CN117660212A - 一种利用废弃羽毛和糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用废弃羽毛和糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸的方法。该方法采用食用或饲用芽孢杆菌降解废弃羽毛形成羽毛降解液，用EDTA预处理糖蜜，再通过食用或饲用酵母菌利用预处理过的糖蜜与羽毛降解液共发酵生产单细胞蛋白和有机酸。此方法显著提高单细胞蛋白和有机酸的产量，且丰富有机酸的种类，极具食用和饲用价值。本发明将废弃羽毛和糖蜜生物转化为单细胞蛋白和有机酸，不仅将废弃物生物转化资源化利用，而且降低产品的生产成本，还能将产品高值化应用于饲料和食品等领域，既创造经济效益，又推动废弃物‑产品‑应用的全链条可持续发展。
Description
技术领域
本发明属于废弃物资源化利用领域，具体涉及一种利用废弃羽毛和糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸的方法。
背景技术
单细胞蛋白是一种由细菌、酵母菌和微藻等微生物通过规模化培养获得的蛋白质资源。其富含蛋白质，同时还含有脂质、核酸、碳水化合物、维生素和无机盐等成分。与动物蛋白和植物蛋白相比，单细胞蛋白作为一种微生物蛋白，具有高蛋白质含量、营养丰富、生产周期短、成本低、生产不与粮争地等优点。因此，它在食品、禽畜和水产饲料等领域具有广泛的应用价值，可以缓解人类和动物对蛋白资源需求的短缺问题。
当前，有机废弃物的处理和资源化利用已经成为全球关注的热点问题。为了降低单细胞蛋白的生产成本，微生物发酵生产单细胞蛋白的过程通常选择廉价的原料，包括糖蜜、酒糟、秸秆、果皮、白酒废水、乙酸、废弃虾壳、食物垃圾等。其中，糖蜜作为制糖工业的副产物，含有丰富的蔗糖、果糖和葡萄糖等糖分，易被微生物利用和转化，已被广泛应用于多糖、寡糖、酶和单细胞蛋白等物质的生产。废弃羽毛是家禽养殖业的副产物，我国的年含量约为400万吨。废弃羽毛的角蛋白含量在90％左右，是一种优质的蛋白资源。然而，废弃羽毛的结构紧密，不溶于水，难以被微生物直接利用，需要先降解为可溶的小分子。目前，利用废弃羽毛生产有机酸(如柠檬酸、乳酸)的报道主要采用强碱-中和与强酸-高温-中和-过滤-蒸发处理废弃羽毛。这些处理方式存在破坏羽毛中重要的氨基酸、污染环境、安全隐患和成本高等问题。而微生物降解羽毛已成为废弃羽毛高值化利用的绿色经济的有效措施。此外，微生物发酵产生的有机酸在食品、医药、化妆品等领域也有广泛的应用。例如，有机酸能提高饲料的酸度，具有抑制有害菌的繁殖和防止饲料霉变的功能，有替代饲料中抗生素的潜力。此外，有机酸还能改善饲料适口性，提高其利用率，促进铁、铜等微量元素的吸收。
然而，糖蜜的成分复杂且含有灰分、胶体等杂质，导致其转化周期长且转化率偏低。同时，废弃羽毛的理化处理会产生诸多问题，其绿色转化非常有必要。目前，糖蜜和微生物降解的废弃羽毛综合利用生产单细胞蛋白和/或有机酸的研究尚未有报道。这种绿色转化方法使不同的废弃物共同减废增值，助力其资源化综合利用。
发明内容
针对以上废弃物综合利用技术的不足，本发明提供了一种利用废弃羽毛和糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸的方法。本发明采用饲料用或食品用的芽孢杆菌降解废弃羽毛，获得羽毛降解液；将该混合液作为氮源按一定比例添加至糖蜜溶液；接种酵母菌种子液，生产单细胞蛋白和有机酸。
为实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：
本发明提供一种利用废弃羽毛和糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸的方法，是用芽孢杆菌降解废弃羽毛得到羽毛降解液；向糖蜜中添加EDTA，常温静置，离心取上清液得到预处理的糖蜜；将酿酒酵母接种至含有预处理的糖蜜与羽毛降解液的发酵培养基中进行发酵生产单细胞蛋白和有机酸。
优选地，所述含有预处理的糖蜜与羽毛降解液的发酵培养基为含有体积比2～20％预处理的糖蜜与体积比0.1～3％羽毛降解液的发酵培养基。
优选地，所述向糖蜜中添加EDTA，常温静置，离心取上清液得到预处理的糖蜜为：将糖蜜稀释2～4倍后添加EDTA，常温静置10～18h，离心，收集上清液。
