CN107641155A - 一种在植物中表达重组人血清白蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种密码子优化的人血清白蛋白基因，其在植物中能够高水平表达。本发明还提供了包含人血清白蛋白基因的核酸构建体、载体和宿主细胞，并进一步提供了生产转基因植物以及利用转基因植物生产重组人血清白蛋白的方法。本发明大大提高了重组人血清白蛋白在植物反应器中的表达水平，从而使转基因植物低成本生产重组人血清白蛋白成为可能。

Description

一种在植物中表达重组人血清白蛋白的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体来说，涉及在植物中高效表达重组人血清白蛋白的方法。

背景技术

人血清白蛋白是由585个氨基酸残基组成的单链蛋白质，分子量为67kDa，它是人血浆中的主要成分，在肝脏中合成后分泌进入血液。人血清白蛋白是一种医疗上大规模使用的药用蛋白，每年全世界市场需求约600吨左右，市场价值大约30亿美元。白蛋白具有维持血液渗透压、抗休克、运输与解毒、促进肝细胞修复与再生等作用，在临床上主要用于：失血创伤、烧伤引起的休克，脑水肿及损伤引起的颅压升高，肝硬化及肾病引起的水肿或腹水，低蛋白血症的防治，新生儿高胆红素血症，还用于心肺分流术、烧伤的辅助治疗、血液透析的辅助治疗和成人呼吸窘迫综合症。

目前医用人血清白蛋白主要通过血液分级过滤得到，不仅价格较高(约5美元/g)，而且产能较低，有限的血液资源极大地限制了白蛋白的生产和使用，供给远远不能满足市场需要。

自1981年首次从人肝脏cDNA文库中克隆得到人血清白蛋白基因cDNA全序列以来，人们一直在尝试利用基因工程技术在不同的物种中高效表达重组人血清白蛋白，取得了一定的进步，但是仍然受困于表达量不够高，高度纯化比较困难等难题。

目前重组生物制药中普遍采用大肠杆菌、酵母等微生物发酵制备，但此方法存在诸多缺点，例如：微生物与人体环境差异大，表达产品生物活性低，掺杂的微生物毒素难以彻底去除，生产工艺复杂，很难形成规模化生产等。

近年来也有利用转基因技术制备转基因动物来制备人重组蛋白产品，与传统的微生物表达系统相比，动物生物反应器具有以下优点：(1)生产的蛋白质生物活性高，能够对重组蛋白质进行多种翻译后加工，非常接近天然产品；(2)表达量大、成本低；(3)产品易提纯、质量高，避免了化学及生物毒素的污染；(4)易产业化，外源目的基因能够遗传，使得某一群体都具有同一特性，可通过动物繁殖扩群，进行规模化生产。但人类基因是随机插入动物的基因组内，虽然与微生物发酵相比有很大优势，但也存在很多不可控的因素和缺陷：(1)目的基因的整合与表达效率较低；(2)有可能引起宿主细胞基因突变；(3)转基因模型与预期结果不符，或表达个体的机能紊乱；(4)动物本身的相应蛋白质在纯化中很难去除，容易引起人类的过敏反应。因此，转基因动物也不是理想的生物反应器。

目前，已经将植物表达系统视为动物细胞培养的有前景替代物用于大规模生产重组蛋白，转基因植物中蛋白质的生产方法可以参见例如：美国专利第5750871号、第5565347号、第5464763号、第5750871号和第5565347号等。尽管植物的大量生长和采集比原核和真核细胞便宜，但植物细胞中外来基因的表达量通常较低。

发明内容

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明人经过长期研究，发明了一种在烟草植株中高效表达重组人血清白蛋白(rHSA)的方法。

本发明的第一方面提供了rHSA的氨基酸序列及其编码序列。

本申请中rHSA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

任何能够编码rHSA的核酸均可用于本发明。优选地，rHSA编码序列具有选自SEQID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。更优选地，rHSA编码序列根据宿主细胞的密码子偏好情况进行了密码子优化。在一个最优选的实施方案中，rHSA编码序列如SEQ ID NO:3所示，其在下文称为yhsa基因。

yhsa基因序列是发明人根据烟草密码子偏好性在天然人血清白蛋白基因序列(hsa基因)基础上人工设计得到的，其长度为1830bp，与hsa基因长度相同，且编码相同的氨基酸序列。

