CN118308433B

CN118308433B - 枯草芽孢杆菌bs-22株在发酵菜粕中的应用

Info

Publication number: CN118308433B
Application number: CN202410735690.9A
Authority: CN
Inventors: 马洪龙; 刘雪连; 王丽英; 万红兵; 李昕岳; 吴昊; 潘春丽; 张欣; 李廷耀; 鲍洪芹; 贠桂玲
Original assignee: Beijing Dabeinong Technology Group Co Ltd
Current assignee: Beijing Dabeinong Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2024-06-07
Filing date: 2024-06-07
Publication date: 2024-09-03
Anticipated expiration: 2044-06-07
Also published as: CN118308433A

Abstract

本发明首次将枯草芽孢杆菌BS‑22株应用于菜粕的发酵，将其与黑曲霉菌剂组合后使用，可以有效提高发酵菜粕中的粗蛋白和小肽含量，同时，采用本发明的发酵剂可以有效降解菜粕中的硫甙、植酸、单宁、粗纤维等抗营养因子，且相比单独的BS‑22株而言，其降解效率有了很大的提升，由此证明，本发明的枯草芽孢杆菌BS‑22株与黑曲霉菌剂之间存在协同增效，促进了抗营养因子的降解，提高了菜粕的可饲用性。

Description

枯草芽孢杆菌BS-22株在发酵菜粕中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株新分离得到的枯草芽孢杆菌BS-22株在发酵菜粕中的应用。

背景技术

在饲料生产中，饲用蛋白原料的产量一直满足不了我国饲料工业的需求，蛋白类饲料的对外依存度较高，每年用于饲料的大豆粕进口量高达5000万吨，鱼粉进口量120万吨，每年的进口总价值在约1800亿元左右。近年来，由于同源蛋白在饲料中的使用会存在对我国养殖行业的伤害，同源蛋白也已被禁用或逐步减少使用，传统植物性蛋白原料在饲料行业的应用进一步凸显。因此，开发新的蛋白饲料资源、利用好饲用蛋白原料，提高蛋白质有效利用，是解决饲用蛋白紧缺和促进饲料工业发展的一个非常重要的措施。

我国食用油的生产量和消费量均居全球第一，在植物类食用油生产中会产生大量的饼粕，例如菜籽油生产中会产生菜粕，其蛋白含量都较高，粗蛋白含量35％～40％，氨基酸组成均衡且含有大量微量元素，是优质的植物蛋白原料。然而，在菜籽饼粕的利用中也存在多种多样的问题，菜籽粕中含有较多抗营养因子，如硫甙、单宁、植酸、粗纤维等，硫甙不仅本身具有一定毒性，其主要分解产物异硫氰酸酯、噁唑烷硫酮等化合物也对畜禽有严重危害，会使禽畜甲状腺肿大、肠胃以及肝脾损坏；植酸会与饲料中金属离子结合，严重影响机体的发育；单宁不仅产生苦味还会阻碍自身蛋白质的消化吸收。基于以上因素，菜粕并不能完全替代饲料工业中使用的豆粕，且其利用过程中需要经过脱毒、去除抗营养因子等工艺处理，导致其生产成本高企，限制了其在饲料工业中的应用。

