CN116875596B - 一种花生种子特异性基因启动子yw4ydb及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB及其应用，涉及植物基因工程技术领域。所述花生种子特异性基因启动子YW4YDB选自SEQIDNO.01、SEQIDNO.01、与SEQIDNO.01或SEQIDNO.02序列进行杂交的DNA或者RNA序列、与SEQIDNO.01或SEQIDNO.02所述序列有至少95％序列一致性的序列、与SEQID NO.01或SEQIDNO.02任一所述序列互补的DNA或者RNA序列中的任意一种。本发明克服了现有技术的不足，利用花生种子特异性基因启动子YW4YDB在花生种子组织细胞内驱动HCMV糖蛋白B基因进行表达，从而实现在花生种子组织细胞内表达HCMV糖蛋白B基因，从而高效生产HCMV糖蛋白B抗原疫苗。

Description

一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB及其应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB及其应用。

背景技术

随着医药技术和基因工程技术的快速发展，为了满足药物生产等生物合成领域的低成本和高效率，将植物、动物或微生物细胞作为反应器，进行转基因和基因转化以高效生产异源蛋白，常用于药用蛋白、抗原和疫苗等产品的生产及高营养价值、高有效成分含量或具备其他优良性状的新品种作物的培育。

经过基因工程育种的农作物能具备多种常规育种模式难以获得或稳定的优良性状，或将本身的各种性状表达进行强化，从而获得具备优秀的抗病虫害、抗倒伏、抗除草剂、高营养价值、高有效成分含量或具备其他优良性状的农作物新品种，在农业生产应用中具有显著的降本增效的能力，应用前途广泛。但也存在着某些外源成分可能诱发人体免疫反应或破坏原有营养成分等潜在问题，需要在基因编辑中进行规避。

其中，转基因植物作为口服疫苗合成反应器最大的优势在于可以利用植物细胞壁形成天然的生物胶囊以避免在口服后蛋白结构被消化系统破坏，只需要简单的摄食就可以让有效成分进入到肠道，在肠道黏膜的刺激下激发特异性免疫反应让人体获得免疫能力，这样的疫苗大大改变了传统疫苗的生产方式、接种模式和经济成本，有重要的社会意义和广阔的发展前景。另外，如人胰岛素、血红蛋白、免疫球蛋白、脑啡肽等重要的蛋白质、多肽药物也已经在植物细胞反应器的生产应用中实现了产业化和商品化。

目前转基因植物细胞反应器生产外源基因表达产物中最突出的问题在于基因表达量不足，这是应用植物生产药用蛋白的最大障碍。这个问题一方面可以利用愈伤组织等干细胞新陈代谢速率高、不断分裂的特点，将其作为反应器以弥补这一缺点，另一方面，也需要在单个细胞内提高此类外源基因的表达水平，想要提高目标基因的表达水平可以从分子生物学层面入手，例如借助强启动子、特异性启动子或前导序列，让目标的外源基因得以有更高的转录、翻译活性，以提高目标产物产量，或是控制其在种子组织、特定外界环境条件下的高表达量，便于生产实践中能在特定条件下收取种子进行目标产物提取以取代整株提取，将大大降低生产成本。

人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是疱疹病毒家族中基因组最大的成员，可编码200多种蛋白质。HCMV感染宿主范围较窄，以人类为宿主，尚无感染动物模型。HCMV裂解复制增殖较缓慢，周期较长，除形成核内包涵体，HCMV具有能引发核周和细胞质包涵体产生和细胞肿胀(巨细胞)的特性，并因而得名。

HCMV可感染血管内皮细胞和白细胞，并在内皮细胞中诱发典型的包涵体特征。在体外单核细胞感染实验中，病毒井不能引起相应的细胞病理学现象，表明HCMV在单核细胞中增殖受限制，推测这类细胞可能是HCMV的潜伏感染场所。HCMV可通过多种不同的机制诱发疾病的发生，包括直接组织损伤和免疫损伤。虽然肺部HCMV感染直接造成黏膜上皮细胞损伤可能是HCMV感染引起的肺炎的致病机制，但在动物模型上的实验表明，针对HCMV感染的免疫应答引起的免疫损伤可能是HCMV引发肺炎的主要机制。与之相应的，肺组织HCMV滴度并不能反映肺炎的严重程度。