由于植物相比动物，其密码子偏好性一定的共性，因而本发明的yhsa基因不仅能够在烟草中高水平表达，在其他植物，例如拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆中也能取得高水平表达。优选地，所述植物为茄科植物。

本发明的第二方面提供了包括本发明的核酸的核酸构建体、载体和宿主细胞。

优选地，所述载体衍生自pCHF3载体。

在一个特定的实施方案中，所述载体为pCHF3-yhsa，其是将yhsa基因插入pCHF3载体的KpnI和SalI酶切位点之间构建得到的。

本发明的宿主细胞选自细菌、真菌、动物和植物细胞。优选地，所述细菌细胞选自大肠杆菌和农杆菌，所述植物细胞选自茄科植物细胞。最优选地，所述植物细胞为烟草细胞。

所述转基因细菌、真菌、动物和植物细胞可作为生物反应器直接用于生产rHSA，转基因农杆菌还能用于介导产生转基因植物。在本发明中，所述动物细胞和植物细胞均不包括生殖细胞，也不用作为繁殖材料。

本发明的第三方面提供了一种生产重组人血清白蛋白的转基因植物的制备方法，包括将本发明的核酸、核酸构建体或者载体引入植物。

在一个特定的实施方案中，所述方法包括：

用本发明的载体转化农杆菌感受态细胞；

农杆菌侵染植物材料；以及

将农杆菌侵染的植物材料培养、再生为植株。

所述转基因植物优选茄科植物，最优选烟草。

优选地，所述转化方法为电击转化。农杆菌侵染方法可以根据待侵染的植物材料的特点自由选择，对于烟草而言，优选叶盘法。

本发明的第四方面提供了一种生产rHSA的方法，包括种植和收获根据本发明的方法制备的转基因植物。

根据转基因植物种类的不同，其利用方式也不相同，对于有的植物，例如水稻、小麦、玉米、大豆等，rHSA在其可食用部分富集，因此可以直接将这些植物的可食用部分加工为提供rHSA的产品。

对于一些不能直接食用的植物，例如拟南芥、烟草等，上述方法还包括从收获的转基因植物中分离、纯化rHSA的步骤。

发明人对人血清白蛋白基因序列进行了密码子优化，大大提高了其在植物反应器中的表达水平，从而使转基因植物低成本生产rHSA成为可能。并且由于密码子优化过程中考虑了植物密码子偏好的共性，人工设计的yhsa基因不仅在烟草，还可以在其他植物中高水平表达。

附图说明

图1过表达载体pCHF3图谱。

图2阳性质粒琼脂糖凝胶电泳图谱。其中，M为DL2000分子量标记，泳道1～4分别是4个重组子，其中3号重组子为阳性。

图3转基因植物中HSA的Western blot鉴定。其中，泳道A为作为阴性对照的野生型烟草，B为作为阴性对照的转入空载体pCHF3的转基因烟草，C-F为转入携带天然基因的过表达载体pCHF3-hsa的转基因烟草，G-J为转入携带优化基因的过表达载体pCHF3-yhsa的转基因烟草，K为分子量标记，L为作为阳性对照的人血清白蛋白。