为了充分利用油脂加工的副产物饼粕，现有技术从多方面解决该问题，例如选用双低菜籽原料，采用物理、化学处理或者微生物发酵的方式进行加工处理以减少其中的抗营养因子和/或毒素。现有技术中也进行了大量的探索，例如淮阴工学院在2020年提出了多菌种联合固态发酵菜籽粕的益生菌剂及其发酵方法，使用解淀粉芽孢杆菌固态发酵菜籽粕，并与酿酒酵母、枯草芽孢杆菌进行组合加入菜籽粕中进行了联合发酵，与菜籽粕原材料(普通菜籽粕)相比，按该工艺生产的产品硫甙完全去除，单宁含量降低了33.88％，植酸含量降37.87％，纤维素含量降低38.00％，肽含量提高297.78％（CN202010137814.5）；中粮集团有限公司申请的菜粕发酵及其制备方法的发明专利（CN104397347A）中披露了采用包括植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、酿酒酵母的复合微生物菌种对菜粕进行发酵，依靠各微生物之间的代谢活动和相互作用，在固态发酵的环境下实现菜粕粗蛋白质以及小肽含量显著提高的目的，从而进一步扩大菜粕在饲料中的应用，在最佳试验条件下，发酵菜粕中小肽及乳酸含量分别为11.67%（占粗蛋白质），2.24%（以总酸计），pH为5.01，粗蛋白质含量为45.59%。作为饲料行业的龙头企业，本集团也一直致力于开发新的蛋白资源，提高植物油脂粕的利用率，例如本集团在2012年即申请了“201210459168.X 适用于发酵饼粕类饲料原料的益生菌发酵剂及其制备方法”，采用酵母菌、地衣芽孢杆菌、乳酸菌、黑曲霉作为发酵剂，经过发酵处理，菜籽粕的粗蛋白均高于对照组，粗纤维显著降低，粗脂肪显著提高，主要抗营养因子硫甙降解率达70%，能够有效降解饼粕中的抗营养因子，改善饼粕饲料的风味及蛋白品质，从而有效地提高饼粕在各种畜禽饲料中的利用率。

发明内容

为了解决现有菜粕运用中存在的问题，本发明旨在提供一种菜粕的发酵方法，具体是将本公司分离得到的枯草芽孢杆菌BS-22株应用于发酵菜粕的生产，以提高其中的粗蛋白含量和小肽含量，同时，对于菜粕中的抗营养因子也有极好的降解作用，能够提高菜粕的饲料价值。

为了解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

枯草芽孢杆菌BS-22株在发酵豆粕中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS-22株的保藏号为CGMCC No：27370，将其与黑曲霉组合后用于菜粕的发酵。

本发明还请求保护一种用于发酵菜粕的发酵剂，其特征在于，该发酵剂由枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉和黑曲霉菌剂组成，所述发酵剂由枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂按照重量份配比为（3-5）:1混合而成，其中枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的活菌数为5.0×10¹⁰CFU/g；黑曲霉菌剂中的活菌数为2.0×10⁷CFU/g。

优选地，所述发酵剂中枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂重量份配比为3:1，或者4:1，或者5:1。

本发明还请求保护一种发酵菜粕的制备方法，其特征在于，利用前述发酵剂进行发酵，包括如下步骤：

（1）预处理：将菜籽粕在烘箱中45℃烘干1h，粉碎过40目筛；

（2）发酵底物的制备：将菜籽粕与自来水按5:4的比例混合，加入菜籽粕干物质总量0.6%的氢氧化钠，0.2%的硫酸铵，搅拌均匀后制备得到发酵底物；

（3）发酵：将步骤（2）制备得到的发酵底物与发酵剂混合，其中发酵剂的添加量为菜籽粕干物质总量的0.4%，将发酵原料混合后进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为72h，发酵完成后将发酵好的菜粕在75℃的温度下进行热风干燥，获得发酵菜。

本发明还请求保护所述发酵菜粕在猪饲料中的应用。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

首先，本发明首次将枯草芽孢杆菌BS-22株应用于菜粕的发酵，将其与黑曲霉菌剂组合后使用，可以有效提高发酵菜粕中的粗蛋白和小肽含量，同时，采用本发明的发酵剂可以有效降解菜粕中的硫甙、植酸、单宁、粗纤维等抗营养因子，且相比单独的BS-22株而言，其降解效率有了很大的提升，由此证明，本发明的枯草芽孢杆菌BS-22株与黑曲霉菌剂之间存在协同增效，促进了抗营养因子的降解，提高了菜粕的可饲用性。