优选地，所述用芽孢杆菌降解废弃羽毛为：将对数期的芽孢杆菌种子液按体积比4～10％的接种量转接至羽毛降解培养基，32-38℃、160～220rpm降解20～35h，所述的羽毛降解培养基，按质量分数计，包括0.02～0.12％KH2PO4、0.01～0.09％K2HPO4、1.0％废弃羽毛，pH为7.0～10，余量为水。
优选地，所述的芽孢杆菌是饲料用或食用的芽孢杆菌。
优选地，所述的芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌CICC 10092。
优选地，所述的酿酒酵母是酿酒酵母BNCC 362974。
优选地，所述的有机酸是乙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、甲酸、富马酸、丁二酸和丙酸的至少一种。
优选地，具体步骤为：将对数期的地衣芽孢杆菌CICC 10092菌液按体积比6％的接种量转至鸡羽毛降解培养基，在37℃和180rpm条件下降解30h，获得鸡羽毛降解液；将甘蔗糖蜜稀释2倍，加入体积比0.03％的2mM EDTA，常温静置12h，离心，取上清获得预处理的甘蔗糖蜜；将对数期的酿酒酵母BNCC 362974菌液按体积比5％的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基含有体积比0.7-0.9％的鸡羽毛降解液和体积比16-18％预处理的甘蔗糖蜜，30℃、200rpm条件下发酵48h生产单细胞蛋白和有机酸；所述的鸡羽毛降解培养基，按质量分数计，包括0.06％KH2PO4、0.03％K2HPO4、1.0％废弃鸡羽毛，pH为7.5，余量为水。
本发明还提供上述的方法在制备饲料中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)不同于目前采用的强酸强碱和高温处理糖蜜，而本发明仅通过常温下的絮凝处理糖蜜，易操作、成本低。
(2)在废弃羽毛与其它生物质高值化利用过程中，通常采用强酸强碱和酶法等方法处理废弃羽毛，而本发明采用微生物法降解废弃羽毛且降解液无需除菌，操作简单，经济环保。
(3)将糖蜜与废弃羽毛共发酵生产单细胞蛋白和有机酸，糖蜜转化率高，实现废弃物的资源化综合利用。
(4)食用或饲用微生物具有益生潜力，产生的有机酸能抑菌杀菌和防止饲料霉变，具有替代抗生素的潜力。
附图说明
图1是地衣芽孢杆菌CICC 10092降解的废弃羽毛。
图2是不同甘蔗糖蜜的浓度对酿酒酵母生产单细胞蛋白的影响。
图3是不同废弃羽毛的降解液含量对酿酒酵母生产单细胞蛋白的影响。
图4是单细胞蛋白。
具体实施方式
本发明采取如下的技术方案：
(1)芽孢杆菌降解废弃羽毛。在LB固体培养基涂布芽孢杆菌，在37℃左右静置培养12～24h；挑取菌落至LB液态培养基，在37℃左右和160～220rpm条件下培养至对数期，获得种子液；按照体积比4～10％的接种量转接至羽毛降解培养基，在37℃左右和160～220rpm条件下降解20～35h，获得羽毛降解液。
所述的羽毛降解培养基，按质量分数计，包括0.02～0.12％KH2PO4、0.01～0.09％K2HPO4、1.0％废弃羽毛，pH为7.0～10，余量为水，121℃灭菌15min。。
(2)糖蜜的预处理及其生产单细胞蛋白的优化。将糖蜜稀释2～4倍添加适量的EDTA，常温静置10～18h，离心，收集上清液。在LB或YPD固体培养基涂布适用于食品或饲料的微生物，在28～37℃静置培养12～36h；将菌落挑至相应的液态培养基，在28～37℃和160～220rpm条件下培养至对数期，获得种子液；以体积比2～10％的接种量将种子液接种至含有不同糖蜜浓度与体积比为0.1％的羽毛降解液的发酵培养基中，在该菌种子液培养条件下发酵36～60h
(3)羽毛降解液用作糖蜜转化的氮源。将不同比例的羽毛降解液添加至糖蜜，按照(2)中接种与发酵条件培养。
(4)检测单细胞蛋白、废弃羽毛的降解率和有机酸及总糖的变化。采用差重法检测生物量与废弃羽毛的降解率，可溶性蛋白含量试剂盒(BCA法)(江苏艾迪生生物科技有限公司，ADS-F-SP002)检测可溶性蛋白含量，高效液相色谱检测有机酸种类及含量以及总糖含量检测试剂盒检测总糖(Solarbio，BC2710)。