具体实施方式

下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1人血清白蛋白基因优化

天然人血清白蛋白基因hsa开放阅读框长度为1830bp，序列如下(SEQ ID NO:2)：

ATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCCCTTCTTTTTCTCTTTAGCTCGGCTTATTCCAGGGGTGTGTTTCGTCGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCCTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGACTCAAGTGTGCCAGTCTCCAAAAATTTGGAGAAAGAGCTTTCAAAGCATGGGCAGTAGCTCGCCTGAGCCAGAGATTTCCCAAAGCTGAGTTTGCAGAAGTTTCCAAGTTAGTGACAGATCTTACCAAAGTCCACACGGAATGCTGCCATGGAGATCTGCTTGAATGTGCTGATGACAGGGCGGACCTTGCCAAGTATATCTGTGAAAATCAAGATTCGATCTCCAGTAAACTGAAGGAATGCTGTGAAAAACCTCTGTTGGAAAAATCCCACTGCATTGCCGAAGTGGAAAATGATGAGATGCCTGCTGACTTGCCTTCATTAGCTGCTGATTTTGTTGAAAGTAAGGATGTTTGCAAAAACTATGCTGAGGCAAAGGATGTCTTCCTGGGCATGTTTTTGTATGAATATGCAAGAAGGCATCCTGATTACTCTGTCGTGCTGCTGCTGAGACTTGCCAAGACATATGAAACCACTCTAGAGAAGTGCTGTGCCGCTGCAGATCCTCATGAATGCTATGCCAAAGTGTTCGATGAATTTAAACCTCTTGTGGAAGAGCCTCAGAATTTAATCAAACAAAATTGTGAGCTTTTTGAGCAGCTTGGAGAGTACAAATTCCAGAATGCGCTATTAGTTCGTTACACCAAGAAAGTACCCCAAGTGTCAACTCCAACTCTTGTAGAGGTCTCAAGAAACCTAGGAAAAGTGGGCAGCAAATGTTGTAAACATCCTGAAGCAAAAAGAATGCCCTGTGCAGAAGACTATCTATCCGTGGTCCTGAACCAGTTATGTGTGTTGCATGAGAAAACGCCAGTAAGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACAGAATCCTTGGTGAACAGGCGACCATGCTTTTCAGCTCTGGAAGTCGATGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTTAATGCTGAAACATTCACCTTCCATGCAGATATATGCACACTTTCTGAGAAGGAGAGACAAATCAAGAAACAAACTGCACTTGTTGAGCTCGTGAAACACAAGCCCAAGGCAACAAAAGAGCAACTGAAAGCTGTTATGGATGATTTCGCAGCTTTTGTAGAGAAGTGCTGCAAGGCTGACGATAAGGAGACCTGCTTTGCCGAGGAGGGTAAAAAACTTGTTGCTGCAAGTCAAGCTGCCTTAGGCTTATAA