构建HCMV疫苗时，可用HCMV糖蛋白B作为抗原物质进入体内以诱发免疫反应，促使动物体受到HCMV侵染时能快速产生针对性免疫应答以快速消灭病原体。转基因植物表达外源病毒抗原有两种不同方式：

1、将外源DNA通过农杆菌T-DNA载体介导或微粒轰击直接介导稳定的基因组整合，稳定表达，可通过无性或有性繁殖生产大量的转基因植物，也可介导多种基因来生产多价疫苗，但表达量低。

2、使用病毒载体瞬时表达，瞬时表达量虽比较高，但需纯化或部分纯化方可口服食用。

在植物基因工程领域，涉及HCMV口服疫苗生物反应器的基因工程时，常用HCMV糖蛋白B作为抗原，在目标植物体中引入HCMV糖蛋白B基因，过往试验中利用烟草植株进行实验时，能高效生产HCMV疫苗，但是该方式往往作用于烟草全株，对于后续的收集存在一定的困扰，花生这一类农产品在种植收集时为收集种子进行加工或直接食用，目前并没有对花生种子细胞作为反应器来获得HCMV糖蛋白B抗原疫苗的报道。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB及其应用，利用花生种子特异性基因启动子YW4YDB在花生种子组织细胞内驱动HCMV糖蛋白B基因进行表达，从而实现在花生种子组织细胞内表达HCMV糖蛋白B基因，从而高效生产HCMV糖蛋白B抗原疫苗。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB，所述花生种子特异性基因启动子YW4YDB的DNA核苷酸序列选自下列序列中任意一组：

(1)如SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列，即：

CATAAACATTAAACAATGCATCTAACCGGAGAATTAGGCATCAGCAAGAAAAGAGAAGAACTGAAGCCGTGCATGCGTGGTCCCCGTTGTGAAGAAATCGCAGATAAATGCTTAGCTGTACATGGAGACAAGGTTGCTCTCTTTGTATGCTTATCATGTTATAGAGATGCTTTGCGAGGTGTAACAAAGGAAGGGTGCCATAGCCATGC；

(2)与SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列反向互补，即可以与原序列形成完整碱基互补配对形成双链结构，而方向相反的单链序列，如SEQ ID NO.02所示的序列：

GCATGGCTATGGCACCCTTCCTTTGTTACACCTCGCAAAGCATCTCTATAACATGATAAGCATACAAAGAGAGCAACCTTGTCTCCATGTACAGCTAAGCATTTATCTGCGATTTCTTCACAACGGGGACCACGCATGCACGGCTTCAGTTCTTCTCTTTTCTTGCTGATGCCTAATTCTCCGGTTAGATGCATTGTTTAATGTTTATG；

(3)能够与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02序列进行杂交的DNA或者RNA序列；

(4)与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02所述序列有至少95％序列一致性的序列；

(5)与SEQ ID NO.01或SEQ ID NO.02任一所述序列互补的DNA或者RNA序列。

优选的，所述特异性基因启动子YW4YDB能够驱动HCMV糖蛋白B基因在花生种子组织细胞内特异性高表达。

优选的，所述花生种子特异性基因启动子YW4YDB通过PCR扩增技术获得。

优选的，所述PCR扩增过程中根据现有的原始DNA链配置两种引物：

(1)序列如SEQ ID NO.03所示：

CATAAACATTAAACAATGCATCTAA；

(2)序列如SEQ ID NO.04所示：

GCATGGCTATGGCACCCTTCCTTTG。

优选的，所述扩增过程中采用基于DNA聚合酶的DNA扩增体系进行扩增。

所述特异性基因启动子YW4YDB应用于生产HCMV疫苗。

优选的，所述应用方式为利用或者操作花生种子细胞作为反应器进行转基因和基因转化来高效生产HCMV糖蛋白B抗原疫苗。

优选的，所述具体过程为对花生种子进行转基因操作，利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子的DNA双链，利用该植物表达载体转化目标植物完成遗传转化。