其次，通过发酵剂组成和配比的优化，使得本发明所制备得到的菜粕相对现有技术具有更高的营养价值，且相对与本集团公司早先的专利，极大地提高了硫甙降解率；对于植酸、单宁、粗纤维的降解率也高于现有技术所报道的水平，且本发明相对而言工艺更为简单，菌剂组成简单，所取得的效果远远超出技术人员的预期，符合行业发展的趋势。

附图说明：图1：发酵菌剂组成对发酵豆粕营养价值的影响：A-发酵豆粕中粗蛋白含量（%）与菌剂组成的关系；B-发酵豆粕中小肽含量与菌剂组成的关系。

具体实施方式：以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。

实施例1：菌粉的制备

1.1 本申请所用的菌种信息如下：

枯草芽孢杆菌BS-22株菌种：保藏号为CGMCC No：27370，由北京大北农科技集团股份有限公司保存和提供，具体参见ZL202311340921.8。枯草芽孢杆菌BS-22株于2023年05月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保存，命名为BS-22株，分类命名为：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），保藏号为：CGMCC No：27370，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

酿酒酵母K1株菌种：保藏号为CGMCC No.6560，由北京大北农科技集团股份有限公司保存和提供，具体参见ZL201210430095.1。

黑曲霉菌种：保藏号为CGMCC No.18112，由北京大北农科技集团股份有限公司保存和提供，具体参见CN202010135534.0。

枯草芽孢杆菌DZS11株菌种：保藏号为CGMCC No.11261，由北京大北农科技集团股份有限公司保存和提供，具体参见ZL201510870125.4。

1.2 枯草芽孢杆菌BS-22株/枯草芽孢杆菌DZS11株菌粉的制备：

（a）发酵培养基的配制：玉米面0.5％，黄豆饼粉1％，蔗糖0.4％，鱼粉0.6％，KH₂PO₄0.1％，FeSO₄.7H₂O 0.025％，MgSO₄.7H₂O 0.05％，MnSO₄ 0.024％，CaCO₃ 0.1％，消泡剂0.05％，pH约7.2。

（b）发酵罐培养：121℃灭菌30min，降温至37℃，向其中接入菌龄为12h的种子液，接种量为1％，发酵期间保持转速220rpm，通气量1:0.3vvm，罐压0.05MPa，培养至24h为发酵终点，检测枯草芽孢杆菌的活菌数≥1.0×10¹¹CFU/mL。

（c）喷雾干燥制备菌粉：在枯草芽孢杆菌发酵菌液中加入10％w/v的玉米淀粉作为保护剂，搅拌均匀后进行喷雾干燥，喷雾干燥条件为：进风口温度160℃，出风口温度85℃，进料速度3L/h。收集得到枯草芽孢杆菌干粉制剂，经检测，菌粉中枯草芽孢杆菌的活菌数≥5.0×10¹⁰CFU/g。

按照以上方法分别制备得到枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉和枯草芽孢杆菌DZS11株菌粉。

1.3 酿酒酵母K1株冻干菌粉的制备

配制种子培养基：1.0%酵母浸粉，2.0%蛋白胨，2.0%葡萄糖，100ml蒸馏水。121℃，15min灭菌。从培养好的酿酒酵母K1斜面上挑取一环接入到种子培养基中。培养条件：28℃，180rpm，36h。

酿酒酵母发酵培养基：1.5%酪蛋白胨，2.5%酵母浸粉，3.0%葡萄糖，0.24%磷酸二氢钾，1.6%磷酸氢二钾，加入蒸馏水。121℃，15min灭菌。按5%接种量接入种子培养基。培养条件：28℃，150rpm，72h。

所得发酵液用高速冷冻离心机离心，离心条件：6000rpm，4℃，10min。离心后弃上清液，得菌泥。配制5%蔗糖、1%Vc和1%海藻糖保护剂，按菌泥重量的2倍稀释搅拌菌泥，再加入10%进口脱脂奶粉混匀。先置于-80℃超低温冰箱冷冻，再置于真空冷冻干燥机干燥24h，取出粉碎，过60目筛，得冻干菌粉。