根据烟草的密码子偏好，设计了一种在烟草中能够高表达的优化人血清白蛋白基因ysha，其全长1830bp，序列如下(SEQ ID NO:3)：

ATGAAGTGGGTCACTTTCATTAGTCTCTTGTTTCTGTTCTCTAGTGCATACTCTAGAGGCGTGTTTAGAAGGGATGCCCATAAATCCGAAGTGGCTCACCGATTTAAAGATTTGGGCGAAGAGAACTTTAAAGCTCTTGTATTAATCGCTTTTGCTCAGTATCTTCAACAGTGCCCGTTTGAGGATCATGTGAAGCTGGTAAATGAAGTTACTGAATTTGCTAAAACTTGCGTCGCTGATGAAAGCGCTGAAAACTGCGACAAATCACTCCATACACTATTTGGTGATAAGTTGTGTACTGTTGCAACCCTGAGAGAGACCTACGGGGAGATGGCTGACTGCTGTGCCAAGCAGGAACCTGAAAGAAATGAATGCTTTCTGCAACACAAGGACGATAATCCTAATCTTCCAAGACTCGTGAGACCAGAGGTTGATGTCATGTGCACAGCTTTCCATGACAACGAAGAGACATTTCTCAAAAAGTATCTTTATGAGATCGCACGTAGACACCCATATTTTTACGCTCCAGAACTACTTTTCTTTGCAAAGCGATACAAGGCCGCTTTTACTGAATGTTGTCAAGCTGCTGATAAAGCAGCTTGCCTGTTACCAAAGTTAGATGAACTGAGGGATGAGGGTAAGGCTTCCTCAGCTAAACAGAGACTGAAATGCGCATCACTACAAAAGTTTGGAGAGAGAGCTTTCAAAGCTTGGGCTGTAGCCCGACTGTCACAAAGGTTCCCTAAGGCCGAATTTGCAGAAGTTTCAAAGCTAGTTACTGATTTAACAAAGGTACACACCGAATGCTGTCATGGTGATCTATTGGAGTGTGCAGATGACCGAGCTGACCTGGCAAAATATATTTGCGAGAACCAAGACAGTATCAGCTCTAAATTAAAAGAGTGCTGCGAGAAACCTTTACTAGAAAAAAGCCATTGTATAGCTGAGGTCGAAAACGATGAGATGCCAGCAGATTTGCCATCACTCGCAGCCGATTTCGTGGAGTCTAAAGACGTGTGCAAGAATTACGCTGAGGCCAAGGACGTATTCTTAGGTATGTTCCTCTATGAGTACGCCAGAAGGCATCCCGACTACTCTGTGGTACTGTTGCTTAGACTCGCAAAAACCTACGAGACTACCTTGGAGAAATGTTGTGCTGCAGCTGACCCTCATGAATGCTATGCTAAAGTATTCGATGAATTCAAACCTTTGGTTGAAGAACCCCAGAACTTGATTAAGCAAAATTGTGAATTGTTCGAACAGTTGGGAGAATACAAGTTTCAAAATGCCCTTCTTGTAAGGTACACTAAAAAGGTTCCACAGGTTTCTACCCCTACTTTGGTAGAGGTTTCCCGAAATTTGGGGAAGGTTGGTTCCAAGTGTTGTAAACACCCAGAGGCTAAGAGAATGCCATGTGCTGAGGATTACCTTTCTGTAGTACTCAATCAACTCTGTGTCCTGCATGAGAAGACACCAGTCTCAGATCGAGTTACTAAATGCTGTACTGAAAGTCTAGTCAATAGAAGGCCATGCTTCAGCGCTCTTGAAGTTGATGAAACCTACGTTCCTAAGGAATTTAATGCTGAAACTTTTACCTTCCATGCAGACATCTGTACTTTAAGTGAAAAAGAGAGGCAAATTAAGAAACAAACTGCTTTAGTTGAGTTAGTAAAACATAAGCCCAAAGCCACTAAAGAGCAATTGAAGGCTGTAATGGACGACTTTGCCGCCTTTGTTGAAAAATGTTGTAAAGCTGACGATAAGGAAACTTGCTTTGCAGAGGAAGGGAAAAAGCTTGTTGCAGCAAGTCAAGCAGCTTTGGGTTTGTGA

hsa基因和yhsa基因编码相同的人血清白蛋白HSA，长度为609aa，序列如下所示(SEQ ID NO:1)：

MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL

实施例2yhsa基因过表达载体pCHF3-yhsa的构建

过表达载体pCHF3载体由本实验室保存，细菌抗性是Spe+，植物抗性是Kan+，用于基因的过表达研究。

1.酶切位点的选取与引物设计

综合考虑过表达载体pCHF3的多克隆位点及基因自身含有的限制性酶切位点，为yhsa基因的上游引物添加限制酶接头KpnI(CGGGGTACC)，为下游引物添加限制酶接头SalI(ACGCGTCGAC)，添加完接头的引物为yhsa-KpnI-F和yhsa-KpnI-R(见表1)，Tm值分别是62.9℃、66.3℃。

表1PCR引物及其序列

2.PCR扩增目的基因

使用KOD-plus-Neo高保真酶对yhsa基因目的片段进行PCR扩增。

表2PCR反应体系

PCR反应程序：94℃预变性3min；98℃变性15s，64℃退火30s，68℃延伸45s，共32个循环；68℃延伸5min。

3.PCR产物的克隆

(1)电泳

PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外灯照下切下预期大小的DNA片段。

(2)DNA片段回收

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，使用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction Kit进行凝胶回收，具体操作步骤同说明书。