本发明提供一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB及其应用，与现有技术相比优点在于：

本发明公开花生种子特异性基因启动子YW4YDB能在所需特定种子组织细胞内活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性，利用特定载体将启动子YW4YDB+HCMV糖蛋白B基因的组合整合进细胞的染色体DNA链中后，利用或者操作花生种子特异性基因启动子YW4YDB在花生种子组织细胞内驱动目标基因进行表达，从而实现在花生种子组织细胞内表达HCMV糖蛋白B基因的目的，在农业生产的分子生物学层面育种中可以利用这样的方式将花生种子组织细胞作为反应器，进行转基因和基因转化以高效生产HCMV糖蛋白B抗原疫苗。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

对花生种子特异性基因启动子YW4YDB的PCR扩增操作：

1、选择以下SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列为花生种子特异性基因启动子YW4YDB序列：

SEQ ID NO.01序列：

CATAAACATTAAACAATGCATCTAACCGGAGAATTAGGCATCAGCAAGAAAAGAGAAGAACTGAAGCCGTGCATGCGTGGTCCCCGTTGTGAAGAAATCGCAGATAAATGCTTAGCTGTACATGGAGACAAGGTTGCTCTCTTTGTATGCTTATCATGTTATAGAGATGCTTTGCGAGGTGTAACAAAGGAAGGGTGCCATAGCCATGC；

2、根据现有的原始DNA链配置两种引物(长度为25bp)：

SEQ ID NO.03序列：CATAAACATTAAACAATGCATCTAA

SEQ ID NO.04序列：GCATGGCTATGGCACCCTTCCTTTG；

3、配制一定量基于Phusion DNA聚合酶(Phusion DNAPolymerase)的DNA扩增体系：

配置方法为混合下列，此处配比以体系总量为50μL为例：

(1)dd H2O 30.5μL

(2)10×Buffer缓冲液5μL

(3)dNTP(10mmol/L)1μL

(4)Sequence SEQ ID NO.03(10μmol/L)5μL

(5)Sequence SEQ ID NO.04(10μmol/L)5μL

(6)MgCl₂(50mmol/L)0.5μL

(7)花生基因组DNA 2μL

(8)Phusion DNA聚合酶1μL；

4、运行PCR扩增程序：

将上述扩增体系放入PCR热循环仪器中，进行下列热循环步骤：

(1)98℃，5min

(2)98℃，30sec

(3)55℃，30sec

(4)72℃，3min

(5)重复步骤(2)-(4)，循环20次

(6)72℃，保温20min；

5、电泳跑胶，回收长度为0.20kb的DNA片段；

6、利用pEASY-Blunt进行平端连接，转化DH5α大肠杆菌感受态，完成测序。

实施例2：

利用上述实施例1获得的花生种子特异性基因启动子YW4YDB用于农作物基因组整合操作：

1、转基因载体的构建：利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子的DNA双链；

2、于MB培养基内分别对泉花806花生愈伤组织进行组织培养及后续诱导分化，获得原始种泉花806品种花生和利用花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子质粒序列插入了HCMV糖蛋白B基因的转基因品种泉花806(遗传转化阳性品种)品种花生经组织培养后获得的完整植株各20株，在正常温室条件下种植120d至植株成熟并结果，分别收集两种植株所结种子并单独分离出种子部分，两种花生种子分别用Westernblot检测糖蛋白B的表达，考察其HCMV糖蛋白B基因强化表达从而生产抗原疫苗的情况，具体如下表所示：