差重法参考文献：Li,Z.W.etc.2020.The feather degradation mechanisms ofa new Streptomyces sp.isolate SCUT-3.Commun Biol,3(1),191。高效液相色谱检测有机酸参考文献：滕达等.基于高效液相色谱法分析梨酒发酵前后有机酸变化[J].食品研究与开发,2023,44(17):153-159。
以下结合说明书附图和具体实施例对本发明作进一步解释，但不对本发明构成任何限定。
实施例1：酿酒酵母利用废弃羽毛与甘蔗糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸
本实施例以适用于生物饲料的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)CICC10092和适用于食品和饲料的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BNCC 362974为例进行说明。其中10092菌购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，BNCC 362974菌购于河南省工业微生物菌种工程技术研究中心北纳生物。
在LB固体培养基涂布地衣芽孢杆菌CICC 10092，在37℃静置培养16～20h；将菌落转移到LB液态培养基，在37℃和180rpm条件下培养至对数期获得种子液，并以体积比6％的接种量转至鸡羽毛降解培养基，在37℃和180rpm条件下降解30h，获得鸡羽毛降解液，检测废弃鸡羽毛的降解率及形成的可溶性蛋白含量。所述的鸡羽毛降解培养基，按质量分数计，包括0.06％KH2PO4、0.03％K2HPO4、1.0％废弃鸡羽毛，pH为7.5，余量为水，121℃灭菌15min。
将甘蔗糖蜜稀释2倍，加入0.03％(v/v)的2mM EDTA，常温静置12h，6000rpm离心5min，取上清获得预处理的甘蔗糖蜜。在YPD固体培养基涂布适用于食品和饲料的酿酒酵母BNCC 362974，在30℃静置培养24h；将菌落挑至YPD液态培养基，在30℃和200rpm条件下发酵20h获得种子液，并以5％(v/v)的接种量接种至发酵培养基，其中发酵培养基含有0.1％(v/v)的鸡羽毛降解液和0(2％葡萄糖)、2％、4％、6％、8％、10％、12％、14％、16％、18％或20％(w/v)预处理的甘蔗糖蜜浓度，余量为水；然后在30℃和200rpm条件下发酵48h，检测其生物量。
确定最佳预处理甘蔗糖蜜浓度(16％，w/v)后，更换发酵培养基为添加16％(w/v)的预处理甘蔗糖蜜和0、0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1.1％、1.5％或3％(v/v)的鸡羽毛降解液，在30℃和200rpm条件下培养48h，确定鸡羽毛降解液的最佳添加比例。同时，检测有机酸与总糖的变化。
图1结果显示，地衣芽孢杆菌CICC 10092菌能够降解废弃鸡羽毛，且在30h时对废弃鸡羽毛的降解率在80％左右，形成的可溶性蛋白含量在1.9g/L左右。在添加0.1％(v/v)废弃鸡羽毛降解液时，酿酒酵母BNCC 362974在不同甘蔗糖蜜浓度下的生长呈现先增加后趋于稳定的变化(图2)。其中，该菌利用2％(w/v)甘蔗糖蜜的生物量显著高于2％(w/v)葡萄糖。这说明酵母菌BNCC 362974能很好利用甘蔗糖蜜生长。随着甘蔗糖蜜浓度的增加，生物量不断升高，并在甘蔗糖蜜浓度为16％(w/v)时生物量达到最高为12.9g/L。然后，优化废弃鸡羽毛降解液的添加量。如图3所示，酵母菌BNCC 362974的生物量随着废弃鸡羽毛降解液添加量的增大而先缓慢升高后下降，在其添加量为0.9％(v/v)时生物量累积到最高15.6g/L，较无废弃鸡羽毛降解液添加时提高了27.9％。这说明废弃鸡羽毛降解液能显著提高酵母菌BNCC 362974的单细胞蛋白产量。该菌在最佳的甘蔗糖蜜浓度16％(w/v)和废弃鸡羽毛降解液添加量0.9％(v/v)下发酵48h获得的单细胞蛋白(图4)，同时发酵前后的有机酸也发生了明显的变化。如表1所示，甘蔗糖蜜中含有多种有机酸，包括乙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、甲酸、富马酸、丁二酸和丙酸，然而酿酒酵母BNCC 362974利用甘蔗糖蜜与废弃鸡羽毛发酵48h前后的上述有机酸均发生了明显的增加，其中，丙酸产量(80g/L)提高了94.2％，乳酸(27.2g/L)、柠檬酸(22g/L)、甲酸(29.4g/L)和丁二酸(23.2g/L)均提高55％以上，尤其是新生成了乙酸(28.6g/L)和酒石酸(27.8g/L)。此外，发酵后的总糖为10g/L左右，这说明94％以上的甘蔗糖蜜总糖转化为了单细胞蛋白和有机酸。