(3)加polyA纯化

对切胶回收的PCR产物加polyA尾并纯化，以便进行TA克隆。

a)Ex Taq酶正常工作体系：凝胶回收产物15.75μL、10×Buffer 5μL、2mM dNTP 4μL、Ex Taq 0.25μL以及DEPC水25μL，混合均匀后72℃反应30min。

b)在上述50μL体系中加入1/10体积3M NaAc溶液混匀，再加入2.5倍总体积无水乙醇混匀，放于-70℃冰箱20min，或者-20℃至少30min。

c)4℃条件下12,000rpm离心15min，弃上清。

d)用500μL75％乙醇漂洗，4℃条件下12,000rpm离心5min，弃上清。

e)重复步骤e)。

f)常温晾干至没有乙醇味道，10～20μL DEPC水溶解。

(4)连接转化

a)利用DNA Ligation Kit(Solution I)将纯化产物与PMD-19T载体进行连接。按照载体:片段体积比为1:3～1:10，载体和片段体积之和等于Solution I体积的比例及用量将载体、纯化产物和Solution I混好。

b)将上述混合液于16℃水浴锅中过夜连接。

c)取50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞放在冰上融化，加入5μL连接产物，用枪头将其混匀。

d)冰上静置30min后，42℃热激90s。热激后，再在冰上放置2～3min，而后加入500μL无抗LB液体培养基，于37℃培养箱150rpm振荡培养1h。

e)准备含有Amp的LB平板，取100μL培养物均匀涂布在上面，待平板表面干燥后，于37℃倒置培养12～16h。

(5)重组克隆的筛选

a)随机挑取独立的单菌落，在含有Amp的LB液体培养基(100μg/mL)中培养，37℃培养约12h。

b)取少量菌液加入1.5mL离心管中，沸水浴10min，12000rpm离心3min。

c)取1μL上清作为模板，20μL体系进行PCR扩增。

d)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测插入片段的大小。如果条带大小符合，即可初步认为该菌斑为阳性克隆。将阳性克隆送交北京六合华大基因公司测序，确认有无碱基突变等。

(6)阳性质粒DNA提取

使用TIANpure Midi Plasmid Kit提取重组质粒DNA，具体操作步骤同说明书。

5.双酶切步骤

(1)同时对阳性质粒和过表达载体pCHF3进行KpnI和SalI双酶切，37℃孵育2h。

表3双酶切体系

(2)将酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的基因片段和过表达载体片段，并连接转化，方法同上。

(3)重组子的筛选与鉴定：首先通过菌液PCR法筛选有插入片段的克隆，挑出能扩增出预期大小DNA片段的菌落。阳性克隆扩大培养后，提取质粒进行双酶切验证，检测能否得到预期大小的目的片段，方法同上。

6.电泳检测

使用DEPC处理水配制1×TBE作为电泳缓冲液，并用其配制1％的琼脂糖凝胶。将双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳仪的参数设置为电压220V，时间20～30min。电泳后在凝胶成像系统中成像(参见图2)。

实施例3过表达载体的遗传转化

1.农杆菌感受态的制备

(1)将保存在-80℃的农杆菌菌株(EHA105和GV3101)取出，用灼烧灭菌的接种环沾取少量菌液，在含25mg/L Rif的YEB固体培养基平板上划线，28℃培养18h左右。

(2)挑取单菌落于含有25mg/L Rif的5mL YEB液体培养基中，28℃250rpm振荡培养16～24h。

(3)按体积比1:50将活化后的菌液接入50mL含有25mg/L Rif的YEB液体培养基中，28℃250rpm培养至OD₆₀₀＝0.5左右。

(4)将培养结束的菌液转移到预冷的50mL离心管中，4℃5000rpm离心10min，弃上清。

(5)收集的菌体用预冷的无菌超纯水重悬，重复步骤(4)。

(6)用1mL 10％甘油重悬菌体，每管100μL分装到无菌的1.5mL离心管中，于-80℃保存。

2.电击法转化农杆菌以及阳性克隆的筛选

(1)从-80℃取出农杆菌感受态细胞置于冰上，待其融化后，加入2μL制备好的pCHF3-yhsa表达载体质粒DNA，用移液枪吸打混匀。

(2)用移液枪吸取混匀后的菌液打入预冷的电击杯中，将电击杯插入电击槽中，2500V电压，电击5ms。

(3)电击后在超净工作台向电击杯中加入500μL预冷的无抗YEB液体培养基，再将其转移到1.5mL离心管中，28℃，250rpm振荡培养2～3h，使外源基因在农杆菌中充分表达。