1.4 黑曲霉菌剂的制备

将黑曲霉种子接种至斜面察氏培养基，28℃下培养6~8 天，待斜面上长满黑色孢子，用生理盐水冲洗获得种子液，然后接种至发酵培养基中（过20目筛的麸皮、0.5%硝酸钠、1%SDS，麸皮与水的比例为5:4），28℃培养36~48h，待长满黑色孢子即可，60℃烘干、粉碎，即得黑曲霉菌剂。

1.5 菌粉活菌数测定

取制备得到的的菌粉0.5g，在无菌条件下放入装有4.5ml无菌水的试管，震荡，混匀，取0.5ml菌液再放入装有4.5ml无菌水的试管，震荡，混匀，以此类推，将菌液稀释至10^-8后，取10^-8、10^-7、10^-6浓度菌液各200μl涂平皿，每个浓度涂两个平皿，培养、计数。酿酒酵母菌使用商业麦芽汁琼脂平皿，枯草芽孢杆菌使用商业营养琼脂平皿，黑曲霉使用商业察氏琼脂平皿（注：黑曲霉计数使用无菌生理盐水）。

活菌计数结果如下：酿酒酵母菌K11株冻干菌粉约1.0×10¹⁰CFU/g；枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉约5.0×10¹⁰CFU/g；枯草芽孢杆菌DZS11株菌粉约4.8×10¹⁰CFU/g；黑曲霉菌剂为2.0×10⁷CFU/g。

实施例2：发酵剂的制备及初步效果验证

2.1发酵剂的制备

酿酒酵母菌K11株冻干菌粉用过40目筛的玉米粉，红糖（食品级）按75%：25%稀释，使最终活菌数达到：酵母菌1.0×10⁷CFU/g。

枯草芽孢杆菌菌粉用过40目筛的玉米粉稀释，使最终活菌数达到：2.0×10⁸CFU/g。

黑曲霉菌剂可不用稀释。

2. 发酵剂的配制

根据下表1的配方分别称取相应的菌粉/菌剂，配制得到相应的发酵剂。

2.3 初步发酵试验

菜籽粕原料来源于菜籽经榨油后产生的副产物，由北京大北农科技集团股份有限公司提供。预处理过程为：将菜籽粕在烘箱中45℃烘干1h，粉碎过40目筛。

发酵底物的制备：将菜籽粕与自来水按5:4的比例混合，加入菜籽粕干物质总量0.6%的氢氧化钠，0.2%的硫酸铵，搅拌均匀后制备得到发酵底物。

发酵过程：将发酵底物与发酵剂混合，其中发酵剂的添加量为菜籽粕干物质总量的0.4%，将发酵原料混合后进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为72h，发酵完成后将发酵好的菜粕在75℃的温度下进行热风干燥，获得发酵菜粕。

2.4 发酵菜粕的检测

参照CN104397347A中记载的检测方法对发酵豆粕中的粗蛋白质含量、小肽含量和pH值进行检测。

（1）粗蛋白质含量检测：按GB/T 5009.5-2003规定执行。

（2）小肽含量检测采用三氯乙酸提取法：准确称取发酵菜粕样品1.5g（精确到0.0001g）于100mL烧杯中，加入15％三氯乙酸溶液25mL，振荡5min，静置5min，将溶液定量转移，在3000rpm下离心10min，取全部上清液过滤，准确移取10mL滤液置于消化管中，按GB/T5009.5-2003方法消化并测定蛋白含量。

小肽计算公式如下：

小肽（占粗蛋白质，％）＝(V-V0)*C*6.25*0.014*2.5*100/(M*CP)

