaag acattgcctt tcatagacaa aagagcattc cacaggtggc attgagatgg 1380

gtatatgagc aaggtgttag tgtattagtg aagagtttta acaaagatag aatgaaagag 1440

aatcttcaaa ttttggattg ggaattaagc aatgaagaaa atgctaagat tcaagagatt 1500

cctcaatgca ggggattcaa aggtgaactt tttgttcatc cagatggacc atacaaatcc 1560

ccagatgaat tctgggatgg tgaactataa 1590

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcaaacta gtgaaggaat 20

<210> 5

<211> 76

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugc 76

<210> 6

<211> 76

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60

ggcaccgagt cggtgc 76

<210> 7

<211> 30

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

agaagattca aaacatttgt aagtgcattt 30

<210> 8

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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Claims (10)

1.一种多核苷酸在马铃薯单倍体诱导中的应用，其特征在于，所述多核苷酸为如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：1所示序列的互补序列、简并序列或同源序列，其中所述同源序列为与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有75％或以上同一性的多核苷酸；

3)在严紧条件下与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列杂交的多核苷酸或其互补序列；

4)所述序列1)-3)中任一序列的cDNA序列或CDS序列。

2.一种蛋白质在马铃薯单倍体诱导中的应用，其特征在于，所述蛋白质为如下序列中的至少一种：

1)SEQ ID NO：2所示的蛋白质；

2)SEQ ID NO：2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

3)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

4)与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

3.一种马铃薯单倍体诱导系，其特征在于，所述单倍体诱导系通过基因的插入、取代和/或缺失的突变方式使权利要求1所述多核苷酸或权利要求2所述蛋白质的表达和/或活性降低。

4.根据权利要求3所述的单倍体诱导系，其特征在于，所述突变方式为CRISPR/Cas9、TELLEN技术、T-DNA插入、EMS诱变、ZFN技术中的一种。

5.权利要求3或4所述的单倍体诱导系在马铃薯单倍体育种或杂交育种中的应用。

6.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述1)至4)中的任一种：

1)敲除权利要求1所述多核苷酸的敲除盒；

2)敲除权利要求1所述多核苷酸的敲除载体；

3)敲除权利要求1所述多核苷酸的重组微生物；

4)敲除权利要求1所述多核苷酸的转基因植物细胞系。

7.一种马铃薯植物，其特征在于，其为权利要求6所述的转基因植物细胞系生长形成的植物。

8.一种马铃薯植物，其特征在于，其为权利要求7所述植物自交所形成的后代，以及所述后代生长形成的植物；

或者其为权利要求7所述植物与其它品种杂交所形成的后代，以及所述后代生长形成的植物。

9.一种马铃薯单倍体植物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以权利要求3所述单倍体诱导系为父本，将其自交或与其它品种杂交，得到种子；

2)所述种子经1～5mg/mL赤霉素处理24～72小时后，消毒，播种在1/2MS培养基中，得到种苗；

3)对种苗进行单倍体鉴别，得到单倍体植物。

10.一种马铃薯纯合二倍体植物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：利用权利要求9所述筛选方法获得单倍体植物，取单倍体植物的顶端嫩芽，采用0.35％～0.55％秋水仙素进行染色体加倍处理至少2天，得到纯合二倍体植物。

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