(4)吸取100μL菌液，涂布于含25mg/L Rif以及表达载体相应抗性的YEB平板上，28℃倒置培养24～48h。

(5)挑取单克隆在含有相同浓度抗生素的YEB液体培养基中培养18h左右，温度设置为28℃，转速250rpm。用表达载体相应的引物进行PCR鉴定。在阳性菌液中加入终浓度20％的甘油，于-80℃保存。

3.农杆菌介导的烟草遗传转化

(1)无菌苗培养

取适量原生烟草种子，在无菌水中浸泡24h后，用75％的酒精表面消毒1min，无菌水洗净，再用10％双氧水浸泡10～15min，无菌水清洗3～4次。将经消毒处理的种子点播于MS平板培养基上，待长出3～4片小叶时将幼苗转移至含有MS培养基的组培瓶中，于人工气候室培养45d左右。选择生长健壮、叶色浓绿、叶脉清晰的叶片进行农杆菌侵染。

(2)侵染与继代

a)农杆菌活化与侵染。取出经鉴定正确后保存的农杆菌原菌液，待其完全融化后吸取500μL于含有相应抗性的50mL YEB液体培养基中，于28℃250rpm振荡培养至OD₆₀₀接近0.6。将菌液转移到提前灭菌预冷的50mL离心管中，4000rpm离心10min，弃上清收集菌体。用预冷的MS0液体培养基重悬菌体，再次4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体并用预冷的MS0液体培养基重悬至OD₆₀₀＝0.6左右。然后加入终浓度为20mg/L的AS，准备用于侵染。用剪刀将无菌叶片的边缘剪掉，沿主脉将叶片剪成1.0×1.0cm的叶盘放入农杆菌侵染液中进行侵染，侵染时间为5～6min。

b)共培养。将侵染后的叶片捞出，在无菌滤纸上吸干农杆菌菌液，以叶面向下平铺到G共培养培养基上，放入人工气候室(温度为26℃，湿度为40％)黑暗培养3天。

c)S1继代。将共培养3天后的叶片叶面朝上转移到S1分化培养基上。如果外植体带有较多的农杆菌，则用含500mg/L Cef的灭菌水洗涤，用灭菌滤纸吸干后再转移至S1分化培养基。每皿放置5～8片，在人工气候室中黑暗培养1周左右置于光照下继续培养，至叶片边缘长出丛芽，芽长至0.5cm左右。

d)S2继代。用镊子将S1分化培养基上长的丛芽转移到S2分化培养基上。丛芽可掰取的将丛芽直接接种，不能直接掰取的可以连带叶片一起接种，并去除未生丛芽的叶片部分。光培养1～2周待丛芽长成幼苗。

e)S3继代。将S2分化培养基上的小苗转移至S3分化培养基上，光培养1～2周。在这一过程中，小苗生长更加健壮。

f)生根培养。对S3分化培养基上的健壮小苗去除底部膨大部分和下部发黄的叶片，再接种到含有R生根培养基的组培瓶中，光培养1～2周，以使小苗尽快生根。

(3)转基因烟草的获得

待小苗生根3～10条，根长2～3cm左右时，将培养瓶的盖子打开进行炼苗。约3d左右后，将幼苗移栽到盛有无菌土的营养钵中，并覆盖塑料薄膜进行保湿。约一周后可根据幼苗的生长状况揭去保鲜膜，使其在自然条件下快速生长。

4.过表达yhsa基因T₀代烟草的阳性鉴定

(1)DNA提取

采集转基因烟草叶片约100mg于2.0mL离心管中，按照Plant Genomic DNA kit说明书提取基因组DNA。

(2)PCR鉴定

由于转基因阳性植株含有pCHF3载体上的35S启动子，而非转基因植株不含有。因此，根据35S启动子的序列设计正向引物pCHF3-35S-F，与扩增yhsa基因的反向引物yhsa-SalI-R一起，对T₀代过表达植株进行阳性鉴定，扩增片段大小约为1850bp。