式中：V—样品消耗HCl的体积，mL；

V0—空白消耗HCl的体积，mL；

C—盐酸的摩尔浓度，mol/L；

M—样品质量，g；

6.25*0.014—蛋白转换系数；

CP—发酵菜粕样品的粗蛋白质含量。

（3）pH测定：称取5g发酵菜粕样品置于100mL三角瓶中，加入45mL蒸馏水，摇匀后静置30min，用电极测定pH。

检测结果如表2所示。

基于以上表2的试验结果可知，发酵剂F1和F2组相对其他组别而言具有更好的发酵效果，将F1和F2组与F3、F4组相比，可知，本发明的枯草芽孢杆菌BS-22株相对DZS11而言具有更好的发酵效果，且更加适合于黑曲霉配合用于菜粕的发酵。将F1和F2组与F5和F6组比较可知，在复合发酵菌剂中，并非菌剂中包含菌种数量越多，发酵效果越好，相反，对于以枯草芽孢杆菌BS-22株作为主要发酵菌种的菌剂而言，其在对酿酒酵母菌进行省略后，不仅发酵效果更好，而且在无需添加酿酒酵母的情况下，节约了生产成本，简化了生产工艺，具有预料不到的技术效果。将本发明的发酵效果与现有技术（CN104…347A）的比较可知，采用本发明的发酵剂，产物中粗蛋白、小肽含量更高，相比该发明专利具有更好的发酵效果。

2.4 发酵剂的优化

按照枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂=1:1，或者2:1，或者3:1，或者4:1，或者5:1，或者6:1的重量比混合制备得到发酵剂，而后按照“2.3初步发酵试验”的方法进行发酵，制备得到发酵菜粕，按照“2.4 发酵菜粕的检测”中所记载的方法检测发酵菜粕中的粗蛋白质含量和小肽含量。具体结果如下图1A和B所示。

基于图1A和图1B可知，在发酵剂中，随着枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂重量比例的增加，发酵菜粕中的粗蛋白含量以及小肽含量呈现出先上升后下降的趋势，且当两者的配比为3:1，4:1，或者5:1时，发酵效果最好，其中粗蛋白含量和小肽含量均达到最高水平。因此，确定以上配比为本申请最合适的菌剂配比为枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂=（3-5）:1。

实施例3：

发酵菜粕的制备方法，包括如下步骤：

（1）预处理：将菜籽粕在烘箱中45℃烘干1h，粉碎过40目筛；

（3）发酵：将步骤（2）制备得到的发酵底物与发酵剂混合，其中发酵剂的添加量为菜籽粕干物质总量的0.4%，将发酵原料混合后进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为72h，发酵完成后将发酵好的菜粕在75℃的温度下进行热风干燥，获得发酵菜粕。

所述发酵剂由枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂按照重量份配比为3:1，或者4:1，或者5:1混合而成，枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的活菌数为5.0×10¹⁰CFU/g；黑曲霉菌剂中的活菌数为2.0×10⁷CFU/g。

另外，设置单纯以枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉作为发酵剂的发酵豆粕作为对照组1，枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的添加量为菜籽粕干物质总量的0.5%，其他条件同上。还设置对照组2，在实验过程中采用枯草芽孢杆菌DZS11株菌粉与黑曲霉菌剂按照4:1混合后用于菜粕的发酵，菌剂的添加量调整为0.5%，其他条件同上。

测定发酵前、后的菜粕中的硫甙、植酸、单宁、粗纤维含量，从而计算发酵菜籽粕抗营养因子的降解情况，具体如下表3所示。

基于以上表3的试验结果可知，采用本发明的发酵剂可以有效降解菜粕中的硫甙、植酸、单宁、粗纤维等抗营养因子，且相比单独的BS-22株而言，其降解效率有了很大的提升，由此证明，本发明的枯草芽孢杆菌BS-22株与黑曲霉菌剂之间存在协同增效，促进了抗营养因子的降解，提高了菜粕的可饲用性，基于本发明的发酵剂与对照组2的发酵剂比较可知，采用BS-22株与黑曲霉的组合相对于其他芽孢杆菌与黑曲霉的组合而言，具有更好的降解效果，能够更好地改善菜粕的饲料性能。另外，相对与本集团公司早先的专利，其硫甙降解率约为70%左右，本发明极大地提高了硫甙降解率；相比淮阴某学院的现有技术而言，虽然本发明的硫甙降解率未能达到100%，但是对于植酸、单宁、粗纤维的降解率也高于其中所报道的水平，且本发明相对而言工艺更为简单，菌剂组成简单，所取得的效果远远超出技术人员的预期，符合行业发展的趋势。