由上述检测可知，花生种子特异性基因启动子YW4YDB可以使HCMV糖蛋白B基因在花生种子组织细胞内强化表达从而生产抗原疫苗；

3、为了验证花生种子特异性基因启动子YW4YDB在用于基因编辑时对HCMV糖蛋白B基因的强化表达从而生产抗原疫苗的效果仅对花生种子组织细胞有特异性，对上述实验中得到的植株进行下列实验检验：

对上述种植后得到的原始种泉花806品种花生和利用花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子质粒序列插入了HCMV糖蛋白B基因的转基因品种泉花806(遗传转化阳性品种)品种花生完整植株的其余部分，即根、茎、叶、果壳部分用Westernblot检测糖蛋白B的表达：

结果为：除种子部分外其他组织内未检测到与糖蛋白B亚单位蛋白分子量相符且具有抗原性的蛋白。

经对比后得到该启动子对于HCMV糖蛋白B基因在两种植株内，在除了种子以外的部分表达的促进并无明显区别。

由上述检测可知，在原始种泉花806品种花生和利用花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子质粒序列插入了HCMV糖蛋白B基因的转基因品种泉花806(遗传转化阳性品种)品种花生两种植株的除种子之外的剩余植株细胞内，HCMV糖蛋白B基因的表达并未受到明显增强。

综合上述实验可得，插入了花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子质粒序列的泉花806种花生幼苗相比未经处理的同种花生种子组织细胞在相同的生长条件下HCMV糖蛋白B含量有明显提升，而植株剩余部分中HCMV糖蛋白B含量并未发现明显变化，故花生种子特异性基因启动子YW4YDB在用于基因编辑时对HCMV糖蛋白B基因在种子组织细胞中的表达有明显的组织特异性和表达强化效果。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB，其特征在于，所述花生种子特异性基因启动子YW4YDB的DNA核苷酸序列如SEQ ID NO.01所示的DNA核苷酸序列，即：

CATAAACATTAAACAATGCATCTAACCGGAGAATTAGGCATCAGCAAGAAAAGAGAAGAACTGAAGCCGTGCATGCGTGGTCCCCGTTGTGAAGAAATCGCAGATAAATGCTTAGCTGTACATGGAGACAAGGTTGCTCTCTTTGTATGCTTATCATGTTATAGAGATGCTTTGCGAGGTGTAACAAAGGAAGGGTGCCATAGCCATGC。

2.根据权利要求1所述的一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB，其特征在于：所述特异性基因启动子YW4YDB能够驱动HCMV糖蛋白B基因在花生种子组织细胞内特异性高表达。

3.根据权利要求1所述的一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB，其特征在于：所述花生种子特异性基因启动子YW4YDB通过PCR扩增技术获得。

4.根据权利要求3所述的一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB，其特征在于：所述PCR扩增过程中根据现有的原始DNA链配置两种引物：

（1）序列如SEQ ID NO.03所示：

CATAAACATTAAACAATGCATCTAA；

（2）序列如SEQ ID NO.04所示：

GCATGGCTATGGCACCCTTCCTTTG。

5.根据权利要求3所述的一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB，其特征在于：所述扩增过程中采用基于DNA聚合酶的DNA扩增体系进行扩增。

6.一种如权利要求1所述的花生种子特异性基因启动子YW4YDB的应用，其特征在于：所述特异性基因启动子YW4YDB应用于生产HCMV疫苗。

7.根据权利要求6所述的一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB的应用，其特征在于：所述应用方式为利用或者操作花生种子细胞作为反应器进行转基因和基因转化来高效生产HCMV糖蛋白B抗原疫苗。

8.根据权利要求7所述的一种花生种子特异性基因启动子YW4YDB的应用，其特征在于：所述具体过程为对花生种子进行转基因操作，利用pCAMBIA2300质粒序列作为载体，经过酶切和连接反应构建花生种子特异性基因启动子YW4YDB-HCMV糖蛋白B基因-NOS终止子的DNA双链，利用该植物表达载体转化目标植物完成遗传转化。