表1酿酒酵母BNCC 362974利用甘蔗糖蜜与废弃羽毛发酵48h前后有机酸的比较
综上，酵母菌利用糖蜜与芽孢杆菌降解废弃羽毛形成的混合液能够联产单细胞蛋白和有机酸，且通过芽孢杆菌降解废弃羽毛能显著提高单细胞蛋白和有机酸的产量与产率，丰富有机酸的种类。这将为废弃物的资源化综合利用提供有力的支持。
以上仅是本发明的具体实施例，但本发明的技术特征并不局限于此，任何在本发明的思想和原理之内所做的修改、变化或者等同替换都应被认为依然落在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种利用废弃羽毛和糖蜜生产单细胞蛋白和有机酸的方法，其特征在于，用芽孢杆菌降解废弃羽毛得到羽毛降解液；向糖蜜中添加EDTA，常温静置，离心取上清液得到预处理的糖蜜；将酿酒酵母接种至含有预处理的糖蜜与羽毛降解液的发酵培养基中进行发酵生产单细胞蛋白和有机酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有预处理的糖蜜与羽毛降解液的发酵培养基为含有体积比2～20％预处理的糖蜜与体积比0.1～3％羽毛降解液的发酵培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述向糖蜜中添加EDTA，常温静置，离心取上清液得到预处理的糖蜜为：将糖蜜稀释2～4倍后添加EDTA，常温静置10～18h，离心，收集上清液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述用芽孢杆菌降解废弃羽毛得到羽毛降解液为：将对数期的芽孢杆菌种子液按体积比4～10％的接种量转接至羽毛降解培养基，32-38℃、160～220rpm降解20～35h，获得获得羽毛降解液，所述的羽毛降解培养基，按质量分数计，包括0.02～0.12％KH2PO4、0.01～0.09％K2HPO4、1.0％废弃羽毛，pH为7.0～10，余量为水。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述的芽孢杆菌是饲料用或食用的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌是地衣芽孢杆菌CICC 10092。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酿酒酵母是酿酒酵母BNCC 362974。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机酸是乙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、甲酸、富马酸、丁二酸和丙酸的至少一种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体步骤为：将对数期的地衣芽孢杆菌CICC10092菌液按体积比6％的接种量转至鸡羽毛降解培养基，在37℃和180rpm条件下降解30h，获得鸡羽毛降解液；将甘蔗糖蜜稀释2倍，加入体积比0.03％的2mM EDTA，常温静置12h，离心，取上清获得预处理的甘蔗糖蜜；将对数期的酿酒酵母BNCC 362974菌液按体积比5％的接种量接种至发酵培养基，发酵培养基含有体积比0.7-0.9％的鸡羽毛降解液和体积比16-18％预处理的甘蔗糖蜜，30℃、200rpm条件下发酵48h生产单细胞蛋白和有机酸；所述的鸡羽毛降解培养基，按质量分数计，包括0.06％KH2PO4、0.03％K2HPO4、1.0％废弃鸡羽毛，pH为7.5，余量为水。
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