实施例4：

发酵菜粕的工厂化生产，包括如下步骤：

（1）预处理：将菜籽粕在烘箱中45℃烘干1h，粉碎过40目筛；

所述发酵剂由枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂按照重量份配比为4:1混合而成，枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的活菌数为5.0×10¹⁰CFU/g；黑曲霉菌剂中的活菌数为2.0×10⁷CFU/g。

经测定，发酵菜粕中的粗蛋白含量高达55.97%，小肽含量（占粗蛋白，%）达到16.04%；且与同批次未发酵的菜粕相比，经过发酵后，硫甙降解率达到90.01%，植酸降解率为47.64%，单宁降解率为37.01%，粗纤维降解率为42.37%。

实施例5：发酵菜籽粕在猪饲料中的应用

采用实施例4所制备得到的发酵菜粕与普通育肥猪全价饲料按照5:95的质量比例混合得到含有发酵菜粕的猪饲料，充分混合均匀后用于育肥猪的饲喂。

在密云猪场随机选取30头体重接近100kg的育肥猪，随机分为3组，其中组1采用普通育肥猪全价饲料饲喂，组2采用以上含有发酵菜粕的猪饲料进行饲喂，组3采用含普通菜粕的饲料进行饲喂（菜粕：全价料=5:95w:w），试验过程持续30天，测定其生长性能，具体结果如表4所示。

由此可见，将本发明的发酵菜粕应用于猪饲料后，可以改善饲料的适口性，提高育肥猪的平均日增重，极大地提高了生产效率。

Claims

1. 枯草芽孢杆菌BS-22株在发酵菜粕中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌BS-22株的保藏号为CGMCC No：27370，将其与黑曲霉组合后用于菜粕的发酵，所述黑曲霉保藏号为CGMCC No.18112，将枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂按照重量份配比为（3-5）:1混合后制备得到发酵剂用于菜粕的发酵，其中枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的活菌数为5.0×10¹⁰CFU/g；黑曲霉菌剂中的活菌数为2.0×10⁷CFU/g。

2. 一种用于发酵菜粕的发酵剂，其特征在于，该发酵剂由枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉和黑曲霉菌剂组成，所述发酵剂由枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂按照重量份配比为（3-5）:1混合而成，其中枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉的活菌数为5.0×10¹⁰CFU/g；黑曲霉菌剂中的活菌数为2.0×10⁷CFU/g，所述枯草芽孢杆菌BS-22株的保藏号为CGMCC No：27370，所述黑曲霉保藏号为CGMCC No.18112。

3.根据权利要求2所述的用于发酵菜粕的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中枯草芽孢杆菌BS-22株菌粉：黑曲霉菌剂重量份配比为3:1，或者4:1，或者5:1。

4.一种发酵菜粕的制备方法，其特征在于，利用权利要求2-3中任意一项所述的发酵剂进行发酵，包括如下步骤：

（1）预处理：将菜籽粕在烘箱中45℃烘干1h，粉碎过40目筛；

（3）发酵：将步骤（2）制备得到的发酵底物与所述发酵剂混合，其中发酵剂的添加量为菜籽粕干物质总量的0.4%，将发酵原料混合后进行发酵，发酵温度为37℃，发酵时间为72h，发酵完成后将发酵好的菜粕在75℃的温度下进行热风干燥，获得发酵菜粕。

5.权利要求4所述的发酵菜粕在制备猪饲料中的应用。