以转基因烟草叶片DNA为模板进行PCR反应，用过表达载体的质粒DNA作为阳性对照，用非转基因烟草叶片DNA以及无菌水作为阴性对照，通过琼脂糖凝胶电泳检测转基因植株是否为阳性株。PCR反应体系和反应条件同上。

实施例4转基因烟草中人血清白蛋白HSA表达量鉴定

用前述实施例的方法分别制备转入携带天然基因的过表达载体pCHF3-hsa和优化基因的过表达载体pCHF3-yhsa的转基因烟草各4株，采用Western blot的方法进行蛋白表达量鉴定。

用Eppendorf管取等质量的烟草叶片，液氮中研磨，加入1倍体积的蛋白质上样缓冲液，振荡，沸水浴10min，立即置于冰上2min，5000rpm离心10min，取上清。15μl样品经PAGE胶分离。点样顺序为：泳道A为作为阴性对照的野生型烟草，B为作为阴性对照的转入空载体pCHF3的转基因烟草，C-F为转入携带天然基因的过表达载体pCHF3-hsa的转基因烟草，G-J为转入携带优化基因的过表达载体pCHF3-yhsa的转基因烟草，K为分子量标记，L为作为阳性对照的人血清白蛋白(Sigma A9511)。经考马斯亮蓝R250染色并脱色后，调整上样量至均匀一致；再次电泳。SDS-PAGE凝胶在转移缓冲液中，用电转移的方法将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上。转移完毕的硝酸纤维素膜在TBST缓冲液中漂洗一下，转入10ml封闭液(5％脱脂奶粉)中37℃封闭2h。封闭完成后，直接在封闭液中加入特异性抗血清(Sigma A2672)(1:10000)，37℃反应2h。将硝酸纤维素膜在TBST缓冲液中漂洗3次，再加入用TBST稀释(1:5000)的碱性磷酸酯酶标记的羊抗鼠抗血清(Sigma A3562)，37℃反应1h。再用TBST洗膜3次。避光条件下，将硝酸纤维素膜置于含330μg/ml NBT和165μg/ml BCIP的碱性磷酸酯酶缓冲液中显色至条带清晰。

从图3可以看出，转入pCHF3-yhsa的转基因烟草中rHSA的表达量远远高于转入pCHF3-hsa的转基因烟草。

本发明不局限于上述最佳实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其它各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是具有与本申请相同或相近似的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种分离的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种分离的核酸，其编码权利要求1所述的蛋白质。

3.根据权利要求2所述的核酸，其具有选自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.一种核酸构建体，其包括权利要求2-4任一项所述的核酸。

6.一种载体，其包括权利要求2-4任一项所述的核酸。

7.根据权利要求6所述的载体，其衍生自pCHF3载体。

8.一种宿主细胞，其包括权利要求6或7所述的载体。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其选自细菌、真菌、动物和植物细胞。

10.根据权利要求9所述的宿主细胞，其选自大肠杆菌和农杆菌细胞。

11.根据权利要求9所述的宿主细胞，其为茄科植物细胞。

12.根据权利要求11所述的宿主细胞，其为烟草细胞。

13.一种生产重组人血清白蛋白的转基因植物的制备方法，包括将权利要求2-4任一项所述的核酸、权利要求5所述的核酸构建体、或者权利要求6或7所述的载体引入植物。

14.根据权利要求13所述的方法，包括：

(1)用权利要求6或7所述的载体转化农杆菌感受态细胞；

(2)用步骤(1)得到的农杆菌侵染植物材料；

(3)将农杆菌侵染的植物材料培养、再生为植株。

15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(1)的转化方法为电击转化。

16.根据权利要求14所述的方法，其中步骤(2)的植物材料为叶盘。

17.根据权利要求13-16任一项所述的方法，其中所述植物为茄科植物。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述植物为烟草。

19.一种生产重组人血清白蛋白的方法，包括种植和收获权利要求13-18任一项所述的方法制备的转基因植物。

20.根据权利要求19所述的方法，还包括从收获的转基因植物中分离、纯化重组人血清白蛋白。

21.根据权利要求20所述的方法，直接用收获的转基因植物生产含有重组人血清白蛋白的产品。